TRANSCRIÇÃO DE IMUNOLOGIA APLICADA

AULA 07 – DIAGNÓSTICO E ACOMPANHAMENTO LABORATORIAL HIV

GAG, ENV E POL: CARACTERIZAÇÃO

Existem 3 grupos gênicos referente ao
vírus HIV: GAG, POL e ENV. Eles são utilizados
para fim de diagnóstico.
O grupo gênico ENV vai codificar uma
proteína chamada de gp160. O HIV,
inicialmente produz essa poliproteína e esta,
ao sofrer ação de uma protease, irá gerar duas
proteínas. Aí age o fármaco que possui ação
inibidora da protease. A gp160 vai dá origem a
duas proteínas: gp120 e gp41. A gp120 é a
proteína do envelope e a gp41 é a proteína da
transmembrana. No HIV-2 existe uma
homologia estrutural entre HIV-1 e HIV-2,
entretanto no HIV-1 existe o gp41 e no HIV-2
há o gp36, ou invés do gp41.
O grupo GAG vai codificar as proteínas do core ou cerne
viral. Esse grupo gênico vai codificar uma poliproteína que vai
resultar em proteínas funcionais, sendo a mais importante a
p24. O p24 é uma proteína do core, do cerne viral, sendo uma
das primeiras proteínas a serem liberadas no sangue,
possibilitando a detecção do anti-p24.
O grupo POL é codifica várias proteínas de ações enzimáticas que vão participar da replicação viral.
Por exemplo, a p66, a p51 e a p31.

EVOLUÇÃO DA DOENÇA HIV

Existem 4 fases importantes no HIV. A primeira
é chamada de fase aguda ou fase Flu-like (influenza
like ou síndrome semelhante à mononucleose
infecciosa-mononucleose infecciosa like). Nessa fase o
paciente apresenta sintomas e sinais inespecíficos que
se assemelham a uma gripe ou a uma síndrome da
mononucleose. Nessa fase o indivíduo ainda não soro-
converteu (produção de anticorpos e células). Nessa
primeira fase há uma viremia (representado em
vermelho).
 No momento em que acontece a soroconversão, o indivíduo começa a ter a produção de células e
anticorpos que são específicos para o HIV, e nesse período o vírus vai se tornar indetectável no plasma. Ele já
está albergado nas células, dentro dos órgãos. As moléculas alvo do HIV são moléculas receptoras,
principalmente o CD4. O CD4 não está apenas nas células T, mas também em monócitos, macrófagos e
células dendríticas. Ou seja, todas essas células são alvo dele.
Uma vez o que o indivíduo soroconverteu, ele entra em uma fase chamada de latência clínica, onde
ele não apresenta comorbidade episódicas. Essa fase é variável, durando em média dez anos. A seguir, o
indivíduo começa a manifestar as infecções oportunistas, ou seja, ele passa por uma fase assintomática e
depois entra na AIDS.
Espera-se que um adulto tenha acima de 500 células/mm³ de TCD4. A AIDS ocorre quando o
individuo chega abaixo de 200células/mm³. Se o indivíduo está com HIV, mas a contagem de TCD4 não
atingiu esse valor, o paciente não está com AIDS. O paciente pode estar assintomático, mas quando ele está
sintomático, existem doenças que são definidoras de
quem está com AIDS (doenças definidoras de AIDS).
Resumidamente: Há a fase flu-like, que dura
de 2 a 6 semanas, a fase assintomática (fase de
latência clínica e à fase sintomática (e AIDS).
O nível de TCD4 anterior a infecção não será
mais recuperado. Antes da infecção. Em um indivíduo
não infectado, há 1,6 a 1,9 TCD4 pra cada 1 TCD8. No
final de um infecção por HIV essa proporção vai ser
muito mais TCD8 que TCD4.

O gráfico ao lado mostra o percurso da viremia do

vírus e o percurso do TCD4. Repare que são inversamente
proporcionais: à medida que aumenta o TCD4 se consegue
controlar a viremia e à medida que vai decaindo o TCD4,
tem-se o aumento da viremia. Para analisar o TCD4 é
fundamental que sejam técnicas quantitativas para
determinar sua presença, quanto à carga vira, ela pode ser
semi-quantitativa ou quantitativa. Em um indivíduo
diagnosticado, esses dois parâmetros são importantes.

Marcadores

No HIV se tem marcadores moleculares, antígenos e anticorpos. O primeiro a aparecer é o RNA viral.
O vírus do HIV é um retrovírus. Em seu genoma há RNA, e uma enzima chamada de transcriptase reversa
que constrói uma fita de DNA complementar, a partir
do molde de RNA, e se integra ao DNA humano.
O segundo marcador é o p24 do cerne viral. Em
seguida, se tema IgM e IgG (na verdade, no diagnóstico
não se busca diferenciá-las, pois pode ocorre que se em
uma fase onde a IgM já tenha desaparecido e ela sofre
influência do fator reumatoide, logo se for identificar, que seja IgG). O anticorpo contra o HIV vai
permanecer durante a fase de latência clínica. É importante usar o anticorpo como diagnóstico, porque pode
ser que ele não tenha viremia, mas pode ser que ele tenha anticorpo.

