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INNOVATION

Techniques émergentes d’analyse


de l’eau utilisant du matériel
biologique

par Florence LAGARDE


Chargée de recherche au CNRS
et Nicole JAFFREZIC-RENAULT
Directeur de recherche au CNRS
Présidente du Club Microcapteurs Chimiques (CMC2)

Résumé : Il existe à l’heure actuelle une forte demande pour des méthodes d’analyse
rapides et peu coûteuses permettant le suivi des polluants chimiques présents dans
l’environnement et l’évaluation de leurs effets toxiques. Certains outils biologiques à base
de cellules, d’enzymes, d’anticorps ou d’ADN s’avèrent prometteurs, en complément ou
en alternative aux méthodes chimiques classiques. Dans cet article, nous évoquerons
plus particulièrement le cas des biocapteurs et des biosorbants (principes, avantages,
limitations, application à l’évaluation de la qualité des eaux, nouvelles tendances).
Abstract : There is currently an increasing need for fast and cost-effective analytical
methods suitable for water pollutants monitoring and toxicological impact assessment. In
this context, some biological tools based on whole cells, enzymes, antibodies or DNA
appear as excellent alternatives or complementary techniques to classical chemical
methods. This article will be more particularly focused on biosensors and biosorbents (prin-
ciples, advantages and limitations, application to water quality assessment, new trends).
Mots-clés : Qualité des eaux, analyse environnementale, polluants chimiques, toxi-
cité, biocapteurs, biosorbants
Keywords : Water quality, environmental analysis, chemical pollutants, toxicity, bio-
sensors, biosorbents

Points clés
Domaine : Techniques d’analyse
Degré de diffusion de la technologie : Emergence | Croissance | Maturité
Technologies impliquées : biocapteurs ; biosorbants
Domaines d’application : environnement
Principaux acteurs français :
Pôles de compétitivité : Axelera (Rhône-Alpes)
Centres de compétence : Laboratoire des Sciences Analytiques, UMR 5180, Uni-
versité Claude Bernard Lyon 1 ; Département de Chimie Moléculaire, UMR CNRS
5250, Université Joseph Fourier Grenoble ; Centre de Phytopharmacie, IMAGES EA
4218, Université de Perpignan ; Laboratoire Sciences Analytiques, Bioanalytiques
et Miniaturisation PECSA UMR 7195 ESPCI ParisTech ; IFREMER Centre de Brest ;
Laboratoire CBAC UMR 6144, IUT de La Roche sur Yon ; GEMBAS, UMR 5246 Uni-
versité Claude Bernard Lyon 1
Autres acteurs en Europe : un grand nombre de laboratoires ou centres de
recherche travaillent dans le domaine des biocapteurs et biosorbants. Leurs tra-
vaux sont mentionnés en bibliographie. En ce qui concerne les acteurs industriels,
on peut citer au niveau européen les sociétés Biacore (Suède), Windsore Scientific,
Affinity Sensors, Remedios, Euroclon Ltd, Universal Sensors (UK), XanTec Bioana-
lytics GmbH, BioTul AG et Dr Bruno Lange GmbH (Allemagne) pour les biocap-
teurs, R-Biopharm AG (Allemagne) et Randox Laboratories Ltd (UK) pour les
supports d’immunoaffinité.

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1. Contexte 2.1.2 Transduction électrochimique


Les capteurs électrochimiques sont classés selon leur mode
L’industrialisation intensive ainsi que les utilisations agri- de transduction : potentiométrique, ampérométrique,
coles et domestiques d’un nombre croissant de produits conductimétrique ou impédimétrique. Le principe de base
chimiques ont conduit à la dissémination de nombreux d’une mesure électrochimique repose sur le fait que certaines
composés toxiques dans l’environnement, à l’origine d’une substances électroactives en solution (molécules ou ions)
pollution des écosystèmes aquatiques. En Europe, la directive peuvent échanger des électrons avec une électrode, cela dans
cadre sur l’eau DCE 2000/60/EC impose la connaissance et le des conditions analytiques bien définies en particulier par le
suivi d’un nombre important de substances dites prioritaires potentiel auquel cet échange a lieu. Les différents principes
avec pour objectif un retour au bon état chimique et écolo- exigent toujours une conception spécifique de la cellule élec-
gique des masses d’eau pour 2015. La mise en place de pro- trochimique. Une revue récente a été consacrée aux biocap-
grammes de suivi et de traitement efficaces nécessite teurs électrochimiques (principes et architectures) [1].
l’utilisation de méthodes d’analyse complémentaires :
2.1.2.1 Transduction potentiométrique
– des méthodes de screening à haut débit, rapides et à Les électrodes sélectives existantes mettent en jeu des
faible coût, capables de prévoir les effets biologiques dange- équilibres d’échange d’ions An+ aux interfaces entre le milieu
reux (toxicité globale, génotoxicité ou œstrogénicité) des de mesure et une membrane constituée d’un matériau
mélanges de polluants présents dans les eaux ; conducteur ionique (électrolyte solide inorganique ou orga-
– des méthodes d’analyse classiques basées sur la sépara- nique, membrane liquide). La nature de l’ion échangé dépend
tion chromatographique des polluants (LC/MS, LC/MS/MS, du matériau constituant la membrane (exemple : verres spé-
GC/MS ou ICP-MS), plus lourdes à mettre en œuvre, permet- ciaux pour les ions H+, solide ionique pour les ions halo-
tant de réanalyser les échantillons positifs afin d’identifier les génures, polymère avec ionophore spécifique inclus pour
composés responsables. Un certain nombre d’entre elles sont d’autres ions). Pratiquement, on détermine une différence de
des méthodes normalisées de laboratoire. Cependant, compte potentiel Ep qui s’établit entre une électrode de référence et
tenu des limites de détection toujours plus basses à atteindre, l’électrode sélective, à courant nul.
et de la complexité des échantillons, elles peuvent devenir La loi de Nernst relie l’activité de l’ion An+ et la différence de
insuffisantes dans certains cas et le développement de sup- potentiel Ep :
ports de séparation et de traitement de l’échantillon plus
sélectifs ainsi qu’une pré-concentration des analytes devient
RT
nécessaire. Ep = E 0 + × ln aAn+ (1)
nF
Les techniques biologiques, telles que les bioessais, les bio-
capteurs ou les biosorbants peuvent répondre à ces différents avec E0 constante de l’électrode sélective,
besoins. Les bioessais ont fait l’objet de nombreux dévelop- aAn+ activité de l’ion An+.
pements par le passé et beaucoup sont actuellement
commercialisés. Ce type d’outil ne sera donc que très rapide- Les transistors à effet de champ de type ISFET (Ion Sensi-
ment évoqué dans cet article. Ce dossier aura pour but princi- tive Field Effect Transistor ) constituent une classe de trans-
pal de faire le point sur les biocapteurs et les supports ducteurs potentiométriques. Le principe a été proposé pour la
biologiques, leurs avantages, leurs domaines d’applicabilité et première fois par P. Bergveld en 1970. Il s’agit d’une
les limitations éventuelles qui freinent actuellement leur combinaison de deux composants : le transistor MOSFET
commercialisation. Le lecteur pourra se référer aux (metal oxide semiconductor field effect transistor ) associé à
nombreuses revues consacrées à ces différents aspects et qui un film mince d’un matériau conducteur ionique. Actuel-
seront mentionnées dans les différentes parties du dossier. lement, seul le capteur ISFET permettant la mesure du pH est
commercial. Par dépôt d’enzymes ou de bactéries, il est
Nota : à voir : Dossier Techniques de l’Ingénieur [P 3 900]. possible de suivre des réactions enzymatiques ou méta-
boliques génératrices d’ions H+ [2].
Nota : à voir : Dossier Techniques de l’Ingénieur [P 360].
2. Biocapteurs
2.1.2.2 Transduction conductimétrique
La conductimétrie est une technique électrochimique alter-
2.1 Principes et différents modes native à l’ampérométrie et à la potentiométrie. Son principe
de transduction repose sur la mesure de la conductivité électrique d’une solu-
tion électrolytique contenant des charges électriques mobiles,
constituées par l’ensemble des ions. Pratiquement, la mesure
2.1.1 Principes de la conductance d’un électrolyte s’effectue en immergeant
dans la solution une cellule de mesure comprenant deux élec-
trodes soumises à un signal électrique, généralement alterna-
Un biocapteur est un dispositif électronique qui sert à tif et de fréquence choisie pour minimiser les effets dus aux
transformer une interaction biologique en un signal élec- polarisations.
trique. Ce dispositif est basé sur l’accouplement spatial La conductance électrique G, inverse de sa résistance, est
direct d’un composé biologiquement actif immobilisé, proportionnelle à la surface S de la section perpendiculaire à
appelé « biorécepteur » ou « élément de reconnaissance la direction du courant et inversement proportionnelle à sa
biologique », avec un transducteur qui agit en tant que longueur. Elle est donnée par l’équation suivante :
détecteur et un amplificateur électronique.
γS
G= (2)
Nota : à voir : Dossier Techniques de l’Ingénieur [F 4 010]. 

