Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
DISPERSIONES MULTIFÁSICAS EN
FERMENTADORES: ENTENDIENDO
FENÓMENOS QUE OCURREN EN TRES
DIMENSIONES Y A ALTA VELOCIDAD
CONTENIDO Página
1. Resumen Ejecutivo 3
2. Introducción 5
3. Desarrollo del Tema 7
3.1 Dispersiones multifásicas 7
3.2 Caracterización de las dispersiones 7
3.2.1 Caracterización de dispersiones por análisis de imágenes 8
3.2.2 Uso de cámaras de alta velocidad 8
3.3 Desarrollos previos en nuestro laboratorio 9
3.4 Desarrollos recientes de nuestro laboratorio 9
3.4.1 Técnica estereoscópica 10
3.4.2 Videoendoscopía de alta velocidad 10
3.5 Metodologías utilizadas 11
3.5.1 Configuración general del sistema 11
3.5.2 Adquisición microestereoscópica de imágenes y su
análisis tridimensional 12
3.5.3 Video de alta velocidad 13
3.5.4 Videoendoscopía de alta velocidad 13
3.5.5 Modelos de estudio 16
3.5.5.1 El hongo Trichoderma harzianum 16
3.5.5.2 El nemátodo Steinernema carpocapsae 16
3.6 Resultados 17
3.6.1 Imágenes en dos dimensiones 17
3.6.2 Imágenes en tres dimensiones 17
3.6.3 Videos de alta velocidad 21
3.6.4. Determinación de la velocidad de objetos 21
3.7 Aportaciones 25
4. Conclusiones 27
5. Referencias 28
6. Agradecimientos 32
7. Anexos 33
7.1 Técnica estereoscópica 33
7.2 Condiciones de operación de los sistemas 37
8. Breve Curriculum vitae 38
1. RESUMEN EJECUTIVO
2. INTRODUCCIÓN
Hay otros casos en los que existe una segunda fase líquida que también es
necesario dispersar, como en el caso de los aceites vegetales que se utilizan
como nutriente de las células o cuando se usan solventes para extraer
compuestos tóxicos para ellas.
Es también relevante el caso cuando existe una fase sólida que debe ser
dispersada en el proceso. Entre los ejemplos de fases sólidas
hidrodinámicamente importantes se incluyen a la biomasa de hongos
filamentosos, de células animales o vegetales y organismos tales como los
nemátodos, los cuales también se producen por procesos de fermentación.
Las interacciones entre un líquido (el medio acuoso) y otro líquido inmiscible (la
fase orgánica), un sólido (la biomasa) y el gas (aire) presentes en ciertos
procesos de fermentación, son particularmente complejas. Gran parte de los
estudios encaminados a lograr un mejor entendimiento de estos fenómenos y
sus implicaciones en la fisiología y la productividad de los procesos se han
enfocado desde un punto de vista macroscópico. Es decir, se ha estudiado el
efecto de las variables de proceso (agitación, pH, temperatura, tensión
superficial, etc.) sobre la productividad de los cultivos. Sin embargo, estos
estudios tienen la desventaja de ser sistema-específicos, lo que ha impedido
que puedan aspirar a tener una aplicación más generalizada, ya que no están
basados en conceptos y características fundamentales de los procesos de
transferencia de masa.
Otra forma es medir el tamaño de las gotas y de las burbujas (Dalmau, 1998). Entre
las técnicas para determinar el diámetro de las gotas o burbujas se encuentran: a) la
medición de la transmisión de luz a través de una interfase (gas-líquido o líquido-
líquido) (Rebelein, 1986); b) a través de una sonda capilar de boro (Bae, 1989); c)
midiendo la diferencia de la velocidad de transmisión de una onda acústica en dos
líquidos (Boyd, 1998); d) con un contador Coulter y la adición de materiales
conductivos (Bae, 1989) y e) por fotografía directa (Chen, 1967; Coulaloglou, 1976).
Algunos de estos métodos son técnicas basadas en la toma de muestra, por lo que
perturban el flujo y rompen el equilibrio de rompimiento y coalescencia o modifican la
distribución de tamaños de gotas o burbujas. En su mayoría, son técnicas que se han
utilizado sólo en sistemas de dos fases (gas-líquido, líquido-líquido).
