Imunoflorescência

Forma de luminescência, emissão de luz

produzida por fonte de energia não
térmica
 Primária - autofluorescência
 Secundária - induzida
Métodos de Imunoflorescência

 Identificação de compostos celulares ou

tecidulares “in situ” através de atc conjugados
a compostos químicos que emitem
fluorescência

 Fluorocromos ou Fluoróforos

 Exigem microscópio especial com lâmpada que

emite radiação no campo dos ultravioleta
(480-590nm)
Métodos de Imunoflorescência

 São métodos de uso limitado, pouco

utilizados
 As moléculas fluorescentes perdem
atividade com o tempo
 Não permite conservar as lâminas em
arquivo
Áreas de Aplicação -
Imunofluorescência
 Diagnóstico histopatológico
 Deteção de auto-anticorpos no soro de doentes
 Biologia celular e tumoral
 Marcação Simples e Múltipla
 Citoesqueleto
 DNA
 Mitocôndrias
 Golgi
 Reticulo endoplasmático
Amostras
Necessário manter os antigénios suficientemente
insolúveis e não desnaturados

 As técnicas de imunofluorescência realizam-se quase

sempre em tecido congelado

 Fixação em formol e inclusão em parafina alteram a

estrutura dos tecidos

 Provocam aumento dos fenómenos de

autofluorescência e bloqueio de alguns determinantes
antigénicos
Amostras
 Utilização de cortes de congelação de tecido não fixado
aderidos em lâminas adesivadas e secos ao ar

 No caso dos antigénios serem solúveis, realizar uma

fixação em formol tamponado a 10%

 Etanol e Acetona são fixadores alternativos menos

utilizados (alteram mais a morfologia do tecido) –
mais utilizados se a fixação for realizada após corte

 As biópsias devem ser enviadas em Solução de

Michel pH 7.0 e congeladas assim que possível .
Cromóforo / Fluoróforo

 São componentes de moléculas que

absorvem luz
 Geralmente são anéis aromáticos
Fluorocromos
 Substâncias capazes de absorver altas fontes de
energia precedentes da radiação UV e do espetro de luz
visível
 Quando iluminadas libertam gradualmente energia
que se prolonga mesmo sem a fonte luminosa -
fosforescência
 Os mais utilizados nas técnicas de imunofluorescência:
Fluoresceína e Rodamina
Características do Fluorocromo
1- não deve interferir com a reação atc-atg
2- armazenamento deve ser estável, condições
semelhantes às da proteína com a qual é conjugado
3- deve encontrar-se disponível na forma purificada
4- ter emissão máxima no espetro do visível
5- comprimento de onda da luz absorvida e da luz
emitidas devem ser diferentes para se poderem
diferenciar
6- ter taxa de eficiência de fluorescência elevada
Fluorocromos mais utilizados
FITC – isotiocianato de fluoresceína

TMRITC – isotiocianato tetrametil de rodamina

PE - ficoeritrina

TR – Texas red

DAPI – 4´,6-diamidino-2-phenylindole
Fluoresceína

 Quase sempre utilizada sob a forma de

FITC (isotiocianato de fluoresceína)

 Absorve a luz azul

 Emite fluorescência verde

λ absorvido: 480-500nm
 λ emitido: 510-530nm
Rodamina

 Quase sempre utilizada sob a forma de TRITC

(isotiocianato de tetrametilrodamina)

 Absorve a luz verde

 Emite fluorescência vermelha

 λ absorvido: 510-530nm
 λ emitido: 560-590nm
Conjugação dos Fluorocromos
 Os fluorocromos ligam-se de forma covalente aos atc
que se ligam aos atg, constituindo um meio de
visualizar zonas de reação atc-atg

 FITC e TRITC ligam-se ao atc por ligações covalentes

principalmente aos grupos amina e carboxilo
 Ligação feita em pH alcalino (9,5) com moléculas
purificadas – reação dependente da temperatura e do
tempo
Conjugação dos Fluorocromos
 Sobreconjugação: alto backround pela rede de
cargas negativas formada que pode ligar-se
inespecificamente ao tecido e reduzir a capacidade de
ligações específicas do anticorpo ao tecido.