Classificação de Fiebig:Sistema de Estagiamento Laboratorial da infecção recente pelo HIV

A janela imunológica é o tempo decorrido entre a infecção e o aparecimento ou detecção de um

marcador da infecção, seja ele RNA
viral, DNA proviral, antígeno p24 ou
anticorpo. Em outras palavras, é o
período em que nenhum teste
disponível no mercado consegue
detectar um dado anticorpo. Quando
se está trabalhando com marcador
molecular/marcador antigênico, o
Ministério sugeriu a utilização do
termo janela diagnóstica.
A janela diagnóstica para RNA é de 10 dias, ou seja, a partir do 10º dia se consegue detectar RNA
viral. O p24 é o primeiro a ser apresentado na circulação, em torno do décimo sexto dia. Em outras palavras,
por volta de 10 dias temos o aparecimento do marcador molecular e em 16 dias, o p24.
Na tabela é expresso o ELISA de 3ªgeração e Western Blot. O ELISA 3ª geração detecta anticorpos
contra HIV 1 e 2, conseguindo detectar em torno de 21 dias. Ele pode ser tanto indireto como sanduíche. Ou
seja, se tem 21 dias de janela imunológica e ele não é 100% específico. O Western Blot consegue detectar a
partir do 30º dia, ele é o padrão ouro de detecção, pesquisando anticorpos contra proteínas de diferentes
pesos moleculares, sendo obrigatoriamente de dois grupos gênicos, um deles obrigatoriamente do
envelope.
Resumidamente o tempo de janela diagnóstica é: RNA -> 10 dias; p24-> 16 dias; Anti-HIV 1 e 2-> 21
dias; ELISA 4ª geração-> 16 dias; Western Blot->30 dias. A produção de anticorpos é em torno de 21 dias, a
partir daí, os testes sorológicos de 3ª geração, pelo menos, já estão pronto pra detectar os anticorpos nos
indivíduos.
Em relação aos indivíduos, 95% deles até o 3º mês já têm que ter produzido anticorpo. Entretanto,
uma porcentagem pequena de 5% vai ter uma produção tardia (nesse caso o ELISA não consegue detectar).
Isso é um problema, porque esse indivíduo vai ter uma pior evolução, rapidamente evoluindo para AIDS.
Vale destacar que embora a janela do p24 seja
pequena, podendo ser vista 24h depois do quadro agudo,
ele só está presente em cerca de 20 a 30% dos pacientes. Ou
seja, se você usar o ELISA p24 sozinho, você corre o risco de
perder 70- 80% dos pacientes, pois a sensibilidade
diagnóstica é muito baixa. O percurso do p24 é similar ao
dos outros marcadores moleculares, pois ele aparece na
fase aguda, desaparece na fase latência e quando ele
reaparece, já está na fase de replicação viral, significando
que o paciente está indo pra fase sintomática.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
O ELISA é um teste de triagem. Ele pode ser
colorimétrico ou de quimioluminescência, apresenta 100% de
sensibilidade diagnóstica, passado os 21 dias. Ele não
confirma, pois existe falsa-positividade, não apenas por reação
cruzada com o H1N1. Existem relatos que pacientes com
hepatite e hipergamaglobulinemia que podem acabar dando
falso positivo no ELISA. Ou seja, o ELISA não pode ser realizado
como teste confirmatório ou mesmo ser liberado um
resultado positivo só com o ELISA.
O teste confirmatório é o Western Blot: padrão ouro.
Além desse, o Imunoblotting e o PCR também são
confirmatórios.
Há ainda o teste rápido por imunocromatografia.

ELISA

A 1ª geração do ELISA era feito a

partir de cultura de vírus em células e gerava
resultado falso positivo. Então ele foi
colocado de lado, e na 2ª geração já passou a
ser utilizando peptídeos recombinantes
sintéticos. Entretanto, só era usado para
detectar anticorpos anti HIV-1.
A 3ª geração, da qual hoje dispomos,
é usada para pesquisa de anti HIV- 1 e anti
HIV-2 específicos, sendo recombinantes ou
sintéticos. Pode ser um ELISA indireto, colocando o HIV-1 e o HIV-2, em seguida o soro do paciente e depois
se revela com anti-IgG ou anti-imunoglobulina total marcado. Existe também a possibilidade de pesquisar o
anticorpo por meio do ELISA sanduíche colocando o HIV-1 e HIV- 2, colocaria o soro do paciente (que
supostamente contém anticorpo)0 e revelaria com antígeno HIV-1 e HIV-2 marcado.
O tratamento para o HIV-1 e HIV-2 é o mesmo, mas o HIV-2 é menos patogênico e mais refratário.
Não se pode dosar o p24
isoladamente, mas se pode dosá-lo junto a
outro marcador. Na 4ª geração, foi
proposto detectar simultaneamente anti-
HIV 1 e 2 e o p24, sendo um sanduíche para
detecção de anticorpos e antígenos
simultaneamente. Caso o paciente tenha só
anticorpo, ele detecta. Caso o paciente
tenha só antígeno, detecta. Caso tenha os
dois, detecta.
TESTE RÁPIDO

Descrição do teste rápido: Existe um

suporte aonde vai esta uma membrana. Em
um determinado ponto dessa membrana vão
esta aderidos partículas de HIV – 1 ou HIV- 2,
ou os dois podem estar separados. É possível
diferenciar os dois tipos de HIV, uma vez que
existem kits que tem o HIV 1 e o HIV 2
aderidos em locais diferentes da membrana
permitindo a diferenciação deles.
Os anticorpos anti-IgG e anti-IgM vão
está aderidos na extremidade superior da membrana. Eles são marcados com ouro coloidal ou látex
colorido. O látex colorido dá a coloração rosa e o ouro coloidal dá uma coloração marrom. Na outra
extremidade (inferior), é colocado o diluente e o soro do paciente. Esse conjunto vai migrar por capilaridade.
Se o indivíduo tiver anti-HIV, o conjunto (diluente + soro do paciente) pára de fluir onde estiver o HIV
1 aderido na membrana e se o indivíduo tiver anti-HIV 2 no soro, o conjunto pára de fluir onde tem as
partículas de HIV 2 aderidas na membrana. Em outras palavras, caso o paciente tenha IgG e IgM no soro,
esses anticorpos serão capturados pelas anti-IgG e anti-IgM que estão aderidas na extremidade do teste e
irão parar de fluir. No próprio teste se tem um controle positivo que serve para validar o teste. Se o controle
não positivar significa que o teste não está funcionando. Esse teste é feito em campo, é bastante rápido
(cerca 15 min) e é chamado de imunocromatografia.
Os testes rápidos são feitos com plasma, com soro ou punção digital.
Obs: O correto em um laboratório é você ter dois testes de procedências diferentes ou de princípios
diferentes.

