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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA
METODOS EN BIOTECNOLOGIA
CROMATOGRAFÍA DE GASES
CONTENIDO
Antecedentes/Historia 1
Mecanismos de la cromatografía 2
Fundamentos teóricos 2
Nomenclatura 5
Fase móvil 6
Puerto de inyección 6
Horno de la columna 7
Fase estacionaria 8
Soporte 9
Columna cromatográfica 10
Detectores 15
Métodos 20
Análisis cualitativo 20
Métodos de coincidencia 21
Aplicaciones 31
Comida, saborizantes y fragancias 31
Químicos y petróleo 34
Ambientales 35
Médicas y biológicas 35
Industria 37
Otras aplicaciones 38
Aplicaciones prácticas 38
Cromatografía de gases como método principal 40
Innovaciones 41
Páginas web 45
Bibliografía 45
1
Antecedentes/Historia
La primera técnica cromatográfica fue ideada por el botánico ruso Mikhail Tswett en 1906,
quien utilizó alúmina para separar los pigmentos coloreados de las hojas de las plantas.
Tswett en su experimento original, metió dentro de un tubo de vidrio un fino polvo
(sacarosa) para producir una columna de una altura deseada. Posteriormente, extrajo los
pigmentos de hojas y los colocó en un solvente (éter de petróleo) y agregó un poco de la
solución dentro de la columna. Cuando toda la solución había pasado a través de la
columna se formó una estrecha zona inicial bajo la capa inicial del adsorbente. Después
agregó más solvente y aplicó presión en la parte de arriba de la columna. Mientras el
solvente iba pasando a través de la columna, los pigmentos se iban separando
individualmente (Fig. 1). La clave del éxito de la columna de Tswett, fue la aplicación de la
mezcla dentro de la columna en una zona inicial estrecha y la posterior aplicación del
solvente fresco.
En 1931, fue redescubierta por Richard Kuhn al utilizarla para el análisis de polienos. Los
primeros en utilizar un gas como fase móvil fueron A. T. James y A. J. Martin en 1952,
para separar ácidos grasos cortos. Posteriormente Dabrio, en 1971, la utilizó para separar
metilaminas, aminas alifáticas y homólogos de piridina.
Mecanismos de la cromatografía
Fundamentos teóricos
Se han propuesto muchas teorías con complejos modelos matemáticos para explicar el
comportamiento de los solutos en las columnas cromatográficas. Las más estudiadas son:
La principal es la teoría de las placas teóricas (theoretical plates theory), la cual plantea
que una columna cromatográfica está constituída por una serie de placas contenidas en la
fase estacionaria. Supone como constante el volumen de la fase estacionaria en cada placa;
que el volumen de fase móvil entre placas es constante; que las dos fases están en equilibrio
en cada placa, y que el valor de coeficiente de distribución es constante e independiente de
la concentración del soluto. Desventaja: además de que se basa en muchas suposiciones, la
principal desventaja es la falta de conexión entre la eficiencia de la columna y las
propiedades fisicoquímicas de la partícula.
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N=16(tr/w)2
Variaciones en las velocidades de flujo, debido a las diferentes rutas que puede tomar el
analito durante su migración a través del empaque.
Difusión axial o longitudinal del soluto en la fase móvil.
Resistencia a la transferencia de masas entre la fase móvil y la fase estacionaria.
HETP o H=A+B/u+Cu
En la teoría para las columnas capilares se considera que la difusión aparente no contribuye
de manera apreciable al ensanchamiento de los picos en este tipo de columnas. El
coeficiente relacionado con la difusión molecular tiene un valor de uno debido a que la
distancia que recorre la partícula es igual a la longitud de la columna. El término
relacionado con la transferencia de masas viene dado en función del diámetro de la
columna, pues en este tipo de columna es más importante que el tamaño de partícula de
relleno.
La ley de Darcy1 correlaciona la velocidad lineal de un gas que circula por una columna
con el gradiente de presión.
Las respectivas integraciones de la ecuación permiten obtener una que relaciona el valor de
la presión con la posición de la columna, otra que indica la velocidad media, la
compresibilidad o factor de obstrucción
Depende de las propiedades termodinámicas del sistema (K) y además es función de las
características de la columna en particular. Probabilidad de encontrar una molécula
determinada de soluto en la fase estacionaria o en la fase móvil
La relación frontal y el factor de capacidad son dos maneras de medir el mismo fenómeno.
Representa la relación entre las velocidades medias del soluto y la fase móvil en su
recorrido por la columna.
Conservan las propiedades del coeficiente de reparto y son fáciles de calcular, su manejo se
dificulta al momento de elegir un patrón adecuado. Se utiliza para disminuir el efecto de
errores, sobre todo, en el conocimiento del peso de la fase estacionaria en la columna.