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avec γ (S · cm–1) conductance spécifique ou conductivité,


caractéristique du milieu, Branche de référence
Couche de gaine
S (cm2) surface,
 (cm) longueur. Source
de lumière Détecteur
S et  sont déterminées par étalonnage dans une solution de
conductivité connue.
Des microélectrodes conductimétriques constituées d’élec-
trodes interdigitées sont maintenant utilisées pour la réalisa-
tion de biocapteurs de type enzymatique [3]. Branche sensible

2.1.2.3 Transduction impédancemétrique Figure 1 – Schéma de principe d’un capteur à base


d’interféromètre Mach-Zehnder
Le principe de ce type de capteur électrochimique repose
sur la mesure de l’impédance d’une cellule électrochimique par
la technique de spectroscopie d’impédance. Cette technique cœur. Ce système peut fonctionner en réflexion ou en trans-
permet de contrôler le processus de transfert de charges à mission. L’immobilisation du biorécepteur est généralement
l’interface électrode/électrolyte. Pratiquement, la mesure de réalisée par adsorption ou fixation covalente sur une
l’impédance s’effectue dans une cellule à trois électrodes, une membrane, ou confinement derrière une membrane
électrode de travail sur laquelle est déposé le biorécepteur, semi-perméable. Les biocapteurs à fibre les plus classiques
une électrode de référence et une électrode auxiliaire. Une sont basés sur des mesures d’absorption, de fluorescence ou
tension sinusoïdale de faible amplitude, imposée entre l’élec- de luminescence [6]. D’autres exploitent les propriétés de
trode de référence et l’électrode indicatrice, permet la mesure l’onde évanescente correspondant à la puissance lumineuse
d’un courant, de la même forme, généré entre l’électrode indi- perdue à l’interface cœur-gaine. Ces biocapteurs nécessitent
catrice et l’électrode auxiliaire. Le rapport de la tension appli- le dégainage de la fibre et sont donc plus fragiles que les sys-
quée à l’intensité du courant mesuré définit l’impédance du tèmes d’optique massive, basés sur les mêmes principes,
système électrochimique. Cette impédance peut être repré- décrits dans les paragraphes suivants.
sentée par un circuit électrique équivalent selon le type du
système (système faradique ou système non faradique). Ce
2.1.3.2 Interféromètres Mach-Zehnder
circuit permet d’exprimer les paramètres électriques qui défi-
nissent le phénomène de transfert de charges qui se produit à Ce type de capteur repose sur la perturbation de la lumière
l’interface électrode/électrolyte. Les biocapteurs impédance- se propageant dans un bras d’un guide optique. Quand une
métriques s’appliquent avantageusement à l’étude des réac- lumière se propage dans un guide d’onde optique par l’inter-
tions mettant en jeu des phénomènes d’affinité moléculaire de médiaire de la réflexion interne totale, un champ évanescent
type antigène-anticorps ou chémorécepteurs membranaires s’établit à l’interface cœur/gaine et se prolonge jusqu’au bout
car de faibles variations de conductance et de capacitance du guide. Si la surface du guide d’onde est fonctionnalisée par
peuvent être décelées à l’interface entre l’électrode et le bio- des molécules spécifiques d’intérêt, la couche sensible cause
récepteur immobilisé [4]. un changement d’indice de réfraction et la vitesse de phase du
mode guidé diminue. Dans une configuration typique de
2.1.3 Transduction optique l’interféromètre Mach-Zehnder, la lumière de guidage est divi-
sée en deux branches par l’intermédiaire d’une jonction Y. Une
Les transducteurs optiques sont variés et peuvent être branche fonctionnalisée est utilisée comme bras sensible, alors
basés sur l’effet des entités biologiques servant de biorécep- que l’autre est une branche de référence (figure 1). À la sor-
teurs sur l’absorption de la lumière, la fluorescence, la varia- tie, la lumière propagée dans les deux branches est réunie
tion de l’indice de réfraction, ou d’autres paramètres optiques. dans une deuxième jonction Y, et il en résulte une interfé-
L’obtention d’un signal lumineux peut nécessiter une fonction- rence. L’intensité de la lumière obtenue sera mesurée par un
nalisation préalable du biorécepteur ou de l’analyte cible (mar- détecteur photoélectrique. Un changement au niveau de la
quage), ce qui augmente le temps d’analyse. Certaines surface du capteur provoque un changement de l’indice de
techniques, par contre, ne nécessitent pas de marquage [5]. réfraction de la branche contenant l’élément sensible. Il en
résulte alors un changement de l’intensité de la lumière
2.1.3.1 Capteurs à fibre optique détectée. Celle-ci est proportionnelle à cos (∆n2 k0 L), où ∆n2
Une fibre optique est un guide d’onde classiquement représente la variation de l’indice de réfraction, k0 l’amplitude
constitué d’un cœur en silice d’indice optique n1 , entourée du vecteur d’onde et L la longueur de la région sensible.
d’une gaine d’indice légèrement inférieur n2 , le milieu ambiant
Ces structures sont fabriquées, soit en verre, soit en silicium
ayant un indice n0 . Les conditions de guidage de la lumière
et sont ainsi facilement intégrées dans des laboratoires sur
sont définies par :
puce [7].

n02 sin2 θ 0 = n12 − n22 (3) 2.1.3.3 Capteurs à Résonance Plasmonique


de Surface (SPR)
avec θ0 ouverture numérique de la fibre ou angle d’injection Ces capteurs reposent sur le principe physique de la réso-
limite du rayon incident. nance plasmonique de surface [8]. L’élément sensible du bio-
Certains biocapteurs à fibre sont dits ponctuels : l’effet phy- capteur est déposé sur une surface métallique recouvrant un
sique ou chimique est mesuré à l’extrêmité de la fibre où se support solide en verre fixé à la base d’un prisme
trouve déposé le biorécepteur. Le biocapteur ne fonctionne (configuration de Kretschmann). Ces systèmes permettent de
qu’en réflexion. Il existe également des biocapteurs continus mesurer en temps réel, avec une grande précision et une
pour lesquels la mesure est réalisée sur une longueur bien grande sensibilité, et cela sans marquage spécifique, les
définie de la fibre. La gaine de la fibre est éliminée sur cette caractéristiques d’interaction entre deux molécules, grâce à la
zone et la couche bioréceptrice est déposée à proximité du mesure de la variation de l’indice de réfraction au voisinage de