IMMUNOBLOT

Esse pente tem uma película onde

põe-se 1µL de anti- IgG, 1µL de HIV 1 e HIV
2. O teste vem com uma câmara composta
por varias colunas, local onde os “dentes”
do pente serão mergulhados. Em cada
coluna há um diluente.
Coloca-se em um “dente” o controle
positivo, em outro, o controle negativo e, no
outro, o soro do paciente. Homogeneíza,
deixa por alguns minutos, tira o excesso e
transfere o pente para as colunas de trás,
onde tem a solução de lavagem. Depois de lavar, se transfere para as outras colunas de trás que possui o
conjugado e se deixa por alguns minutos. Posteriormente, o pente é lavado novamente e depois se adiciona
o substrato. No final ocorrerá a revelação. Esse teste pode ser usado como confirmatório para o HIV.
 No exemplo ao lado vemos o controle interno (anti-
IgG), p24 (GAG), p31 (POL), gp120 (ENV), gp41
(transmembrana do HIV1) e gp36 (transmembrana do HIV 2).
Observe que o paciente 1, por exemplo, tem anti-p24,
anti-gp41 e anti-p31. Para se fechar o diagnóstico tem que ter
obrigatoriamente o reconhecimento de dois grupos gênicos,
sendo um o do envelope.

WESTERN-BLOT

O princípio da técnica se baseia na associação de eletroforese de proteínas em gel de alta resolução

com transferência para membranas (blotting).
O primeiro pesquisador descreveu essa técnica para detectar DNA. O nome dele era South. O
segundo pesquisador aplicou para detecção de RNA e se auto-denominou Northern. O terceiro, que fez para
detectar proteínas, se auto-denominou Western.
Essa técnica faz separação por peso molecular, sendo usada para detectar anticorpos ou proteínas
de diferentes pesos moleculares. Na rotina, é padrão confirmatório de HIV (a meta final é a busca anti-HIV),
de HTLV (infecta linfócitos T) e hepatite C.
A eletroforese é feita em gel de poliacrilamida e é feita verticalmente (eletroforese vertical). A
poliacrilamida separa polipeptídeos ou proteínas de 5 a 50 quilodaltons (faixa de peso molecular bastante
restrita), ou seja, você tem um espaço limitando para analisar a sua amostra.

Preparo do gel

O primeiro passo é construir o gel. Esse gel é resultante de uma

ligação química entre bis-acrilamida e acrilamida. Na presença de
catalisadores (persulfato de amônio) irá se formar uma “trama”, por conta
dessas ligações. Essa malha, por onde irão passar as proteínas, deve ter no
mínimo 5% e no máximo é 25%. Menos que 5% fica muito mole, e se for mais
de 25% não passa proteína alguma.
Antes de partir para a técnica, é necessário saber se a proteína de
interesse tem peso molecular alto ou baixo. Caso tenha peso molecular baixo,
se concentra a acrilamida (interessante usar a 15%), ou seja, a malha ficará
mais fechada para separar pesos moleculares mais baixos. Caso a proteína
tenha peso molecular mais alto, a tendência é que fiquem retidas na parte
superior do gel, por isso se trabalha com a malha menos concentrada
(interessante usar a 7%), de modo que serão separadas as proteínas de pesos
moleculares mais altos e as de pesos moleculares mais baixas “passarão
direto” no gel.
 Para formar o gel, é adicionada uma solução contendo bis-acrilamida, acrilamida,
persulfato e o TEMED (os dois últimos são catalisadores) dentro de um suporte de vertical,
onde ocorrerá a eletroforese vertical. O suporte é formado por duas lâminas de vidro
havendo um pequeno espaço entre elas, no qual a solução será adicionada.
Após ser aplicada a solução para formação do gel é colocado um
“pente” na parte superior do suporte, com a solução ainda líquida. Esse conjunto é deixado
em repouso por pelo 30min-1h para que o gel seja formado e solidificado, e após a retirada
do pente, é formado os poços onde serão aplicadas as amostras. No primeiro poço é
colocado o padrão de peso molecular e nos demais, são colocados o material de interesse. O
padrão de peso molecular associa o padrão/localização da banda com o peso.
Existem dois pentes: o analítico e o preparativo. O analítico forma vários pequenos poços,
enquanto que o preparativo forma apenas dois poços: um pequeno e um grande. Conforme a
necessidade é possível escolher um ou outro.
Quando se usa o pente analítico é possível escolher a melhor amostra para ser usada no
teste (analisar qual amostra tem uma separação mais efetiva das bandas). Por exemplo, ao submeter duas
amostras a eletroforese (ex: peptídeos de HIV recombinante e peptídeo sintético), com a posterior coloração
das bandas resultantes da separação com corante de prata, observou-se que na amostra X aparece uma
banda de forma mais evidente que na amostra Y. Portanto, é melhor se trabalhar com o X.
Definida a amostra a ser usada, se faz outro gel usando agora o pente preparativo. No poço menor
será aplicado o padrão molecular e no poço maior será colocado o preparado/amostra escolhido (cerca de
120µL). Ao submeter à eletroforese, serão obtidas as bandas com um maior comprimento de extensão (já
que a aplicação foi feita em apenas um poço grande/largo). Dessa vez, o material não será corado, e sim
submetido ao Blot.