Resolución
Cada sustancia se desplaza a una velocidad característica dada por el valor de su relación
frontal en dichas condiciones. Altura equivalente a una placa teórica. Por tratarse de un
método donde se separa por elución es mejor referirse a tiempo de elución más que a
distancias recorridas.
Eficacia
Una columna será más eficaz mientras mayor sea el número de placas teóricas que tenga.
Para poder hacer comparaciones entre columnas es necesario establecer condiciones
similares de trabajo.
Nomenclatura
Desde el primer cromatógrafo de Tswett hasta los cromatógrafos de ahora siguen utilizando
la misma nomenclatura para sus componentes:
Un tubo de metal o vidrio se llena con un sólido activo (adsorbente) para formar una
columna cromatográfica. La mezcla a separar es aplicada en una zona inicial y es lavada
con un solvente, líquido de lavado o revelador. La serie de resultados se denomina
cromatograma, y el lavado de la zona inicial para formar el cromatograma es la formación
o desarrollo del mismo.
Cuando el agente a detectar se trata con un agente químico para formar un color, se dice
que la cromatografía está siendo revelada. La combinación del solvente, la mezcla y el
adsorbente son llamados sistema cromatográfico. Cada sistema cromatográfico está
compuesto por una fase móvil (solvente) y una fase estacionaria (la columna).
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La forma más usual de hacer cromatografía de gases es utilizando un líquido como fase
estacionaria; recibe entonces el nombre de cromatografía gas-líquido (CGL). También se
utilizan absorbentes, dando lugar a la cromatografía gas-sólido (CGS), pero en mucho
menor proporción.
La cromatografía de gases es una técnica analítica que puede ser utilizada para separar
compuestos orgánicos basada en sus volatilidades. También provee información cualitativa
y cuantitativa de los componentes presentes en una mezcla. Los componentes son
separados por sus diferencias de partición entre la fase móvil gaseosa y la fase estacionaria
en la columna, permitiendo que sean separados en tiempo y espacio.
1. Fase móvil.
2. Puerto de inyección.
3. Horno de la columna.
4. Columnas
5. Fase estacionaria.
6. Detector.
7. Sistema de registro de datos.
Horno de la columna
Percha de
la columna
Columna de
capilaridad
Para obtener la mejor resolución de dos substancias dentro de la columna, se requiere tener
una fase estacionaria donde su retención relativa sea mayor a la unidad. Esto depende del
punto de ebullición y el coeficiente de actividad de los solutos en dicha fase. De aquí que
en series homólogas el orden de elución sea el de los puntos de ebullición crecientes,
independientemente de la fase empleada, salvo en casos especiales. Por otra parte, dos
sustancias de punto de ebullición idéntico, pero de estructura química diferente, podrán
separarse fácilmente con base en su distinta solubilidad.
tipo de material es la temperatura máxima a la que se puede trabajar. Las fases se pueden
clasificar en:
• No polares: para separar sustancias poco o nada polares. El más utilizado son las
gomas de silicona OV-1, OV-101 o SE-30, para trabajar hasta más de 300ºC donde
se consiguen eficacias de columna extraordinarias.
Columnas con fase mixta: para resolución de separaciones parciales con dos o más líquidos.
Posibilidad de separar hasta 50 sustancias mezclando dos, tres y cuatro líquidos para formar
la columna final. Aunque es más laboriosa y poco práctica la representación gráfica esto ha
sido simplificado al utilizar programas computacionales.
Soporte (Support)
La función básica del soporte sólido es sostener la fase estacionaria. El soporte debe de
tener elevada superficie por unidad de volumen, estabilidad térmica, dureza mecánica,
inactividad química y baja resistencia al paso de un gas.
Fundente carbonato sódico, productos blancos utilizados para filtración. Celita, Celatom.
Tiene menor actividad superficial residual. El cromosorbo G es utilizado en columnas con
poca fase estacionaria y se obtienen mejores eficacias. El cromosorbo A es utilizado en
escala preparativa.
Sin fundente y a mayor temperatura, productos rosados utilizado para ladrillos refractarios.
Sil-O-Cel, Sterchamol, C-22. Son de mayor superficie y mejor resistencia mecánica, pero
son los que presentan mayor actividad superficial residual.
Todos los soportes porosos tiene cierta actividad residual debida a la presencia de iones
metálicos o defectos de superficie, y a los grupos OH de las moléculas. Esta actividad
modifica el desarrollo normal del cromatograma, por lo tanto este efecto debe ser
disminiudo desactivando el soporte.
Una manera es cubrirlos con la misma fase estacionaria, la cua se adsorbe fuertemente en
estos puntos y el efecto sobre el soluto es menor. También se puede hacer por lavado ácido
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o básico, aunque el sistema más utilizado es hacer reaccionar los grupos hidroxilo de la
superficie del soporte con reactivos adecuados.