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l’interface. Ces capteurs ont donc été abondamment utilisés avec F0 fréquence fondamentale,
pour l’étude des interactions d’affinité (exemple : anti- A surface géométrique,
gène-anticorps).
µQ mode de cisaillement,
Les systèmes SPRi permettant l’imagerie en temps réel de
plusieurs plots fonctionnalisés avec différents systèmes d’affi- ρQ densité du cristal piézoélectrique.
nité sont en pleine expansion actuellement [9]. L’équation de Sauerbrey n’est applicable que pour des
couches suffisamment fines et rigides et elle perd son utilité
Nota : à voir : Dossier Techniques de l’Ingénieur [F 4 010].
dans le cas de films viscoélastiques, en particulier des films de
2.1.3.4 Spectroscopie optique sur guide d’onde modal polymères ou des polyélectrolytes.
(Optical waveguide lightmode spectroscopy, Le biocapteur à effet piézoélectrique le plus utilisé est connu
OWLS) sous le nom de microbalance à quartz (QCM).
Il s’agit d’une technique de détection nouvelle, basée sur le
champ évanescent pour l’étude in situ et sans marquage des 2.1.4.2 BioMEMS
processus de surface au niveau moléculaire. Elle est basée sur Les bioMEMS (bio-Micro-Electro-Mechanical-Systems) ou
la mesure précise de l’angle de résonance d’une lumière laser microsystèmes électromécaniques, sont des systèmes méca-
polarisée linéairement, diffractée par un réseau et couplée niques de taille nanométrique. Ce dispositif permet la traduc-
dans une fine couche de guide d’onde. Le couplage est un tion des interactions biomoléculaires par une donnée
phénomène de résonance qui a lieu à un angle de résonance mécanique suite à une déflexion d’un microlevier. Une bio-
donné, dépendant de l’indice de réfraction du milieu couvrant membrane, fixée à une plate-forme de silicium, constitue l’élé-
la surface du guide d’onde. Dans la couche guide d’onde, la ment sensible du bioMEMS. Cette membrane, fonctionnalisée
lumière est guidée par réflexion totale interne sur les bords où par des molécules spécifiques d’intérêt (sondes), est entraînée
elle est détectée par des photodiodes. En faisant varier l’angle en vibration sur son mode fondamental grâce à l’action d’une
d’incidence de la lumière, on obtient un spectre à partir pastille piézoélectrique. Lorsque la biomembrane est en
duquel sont calculés les indices effectifs à la fois pour le contact avec une solution aqueuse contenant des espèces à
champ électrique et le champ magnétique [10]. détecter (cibles), celles-ci sont captées par la sonde et le
poids de la membrane augmente. En détectant les vibrations
2.1.3.5 Fluorescence à réflexion totale interne de cette biomembrane, on peut mesurer la variation de fré-
(Total internal reflection fluorescence, TIRF) quence de résonance qui s’ensuit et ainsi estimer la quantité
Cette technique a été utilisée avec des guides d’ondes pla- de biomolécules présente dans le liquide. Ce bioMEMS permet
naires et à fibre optique comme transducteurs optiques dans de détecter, de façon automatique et autonome, la présence
de nombreux biocapteurs. La lumière est propagée le long du d’une molécule donnée contenue dans une solution aqueuse.
guide d’onde, ce qui génère une onde évanescente à la sur-
Le BioMEMS offre énormément d’avantages : une vitesse
face du milieu optiquement plus dense du guide d’onde
accrue des réactions chimiques à l’échelle nanométrique, une
(quartz) et dans le milieu adjacent moins dense (milieu
grande sensibilité, la possibilité de mesurer en temps réel, un
aqueux). L’amplitude de l’onde établie décroît exponentiel-
faible rapport signal sur bruit, une intégration aisée de plu-
lement avec la distance dans le milieu d’indice de réfraction le
sieurs capteurs sur une surface réduite [12].
plus bas. La fluorescence d’un fluorophore excité par le champ
évanescent peut alors être détectée. Ce phénomène ne
concerne que les fluorophores liés à la surface alors que les 2.1.5 Méthodes d’immobilisation du biorécepteur
fluorophores au sein du milieu liquide ne sont pas excités. Les Un point essentiel pour la fabrication d’un biocapteur est
systèmes TIRF permettent la mesure de la cinétique en temps l’immobilisation des entités biologiques actives (enzymes,
réel de l’interaction de bioanalytes avec des molécules immo- anticorps, cellules ou tissus...) sur la surface du transducteur.
bilisées sur la surface du guide d’onde. C’est une technique Différentes procédures d’immobilisation du biorécepteur ont
rapide, non destructive et sensible qui a été utilisée dans des été développées dans le but d’aboutir à une immobilisation
systèmes de détection automatisés pour le suivi efficace et stable, de maintenir intactes les propriétés biolo-
environnemental [11]. giques du biorécepteur et de garantir une accessibilité et une
réactivité maximales. La sélection d’une méthode d’immobili-
2.1.4 Transduction mécanique sation appropriée dépend de la nature de la molécule biolo-
gique, du type de transducteur utilisé, des propriétés
Différentes méthodes mécaniques ont été utilisées en tant
physico-chimiques de l’analyte et des conditions opératoires
que systèmes de détection pour les biocapteurs. Ces transduc-
du biocapteur. Il existe plusieurs techniques d’immobilisation
teurs sont devenus de plus en plus populaires au cours des
que l’on peut subdiviser en procédés physiques et chimiques
dernières années.
(figure 2) [13].
2.1.4.1 Transducteurs basés sur l’effet piézoélectrique L’immobilisation physique peut tout d’abord avoir lieu par
Un cristal de quartz, soumis à une tension sinusoïdale, subit adsorption. L’adsorption est basée sur l’établissement d’inte-
une déformation mécanique liée à l’apparition d’un potentiel ractions de faible énergie de type ionique, polaire ou hydro-
électrique à la surface (effet piézoélectrique). À une fréquence phobe, ou encore des liaisons hydrogènes, entre les groupes
bien choisie, le cristal peut osciller à sa fréquence de réso- fonctionnels du biorécepteur et la surface du support. Ce type
nance. Tout changement de masse (∆m) intervenu à la sur- d’immobilisation possède l’avantage de préserver les proprié-
face du cristal entraîne une diminution proportionnelle de sa tés du biorécepteur, mais la faiblesse de la liaison peut entraî-
fréquence de vibration (∆F). Cette relation linéaire s’exprime ner sa désorption suivant les conditions physico-chimiques du
quantitativement par l’équation de Sauerbrey : milieu (pH, température...). Le biorécepteur peut être stabilisé
par addition d’une membrane mince polymérique permettant
la diffusion de la molécule cible. L’immobilisation physique par
2 F02 ∆m piégeage consiste à incorporer la molécule biologiquement
∆F = − ⋅ (4)
µQ ρQ A active dans une matrice organique (polymère hydrophile d’ori-
gine naturelle ou synthétique) ou inorganique (sol-gel).

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lesquelles sont déposés, par voie électrochimique, des films de


polymère conducteur fonctionnalisé (polypyrrole, polythio-
phène, polyaniline) ont été utilisées pour l’immobilisation des
biomolécules actives par formation de liaisons covalentes [14].
+ + + +
– – – –
2.2 Application au suivi environnemental
Se reporter à [15] [16].