Preparo da amostra

Sabemos que a eletroforese leva em consideração as cargas das proteínas possibilitando a corrida e
separação das mesmas, uma vez que são anfóteras. Entretanto, no Western Blot as proteínas são separadas
por peso molecular. Para que as diferentes cargas das proteínas não interfiram no processo, as proteínas a
serem analisadas são tratadas previamente com dodecilsulfato de sódio (SDS -
detergente). Esse agente desnatura a proteína. Ele causa o desnovelamento
conferindo carga negativa uniformemente ao polipeptídeo (a carga natural da
proteína se torna desprezível). Uma vez que todas as proteínas estarão com
carga negativa, o que vai permitir a diferenciação/separação uma da outra, é
o tamanho. Essa etapa é chamada de digestão da amostra.
Em outras palavras, antes de colocá-la na eletroforese, a amostra tem
que ser digerida, ou seja, tratada com SDS. Quando na literatura encontramos
o termo SDS PAGE, quer dizer que se trata de uma eletroforese em gel de
poliacrilamida em condições desnaturantes. Além do tratamento com SDS é necessário tratar a amostra com
uma solução de β-mercaptoetanol que cliva pontes S-S. Assim, se essa proteína ainda tiver alguma
subunidade isso não vai interferir, pois com a quebra, a subunidade vai ficar separada podendo ser também
avaliada. Resumindo: A proteína analisada não é a proteína nativa, é uma proteína desnaturada!
OBS: Para amostra de DNA não é preciso digestão, pois ele já é negativo.
Transferência

Uma vez terminada a corrida de eletroforese é feita a transferência

das bandas separadas do material de trabalho (ex: proteínas do HIV) para
uma membrana de nitrocelulose. Nessa etapa se monta o chamado
“sanduiche”: a membrana de nitrocelulose fica em contato com o gel e isso é
envolvido por papel filtro e esponja de ambos os lados.
A membrana de nitrocelulose é altamente ligante de proteínas e
também pode ser guardada por meses (diferente do gel, que resseca e
quebra). Essa transferência normalmente é feita de maneira eletroforética (em uma cuba de transferência
que contém tampão, caso a transferência seja a úmido).
A membrana fica no pólo positivo e o gel no pólo negativo, assim, os polipeptídios carregados
negativamente vão migrar para a membrana que está no pólo positivo quando submetida a corrente
elétrica.
O tempo de transferência varia de acordo com o protocolo (5h-16h). Na cuba de transferência é
ainda colocado uma placa de gelo, pois esse sistema não pode ficar quente.

Trabalhando com a membrana

Uma vez que as bandas de proteínas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose, essa
membrana será submetida à reação imunológica. OBS: essa membrana pode ser corada com corantes que
saem com a água. Isso é feito só para certificar que a transferência ocorreu com sucesso.
Lembre-se que na membrana estarão as bandas de proteínas
separadas por peso molecular, e cada banda se estende horizontalmente
por grande parte do comprimento da membrana, uma vez que na
preparação do gel foi usado o pente preparativo (no primeiro poço
pequeno é colocado o padrão de peso molecular e o segundo poço largo é
onde foi aplicada a amostra).
É feito então cortes verticais na
membrana, resultando em tirinhas (cerca de 4cm) que vão conter uma parte de
todas as bandas.
No caso, foi aplicado proteínas do HIV (antígeno), após a corrida, as
proteínas foram separadas horizontalmente
(ex: uma banda é o gp160, embaixo a gp120,
embaixo a p56 e assim por diante) e transferidas para a membrana.
Quando são feitos os cortes verticais, para obtenção das tiras, em cada
tira vai permanecer as mesmas bandas só que em menor
comprimento. Uma vez obtida as tiras, cada tira é colocada
separadamente em canaletas.
Cada tira vai receber uma amostra de soro de indivíduos
diferentes. Nesse ponto é que se começa análise do teste, pois o
objetivo é saber se um dado paciente tem anticorpos contra alguns dos
antígenos presentes na membrana (ex: anti-gp160, anti-gp120...).
 OBS: Quando é feita a eletroforese das proteínas, elas vão ser dispostas em bandas no gel e isso será
transferido para a membrana. Em ambos os casos, essas bandas não são visíveis. Elas só serão visíveis caso
haja uma coloração prévia (as vezes é feita com corante que sai na agua para certificar que a transferência
ocorreu com sucesso) e caso tenha a posterior ligação dos anticorpos do soro do paciente com os
antígenos/proteínas presentes na membrana. Assim, se uma banda conhecida ficar evidenciada após a
reação imunológica, significa que o paciente tem o anticorpo contra aquele antígeno. As figuras anteriores
que representam a membrana já com as bandas evidenciadas foram colocadas para facilitar o
entendimento!

Bloqueio da membrana

Antes de aplicar a amostra de soro sobre a membrana, que contém as bandas de proteínas, é
necessário submeter a membrana a um bloqueio. Isso porque, lembre-se que o objetivo é que os anticorpos
do soro se liguem apenas em cima da banda referente a alguma das proteínas (caso o paciente tenha em seu
soro os anticorpos), mas como a membrana é altamente ligante, é preciso que haja o bloqueio dos sítios
livres (entre as bandas) para que isso não interfira na reação. Caso não haja o bloqueio, tudo estará ligado e
não será possível identificar com clareza as bandas.
O bloqueio dos sítios livres é feito com albumina sérica bovina (pode ser usado a caseína, o soro fetal
bovino...). O que mais é utilizado é o leite desnatado (ex: Leite Molico). Esse procedimento demora mais ou
menos umas duas horas e é feito em agitador gangorra ou vai e vem.
É importante salientar que além de incubar a membrana, o próprio soro do paciente também é
diluído com o leite.