Columna cromatográfica
Las columnas están hechas de cobre, acero inoxidable o tubos de vidrio, dobladas o
enrrolladas. Excepto para las de vidrio, las columnas son empacadas mientras se están
doblando. Las columnas analíticas tienen una longitud de 1-6 m. de longitud y de 2-4 mm.
de diámetro. Según se encuentre en ella distribuida la fase estacionaria y el valor que
alcance la relación de fases se originan los diferentes tipos de columnas. La separación de
la mezcla se realiza dentro de la columna, por lo tanto, es la parte más importante del
cromatógrafo.
La primera columna utilizada fue una de relleno (James & Martin, 1952), posteriormente
fue introducida la columna capilar, siendo así los dos extremos en la gama de columnas
utilizadas en la cromatografía de gases. El criterio para la diferenciación de columnas es
con base en dos propiedades de éstas:
Con base en estas dos características se encuentran los siguientes tipos de columnas, en las
que Vm/Vs y k aumetan en orden progresivo1:
1. Clásicas de relleno
2. Capilares rellenas
3. Capilares de capa porosa
4. Capilares abiertas
La elección de las columnas es lo más crítico, existen dos diferencias fundamentales que
deben ser cosideradas para la elección de la columna: la cantidad de muestra que admiten
(capacidad de carga) y los valores de los flujos del gas portador. La capacidad de carga se
define como la cantidad de muestra que se puede inyectar sin pérdida apreciable de eficacia
y está relacionado con la cantidad de fase estacionaria por unidad de longitud de la
columna.
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Las columnas empaquetadas contienen un soporte sólido inerte con una cubierta delgada de
la fase líquida. El soporte sólido es frecuentemente tierra de diatomeas. La fase líquida
puede tener una viscosidad baja y una alta solubilidad para la mezcla de componentes.
Las columnas de capilaridad originalmente contenían una película del líquido cubriendo la
pared interna de la columna de vidrio o metal. Las columnas de capilaridad ahora contienen
una capa de revestimiento sólido dentro de ella con poro en el centro. Estas columnas son
mejores porque se les puede aplicar una velocidad óptima de flujo más rápida (aprox. de 2-
5 ml por min en lugar de 1 ml por min). Debido a este tipo de columnas, los análisis han
podido ser más sensibles.
La cantidad de muestra que admite una columna capilar sin que sufra sobrecarga es mucho
menor que en una columna clásica. La sobrecarga se alcanza cuando la concentración de
soluto en la fase estacionaria es tan grande que la isoterma de distribución deja de ser
lineal.
Constituídas por un tubo de metal o vidrio con relleno de soporte granular con la superficie
recubierta por una película de la fase estacionaria.
Longitud 1-10 m
Diámetro interno 2-4 mm hasta 5 cm en escala preparativa
Tamaño de la partícula de relleno diez veces menor que el diámetro del tubo
Capacidad de carga grande
Relación de fases pequeña
Permeablilidad baja
A mayor tamaño de partícula del relleno mayor será su permeabilidad, cuanto más rugosa
sea su superficie mayor capacidad de carga se obtendrá. Por esta razón es el único tipo de
columna que se usa a escala preparativa.
Se distinguen de las columnas clásicas de relleno por le diámetro interno del tubo, no
excede un milímetro. Además, la relación entre los diámetros del tubo y de la partícula de
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relleno es del orden de tres a cinco veces. Esto hace que sea un relleno más irregular y una
permeabilidad del orden de diez veces superior.
Longitud de 10-50 m.
Diámetro interno de 1 mm.
Tamaño de la partícula de relleno de 3 a 5 veces
Capacidad de carga pequeña
Relación de fases grande
Permeablilidad mayor que las clásicas
Al ser mayor la permeabilidad pueden construirse columnas más largas (10-50 m). Guichon
(1966) y Halasz (1967) han hecho estudios muy detallados de este tipo de columna.
En este caso el soporte es depositado en la pared interior del tubo, después es recubierto por
la fase estacionaria y la parte central del capilar permanece vacía.
Longitud de 25-200 m
Diámetro interno de 0.1-0.5 mm
Tamaño de la partícula de relleno varía entre el de un soporte clásico y las partículas de
carbono producidas por la pirólisis de una sustancia orgánica.
Permeablilidad valores máximos (al igual que las capilares abiertas)
También conocidas como columnas Golay, quien fue el primero en utilizarla (Golay, 1958).
La fase estacionaria va depositada en la pared interior del tubo que actúa como soporte.