2.2.1 Biocapteurs à enzyme


Retention par
Piègeage Adsorption
une membrane
Les enzymes sont des protéines ayant une fonction cata-
lytique vis-à-vis des réactions cruciales pour la vie de la
Méthodes physiques cellule. Leur site actif a une fonction de reconnaissance
spécifique de la molécule qui subit la réaction, que l’on
nomme substrat de l’enzyme.

Les enzymes sont classées en familles, correspondant au


type de réaction catalysée. Les oxydases, les réductases et les
hydrolases sont les enzymes les plus utilisées dans les biocap-
teurs. L’enzyme est immobilisée sur un transducteur qui per-
met la détection soit de la consommation d’un co-facteur
entrant dans la réaction enzymatique (exemple : l’oxygène
dans le cas des oxydases) ou de l’apparition d’un produit de la
réaction enzymatique. De manière générale, on associe une
hydrolase à un transducteur potentiométrique ou
Coréticulation Liaisons covalentes conductimétrique ou une fibre optique permettant de détecter
le changement local de pH ou de conductivité. Les enzymes
réductases ou oxydases sont associées à un transducteur
ampérométrique ou conductimétrique, permettant d’enregis-
Méthodes chimiques trer les transferts électroniques. Ces transferts électroniques
vers l’électrode sont favorisés par l’utilisation de médiateurs
Figure 2 – Représentation schématique des différentes redox qui permettent d’abaisser le potentiel imposé et qui
méthodes d’immobilisation de l’élément biologique limitent les interférences avec d’autres espèces électroactives.
Les principaux polluants détectés par des biocapteurs enzy-
matiques sont listés dans le tableau 1.
L’immobilisation chimique peut avoir lieu par formation
d’une liaison chimique entre le biorécepteur et un groupe 2.2.2 Immunocapteurs
réactif d’un agent d’immobilisation ou directement du support.
La coréticulation est, quant à elle, basée sur l’interaction entre
une protéine de charge (comme l’albumine) et un agent
Les anticorps ou immunoglobulines (Ig) sont les
bifonctionnel, comme la glutaraldéhyde, pour la formation
protéines du système immunitaire. Elles se forment géné-
d’un réseau. Cette deuxième technique est utilisée principale-
ralement en réponse à l’agression d’un organisme par un
ment pour la fixation d’enzymes ou d’anticorps sur les trans-
toxique, une protéine étrangère ou une bactérie qui
ducteurs, beaucoup plus rarement pour celle de cellules. Les
constitue l’antigène de cet anticorps. Il existe des anticorps
conditions de réaction, parfois trop agressives, peuvent en
polyclonaux et des anticorps monoclonaux. Les anticorps
effet engendrer des modifications de l’intégrité de la structure
polyclonaux sont constitués de protéines dirigées contre le
des cellules et entraîner la perte d’enzymes, ainsi qu’une dimi-
même antigène mais peuvent cibler des sites différents
nution de l’activité métabolique. Le greffage covalent est enfin
(épitopes), alors que les anticorps monoclonaux sont diri-
basé sur la réaction entre un groupement fonctionnel de
gés contre un seul et même épitope de l’antigène.
l’entité active et un groupement fonctionnel du support préa-
lablement activé. Les groupements fonctionnels disponibles au
niveau du biorécepteur proviennent des chaînes latérales des Les principales méthodes utilisées dans les immunocapteurs
acides aminés des protéines (enzymes, anticorps ou protéines sont :
cellulaires de surface), notamment les groupements ε-amines
de la lysine, carboxyles de l’aspartate et du glutamate, sulfhy- – soit des méthodes de détection directe de la formation du
dryles de la cystéine et hydroxyphénoliques de la tyrosine. complexe antigène-anticorps (mesure de la modification des
Pour assurer la formation des liaisons covalentes avec le propriétés électriques par spectroscopie d’impédance électro-
transducteur, on procède à sa fonctionnalisation. Ainsi, par chimique, mesure de la modification des propriétés optiques
exemple, des surfaces métalliques telles que l’or et l’argent par résonance plasmonique de surface) ;
peuvent être fonctionnalisées avec des groupements amines, – soit des méthodes par marquage de l’antigène fixé par un
hydroxyles ou carboxyles par réaction avec des aminoalcane- anticorps marqué par une enzyme conduisant, soit à des pro-
thiols, hydroxyalcanethiols et carboxyalcanethiols simultané- duits colorés ou fluorescents (transducteur optique), soit à des
ment. Les surfaces d’oxydes sont fonctionnalisées par des produits électroactifs (transducteur électrochimique).
organosilanes. Plus récemment, des électrodes métalliques sur Le tableau 2 présente quelques exemples d’immunocapteurs
développés pour la détection de polluants aquatiques.

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Tableau 1 – Exemples de biocapteurs enzymatiques pour la détection de polluants chimiques


Polluant Type d’enzyme Transducteur Limite de détection Réf.
Polluants trophiques
Nitrates Nitrate réductase Ampéromètrique 3 µM [17]
Conductimétrique 5 µM [18]
Nitrites Nitrite réductase Ampérométrique 4 nM [19]
Conductimétrique 50 nM [20]
Maltose
Phosphates phosphorylase + Mutarot Ampérométrique 1 µM [21]
ase + Glucose oxydase
Maltose phosphorylase Conductimétrique 1 µM [22]
Matière organique
Protéinase K + Pronase Conductimétrique 0,583 µg/L forTOC [23]
(fraction protéique)
Micropolluants
Bisphénol A Tyrosinase Ampérométrique 1 µM [24]
(électrode BDD)
(nanotubes de carbone) 0,02 µM [25]
17β-estadiol Tyrosinase Ampérométrique 10 µM [24]
Catéchol Tyrosinase Ampérométrique 0,09 µM [26]
Pesticides Organophosphorus
Potentiométrique 1 µM [27]
organophosphorés hydrolase
Ampérométrique 0,1 µM [28]
Fibre optique 1 µM [29]

Tableau 2 – Exemples de biocapteurs immunologiques pour la détection


de polluants chimiques
Polluant Mode de détection Transducteur Limite de détection Référence
Pesticides (propanil, atrazine,
isoproturon) Marquage TIRF 0,01-0,02 µg/L [11]
Chlorpyrifos Marquage SPR 54-64 ng/L [30]
DDT et produits dérivés Marquage SPR 15 ng/L [31]
Atrazine Direct EIS 10 ng/mL [32]
Acide 2,4-dichlorophenoxyacétique Direct Ampérométrique 0,1 µg/L [33]
Testostérone Marquage TIRF Sub ng/L [34]
Bisphénol A Direct SPR 0,4 µg/L [35]
Marquage TIRF 0,008 µg/L [11]
Nonylphénols Direct Ampérométrique 10 µg/L [36]

2.2.3 Biocapteurs cellulaires Les principaux organismes utilisés pour l’élaboration de bio-
Un grand nombre d’ouvrages et de revues ont été consacrés capteurs cellulaires sont les bactéries, les algues et les
aux biocapteurs cellulaires, qu’ils soient utilisés pour la déter- levures. Ils présentent l’avantage d’être beaucoup plus
mination d’analytes ou de familles d’analytes cibles, ou pour robustes que leurs composants isolés (enzymes, anticorps ou
l’évaluation de la toxicité aquatique, comme nous le verrons ADN) et peuvent plus facilement s’adapter à des modifications
dans le paragraphe 2.3 [37] [38] [39] [40] [41]. de pH et de température. Le nombre élevé d’enzymes et de