Testando o soro do paciente

Uma vez que apenas os sítios referentes as bandas das proteínas (antígenos do HIV) estão
disponíveis para a ligação na membrana, se no soro do paciente existirem anticorpos contra as proteínas
presentes a membrana, ocorrerá a ligação. O anticorpo do
soro do paciente é chamado de anticorpo primário. Essa
primeira etapa de incubação é extremamente demorada
(em média 16 horas no agitador).
Posteriormente é feita uma lavagem para retirar o
que não foi ligado e em seguida é adicionado um
conjugado de anti-IgM ou, mais normalmente, anti-IgG.
Isso é chamado de anticorpo secundário. O anticorpo
secundário é marcado com peroxidase ou outro marcador.
O Western Blot colorimétrico é o convencional. Se
for usar o colorimétrico, o ideal é usar a fosfatase alcalina,
enzima muito mais sensível que a peroxidase, mas também pode ser feito o Western Blot
quimioluminescente. Caso seja usado o quimioluminescente, a peroxidase é usada, sendo seu substrato o
peróxido de hidrogênio, e tendo a presença do luminógeno. No caso da fosfatase alcalina, é usado o BCIP
(Bromo Cloro Indolil Fosfato) e o NBT (Nitroblue Tetrazolium). A fosfatase alcalina ataca o bromo cloro
indolil fosfato, o NBT se reduz na presença desse produto e revela uma cor roxa.
 O resultado sai positivo se caso houver reação com dois
grupos gênicos, sendo um necessariamente o do envelope (anti-
gp160, anti-gp120, anti-gp41(HIV1), anti-gp36(HIV2). O anti-p24 acaba
aparecendo quase sempre porque é imunogênico. Mas, quando
aparece apenas o anti-p24 não fecha o diagnóstico de HIV, ele sai
como indeterminado.
No exemplo da figura ao lado veja: a tira 1 é o controle
positivo onde estão expressas a identificação das proteínas do HIV por
localização da banda. A tira 2 é de um paciente X. Vemos que estão
evidenciadas as bandas referente a gp160, gp120, gp55, gp56, gp51,
p31 e p24. Ou seja, esse paciente tem em seu soro anti-gp160, anti-
gp120, anti-gp55 e assim por diante. No caso, ele recebe resultado
positivo pois apresenta reação para dois grupos gênicos, incluindo o
do envelope. Já a tira 4, referente a um paciente Y, sai como resultado
indeterminado, pois apresentou apenas anti-p55 e anti-p24. Nenhum
deles é do envelope.

Resumidamente
FLUXOGRAMAS PARA DIAGNÓSTICO
Esse é o fluxograma
convencional de diagnóstico de HIV
(acima de 18 meses). Se usa amostra
de soro do plasma (não pode ser
punção digital) e é feito ELISA de 3ª
geração, cuja janela imunológica é de
21 dias. Pode ser usado também um
de 4ª geração. Se amostra der não
reagente, para HIV, é preciso se
certificar ainda que não tenha tido
risco de contágio no período de 21 dias
da janela imunológica. Caso tenha tido
o risco, é importante que se aguarde
um tempo.
Se a amostra der reagente,
parte para o teste confirmatório que
pode ser o Western-Blot, o
Imunnoblot ou o imunnoblot rápido.
Nessa análise, se o resultado der
reagente, a amostra é reagente para
HIV se tiver acima de 5000 copias, caso
contrário sai como indeterminado. Se
der negativo é feito o teste molecular (PCR), dando este negativo, sai também como indeterminado para
HIV.

Ao lado há uma adaptação do

fluxograma anterior.
Testes rápidos no diagnóstico do HIV

Fluido oral – detecção de anti-HIV

Se este teste der negativo, libera a amostra como não reagente. Se o teste der positivo é necessário
confirmar fazendo um teste rápido no sangue. Deve-se tomar cuidado pois o guia do Ministério há falando
sobre a possibilidade de haver uma janela imunológica de até três meses.
ACOMPANHAMENTO LABORATORIAL DE HIV
Uma vez que o indivíduo está devidamente diagnosticado, dois parâmetros são importantes para
acompanhar o paciente: contagem de linfócito TCD4 e carga viral.
Existe uma dúvida sobre o fato da contagem de TCD4: ela serve para acompanhar indivíduos
infectados com HIV ou com AIDS? Até o ano retrasado, se considerava até 500 células de TCD4/ml como o
ideal para começar o tratamento. Atualmente, o médico sugere ao paciente que ele faça o tratamento no
momento do diagnóstico, independente da contagem de TCD4, trata-se, portanto, de uma grande
responsabilidade para o paciente por que ele quem vai decidir sobre o tratamento. Pode ser que isso mude
com o tempo, pois o manejo terapêutico do HIV é revisado a cada dois anos.
Existe muita controversa. Com 350 células o paciente já está muito perto de chegar em AIDS, pois
abaixo de 200 células já é AIDS. Foi visto que 350 é um ponto de corte bom, mas o de 500 células é mais
seguro, sendo melhor ainda. A medida que a pessoa está fazendo o tratamento, a presença do fármaco vai
fazer uma pressão sobre o vírus. O vírus vai ou não sofrer mutação. Essa mutação pode levar a um vírus
inviável, mas, ocasionalmente pode acabar levando a produção de um vírus que é resistente àquele fármaco,
com isso vai perdendo a susceptibilidade. É por conta disso que sempre se protelou ao máximo o
tratamento.
Então se questiona: Se o indivíduo está assintomático, qual é a necessidade de ele começar o
tratamento assim que é diagnosticado? De qualquer forma, o tratamento também tem outros efeitos, como
as várias reações adversas. Pensado por esse lado, será que o médico deve levar essa responsabilidade
sozinho? Por isso que devemos pensar sobre isso. O caso da profilaxia também é algo para se pensar, uma
vez que o paciente faz o tratamento antes mesmo de ter a infecção.
OBS: Lembre-se da diferença entre HIV e AIDS. O paciente estando assintomático, o HIV passa a ser
AIDS quanto estiver abaixo de 200 células/mm3 de TCD4. Se o paciente tiver uma doença definidora de AIDS,
(por exemplo, sarcoma de Kaposi ou doença por Pneumocystis jiroveci, doenças que estão nitidamente
relacionadas com a AIDS), então o indivíduo já é considerado na condição de AIDS, mesmo que ele esteja a
acima de 200 células TCD4. A conduta é a mesma, você começa com um esquema básico (TARV) e a carga
viral é acompanhada.
Outro ponto que é discutido é quando a contagem de TCD4 e da carga viral para avaliar a adesão e
desenvolvimento de falha terapêutica. Hoje, é extremamente questionado a validade da contagem de TCD4
ao longo do tempo. Antes, a cada três ou seis meses se fazia a quantificação de TCD4 e a carga viral. Alguns
pensam que apenas se guiar pela viremia é um bom parâmetro, outros acreditam que não. Pela nossa
experiência, o ideal é seguir os dois. O TCD4 dá sim um parâmetro de como está a pessoa, a questão é por
que custa caro seguir acompanhando os pacientes dosando o TCD4.