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La naturaleza del tubo y el procedimiento seguido para su limpieza son de gran importancia
en este tipo de columnas, ya que la pared del mismo sirve como soporte y su capacidad de
retención del solvente influirá notablemente en la uniformidad de la película formada. Uno
de los métodos consiste en llenar el tubo con una disolución diluida de la fase estacionaria
en un disolvente volátil, cerrar un extremo e introducirla en una estufa con una temperatura
superior al punto de ebullición del solvente, la fase quedará depositada sobre la pared del
capilar.
Los flujos del gas portador que se utilizan en columnas capilares suelen ser del orden de
0.5-3 ml/min, mientras que en una columna clásica ascienden a un orden de 30-100 ml/min.
Para poder utilizar la columna capilar con éxito será necesario intoducir entre el inyector y
la columna un dispositivo denominado divisor de flujo, cuya finalidad es permitir la entrada
en la columna de una pequeña fracción solamente del flujo que pasa por el sistema de
inyección. La relación de división (flujo al exterior/flujo que pasa por la columna) suele
oscilar entre 50 y 120. Esto permite disminuir la cantidad de muestra que pasa por la
columna (que queda reducida a la fracción que indica la relación de división) y aumentar la
velocidad lineal del gas portador en el sistema de inyección en la cantidad indicada por la
relación de la división (la difusión molecular en esta parte del instrumento se hace muy
pequeña).
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Tubo
o
Fase estacionaria
Grano de soporte
Detectores
Los detectores son dispositivos que indican y miden los solutos en la corriente del gas
acarreador, convirtiendo una señal no medible directamente en una señal elaborable de
una propiedad física. Esta señal es elaborada por una comparación entre el gas acarreador
puro (blanco) y el mismo gas llevando cada uno de los componentes previamente
separados en la columna, esto es traducido en una señal eléctrica que es amplificada y
registrada al momento de salir de la columna.
Los detectores más ampliamente utilizados son el detector de conductividad térmica (TCD)
y el detector de ionización de flama (FID).
Consiste de dos celdas metálicas idénticas, cada una conteniendo un filamento de alambre
de tungsteno o de tungsteno con lámina de oro. El efluente fluye a través de una celda y el
gas portador (He o H2) fluye a través de la otra. En un lado de la muestra el gas fluye por el
filamento mientras que en el lado de referencia el gas puede pasar sobre el alambre del
filamento y difundir a través de él. Los filamentos son calentados por una corriente
eléctrica. La temperatura del elemento censor depende de la conductividad térmica del gas
que fluye alrededor. Cambios en conductividad térmica, como cuando las moléculas
orgánicas desplazan un poco al gas portador, provocan un incremento en la temperatura del
elemento el cual está siendo monitoreado como un cambio en la resistencia.
Dos pares del TCD son utilizados en cromatógrafos de gases, un par localizado en la salida
de la columna para detectar los componentes separados mientras van saliendo, el otro par
localizados antes del inyector o en una columna de referencia separando las resistencias de
los dos pares y están acomodados en un circuito de puente.
conductividad térmica (la mayoría de los gases orgánicos tienen calores de conductividad
bajos).
El FID consiste de una flama hidrógeno/aire y una placa colectora. Las muestras que salen
de la columna pasan a través de la flama, la cual rompe las moléculas orgánicas y produce
iones. Los iones son colectados en un electrodo parcial y produce una señal eléctrica. Es
extremadamente sensible en un amplio rango dinámico. La única desventaja es que
destruye la muestra.
La muestra debe ser un combustible, esta entra en la base del detector, se mezcla con el
hidrógeno y entra a la flama. Hay compuestos con poca o sin respuesta al FID, compuesto
como el NH3, CS2, Nox, CO, CO2, O2, H2O, N2, compuestos perhalogenados, etc. La
respuesta está basada en el número de carbonos y otros elementos tales como halógenos y
el oxígeno presentes que reducen la combustión.
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Es uno de los más usados en los métodos selectivos de cromatografía de gases. El FPD
consiste de una flama reductora que produce especies quimioluminiscentes. Estas especies
emiten una luz característica que es óptimamente filtrada por la longitud de onda deseada,
la cual determina que componentes son los detectados. La luz filtrada es medida por un
fotomultiplicador (PMT) y transducida a una señal. Se puede agregar un segundo
fotomultiplicador, el cual permite una detección simultánea de una segunda señal.
Los filtros para FPD pueden ser seleccionados para diferentes componentes, pero los más
comunes son para la detección de sulfurados y fosforados en mezclas complejas. La
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selectividad de FPD clásicos (como una porción por peso del carbono) es 105 para
sulfurados y 106 para fosforados.
La cromatografía de gases con FPD puede ser usada para detectar componentes sulfurados
en extractos crudos de aceite y en contaminantes de gas natural. También puede ser
utilizado para detectar pesticidas y herbicidas organofosforados, así como de componentes
sulfurados volátiles en el análisis de alimentos.