∑
k
n di3
d32 = i =1 i
∑
k
n di2
i =1 i
Este valor relaciona el área interfacial (a) por unidad de volumen y el área para la
transferencia de masa, la cual esta dada por:
6h
a=
d 32
Se han utilizado cámaras de video de alta velocidad, que permiten obtener imágenes
para la medición en dispersiones líquido-líquido, cuando la fase dispersa está en altas
concentraciones, tal como reportan Lovick (2005), quienes utilizaron una cámara de
video de alta velocidad acoplada a un endoscopio, para la medición de una dispersión
líquido-líquido.
Galindo (2000) tomaron como base el sistema reportado por Pacek (1994) para
desarrollar una metodología con el fin de caracterizar dispersiones de hasta cuatro
fases, utilizando sistemas modelo que simulan el cultivo del hongo Trichoderma
harzianum en aceite de ricino. La metodología (Pacek, 1994) para cuantificar gotas
constaba de una cámara de video acoplada a un estereomicroscopio y que envía su
señal a una videograbadora. Las imágenes grabadas se desplegaban en una
computadora donde se medían las gotas manualmente. Posteriormente Machon (1997)
utilizaron esta metodología para cuantificar los tamaños de burbujas como función de
la tensión superficial. Dalmau (1998), con un sistema similar midieron los tamaños de
gotas en un sistema modelo de tres fases (medio acuoso, aceite y aire) para la
producción de una lipasa. Sin embargo, Galindo (2000) fueron quienes demostraron
por primera vez la factibilidad de la técnica de análisis de imágenes para la
caracterización de dispersiones de hasta cuatro fases.
También se han estudiado algunos de los factores que afectan la dispersión de las
fases en estos sistemas modelo, tales como el contenido de aceite, la concentración y
morfología de la biomasa y la presencia de proteínas (Larralde, 2002; Lucatero, 2003;
Pulido-Mayoral, 2004; Galindo, 2005).
En este trabajo, usando una cámara de video de alta velocidad, capaz de grabar a
velocidades mayores a 5130 imágenes de 512 x 512 pixeles por segundo, la cual
utiliza una fuente de luz directa de alta intensidad, fue posible adquirir fotografías
nítidas de objetos que se mueven a altas velocidades dentro del tanque. No hay
antecedentes en la literatura respecto a utilizar este tipo de sistemas para la
caracterización de sistemas multifásicos de alta complejidad, como los que suceden en
algunos procesos de fermentación.
11
1
4
3
8
5
7 10
5
4
6
7
8
3
2
10
un juego con este documento para poder apreciar el fenómeno en las imágenes
señaladas).
Se adquirieron videos de 200 imágenes, a 5130 cuadros por segundo (512 x 384
pixeles) con magnificaciones de 6 X, 8 X y 11 X. Estos videos se utilizaron para la
determinación tanto de los diámetros de gotas de aceite y burbujas de aire como del
porcentaje de inclusiones de burbujas de aire en gotas de aceite.
6
1
4 3
Video
10 Luz
Posición de la Imagen
3
1
9
La 6-pentil-α-pirona (6PP) es una lactona que tiene aroma a coco y presenta actividad
fungicida (Bonnarme, 1997) y que es producida por el hongo Trichoderma harzianum.
Este hongo puede crecer en la forma de micelio o agregado laxo (figura 6 a) o bien
como pellets (figura 6 b). Se ha demostrado que en el caso de Trichoderma, como en
otros cultivos de hongos filamentosos, existen condiciones hidrodinámicas óptimas
para el crecimiento y/o la producción de un metabolito dado. La producción de la 6PP
es función de la hidrodinámica presente dentro del fermentador y responde a un
cambio en el metabolismo de la fuente de carbono (Rocha-Valadez, 2005). Sin
embargo, es importante mencionar que en este sistema tan complejo y dinámico, el
transporte de nutrientes (y por ende su disponibilidad) está muy lejos de estar
plenamente entendido a detalle.
a) b)
Los nemátodos entomopatógenos (NEPs) del género Steinernema spp. (figura 7) son
enemigos naturales de diferentes insectos, por lo que se utilizan como agentes de
control biológico contra insectos-plaga que atacan a diversos cultivos agrícolas (Islas-
López, 2005).