Citometria de Fluxo

A quantificação de TCD4 sempre deve ser por métodos

quantitativos e para isso se utiliza a técnica de citometria de fluxo.
No equipamento se tem uma coluna, em que passa uma célula
por vez, havendo em um determinado a incidência de uma raio laser
em cada célula que vai passando. Quando um raio laser incide sobre a
célula, a célula vai promover uma dispersão dessa luz, chamada de
dispersão frontal (forward scatter). Isso diferencia o tamanho da célula.
 Ocorre ainda uma dispersão a 90° (side scatter) que vai diferenciar em termos de granulosidade da
célula. O citômetro mais simples vai fornecer pelo menos dois
parâmetros: um em termos de tamanho e outro de granulosidade. Além
disso, quais mais canais de florescência um citômetro tiver, mais
complexo ele será. Nesses canais de fluorescências estão posicionados
espelhos dicroicos (cristais da natureza que refletem a luz em um
determinado cumprimento de onda e deixam passar outro).
Assim, a citometria de fluxo é uma técnica que emprega a
fluorescência e serve para caracterizar células em diferentes fases de
maturação e diferenciação, diferenças de subpopulações de células, etc.
Na prática, se pega uma alíquota de sangue com heparina e adicionam anticorpos. No nosso caso em
questão se quer saber se o paciente tem TCD4, logo é colocado o anti-TCD4. Veja que “CD” (clusters of
differentiation) são moléculas que caracterizam a célula. Sabemos que existem anticorpos anti-CD4, anti-
CD8 e anti-CD3, portando se for colocado o anti-TCD4 marcado com fluoresceína e o anti-TCD8 também
marcado com fluoresceína, os dois vão emitir fluorescência em verde e não será possível distingui-los. Logo,
deve-se usar outro fluorescente como a rodamina que emitirá vermelho, ou outro com eritrina que floresce
em laranja.
As misturas dos os anticorpos marcados com fluorocromos associados as células do sangue, são
incubadas por determinado tempo e depois as hemácias são lisadas e as células são submetidas a passagem
na coluna para serem analisadas no citometro de fluxo.
Inicialmente será gerado um gráfico com tamanho versus
granulosidade, sendo possível quantificar quanto de células se tem naquela
alíquota usada no teste e quais são as células (veja na figura a direita).
Como houve a incubação com anticorpos marcados, pode ser
gerado outro gráfico que vai quantificar cada marcador, ou seja, é possível
relacionar o marcador com a célula
que se quer quantificar (veja figura a
esquerda).
No gráfico a esquerda, é
delimitado o que é negativo para CD4
(linha horizontal) e o que é negativo
para CD8 (linha vertical). Assim sendo, o 31% é duplo negativo, o 1% é
duplo positivo, 44% é positivo para CD4 e 23% positivo para CD8.
TESTES DE BIOLOGIA MOLECULAR
Os testes de Biologia Molecular têm como objetivo:
 Determinar a carga viral na evolução do HIV;
 Diagnóstico em recém-nascido e crianças abaixo de 18 meses de idade, pois o anticorpo
materno passa, assim, é preciso utilizar métodos de Biologia Molecular para detectar o HIV;
 Confirmação de diagnóstico de HIV (já discutida anteriormente);
 Banco de Sangue, porque diminui a janela diagnóstica;
 Avaliar a resistência viral aos fármacos (genotipagem);
 Também é usado em casos de resultados indeterminados da sorologia, principalmente
gestantes.

Dentre os testes de Biologia Molecular podemos citar 3: O Branched DNA (não amplifica material
genético), o RT-PCR e o NASBA (ambos amplificam material genético).
Na Biologia Molecular se usam três características do DNA:
1. Desnaturação -> Se submetermos o DNA ao calor, como 95°C, ou a um pH alto, vai acontecer
a desnaturação do DNA (separação das fitas complementares);
2. Anelamento (hibridização e complementariedade) -> Se você diminuir a temperatura para
60°C e diminuir o pH de 9 para 7, as fitas voltam a se anelar;
3. Extensão -> Se colocarmos nucleotídeos e polimerase, a fita de DNA pode ser estendida.