Este es un método destructivo dependiente de flujo de masa, con selectividad para S, P, Sn,
B, As, Ge,Se, Cr; con un límite de detección de ~ 100pg/seg. Su modo de detección es
debido a la producción longitudes de onda particulares resultando en una corriente que
puede ser medida.
Este tipo de detector es muy selectivo para los compuestos con hidrocarburos aromáticos o
con heteroátomos, los cuales tienen potenciales de ionización. Utiliza luz ultravioleta para
ionizar un analito, la longitud de onda oscila entre 106-150 nm. Los iones producidos son
colectados por electrodos siendo la corriente generada una medida de la concentración del
analito.
Métodos
Análisis cualitativo
La cromatografía de gases es uno de los métodos físicos de separación más eficaces que se
conocen; cada componente de una muestra suministra tres unidades de información:
posición, altura y anchura de los picos en el cromatograma. La posición, un solo parámetro
expresado cuantitativamente expresado como dato de retención, suministra la información
cualitativa y los otros proporcionan la información cuantitativa.
En la siguiente tabla se resumen los procedimientos utilizados para identificar los picos
cromatográficos. No existe un método general aplicable a todos los problemas prácticos, la
información cromatográfica cualitativa depende del conocimiento previo de la composición
de las muestras y casi siempre se han de combinar varias de las operaciones incluidas en la
tabla para seguir identificaciones fiables. A pesar de los inconvenientes del método, la
cromatografía de gases en combinación con otras técnicas es el instrumento más eficaz
conocido hasta la fecha para determinar la composición cualitativa de mezclas complejas de
compuestos orgánicos.
Métodos de coincidencia
Al estudiar la probabilidad de que el pico que coincide con el patrón sea el patrón, la
certeza es la identificación de que un pico depende de sustancias eluidas cerca del mismo
con las que puede confundirse. Expresando cuantitativamente esta observación intuitiva se
tiene2:
ρ = h/(V1r-V2r)/δVr
pn = e-pρn/n!
pesA+B = pesA*pesB
como pesB <1 se deduce que pesA+B < pesA; y por ello la separación en dos columnas ha
reducido la probabilidad de identificación errónea debida a la elución simultánea.
Retención relativa
de referencia y su selección queda a disposición del especialista, por lo que existe gran
número de datos de poca aplicación a problemas particulares.
La resolución y separación de los picos son dos de los factores más importantes para la
resolución de la columna. Resolución es la capacidad de la columna para separar dos picos
adyacentes, dependientes de la selectividad y eficiencia. La eficiencia es la relación entre la
longitud del tiempo que gasta el soluto en salir de la columna y la anchura del pico sobre la
elución. Esto es determinado por el número efectivo de placas teóricas las cuales son
secciones ideales de la columna donde los solutos se equilibran entre la fase estacionaria
líquida y la fase gaseosa móvil. Expresado como4:
N = 5,54 [(tr-to)/w1/2] 2
Un valor alto de N indica una gran capacidad de retención del soluto de la fase estacionaria
y una gran eficiencia de la columna. La presencia de un volumen muerto grande (to)
esconde la eficiencia de la columna pero puede ser reducido incrementando la velocidad
lineal del flujo del gas acarreador. La asociación entre la velocidad lineal y eficiencia de
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.
Fig.10 Efectos de usar diferentes gases acarreadores en el punto Van Deemeter4.
Antes de marcar el uso de flujo de acarreadores, se ajusta la fuente del acarreador que es
por lo menos 20 psi más grande que la presión de la cabeza de la columna. Esto es para
minimizar la resistencia del flujo de la columna para suplementar líneas y garantizar una
velocidad de flujo volumétrico constante entre el inyector, la columna y el detector. Para
medir la velocidad lineal, se inyecta una sustancia no retenible a la temperatura donde hay
mayor elución. Si a esto se le optimiza la temperatura, estará arriba del 50 % de la
eficiencia que puede ser perdida cuando se hacen rangos de 50 hasta 200 ºC. La velocidad
lineal es calculada usando la siguiente ecuación y entonces un valor promedio se obtiene de
un mínimo de tres mediciones4. Cuando la velocidad lineal se optimiza para el helio será
aproximadamente 21-40 cm/seg y para el hidrógeno de 50-80 cm/seg.
Por ejemplo, con ECD el detector de gas necesita mantener un equilibrio de concentración
de electrones térmicos y un barrido efectivo de gas acarreador-soluto. La sensibilidad ECD
es inversamente proporcional al flujo, aunque un flujo fuerte se requiera para el barrido de
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sustancias altamente retenidas para producir picos agudos. Para mantener una sensibilidad
satisfactoria en las velocidades de flujo en el ECD se utiliza 95 % de argón y 5 % de
metano como fuente de gas.
rt2 – rt1 es la diferencia en los tiempos de retención entre los dos picos, w2 es el ancho del
pico 2 y w1 es el ancho del pico 1.