 Subconjugação: preparação final terá um nível baixo

e insatisfatório de fluorescência
Métodos de imunoflorescência

 Diretos

 Indiretos

(escolhidos de acordo com a sensibilidade/rapidez

pretendida)
Amostras mais
frequentes/objetivos
 Imunoflorescência tem vindo a ser substituída, em
muitas situações, pela citometria de fluxo e/ou por
técnicas de imunocitoquímica enzimática

 Imunofluorescência em conjunto com a microscopia

de luz e microscopia eletrónica são uma forte
ferramenta no diagnóstico de doenças da pele e renais.

 Amostras mais frequentemente analisadas:

Biópsias de pele e biópsias renais
Patologia Renal
 Rim transplantado
Infliltração linfocitária:
CD3, CD4, CD8 e CD19
 Glomerulopatias
 Acumulação na membrana basal glomerular,
mesângio e paredes vasculares de:
 Igs, componentes do complemento, fibrina
 IgA, IgG, IgM, C3, C1q, Fibrinogénio
Avaliação da marcação

 Antigénio avaliado
 Intensidade: +, ++, +++
 Localização: mesangial, periferal,
membrana basal,…
 Padrão: linear ou granular
 Extensão: focal, difuso, global ou
segmentar.
Pele

 Doenças Imunes
 Acumulação na epiderme, membrana basal
e derme de:
 Igs, componentes do complemento, fibrina
 IgA, IgG, IgM, C3, C1q, Fibrinogénio
Patologia Pele Substância presente Localização
Penfigo IgG (+C3; Fibrin) Epiderme intercelular (L e N)

Penfigóide IgG e C3 (linear) Membrana basal (L e N)

Dermatite Herpetiforme IgA e C3 (granular) Derme papilar (N)
LES/LED IgM e C3 (+IgG, IgA) (granular) Membrana basal
(LES - L e N; LED – L)
Vasculite C3 (+ Fibrin, IgM, IgG, IgA)
L- lesão pele; N- pele normal; LED- Lupus eritematoso discóide; LES- Lupus eritematoso sistémico
Microscópio de Fluorescência

 Tem incorporado:
 Fonte de luz UV e visível
 Filtros primários para selecionar o λ que
incide sobre a amostra
 Filtro secundário que seleciona os λ
emitidos no espectro do visível, deixando
passar a luz emitida pela substância
fluorescente
Controlo de Qualidade
 Controlos utilizados semelhantes às técnicas
imunoenzimáticas

 Alto background ou falsos positivos:

 inadequadas lavagens dos cortes após incubação com os
anticorpos
 Racio aumentado fluorocromo:proteína
 Cromoforos livres no conjugado
 Sobre-incubação com o reagente
 Huang Métodos ABC
atc
conjugados
Digestão
com enzimática
peroxidase por
Protease

Coons et al.

1930 1942 1966 1968 1975 1976 1978 1981 1991 1995

1º estudo IHQ
relatado atc com
FITC

Shi e cols.

Mo atc
César Milstein e
Georges Köhler Envision
dextran
polymer
conjugate
 Suportes para lâminas removíeis e inclináveis
 Possibilidade de camera húmida e fechada
SEQUENZA Shandon

• Manual
• Até 50 lâminas
• Sistema coverslip
• Aplicação manual de
reagentes
• 90µl por lâmina
• 5 conta-minutos
Cadenza Shandon
Cadenza Shandon

 Até 20 lâminas por série

 +/- 1L de tampão
• Sistema de coverslip
 Bolhas com ausência de marcação
• Recipiente para recolha de resíduos
• Suporte para incubação ON
• 18 contentores para reagentes
 Valor residual 300µl
Vídeo exemplificativo
Vídeo exemplificativo
 Autostainer Labvision
Dako
 36, 48, 72 lâminas

 Acoplasistema de recuperação
antigénica
 Módulo PT
Autostainer Labvision
Dako
• Separação de resíduos
 Não perigosos e Perigosos
 Incubação com 100 a 300µl por lâmina
 Valor residual de 200µl por recipiente
 Desparafinação e Recuperação antigénica
efetuadas previamente (PT ou outro)
 Limpeza obrigatória após 240 lâminas
Autostainer Labvision
Dako
T RT
RE
A
Codificação de componentes
 Etiqueta para  Etiqueta para
reagentes lâminas
Vídeo exemplificativo
Autostainer