PCR

O PCR (Reação de Cadeia e Polimerase) se utiliza das três características do DNA discutidas
anteriormente (desnaturação, anelamento, extensão).
Nunca se sabe o quanto se tem de cópia do material alvo na amostra, pode haver muito ou pouco.
Dessa maneira, é necessário amplificar aquilo que interessa para ajudar na identificação. Assim, o PCR é uma
técnica de amplificação do material nucléico. Para tanto, é preciso conhecer o genoma do alvo.
Se conhecemos uma sequência gênica específica de um patógeno (hoje temos os bancos de genes,
que facilitam esse procedimento), podemos obter o chamado primer. O primer é uma sequência que é
similar a aquilo que o patógeno possui, de modo
que a conhecendo, o analista manda construir o
primer. O primeiro ponto do procedimento é
separar a amostra e desnaturá-la. O analista
submete a amostra a uma desnaturação e vai
ocorrer a separação em fitas simples. Feito isso,
coloca-se o primer na solução e, se houver
pareamento/complementariedade, quando baixar
a temperatura, vai haver o anelamento.
Lembrar que em uma fita de DNA há a
sequência 5’ → 3’ e a sequência 3’ → 5’. Essa é uma
informação necessária para a síntese do primer.
Após o primer encontrar o análogo, local
onde vai haver a complementariedade, é
adicionado a DNA polimerase. A polimerase que os
 analistas mais usam é a TAQ polimerase, uma polimerase que
tem origem na bactéria Thermus aquaticus. Após acrescentar
o DNA polimerase e os nucleotídeos, o restante da fita será
construída.
Observe que começou com uma fita e terminou com
duas, a isso chamamos um ciclo de amplificação. Um ciclo de
amplificação se resume a desnaturação, anelamento e
extensão. Tudo isso acontece em um termociclador, que
permite variação de temperatura em um intervalo pequeno de
tempo. Alguns ciclos são necessários para que, ao final,
tenhamos um produto que consigamos quantificar, visualizar. Ou seja, o PCR é útil para a amplificação do
DNA, sendo um meio para o exame de diagnóstico, pois ele permite “visualizar” o alvo na amostra, que às
vezes é muito pequeno sendo necessário amplificá-lo.
Ao final, após obtermos o produto da amplificação, submetemos esse produto a uma eletroforese,
de agarose ou poliacrilamida, e se é observado comparando com o padrão de pares de base. Na agarose, os
analistas usavam brometo de etídio. Hoje, a recomendação é que não se utilize mais, mas se adicionem
corantes que sejam fluorescentes. Na poliacrilamida, os analistas usam o nitrato de prata.
Resumidamente: Inicialmente, nós temos o alvo, a sequência que nos interessa, chamado de DNA
template (DNA inicial, aquilo que queremos amplificar). Se tivermos na amostra do plasma o vírus da
Hepatite B, ali haverá meu DNA template. O DNA template (alvo), o DNA polimerase, os primers e os
nucleotídeos são submetidos ao termociclador e, no final, obtemos os produtos de PCR, chamados de
amplicons (amplificação do DNA Template).
A TAQ polimerase é utilizada somente em PCRs em que o alvo é um DNA. Quando trabalhamos com
RNA, como é o caso do HIV, temos que adicionar uma transcriptase reversa e não utilizamos a TAQ
polimerase. Podemos utilizar o Tth, uma enzima de uma bactéria chamada de Thermus thermophilus, que é
uma transcriptase reversa. Ao ser adicionada a transcriptase reversa, esta vai construir o DNA complementar
(cDNA). O cDNA é submetido ao PCR. A isso, chamamos de RT-PCR
(Transcriptase Reversa). Cuidado: RT-PCR é a mesma nomenclatura de
PCR em tempo real.
O PCR em tempo real é aquele em que se acompanha ciclo
por ciclo e usa-se a fluorescência para a detecção. O corante mais
utilizado é o SYBR Green, onde toda vez que há a duplicação do DNA,
o corante se liga, se intercala, e há a emissão de fluorescência,
permitindo que o ciclo de amplificação seja acompanhado passo a
passo. OBS: Esse é chamado de RT-PCR (Real Time-PCR) diferente do
RT-PCR (transcriptase reversa).
No banco de sangue, se justifica o uso do PCR por conta da
diminuição da janela diagnóstica (os analistas observam que é a maior
vantagem do uso da biologia molecular). É empregado ainda para HIV, HVC e HVB (tem janela imunológica
grande). A Hepatite C é o que tem maior janela imunológica, ou seja, o indivíduo demora muito mais para
produzir anticorpos.
Branched DNA

O Branched DNA é uma técnica que usa apenas a propriedade de desnaturação e anelamento. Não
ocorre a terceira etapa de amplificação. Nessa técnica, temos o material template, que pode ser DNA ou
RNA, e o primer. Mas, nesse caso, o primer é marcado, o que é chamado de sonda e há
várias sondas ramificadas, por isso é denominado de Branched DNA. Assim, o sinal
emitido aqui é muito maior, ou seja, a sensibilidade dessa técnica é muito maior.
A vantagem dessa técnica é que não se corre o risco de amplificar aquilo que
não nos interessa. Pois nas técnicas comuns, embora seja adicionado um primer
específico, no final, pode ser obtido um material amplificado que não interessa. Quando se retira essa
terceira etapa, amplifica-se o sinal, aumenta a sensibilidade analítica da técnica de tal forma que não precisa
amplificar a amostra.

NASBA

NASBA é outra técnica também utilizada para HIV, que significa Nucleic acid sequence based
amplification. É uma técnica de amplificação
isotérmica, ou seja, não usa o termociclador.
O material template é um RNA.
Primeiro adiciona-se o primer que
anela com o RNA template e adiciona-se
também uma transcriptase reversa e os
nucleotídeos, assim o DNA complementar
será construído. Coloca em seguida uma
RNAse que vai digerir o RNA template.
Depois adiciona-se o segundo primer
para anelar com a fita complementar. Essa
mesma transcriptase reversa comporta-se
também como polimerase, assim, na presença de nucleotídeos, ela constrói o restante da fita. No final,
coloca-se uma RNA polimerase para, a partir das fitas construídas, formar as fitas de RNA.
Nesse procedimento é usado apenas enzimas, não está usando a temperatura. Pode ser que uso de
enzimas garanta especificidade a depender do kit.