3) La sensibilidad está relacionada con la altura del pico a la base del mismo. Una porción
de 3:1 indica una sensibilidad adecuada.
Las muestras con splitless son frecuentemente usadas para análisis de componentes donde
una gran cantidad de muestra es inyectada a la columna. Durante el muestreo con splitless,
la muestra se inyecta dentro de la columna caliente y forma un vapor que consiste de
muestra, solvente y gas. Parte del gas sale por el respirador al pasar en el alineador. El
respirador del split se apaga en éste punto y se vuelve a prender después de 20 a 60 seg.
para prevenir que los vapores entren en contacto con la cabeza de la columna y sean
retenidos ahí. El tiempo de purga, o el tiempo que el respirador del split es abierto después
de la inyección, es crítico para la discriminación y reproducibilidad del cromatograma.
Sin embargo, con solventes como el cloruro de metileno (punto de ebullición de 40ºC), la
concentración del solvente no es práctica porque la temperatura inicial del horno estará a
menos de la temperatura del cuarto. En este caso, el analizador debe aceptar los picos que
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estén entre los solutos que eluyen al principio o tratar varias técnicas de inyección que sean
compatibles con el muestreo tipo splitless.
Una cabeza del alineador desactivada, sin lana de sílica es preferida para una mezcla ligera
de la muestra con el solvente. Ocasionalmente, la lana puede ser usada para ayudar a la
volatilización de los componentes de alto peso molecular. Un alineador de cuello de ganso
es una alternativa viable para un alineador delgado, diseñado específicamente para mejorar
la eficiencia del splitless y disminuir la degradación de la muestra. Una columna
moderadamente polar desactivada, puesta 1 o 2 cm abajo del punto de inyección, podría ser
utilizada siempre con splitless para minimizar el pegado de los picos y para tener una
migración uniforme del solvente.
Para tener un tiempo de purga óptimo, se comienza con un rango de purga de 0.2 a 1.5 min.
Si el tiempo es muy corto, menos de 0.1 min. los componentes más pesados no se
volatilizarán lo suficiente o no se crearía la “concentración del solvente”. Si hay una gran
diferencia entre el punto de ebullición del solvente y el del soluto, el tiempo de purga
necesitar estar cercano a 0.2 min. Ajustar el tiempo de purga en incrementos de 0.1 min.
hasta alcanzar el máximo de sensibilidad del soluto sin que haya trazas del solvente.
El muestreo tipo split es el método más popular porque inyectar muestras de 0.1 a 2 µl no
impide que haya una buena altura y sensibilidad en el pico. Si se obtiene la cantidad
máxima de eficiencia de la columna, las áreas del pico más pequeñas asociadas con el
muestreo tipo split reflejan una reducción en lo ancho lugar de lo alto del pico. Mejorar la
simetría del pico permite una mejor reproducibilidad y por lo cual da una mejor
cuantificación del área de los picos. Otra ventaja del split, es que se pueden usar columnas
más estrechas para tener una mejor resolución sin tener que volver a muestrear la columna.
Quizá el único inconveniente del split es que la cantidad inyectada a la columna podría no
ser representativa si la muestra no es completamente vaporizada. Esto es porque la muestra
entra en el alineador con el respirador split abierto y el extracto de la muestra y el
acarreador son purgados antes de que entren a la columna. Por esta razón, el método de
inyección split puede ser monitoreado siempre corriendo soluciones estándares de
concentraciones conocidas y analizar su reproducibilidad. La cantidad purgada en el
respirador del split está determinado por la velocidad del split4:
Para mejorar la velocidad del split, colocar la temperatura del horno a la temperatura inicial
y ajustar flujo del respirador del split hasta que esté en 10 a 15 ml/min. El flujo a través del
respirador de purga pude estar entre 0.5 a 6 ml/min. y el flujo del acarreador en 2 a 5
ml/min. al final del detector.
Pi2 = [(T2/T1)1.7(pi2-po2)1+po2]1/2
Cuando se usa EPC con inyección tipo split, la velocidad del split puede ser programada
para cambiar durante la corrida o entre los métodos en una secuencia. También, puede ser
programado para apagarlo entre corridas para conservar la cantidad de gas acarreador. Si se
aplican pulsos de presión a la inyección tipo split, incrementa el flujo el cual podría reducir
la velocidad de split.