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cofacteurs présents dans la cellule lui confère la possibilité de vaux consacrés au développement de biocapteurs optiques
réagir avec un large spectre de substrats, ouvrant la voie vers sont les plus nombreux et concernent aussi bien l’analyse de
le développement de biocapteurs permettant la détection d’un métaux (cuivre, arsenic...) que de composés organiques
grand nombre d’analytes, cela parfois au détriment de la (alcanes, composés aromatiques...).
sélectivité. Ces organismes peuvent néanmoins être facile- Le tableau 3 présente quelques exemples d’applications de
ment modifiés génétiquement afin de limiter leur réponse à un biocapteurs cellulaires électrochimiques et optiques.
composé donné ou à une famille de composés [40] [41]. Les
modes de transduction utilisés pour ce type de biocapteur
sont essentiellement électrochimiques et optiques. Les 2.3 Application à l’évaluation de la toxicité
méthodes d’immobilisation des cellules par piégeage à l’inté- aquatique
rieur d’un réseau polymérique ou par greffage au support
fonctionnalisé avec des anticorps par interactions anti- Les premières études menées en écotoxicologie environ-
gène-anticorps sont les plus courantes car elles sont douces et nementale étaient basées sur des mesures de toxicité aiguë
permettent de préserver l’activité métabolique des sur des organismes supérieurs tels que les mammifères, les
micro-organismes. poissons et les oiseaux. Néanmoins, ces méthodes n’étaient
pas standardisées, étaient chères, longues à mettre en œuvre
2.2.3.1 Biocapteurs électrochimiques et posaient des problèmes d’ordre éthique. Elles ont donc été
L’application la plus courante des biocapteurs ampéro- progressivement remplacées par différents outils biologiques à
métriques à base de bactéries ou de levures concerne la base d’organismes vivants inférieurs (macroinvertébrés), de
détermination de la DBO5 qui correspond à la consommation cellules animales ou végétales, d’enzymes, d’anticorps ou
d’oxygène de ces micro-organismes en 5 jours par respiration. d’acides nucléiques. Parmi ces nouvelles techniques figurent
Ce paramètre constitue une bonne indication de la teneur en les bioessais et les biocapteurs [15] [16].
polluants organiques de l’eau qui servent de source de car- Les bioessais ont fait l’objet de nombreux développements
bone à la cellule lors de la mesure. Des biocapteurs dédiés à par le passé et beaucoup sont à présent normalisés et pour
la détection de surfactants ou de dérivés phénoliques ont été certains disponibles commercialement sous forme de kits [41].
développés par immobilisation de bactéries dégradant spécifi- On peut notamment signaler les tests de toxicité sur Daphnia
quement ces groupes de polluants sur des électrodes à oxy- magna (ISO 6341), les microalgues Skeletonema costatum
gène ou des électrodes à pâte de carbone. Différentes souches (ISO 10253) et Selenastrum capricornotum (EPA-600/
de levures métabolisant l’éthanol ont également été exploitées 9-78-018), ou encore la bactérie luminescente Vibrio fischeri
pour le développement de biocapteurs plus ou moins spéci- (ISO 11348-1,2, et 3) ou Salmonella typhimurium (ISO/DIS
fiques aux alcools aliphatiques à chaîne courte. 13829). Des immunoessais et des bioessais comportant des
Les biocapteurs potentiométriques sont quant-à-eux cellules modifiées génétiquement ont également été
constitués d’une électrode sélective à certains ions (H+, NH4+ , développés [42].
Cl–...) ou certains gaz (O2 , NH3...) sur laquelle est déposée Les recherches portent plutôt à présent sur la mise au point
une membrane renfermant les cellules. La consommation de de biocapteurs, qui se distinguent des bioessais par le fait que
l’analyte par la cellule conduit à une accumulation ou à une le biorécepteur est immobilisé sur un transducteur. Ils offrent
consommation d’ions ou de gaz à l’origine d’une différence de l’avantage d’être peu chers, miniaturisables, utilisables en
potentiel. Ainsi par exemple, une électrode sensible aux ions ligne, sur site et contrôlables à distance. Les biocapteurs pour
chlorures issus de la dégradation du trichloréthylène par Pseu- l’estimation de la toxicité sont basés sur les effets toxiques
domonas aeruginosa JI104 a été exploitée pour la détection des polluants : inhibition d’enzyme (neurotoxicité), interaction
de ce composé dans les eaux. Des électrodes de pH ont éga- avec un récepteur spécifique (endogénicité, œstrogénicité),
lement été abondamment utilisées. interaction et dommages de l’ADN ou de l’ARN (génotoxicité).
Les biocapteurs à base de cellules entières mettent en œuvre
2.2.3.2 Biocapteurs optiques l’un de ces effets. Des biocapteurs pour la détection de cer-
tains biomarqueurs de toxicité sont également développés..
Le principe de ces biocapteurs repose sur la modulation des
propriétés optiques des cellules (absorption UV-Visible bio et
chimioluminescence, réflectance, fluorescence) à la suite de 2.3.1 Biocapteurs à enzymes
leur interaction avec un ou des composés présents dans Une des contributions majeures des biocapteurs enzyma-
l’échantillon. Une grande partie des biocapteurs optiques sont tiques aux études écotoxicologiques concerne l’évaluation de
basés sur une détection par bioluminescence ou fluorescence. la neurotoxicité aquatique. Cette dernière provient des
Il peut s’agir d’un mode de détection de type light off. On composés organophosphorés et des carbamates, utilisés
observe dans ce cas une diminution de l’émission lumineuse comme pesticides, mais également des métaux lourds et des
de la cellule (naturelle ou induite par modification génétique) détergents qui provoquent l’inhibition d’un groupe particulier
après contact avec le polluant. Dans le cas des systèmes light d’enzymes, les estérases. Les biocapteurs de neurotoxicité
on au contraire, l’interaction provoque l’apparition d’un signal proposés dans la littérature sont principalement élaborés à
lumineux. partir de deux enzymes appartenant à cette famille, l’acéthyl-
Les biocapteurs sont rendus plus spécifiques par modifica- cholinestérase et la butylcholinestérase. Ils ont fait l’objet d’un
tion génétique. De manière générale, celle-ci consiste à insé- grand nombre de travaux et de deux revues récentes [43]
rer dans la cellule un promoteur de gêne répondant [44]. Les développements actuels visent à améliorer l’activité
spécifiquement à un analyte ou un groupe d’analytes fusionné des enzymes, soit par modification génétique [45], soit par
à un gène codant pour l’expression d’une protéine particulière une meilleure immobilisation sur le transducteur. L’utilisation
facilement détectable [40]. Les gènes les plus fréquemment de nouveaux matériaux à base de nanoparticules d’or [46],
utilisés pour une détection optique sont le gène lux codant d’argent ou de fer, de nanotubes de carbone [47] a également
pour la luciférase luminescente et le gène gfp codant pour la permis d’augmenter de manière significative la sensibilité des
production de la protéine fluorescente GFP (Green Fluorescent biocapteurs optiques et électrochimiques. Un système portatif
Protein), tandis que le gène lacZ codant pour la β-galactosi- utilisant une transduction potentiométrique a été récemment
dase est inséré pour une détection électrochimique. Les tra- validé sur différents échantillons d’eau [48].