Monitorização terapêutica

É importante monitorar a carga viral do HIV a cada 3 – 4 meses. Isso acontece, na prática, apenas no
início e depois acaba sendo anual. O ideal é que a monitorização seja feita duas vezes por ano a partir do
segundo ano de tratamento.
É importante, quando se pensa em Biologia Molecular, que se use uma mesma técnica, diferente da
sorologia. É preciso que seja feito pela mesma técnica e pelo mesmo laboratório, porque as técnicas não têm
compatibilidade entre si, ou seja, pode dar um resultado em um determinado teste e outro resultado em um
teste diferente, por isso é importante que o analista use sempre as mesmas técnicas.
 O aumento ou diminuição da carga viral em 3 vezes é
considerado significativo. Ou seja, em exemplos de variação
entre exames de carga viral (ver tabela ao lado), três vezes
acima ou abaixo do valor basal são considerados
significativos. Normalmente se libera os resultados em log na
base 10 (log10).
Quando o
indivíduo está com
uma carga viral
baixa, ele demora
mais para progredir
para a AIDS. No gráfico ao lado é mostrado a proporção de
sobreviventes sem AIDS e tempo de infecção. Mostra que uma
carga viral elevada a porção de sobrevida sem AIDS é muito menor,
ou seja, o indivíduo chega rapidamente à AIDS quando ele está com
uma carga viral elevada.

Genotipagem HIV

Espera-se que a carga viral se torne indetectável em 3 meses, quando há uso de TARV. Se não
ocorrer essa diminuição, o paciente vai sendo acompanhado e a amostra é submetida à genotipagem.
A genotipagem detecta mutações no gene alvo em que o fármaco atua. Se o indivíduo estiver
tomando os inibidores de protease e de transcriptase reversa, serão esses genes alvos que serão
investigados (pode acontecer de ser em outros genes). Há ainda novos alvos como o gene da gp41 e
integrase. Portanto, é preciso saber quem são os alvos terapêuticos.
O fármaco induz uma pressão sobre o vírus e acaba levando a uma mutação. Essa mutação, por
muitas vezes, leva a uma geração de vírus que são inviáveis, mas, ocasionalmente, o vírus pode se tornar
resistente ao fármaco. A genotipagem informa quais anti-retrovirais não devem ser usados. Assim, se o vírus
tem mutação em uma dada região, aquele anti-retroviral, específico para aquela região, não deve ser usado.
Para detectar esse vírus, na amostra deve haver uma carga viral superior a 1000 cópias/mL, ou seja,
não é detectado em carga viral baixa. Além disso, o paciente deve estar sob uso de TARV, se não o vírus fica
inaparente.
A única condição em que o ministério indica a realização da genotipagem antes do tratamento é em
gestantes infectadas pelo HIV, em pessoas que tenham se infectado com parceiro em uso de TARV e em
crianças antes de iniciar a TARV.

Procedimento da genotipagem: Coleta-se o sangue, extrai-se o RNA, sintetiza o DNA complementar (cDNA) e
amplifica os genes alvo terapêuticos. Após isso, faz-se o sequenciamento e compara-se com o gene selvagem
(gene não multado). Já existem mapas que indicam que em uma certa localização o anti-retroviral já não
pode mais ser administrado.
Diagnóstico Molecular em crianças abaixo de 18 meses de idade

Faz-se o primeiro teste, se for detectável, tem

que ser coletada uma nova amostra e fazer um segundo
teste (isso mostra que só podemos diagnosticar uma
criança com HIV se ela tiver duas amostras com carga
viral detectável).
Caso o resultado esteja abaixo do limite de
detecção, é sugerido que se espere até os 4 meses de
idade, para garantir de fato que a criança tenha carga
viral. Nesse terceiro teste, caso seja detectável, pode ser
fechado o diagnóstico (a criança realmente está
infectada). Nesse terceiro teste, se a criança estiver
abaixo do limite de infecção, a criança não está infectada.
Resumindo: A condição para determinar que uma
criança esteja realmente infectada é duas amostras com
carga viral detectável. A condição para determinar que a
criança não está infectada é carga viral indetectável em
duas amostras, sendo que a segunda seja depois de 4
meses de idade.

Se no primeiro teste tiver dado abaixo do limite de

detecção, sugere-se que aguarde a criança chegar aos 4 meses
de idade para a realização do segundo teste. Se no segundo teste
der detectável, não pode ser liberado, sendo necessária a coleta
de uma nova amostra. Se esta tiver detectável, a criança está
infectada se em um terceiro teste também for detectável. Se no
segundo teste der abaixo do limite de detecção, a criança não
está infectada, pois o primeiro teste também deu abaixo do
limite de detecção.
Lembrando que, para o diagnóstico de crianças acima de
18 meses de idade, é realizado a pesquisa de anticorpos anti-HIV
segundo o protocolo discutido anteriormente. E nesse caso a
infecção é excluída se tiver uma amostra negativa, utilizando o
fluxograma do Ministério da Saúde.

Obs.: Amamentação é considerada nova exposição ao HIV.

O Teste do pezinho é feito entre 3 e 30 dias de idade de vida. Nele se pesquisa IgM, sendo um
rastreio sorológico, não se trata de um diagnóstico. Serve como pesquisa para Toxoplamose congênita, Sífilis
congênita, Citomegalovirose congênita, Doença de Chagas congênita, Rubéola congênita e HIV-1/-2
congênita.