Características idênticas ao anterior

BOND Max
BOND Max

•Até 30 lâminas por

série.
•150 a 300µl por
lâmina.
•Aquecimento
individualizado de
cada tabuleiro.
•Permite efetuar a
adesão do corte à
lâmina no
equipamento.
BOND Max

Clips
•Facilitam a incubação de
toda a extensão da lâmina.
•Evitam a evaporação dos
reagentes.
•Uniformidade de
marcação.
BOND Max

•Reagentes controlados
•Recipientes para atc de outras
marcas
•Variedade de atc pré-diluídos
BOND III

•Reagentes controlados
•Recipientes para atc de
outras marcas
•Variedade de atc pré-
diluídos
•Tecnologia Covertille
•3 tabuleiros de 10 lâminas
•Automatização da adesão
ao contraste
•IHQ; IF; ISH; FISH
BOND III
• Espaço para 36 reagentes em 4
bandejas
• Protocolos distintos em
simultâneo
• Com múltiplos sistemas de
deteção em simultâneo
BOND III
• Até 50% mais rápido que
modelos anteriores
• Três robôs adicionais para
dispensa de alto volume de
fluido
• Com múltiplos sistemas de
deteção em simultâneo
BOND III
• Gestão eficiente de
reagentes e resíduos em
tempo real
• Software simples e eficaz
BOND III
http://www.leicabiosystems.com/pt/ihc-ish/coloracao-avancada-de-
ihq-e-his/detalhes/product/leica-bond-iii/showcase/
BenchMark
BenchMark XT
• Até 30 lâminas
• Aquecimento individualizado de
cada lâmina (37 a 100oC)
• Programa desde desparafinação
até ao contraste
• Opção de programas automáticos
ou doseamento manual de atc 1o
• 100µl por lâmina
• Metodologia LCS
• Recipiente recolha resíduos com
sensor de nível
Manutenção mensal e trimestral (op)
Manutenção anual (fabricante)
Sistema de “lamela “ (LCS) evita a evaporação dos reagentes e permite menores
quantidades
BenchMark XT
• Aquecimento, desparafinação,
recuperação antigénica
• ICQ (mono, duo ou tripla), ISH, FITC
• 1 PC controla até 8 módulos
• 7 contentores de reagentes com
capacidade de 3 a 6 litros
• 35 posições para reagentes
• Processa até 60 lâminas em 8h
• Simultaneamente mais que uma
metodologia (p ex: ICQ e ISH)
• Programa completamente
automático
• Não necessita bancada
Aquecimento controlado e individualizado das lâminas,
permitindo efectuar o protocolo desde a desparafinação até ao
contraste.
Registo de reagentes

Lote
Prazo de validade
Nº de utilizações
Controlo Qualidade
Chip + Código de
barras
Suporte de reagentes

Lote
Prazo de validade
Nº de utilizações
Código de barras
Dispensador
Contentor cheio pelo
utilizador com atc
distintos
Atc pré-diluidos
Possibilidade de incubação manual
do atc 1º
Protocolos
Placas de lavagem dupla

Eficácia das lavagens com jactos enérgicos e dirigidos

Placas de ajuste de volume
Misturador exterior

Agitação
constante da
solução e
renovação do
soluto em
contacto com o
tecido
Reservatórios de reagentes
Resíduos
BenchMark XT

 Apoio à gestão laboratorial

 Controlo qualidade
 Lotes e validade reagentes e dispensadores

 Manutenção periódica e manutenção

preventiva
 Registo de casos e casos controlo

 Listagens de trabalho efetuado

 Inventário de reagentes
BenchMark ULTRA
BenchMark ULTRA

 30 lâminas processadas individualmente

 Processa até 90 lâminas em 8 horas ou 120
lâminas ON
 Aquecimento individualizado de cada lâmina
 Programa inclui passo de adesão do corte
 Combinação simultânea de programas
automáticos e doseamento manual de atc 1º
 100µl de reagente por lâmina
 Metodologia LCS
 Recipiente recolha resíduos com sensor de nível