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Tableau 3 – Quelques exemples de cellules utilisées pour l’élaboration de biocapteurs


pour l’analyse de polluants aquatiques
Analytes Micro-organismes Limite de détection Référence
Détection ampérométrique
Éthanol Gluconobacter oxydans 0,85 à 50 µM
Candida tropicalis 500 µM
Saccharomyces ellipsoideus 69 µM
p-Nitrophenol Arthrobacter JS 443 5 à 200 nM
Moraxella sp 20 à 100 nM
Composés phénoliques Pseudomonas putida 0,02 à 0,5 µM [37]
Cyanure Saccharomyces cerevisiae 0,15 à 0,3 µM
T. ferrooxidans 0,5 µM
Surfactants anioniques Pseudomonas sp 1 µM
Cu2+ S. cerevisiae modifiée (gène lacZ ) 0,5 mM
Cd2+ Escherichia coli modifiée (gène lacZ ) 25 nM
Détection potentiométrique
Trichloréthylène Pseudomonas aeruginosa J1104 0,03 mg/L
Éthanol S. ellipsoideus 0,02 mM
Détection par luminescence
Escherichia coli MC1061 pTOO31, CM1166 pC200,
CM1569 pC202
Arsénite, antimonite
Staphylococcus aureus SA3 pC200
Ralstonia eutrophus AE1696 pC202
[40]
Hg2+ Escherichia coli MC1061 pTO11 0,1 fM

Cd2+, Pb2+, SbO2− Staphylococcus aureus RN4220 pTOO24 10, 33 et 1 nM

Composés aromatiques Escherichia coli DH5α pGLTUR 10-20 µM (toluène)

2.3.2 Biocapteurs à récepteurs œstrogéniques ont été incluses dans la liste des substances prioritaires de
la Directive-cadre sur l’eau. Une revue récente a été
consacrée à l’utilisation des biocapteurs pour le suivi environ-
Les perturbateurs endocriniens sont des substances chi- nemental des perturbateurs endocriniens [49]. Les bio-
miques qui entraînent des dérèglements hormonaux et des capteurs de toxicité exploitent les capacités de fixation de ces
anomalies du système endocrinien, voire du système ner- substances sur des récepteurs œstrogéniques immobilisés à
veux. Certains agissent sur la synthèse des hormones la surface d’un transducteur. Le récepteur œstrogénique
endogènes ou de leurs récepteurs. D’autres possèdent une d’origine humaine est le plus souvent utilisé. Différents
structure voisine des œstrogènes et se lient à leurs récep- modes de transduction comme la fluorescence, la voltamétrie
teurs, conduisant à l’inactivation ou à un fonctionnement cyclique, la SPR, la mobilité électrophorétique, ont été propo-
anormal de ces derniers. sés. Des systèmes portables, essentiellement basés sur une
détection par SPR ont par ailleurs été développés [50].
Récemment, un biocapteur comportant des nanotubes de car-
Un grand nombre de molécules possèdent de tels effets, bones fonctionnalisés avec le récepteur œstrogénique humain
comme les hormones de synthèse ou des substances de type α et utilisant un transistor à effet de champ comme
chimiques comme les phtalates, les surfactants, les PCB, les transducteur a été proposé. Le temps de réponse est extrê-
alkylphénols, les parabènes, les HAP, les dioxines et certains mement rapide (2 min) [51].
pesticides. À ce jour, 320 substances prioritaires susceptibles
de perturber le système endocrinien ont été répertoriées par Nota :
l’Union européenne. Certaines d’entre elles (nonylphénol, PCB : polychlorobiphényles.
di-2-éthylhexylphtalate et les éthers diphényl-polybromés) HAP : hydrocarbures aromatiques polycycliques.

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2.3.3 Immunocapteurs 2.3.5.2 Biocapteurs optiques


Ainsi qu’il a été vu précédemment (§ 2.2.2), un grand Les applications des biocapteurs cellulaires optiques à
nombre d’applications des immunocapteurs concernent la l’évaluation de la toxicité aquatique sont extrêmement nom-
détermination de polluants ou de groupes de polluants cibles. breuses. Des souches sauvages, comme Photobacterium phos-
Il est également possible de les exploiter pour la détection de phoreum ou Vibrio fischeri, ainsi que des souches comme
substances, appelées biomarqueurs, qui sont produites par un Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas
organisme donné à la suite d’une exposition à certains pol- putida ou Salmonella typhmurium modifiées génétiquement
luants. La vitellogénine, par exemple, est une phospho- ont été utilisées et combinées à des détecteurs de fluores-
lipo-glycoprotéine du sérum sécrétée en grande quantité par cence ou de luminescence pour l’évaluation de la toxicité
le poisson exposé aux perturbateurs endocriniens. Sa pré- aiguë ou la génotoxicité aquatique [37] [38] [39] [40] [41].
sence est donc un excellent biomarqueur permettant d’identi-
fier les effets œstrogénotoxiques de substances naturelles ou
anthropogéniques. Sa détection a été réalisée à l’aide de bio- 3. Matériel biologique
capteurs électrochimiques, optiques ou piezoélectriques à base
d’anticorps anti-vitellogénine de carpe [52]. pour la séparation
et/ou la préconcentration
2.3.4 Biocapteurs à ADN des polluants
La structure de l’ADN est extrêmement sensible à l’influence
de polluants environnementaux tels que les métaux lourds, les
composés aromatiques polycycliques et les PCB. Ces subs-
3.1 Généralités
tances sont connues pour avoir une forte affinité pour l’ADN, à Deux types d’éléments biologiques ont montré de réelles
l’origine de mutagénèse et de carcinogénèse. Des biocapteurs, potentialités dans l’élaboration de supports pour la séparation
basés sur la mesure de l’interaction entre ces substances et et de la préconcentration analytique : les anticorps et les
des molécules d’ADN simple ou double brin immobilisées sur cellules entières, ces dernières pouvant être exploitées mortes
un transducteur, ont donc été élaborés et utilisés pour l’éva- ou vivantes. Dans les deux cas, l’élément biologique est
luation de la génotoxicité aquatique. La détection est généra- immobilisé sur ou dans un support en vue d’une utilisation
lement réalisée par voie électrochimique [53]. Les composés sous forme de cartouches, de colonnes ou de disques.
liés à l’ADN sont détectés, soit directement lorsqu’il s’agit L’échantillon percole à travers le matériau et seuls les
d’espèces électroactives, soit grâce à la modification du signal composés possédant une affinité pour le support sont retenus.
électrochimique provenant de l’ADN. Des biocapteurs de toxi- Après une éventuelle étape de lavage, une étape d’élution
cité basés sur la détection de l’oxydation des bases de l’ADN permet de récupérer les analytes. Il est donc possible de réa-
(guanine essentiellement, mais aussi guanosine et adénosine) liser à la fois l’extraction des composés d’intérêt, leur pré-
ou de la dégradation des brins à l’aide d’une sonde électrochi- concentration et la purification de l’échantillon, ceci en mode
mique ont été développés et appliqués à l’analyse d’eaux dynamique, en ligne ou non.
contenant différents types de contaminants aquatiques géno-
toxiques (métaux, pesticides, PCB, amines aromatiques...).
Certains de ces biocapteurs ont été comparés favorablement à 3.2 Supports d’immunoaffinité
des tests de génotoxicité commerciaux.
Cette technique s’est avérée particulièrement adaptée à
D’autres biocapteurs de types optiques (SPR, fluorescence) l’analyse de composés organiques polaires. Les supports de
ou mécaniques ont également été proposés [54]. chromatographie d’immunoaffinité (immunoadsorbants) sont
préparés par immobilisation chimique ou physique d’anticorps
2.3.5 Biocapteurs à cellules entières spécifiques à un composé ou une famille de composés
Les bactéries, les levures, les algues et les cellules de pois- sur/dans une matrice polymérique. Lorsque l’immunoextrac-
son ont également été utilisées pour l’élaboration de biocap- tion est combinée à une technique chromatographique (CG,
teurs de toxicité [37] [38] [39] [40] [41]. La réponse CLHP ou EC), en ligne ou en discontinu, il est également pos-
enregistrée peut provenir d’une modification du métabolisme sible de séparer et de quantifier les composés chimiques de
cellulaire, de l’altération de la cellule pouvant aller jusqu’à sa structures proches qui n’auraient pas pu l’être sur
mort, ou d’un changement dans l’expression de certains gènes l’immunoadsorbant [55]. Cela constitue un avantage certain
dans le cas d’organismes modifiés. Différents types de toxicité par rapport aux immunoessais de type ELISA (Enzyme-linked
peuvent ainsi être mis en évidence : la neurotoxicité, la géno- Immunosorbent assay ) actuellement disponibles
toxicité, l’œstrogénicité, la toxicité aiguë. commercialement sous formats microplaques, sticks, tubes
tests ou billes magnétiques. Ces tests ELISA, également basés
2.3.5.1 Biocapteurs électrochimiques sur des interactions de type antigène-anticorps, sont rapides
et abondamment utilisés sur site pour le screening d’échan-
Des souches modifiées génétiquement pour exprimer l’OPH
tillons environnementaux [56]. Bien qu’ils conduisent dans
ont été utilisées pour la détermination de la neurotoxicité liée
certains cas à des résultats en bon accord avec des techniques
aux pesticides organophosphorés par ampérométrie et poten-
d’analyses chimiques classiques, ils ne permettent souvent
tiométrie. Des biocapteurs basés sur l’inhibition de la respira-
qu’une analyse semi-quantitative et non exempte d’inter-
tion cellulaire chez certaines souches de bactéries ou de
férences de classes entières de composés.
levures ont également été développés pour l’évaluation de la
toxicité globale d’effluents ou de celle provenant plus spécifi- La matrice d’immobilisation utilisée pour l’élaboration des
quement de la présence d’ions cyanures. Des biocapteurs supports d’immunoextraction doit satisfaire plusieurs critères.
ampérométriques ont enfin été utilisés pour l’évaluation de la Elle doit tout d’abord être inerte chimiquement et biologique-
neurotoxicité aquatique, à partir d’électrodes de verre modi- ment, suffisamment poreuse pour permettre la fixation des
fiées par des bactéries dégradant les organophosphorés (par anticorps qui sont des molécules de grande taille. Elle doit par
exemple Flavobacterium sp) ou des souches d’Escherichia coli ailleurs être hydrophile de manière à éviter les interactions
modifiées génétiquement [37]. non spécifiques. L’approche la plus communément utilisée