3.6 Resultados
a) b) c)
Con el fin de establecer las posibles diferencias entre los datos adquiridos en dos y tres
dimensiones, se estudió un sistema de cuatro fases, previamente caracterizado por
Lucatero (2003), quienes evaluaron el efecto de la concentración de la biomasa de
Trichoderma harzianum, ya sea en forma de pellets o de agregados laxos, sobre el
porcentaje de burbujas (con respecto al total medido de la muestra) que se
encuentran incluidas dentro de las gotas de aceite.
80
60
% burbujas dentro
40
3D
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Biomasa (g/L)
80
% burbujas dentro
60
40
2 D (Lucatero, 2003)
20
3D
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Biomasa (g/L)
1400
1200
Diámetro Sauter (μm)
1000
800
600
400
Gotas de aceite
200
Burbujas de aire
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Biomasa (g/L)
El sistema de alta velocidad permitió obtener imágenes nítidas, bien iluminadas y con
un elevado número de objetos enfocados (figura 14), con lo cual se pueden
determinar confiablemente los d32 y la distribución de tamaños.
Figura 14. Secuencia de imágenes obtenidas con el sistema de video de alta velocidad
de un sistema de tres fases.
Dentro
Fuera
Figura 17. Secuencia de imágenes para discernir los objetos incluídos dentro de las
gotas de aceite de los objetos sobrelapados.
De igual manera, con este sistema de video de alta velocidad fue posible estudiar la
cinética de la dispersión y caracterizar de forma muy fina los cambios que ocurren en
el sistema. Un ejemplo de esto se observa en la figura 18, donde se incluyen
imágenes representativas de lo que sucede desde que se inicia la agitación en el
tanque y conforme transcurre el tiempo de dispersión. Las inclusiones de burbujas en
gotas de aceite se incrementaron con respecto al tiempo de dispersión y con este
sistema fue posible registrar fenómenos como el proceso de formación de gotas
multifásicas (figura 19) o la interacción entre las estructuras (figuras 20 y 21).
Figura 20. Interacción entre las diversas estructuras presentes en un sistema de tres
fases (en presencia de proteína).
Figura 21. Interacción entre una gota de aceite, una burbuja de aire y un NEP en
estadío IJ. Estas son estructuras presentes en un sistema de cuatro fases con
nemátodos.
t0 + 5.8 x 10-4 s t0
Figura 22. Determinación de la velocidad con la que mueven las gotas y burbujas
dentro del tanque de mezclado en un sistema de tres fases con BSA y Pg de 0.5 kW/m3
(29.6 cm/s).
3.7 Aportaciones
Hasta el momento se desconocen los mecanismos por los cuales se forman estas gotas
multifásicas. Una posibilidad serían las colisiones gota-burbuja y/o gota-
micelio/nemátodos. El primer paso que se dió para dar respuesta a estas
interrogantes, fue la implementación de un sistema capaz de visualizar el proceso de
formación de dichas estructuras, de manera que se puedan conocer los factores que
están participando en su formación.
4. CONCLUSIONES
Fue posible documentar la interacción entre los nemátodos y las otras fases
involucradas en el proceso así como verificar que la agitación mecánica no causó
fragmentación de ellos.
5. REFERENCIAS
Bae, J.H. and Tavlarides, L.L. “Laser capillary spectrophotometry for drop-size
concentration measurements”. AIChE J. Vol. 7, pp. 1073-1084, 1989.
Bonnarme, P., Djian, A., Latrasse, A., Féron, G., Giniés, C., Durand, A. and Le
Quéré, J.L. “Production of 6-pentyl-α-pyrone by Trichoderma sp. from vegetable
oils”. J Biotechnol. Vol. 56, pp. 143-150, 1997.
Corkidi, G., Voinson, T., Taboada, B., Córdova-Aguilar, M.S. and Galindo, E.
“Accurate determination of embedded particles within dispersed elements in
multiphase dispersions, using a 3D micro-stereoscopic vision system”. Chem. Eng.
Sci. (enviado), 2007.