El software requiere que dos programas extremos sean usados como un rango 1) Una
presión o temperatura alta con un rampeo rápido y 2) una presión y temperatura inicial con
un rampeo bajo. Los resultados entran al programa, con la longitud de la columna, la
presión sobre el diámetro de la columna, la velocidad lineal, de tiempo muerto y otros
parámetros. Una serie de algorímetros determinan los mejores programas basados en la
termodinámica de retención para índices y cálculos.
Aplicaciones
Un intento para crear una compilación de aplicaciones deseadas para generar un manual
debe ser selectivo, en consecuencia la compilación casi siempre puede estar incompleta por
cromatógrafos individuales debido a la omisión de ejemplos que se consideran críticos para
algunos campos específicos. Por otra parte, algunos de los ejemplos incluidos pueden ser
criticados porque los eventos de separación en la cromatografía de gases pueden ser muy
rápidos y en muchos casos es posible generar resultados que son superiores a los mostrados
en las ilustraciones. Los avances que han permitido mejorar los métodos incluye a)
mejores métodos de preparación y almacenamiento de las muestras, b) mejoras en la
instrumentación comercial, incluyendo entradas superiores que llevan a cabo un mejor
proceso de inyección de la muestra y c) la disponibilidad de mejores columnas desactivadas
en un rango más amplio de diámetros y cubiertas de una gran variedad de fases
estacionarias. Las guías de aplicaciones para fases estacionarias en los análisis de las
diferentes áreas se muestran en catálogos tales como Supelco, Applied Science, Analabs,
etc.
Otra forma de clasificar las aplicaciones en la cromatografía de gases es dividir los datos de
la literatura en áreas de interés, pese a que la sobrelapación de algunos sea inevitable, una
serie de grados de redundancia puede ser evitada por la asignación de cuatro grandes
categorías:
cromatografía de gases. El análisis puede ser complicado debido a que los compuestos de
interés volatilizan usualmente en muy bajas concentraciones, y son frecuentemente
dispersados dentro de una matriz que contiene materiales los cuales podrían, si se quedan
dentro de la columna, acortar la vida de la muestra en un grado considerable. La
cromatografía puede ser extremadamente compleja y frecuentemente influenciada por los
métodos de preparación de la muestra.
Un ejemplo de esto puede ser el aceite de limón al cual se adulteraba por la adición de
turpentina. De aquí que la cromatografía de gases es usada no solo para establecer cuales
son los materiales normales que contiene cada muestra, sino también aquellos componentes
cuya concentración aumenta el abuso del aceite (ejemplo: el p-cymeno). La complejidad el
aceite es tan alta que no se podría analizar su composición por una simple columna
cromatográfica, por lo que se usan columnas especializadas de polimetilsiloxano con
diferentes fases estacionarias, para producir una mejor separación de los compuestos así
como un tiempo de vida más largo.
Los análisis de productos del petróleo incluyen la separación de mezclas de gases ligeros
hasta la caracterización de aceites crudos y materiales producidos en la licuación del
carbón. La diferenciación de hidrocarburos parafínicos, olefínicos y aromáticos son metas
normales, y algunas veces se requiere la detección de componentes nitrogenados y
sulfurados. Las preparaciones de hidrocarburos derivados de aceites o carbón licuado
pueden ser extremadamente complejas y también pueden incluir una variedad de otros
grupos funcionales. La cromatografía multidimensional puede ser requerida para el análisis
de estas mezclas complejas, la cual da una gran estimación de ciertos aditivos de octanos.
Las interacciones entre la fase estacionaria y los solutos hidrocarbonados están limitados
generalmente a fuerzas de dispersión; por ejemplo, la fase estacionaria de
metilpolisiloxano, cuya interacción con los solutos está limitada a las fuerzas de dispersión,
funciona bien para la separación de estos componentes. Mooney, et al. (1982) 4 demostaron
la separación de hidrocarbonos de bajo peso molecular en un sistema de válvula de entrada,
usando una columna de película apretada en condiciones subambientales. Estas columnas
son especialmente útiles para mezclas de baja ebullición. También se han diseñado
separaciones interesantes utilizando columnas tubulares de capa porosa (PLOT) cubiertas
con alúmina.
Las pruebas de solventes han sido todo un reto, debido a la cantidad masiva del
constituyente principal que debe ser inyectado a la columna si la detección es para los
constituyentes menores; por ejemplo, el rango dinámico del sistema debe ser
suficientemente amplio para acomodar estas diferencias cuantitativas en los componentes.
34
Aplicaciones ambientales
Los análisis cromatográficos se llevan a cabo por columnas tubulares abiertas, las cuales
dan una excelente precisión y tiempos de análisis muy cortos pese a la complejidad que
podría presentar la muestra. En estos análisis cromatográficos se usan fases estacionarias de
compuestos aromáticos para mejorar la separación de los solutos. Las mismas columnas se
usan para la separación de pesticidas y compuestos aromáticos clorados.
diferentes, una empleando FID y la otra con detección de nitrógeno/fósforo (NPD), para
generar los datos de la Fig. 12.