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consiste à immobiliser les anticorps sur un gel d’agarose ou bonne compréhension des mécanismes mis en jeu (échange
des particules de silice. Les supports d’imunoextraction à base d’ions, complexation, précipitation...) et des paramètres qui
d’agarose ayant une faible résistance à la pression, les échan- les affectent (pH, force ionique, rapport analyte/biomasse...).
tillons percolent par simple gravité ou sous faible débit à tra- L’utilisation d’organismes vivants (bioaccumulation) permet
vers les cartouches remplies de gel. Ils sont adaptés à une d’atteindre une meilleure spécificité d’interaction mais peut
utilisation en mode discontinu. Par contre, la silice est un s’avérer plus délicate.
matériau résistant à la pression. Les immunosorbants à base
de silice sont donc adaptés à une utilisation en ligne en amont La sorption dépend de différents facteurs liés à la biomasse
d’une séparation chromatographique. D’autres types de maté- elle-même, à savoir sa nature (bactérie, algue, champignon...,
riaux d’immobilisation tels que le verre, l’alumine ou le polys- vivante ou morte, immobilisée ou non), sa morphologie (taille,
tyrène divinylbenzène ont été évalués pour une utilisation en forme), son milieu de croissance (qui influence la structure
colonne remplie mais n’ont pas montré d’avantages significa- physiologique et la composition chimique de la paroi), sa
tifs par rapport à la silice. Un des points clefs de l’élaboration phase de prélèvement (latence, exponentielle, stationnaire), la
des supports d’immunoaffinité à base de silice concerne méthode choisie pour son inactivation (chimique, thermique
l’étape de synthèse. L’immobilisation des anticorps est le plus ou biologique), son mode de conditionnement (biomasse
souvent réalisée par établissement de liaisons covalentes avec fraîche, séchée à l’air, à l’étuve, par lyophilisation) ou encore
le support, ce qui peut conduire à la dénaturation ou à une son traitement avant sorption (lavage à l’eau, à l’acide, à la
mauvaise orientation des anticorps. Une alternative consiste à soude, aux détergents, à l’éthanol ou à l’acétaldéhyde).
emprisonner les molécules actives au sein d’un réseau poly- Le matériau choisi pour l’immobilisation doit tout d’abord
mérique par des techniques de type sol-gel. Stalikas et être résistant aux éventuelles contraintes mécaniques impo-
coll. [57] ainsi que Vera-Avila et coll. [58] ont ainsi proposé sées. Le matériau ne doit par ailleurs pas nuire à la séparation
une méthode de détermination de différentes triazines et du des espèces lorsque celle-ci est recherchée. Il doit enfin,
malathion dans les eaux par couplage d’un immunosorbant à comme dans le cas des biocapteurs, être suffisamment per-
base d’anticorps encapsulés dans de la silice sol-gel avec la méable pour permettre une diffusion rapide de l’analyte vers
chromatographie en phase liquide et en phase gazeuse, res- les cellules biologiques et préserver le métabolisme cellulaire
pectivement. si celui-ci est nécessaire. Si ces différents critères ne sont pas
Les supports d’immunoaffinité ont été abondamment mis en remplis, la qualité séparative du support ainsi que le facteur
œuvre pour l’analyse de produits pharmaceutiques et d’hor- de préconcentration maximal accessible risquent d’être
mones dans les échantillons biologiques ainsi que celles de considérablement diminués. Une des phases stationnaires les
composants naturels ou de toxiques dans les aliments [54] plus couramment utilisées en science séparative est la silice
[58]. Les seuls supports commerciaux existant actuellement qui présente une forte tenue à la pression. Elle existe par
concernent l’analyse de microtoxines, de vitamines et de ailleurs commercialement sous différentes formes avec des
médicaments vétérinaires [59]. Dans le domaine de l’analyse granulométries et des porosités très diverses. Une grande par-
de l’eau, l’essentiel des applications concerne les pesticides, tie des auteurs s’étant intéressés à l’immobilisation de cellules
bien que les médicaments constituent également une classe en vue d’applications analytiques se sont donc tout naturel-
de polluants majeurs des milieux aquatiques [60]. Un système lement tournés vers ce support aisément disponible. La bio-
portable immusorbant-CLHP a été récemment développé par masse est dans la plupart des cas fixée par adsorption
Nelson et coll. pour l’analyse sur site de résidus physique (gels de silice [63] [64], verres à porosité contrôlée
d’herbicides [61]. (CPG) [65], sépiolite [66] [67], mousse de
polyuréthane [68]), plus rarement par formation de liaisons
Nota : à voir : Dossier Techniques de l’Ingénieur [P 1 420].
covalentes avec des CPG [69] ou par piégeage dans une
CG : chromatographie en phase gazeuse.
CLHP : chromatographie en phase liquide haute performance. matrice sol-gel [70]. Cependant, les immobilisations de
EC : électrophorèse capillaire. surface peuvent conduire à un relargage des cellules dans le
milieu. De plus, plusieurs auteurs ont mis en évidence une
affinité de la silice pour certaines espèces inorganiques du
3.3 Supports à base de micro-organismes chrome, ou pour des cations divalents. Cette sorption par les
Il s’agit, comme précédemment, de méthodes d’extraction matériaux peut être considérée comme un moyen d’augmen-
solide/liquide utilisant des matériaux sorbants d’origine biolo- ter les capacités de rétention de l’élément inorganique
gique, en l’occurrence des cellules de levures, d’algues, de considéré, mais peut également nuire à la séparation des
champignons ou de bactéries. Ces méthodes s’appliquent à la espèces ainsi qu’à l’élution de l’élément retenu.
préconcentration et à la séparation sélective d’espèces inorga- Certains auteurs ont également mis en évidence une libéra-
niques (spéciation) en couplage direct à une détection élé- tion importante de cellules lors de l’utilisation de supports
mentaire de type ICP-AES, ICP-MS ou AAS. Ces solides macroporeux tels que la mousse de polyuréthane.
micro-organismes sont dotés d’un rapport surface/volume L’immobilisation de surface par liaisons covalentes est moins
élevé ainsi que de nombreuses fonctions chimiques à leur sur- sujette au relargage cellulaire mais les agents de réticulation
face (groupements carboxyle, amine, phosphate, sulfhy- utilisés pour la fixation peuvent induire une diminution des
dryle...). Ils peuvent ainsi présenter des capacités de fixation propriétés de sorption. Le piégeage à l’intérieur de polymères
métallique (biosorption) proches de celles des supports comme le polysulfone a également été proposé pour la sépa-
chimiques, sans nécessiter d’étape préalable de fonction- ration des espèces de l’antimoine par la levure de boulanger
nalisation. L’utilisation de micro-organismes peut se montrer S. cerevisiae [71].
plus intéressante d’un point de vue économique puisqu’il est
possible de les produire à faible coût et en grande quantité au Différents exemples d’utilisation de micro-organismes
laboratoire. Les différents avantages et limitations de immobilisés pour la séparation et la préconcentration
l’utilisation des biosorbants dans le domaine de l’analyse inor- d’espèces inorganiques sont présentés dans le tableau 4.
ganique ont été exposés en détail dans la revue de Comme le montre ce tableau, les facteurs de préconcentration
Godlewska-Zylkiewicz [62]. L’auteur démontre que ces obtenus par les différentes méthodes sont très variables : le
méthodes présentent un fort potentiel pour l’analyse d’échan- type de micro-organisme, le mode d’utilisation ainsi que les
tillons environnementaux, mais leur maîtrise nécessite une éléments considérés ont une grande influence sur ce facteur.