Coulaloglou, C.A. and Tavlarides, L.L. “Drop size distributions and coalescence
frequencies of liquid-liquid dispersions in flow vessels”. AIChE J. Vol. 22(2), pp.
289-297, 1976.
Dalmau, E., Sánchez, A., Montesinos, J.L., Valero, F., Lafuente, F.J. and Casas, C.
“Study of a drop size frequencies in a microbial growth system with an aqueous-
organic medium: lipase production from Candida rugosa”. J. Biotechnol. Vol. 59,
pp. 183-192, 1998.
Galindo, E., Pacek, A.W. and Nienow, A.W. “Study of drop and bubble sizes in a
simulated mycelial fermentation broth up to four phases”. Biotechnol. Bioeng. Vol.
69(2), pp. 213 – 221, 2000.
Galindo, E., Larralde-Corona, C. P., Brito, T., Córdova-Aguilar, M.S., Taboada, B.,
Vega-Alvarado, L. and Corkidi, G. “Development of advanced image-analysis
techniques for the characterization of multiphase dispersions occurring in
bioreactors”. J. Biotechnol. Vol. 116, pp. 261 – 270, 2005.
Junker, B. “Measurement of bubble and pellet size distributions: past and current
image analysis technology”. Bioprocess Biosyst. Eng. Vol. 29, pp. 185 – 206, 2006.
Kawase, Y., Araki, T., Shimizu, K. and Miura, H. “Gas-liquid mass transfer in three-
phase stirred tank reactors: Newtonian and non-Newtonian fluids”. Can. J. Chem.
Eng. Vol. 75, pp. 1159-1163, 1997.
Kawase, Y. and Moo-Young, M., “The effect of antifoam agents on mass transfer”.
Bioprocess. Eng. Vol. 5, 169–173, 1990.
Larralde, P., Cordova, M. S. and Galindo, E. “Distribution of the free and oil-trapped
air bubbles in simulated broths containing fungal biomass”. Can. J. Chem. Eng. Vol.
80, pp. 491 – 494, 2002.
Laakkonen, M., Honkanen, M., Saarenrinne, P. and Aittamaa, J. “Local bubble size
distributions, gas-liquid interfacial areas and gas holdups in a stirred vessel with
particle image velocimetry”. Chem. Eng. J. Vol. 109, pp. 37-47, 2005.
Leng, D.E. and Calabrese, R.V. “Immiscible liquid-liquid systems”. In: Handbook of
Industrial Mixing: Science and Practice; Paul E, Atiemo-Obeng V, Kresta S (eds)
Wiley-Interscience, Chapter 12, pp. 639-753, 2004.
Lovick, J., Mouza, A. A., Paras, S. V., Lye, G. J. and Angeli, P. “Drop size
distribution in highly concentrated liquid-liquid dispersions using a light back
scattering method”. J. Chem. Technol. Biotechnol. Vol. 80, pp. 545-552, 2005.
Lucatero, S., Larralde-Corona, P, Corkidi, G. and Galindo, E. “Oil and air dispersion
in a simulated fermentation broth as a function of mycelial morphology”.
Biotechnol. Prog. Vol. 19, pp. 285 – 292, 2003.
Machon, V., Pacek, A.W. and Nienow, A.W. “Bubble sizes in electrolyte and alcohol
solutions in a turbulent stirred vessel”. Trans. Inst. Chem. Eng. Vol. 75, pp. 339-
348, 1997.
Ozkan, O., Calimili, A., Berber, R. and Oguz, H. “Effect of inert particles at low
concentrations on gas-liquid mass transfer in mechanically agitated reactors”.
Chem. Eng. Sci. Vol. 55, pp. 2737-2740, 2000.
Pacek, A.W., Moore, I.P.T., Nienow, A.W. and Calabrese, R.V. “Video technique for
measuring dynamics of liquid-liquid dispersion during phase inversion”. AIChE J.
Vol 40, pp. 1940-1949, 1994.
Rebelein, F. and Blass, E. “A measuring technique for drop diameters in the mm-
range in liquid-liquid dispersions”. ISEC′86, pp. 387-395, 1986.