Fig. 11. Análisis de una droga ilegal en un analizador de detector y columna doble4.
Aplicaciones en la industria
La cromatografía de gases es muy útil cuando pretendemos identificar los compuestos que
determinan una característica aromática conocida. Por lo tanto, es necesario conocer los
umbrales a partir de los cuales mejora o se desvirtúa nuestro producto, ya sea mediante
estudio bibliográfico o por detección olfatométrica. Esta información es un instrumento útil
para el seguimiento del producto en el proceso productivo, así como el control de otros
materiales enológicos, como son los tapones y las barricas. Algunos controles importantes a
efectuar durante la fase de crianza en vinos y cavas son métodos específicos para la
determinación de fenoles volátiles y compuestos azufrados. Concretamente en la cava, a
partir de la evolución de ciertos compuestos volátiles, entre ellos los vitispiranos, se calcula
el momento en el que tienen lugar las fases de autólisis y postautólisis durante la crianza.
Controlar el momento en que se desarrollan estas fases es importante debido a las
alteraciones organolépticas que conllevan.
La información que nos puede suministrar la GC en el control de calidad será más grande
cuanto mejor conozcamos el perfil cromatográfico de la fracción aromática de nuestro
producto. Por ello, hay que disponer de un amplio banco de datos del mismo en las
diferentes etapas de elaboración y en diferentes adiciones, y correlacionar estadísticamente
determinados compuestos con ciertas anomalías, o tipificar variedades que no contengan
algún compuesto específico que las identifique (como sucede en la mayoría de casos). No
37
En todo caso, el análisis por cromatografía de gases no nos permite definir el perfil
aromático del vino analizado. El problema se agrava en aquellos compuestos para los que
no disponemos de patrones sintéticos y, por tanto, no es posible conocer sus propiedades
aromáticas.
Otras aplicaciones
Aplicaciones prácticas
Abundance
TIC: DBT.D
5500000
5000000
4500000
4000000
3500000
3000000
2500000
2000000
1500000
1000000
500000
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00
Time
Time-->
A) cromatografía de gases.
Abundance
550000
500000
450000
400000
350000
300000
250000
200000
150000
139
100000
50000 92
63
32 215246281 327 377 429 479 530562 605 659693
0
m/z
m/z-->
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
B) espectrometría de masas
Entre las aplicaciones de más importancia está la del ámbito de alimentos, debido a que es
de suma importancia tener conocimiento de los componentes cuya presencia cae dentro de
los parámetros permitidos en ciertos productos, aún a pesar de que no formen parte del
contenido original. Para ejemplificar este punto hacemos referencia al siguiente artículo de
divulgación. Se anexa publicación al finaldel trabajo.
39
López, M.G. 2001. Una sinfonía de aromas. Avance y perspectiva, Unidad Irapuato,
CINVESTAV. vol. 20. p. 421-424
** Química atmosférica
Programa de Ingeniería Química Ambiental y de Química Ambiental (PIQAyQA)
Facultad de Química/UNAM. Distrito Federal
Cromatógrafo de gases Perkin Elmer
http://www.cneq.unam.mx/paidoteca/quimicaambiental/instalaciones.htm
Innovaciones
Debido a que ProSep provee alguna separación, los componentes inyectados son
organizados en la precolumna de acuerdo a su punto de ebullición, aquí el solvente, el
analito y la matriz son ordenados en el puerto y los solventes de bajo punto de ebullición
son rápidamente eluidos (paso 2).
Cuando ya se han transferido todos los solutos de interés, se abre de nuevo el respirador
split se abre de nuevo y la columna de preseparación aumenta la temperatura para hervir a
los componentes no deseados de la matriz (paso 4). Todos estos pasos son monitoreados
bajo softwares de la marca ProSepTM.
individuales de una mezcla con un alto grado de poder resolutivo, no puede dar, en sentido
riguroso más que información preliminar sobre su estructura. Hay que señalar como
esencial que cualquier columna cromatográfica no es un instrumento analítico, sino tan solo
un medio de separación física.
Páginas web
Bibliografía
1. Dabrio, M.V. 1971. Cromatografía de gases. Vol. I. Ed. Alahambra, S.A. España.
182pp.
2. Dabrio, M.V. 1971. Cromatografía de gases. Vol. II. Ed. Alahambra, S.A. España.
223pp.
5. Wilson, H.W. & M.S. Klee. 1997. Analysis of sulfur and phosphorus compounds
with a flame photometric detector on the Agilent 6890 Series Gas Chromatograph.
Innovating the HP way Manual. p.1-4
6. http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/GC/
7. http://www.bst.com.au/resources/tutorapp.pdf