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Tableau 4 – Exemples d’utilisations de micro-organismes immobilisés


pour la préconcentration et la spéciation d’espèces inorganiques
Facteur Limite
Micro-organismes Espèces analysées Détecteur de de détection Référence
préconcentration (µg · L–1)
Saccharomyces Sb(III) 0,8
HG ICP-AES 8,7 [68]
cerevisiae Sb(V) 0,15
Saccharomyces Sb(III),
ICP-AES 9 [71]
cerevisiae Sb(V)
Saccharomyces Cr(III),
FAAS 75 94 [66]
cerevisiae Cr(VI)
Saccharomyces Cr(III), 12 0,45
ICP-AES [65]
cerevisiae Cr(VI) 5 1,5
Saccharomyces Hg(II), 100
CVAAS – [63]
cerevisiae CH3Hg+ 15
Saccharomyces Cu(II) 286 0,7
cerevisiae Zn(II) 2 000 0,1
préconcentration Cd(II) FAAS 250 0,2 [69]
seulement Fe(III) 750 0,6
Pb(II) 125 8
Fe(II)
Aspergillus niger FAAS 75 113 [67]
Fe(III)
Hg(II), 0,5-1
Chlorella vulgaris HGAAS 75 [64]
CH3Hg+ 2-4

Les limites de détection sont elles aussi reliées à ces différents taille importante des anticorps empêche par ailleurs le gref-
paramètres ainsi qu’à la nature du détecteur utilisé. fage d’un nombre élevé d’entités par unité de surface de sor-
bant. Cependant, les progrès récents observés dans le
Nota :
domaine de l’ingénierie des anticorps permettent à présent
ICP-AES : Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometry.
ICP-MS : Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry.
l’utilisation de fragments synthétiques d’anticorps
AAS : Atomic Absorption Spectrometry. (aptamères), à l’origine d’une nette amélioration des perfor-
mances des supports d’immunoaffinité [73]. Par ailleurs, le
développement de nouveaux types de supports, de type
monolithiques, est en pleine expansion. Il s’agit de matériaux
4. Nouvelles tendances à haute surface spécifique, facilement fonctionnalisables, dont
et nouveaux développements la synthèse peut être directement réalisée dans des colonnes,
des capillaires d’électrophorèse ou des systèmes micro-
Malgré le grand nombre de travaux menés et de projets fluidiques miniaturisés. La surface spécifique particulièrement
financés dans le domaine des biosorbants et des biocapteurs élevée de ces matériaux autorise une extraction ultrarapide
pour l’analyse de l’eau, et bien que ceux-ci présentent de mul- des échantillons [74].
tiples avantages, très peu de systèmes ont à ce jour été Contrairement aux biocapteurs et aux supports d’immunoaf-
commercialisés, contrairement aux bioessais. La plupart des finité, les biosorbants à base de micro-organismes ne sont
biocapteurs commerciaux sont d’ailleurs versatiles et sont applicables qu’à l’analyse d’espèces inorganiques, en nombre
dotés d’une configuration adaptable à des applications à des beaucoup plus limité que les molécules organiques rejetées
domaines variés comme l’environnement, l’analyse biologique dans l’environnement. La restriction du marché constitue cer-
ou médicale [72]. tainement le principal frein actuel à leur développement
Les principales limitations des supports d’immunoaffinité commercial.
concernent, d’une part la production des anticorps et d’autre Dans le domaine des biocapteurs, d’importants efforts
part la faible capacité de traitement des supports particulaires. restent encore à réaliser pour l’obtention d’outils sélectifs,
La production d’anticorps capables de reconnaître les petites robustes, rapides et sensibles utilisables sur le terrain. Les
molécules est laborieuse, coûteuse, et parfois infructueuse. La limitations des systèmes proposés proviennent pour une part

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de l’élément biologique. Les développements en cours L’exploration de nouveaux matériaux, incluant en particulier
concernent l’amélioration de leur sensibilité, leur sélectivité et des nanoparticules d’or, des nanotubes de carbone ou des
leur stabilité par ingénierie génétique [41] [75] [76]. Les pro- quantums dots est une voie extrêmement prometteuse [79]
grès récents réalisés dans ce domaine laissent ainsi entrevoir [80].
la possibilité de construire des batteries de micro-organismes Des progrès essentiels ont enfin été réalisés ces dernières
ou d’enzymes qui seront disposés sur une même plate-forme années en matière de miniaturisation des transducteurs
pour une détection simultanée multi-polluants. En parallèle, le (nanoélectrodes, nanoguides d’onde, BioMEMs) et vont se
développement de nouveaux récepteurs biomimétiques tels poursuivre, permettant de réduire de manière importante la
que les polymères à empreinte moléculaire (MIP) ou les apta- quantité d’entité biologique nécessaire à la réalisation du bio-
mères (peptides synthétiques) est en pleine expansion pour capteur, mais également l’intégration dans des laboratoires
pallier la fragilité des biorécepteurs naturels [77] [78]. sur puces [81] [82]. Des progrès dans les domaines de la
Des méthodes performantes d’immobilisation du biorécep- numérisation et de la transmission des données ainsi que de
teur sur le transducteur devront être également développées leur traitement permettent à présent la réalisation de microar-
afin d’améliorer la sensibilité et la robustesse des biocapteurs. rays pour la multidétection de polluants.

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