Reséndiz, R., Martínez, A., Ascanio, G. and Galindo, E. “A new pneumatic bearing
dynamometer for power input measurement in stirred tanks”. Chem. Eng. Technol.
Vol. 14, pp. 105-108, 1991.
Rocha-Valadez, J.A., Hassan, M., Corkidi, G., Flores, C., Galindo, E. and Serrano-
Carreón, L. “6-pentyl-α-pyrone production by Trichoderma harzianum: the
influence of energy dissipation rate and its implications of fungal physiology”.
Biotechnol. Bioeng. Vol. 91, pp. 54-61, 2005.
Taboada, B., Larralde, P., Brito-Albavera, T., Vega, L., Díaz, R., Galindo, E. and
Corkidi, G. “Images acquisition of multiphase dispersion in fermentation
processes”. J. Appl. Sci. Technol. Vol. 1 (1), pp. 78-84, 2003.
Taboada, B., Vega, L., Córdova, M.S., Galindo, E. and Corkidi, G. “Semi-automatic
image analysis methodology for the segmentation of bubbles and drops in complex
dispersions occurring in bioreactors”, Exp. Fluids, Vol. 41(3) pp. 383-392, 2006.
Umbaugh, S.E. “Computer vision and image processing”. Pearson Higher Education,
1997.
Wang, D., Liu, W., Han, B. And Xu, R. “The bioreactor: a powerful tool for large –
scale culture of animal cells”. Curr. Pharm. Biotechnol. Vol. 6 (5), pp. 397 – 403,
2005.
Zhou, G. and Kresta, S.M. “Correlation of mean drop size and minimum drop size
with turbulence energy dissipation and the flow in an agitated tank”. Chem. Eng.
Sci. Vol. 53, pp. 2063–2079, 1998b.
6. AGRADECIMIENTOS
7. ANEXOS
7.1 Anexo 1
La técnica estereoscópica implica dos partes, una es la adquisición del par de imágenes
estereoscópicas, donde se debe colocar cuidadosamente las dos cámaras de video con
la misma referencia vertical, de manera que las coordenadas y de los centros de
gravedad de los objetos tengan hipotéticamente los mismos valores.
Se hace uso de la trigonometría para obtener la posición (x,y,z) del punto pi dentro de
la referencia πxyz, desde su posición con respecto al sensor p1 de la cámara izquierda
(x1,y1) en la referencia π1 y con respecto al sensor de la cámara p2 (x2,y2) en la
referencia π2 (figura A 2).
Las posiciones espaciales de los diferentes objetos permiten discernir si los objetos
están atrapados realmente, de los resultados que se obtienen utilizando una técnica
bidimensional, donde no es posible determinar la posición espacial de los objetos.
Para esto, se calcula la distancia Euclidiana entre los centros de gravedad de gotas o
burbujas (Dxyz, ver la figura A 3). Tanto las gotas como las burbujas son
consideradas como esferas perfectas desde su segmentación, la cual se realiza con
círculos.
Para calcular el error del sistema, se utilizó un portaobjetos de vidrio con un círculo
grabado de 3 mm de diámetro, en cuyo centro se encuentra una recta de 1 mm
dividida en secciones de 10 μm cada una. Este micrómetro se colocó en la platina de
un microscopio, cuyo desplazamiento fue controlado por un programa de computadora.
El micrómetro se colocó en una posición en la que el círculo y la regla tuvieran el
mismo tamaño en las imágenes adquiridas por las cámaras izquierda y derecha, con la
finalidad de lograr el alineamiento perpendicular.
7.2 Anexo 2
La fase continua fue una solución de sales con la misma composición que el medio de
cultivo para la producción de micelio de Trichoderma harzianum (Serrano-Carreón,
2002). La fase dispersa fue aceite de ricino al 5 % (v/v). La fase sólida fue biomasa
Trichoderma harzianum a diferentes concentraciones (0.05 a 2.4 g/l), con dos tipos de
morfología: pellets y micelio disperso y clumps. Se trabajó con una agitación de 200
rpm y un flujo de aire de 0.25 vvm. El volumen de operación fue de 6.7 l. Las
imágenes adquiridas se procesaron, segmentando manualmente los objetos para así
determinar la distribución de tamaños de gotas y burbujas.