Université Oran 1, Faculté de Médecine, Service d’Histologie-Embryologie

Travaux Pratiques et Dirigés de Cytologie des étudiants en première année de Médecine

Année Universitaire : 2018-2019 Dr Belarbi-Amar N Dr Mebarki K

I-Méthodes d’étude de la composition biochimique des cellules.

Etape 1 : éclatement de la cellule Pour récupérer des organites.

Etape 2 : séparation des organites Pour étudier les organites.

1/Éclatement de la cellule : Les méthodes de fractionnement subcellulaire consistent à séparer les différents
composants cellulaires par destruction de la membrane plasmique, puis par désorganisation de la cellule
(L’homogénat)
Techniques: physiques : ultrasons ou hautes pressions.
chimiques : choc osmotique, action de détergents ou d’enzymes.
mécaniques : pistons et cylindres comme tube de Potter.

-L’homogénat est conservé à 0°C pour la Préservation maximale des structures et fonctions des différents
constituants cellulaires et des enzymes.
-Quel est le contenu de l’homogénat ?

*noyaux, mitochondries, lysosomes et peroxysomes

*fragments provenant des ruptures membranaires (plasmique, réticulum, Golgi) se refermant immédiatement
pour donner de petites vésicules fermées appelées microsomes

2/ Séparation des organites:

A- Séparation des organites par ultracentrifugation différentielle

*série de centrifugations de plus en plus longues et donnant des champs de gravité de plus en plus élevés pour
fractionner l’extrait initial en une série de culots et surnageant.

*technique préparatoire rapide, simple et permettant de manipuler des grandes quantités de matériel sans
donner cependant de fractions parfaitement

pures.

B-Séparation des organites par ultracentrifugation:

1/Séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité préformé:

Protocole:

*Dépôt d’une fine couche de l’homogénat à la surface du gradient contenu dans le tube à centrifuger : solution
de saccharose ou de glycérol dont la concentration varie de façon régulière et décroissante du bas vers le haut
du tube, variation linéaire et continue ou bien discontinue et par paliers.

*Centrifugation à vitesse élevée pendant quelques heures.

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*Migration des particules dans le gradient jusqu’à une position d’équilibre qui correspond à sa densité

*Obtention d’anneaux le long du tube (centrifugation zonale) qui peuvent être récupérés séparément par
aspiration.

Technique : permettant d’obtenir une séparation des constituants cellulaires en une seule étape.

d’un grand degré de pureté.

ne permettant de manipuler que de petits volumes de matériel biologique .

2/Séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité auto formé:

Dilution de l’homogénat dans une solution concentrée de chlorure de césium (CsCl)

Centrifugation de cette préparation à plus de 200 000g pendant plusieurs heures.

Cette technique permet de séparer les molécules indépendamment de leur taille et avec des différences
de densité très faibles exemple : fait la différence entre molécule d’ADN standard et d’ADN lourd
(artificiel )

II-Culture cellulaire.
1/Conditions à respecter :

• Température régulée la plus proche possible de la température naturelle.

• pH neutre maintenu grâce à l’emploi de solutions salines tamponnées et une atmosphère

enrichie en CO2.

• Présence de nombreux éléments nutritifs : glucose, sels minéraux, acides aminés….

• Présence de facteurs de croissance : vitamines et utilisation de sérum de veau.

• Respect d’une asepsie stricte : ajout éventuel d’antibiotiques aux milieux de culture.

• Support adapté en verre ou en plastique parfois recouvert de composants de la matrice

extracellulaire comme le collagène.

2/Intérêts des cultures cellulaires :

-Étude de l’influence de différents facteurs sur les cellules : substrats, température, substances chimiques,
médicaments…

-Suivi de précurseurs du métabolisme marqués pour étudier leur devenir dans la cellule ( isotope).

3/Différents types cellulaires utilisés:

a/ Cellules issues de tissus normaux:

-Obtention des cellules à partir d’organes ou de tissus d’organismes adultes ou embryonnaires.

- Nombre de passage : limité sauf pour les cellules embryonnaires (,2 ou 3) pour les cellules épithéliales,

un peu plus pour les fibroblastes (cellules du tissu conjonctif).

- Cellules gardant les caractéristiques des cellules du tissu d’origine.

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b/ Cellules de lignées continues: propriétés : croissance rapide,

perte de l’inhibition de contact,

possibilité d’un nombre illimité de passage.

c/ Cellules hybrides: obtenues par fusion chimique ou physique et possédant, dans un premier temps, deux
noyaux séparés appelées hétérocaryons . donnant après mitose des cellules hybrides dans laquelle tous les
chromosomes se rassemblent pour former un unique noyau.
Exemple: Le jumelage de la bactérie et de l'ADN hybride va produire l'insuline.
QCM:
1/ Apres l'éclatement de la cellule, (la ou les réponses justes):

a- On obtient un homogénat avec tous les constituants de la cellule.

b- toutes les organites restent intacts.

c- La plupart des organites restent intactes.

d- les ruptures membranaires (plasmique, réticulum, Golgi) donnent les microsomes.

e- toutes les réponses sont justes.

2/ L’homogénat est conservé (la réponse juste):

a- à 37 ºc .

b- selon la température optimale du sujet.

c- à moins 0ºc.

d- à 0°C.

e- toutes les réponses sont fausses.

3/ Concernant la Séparation des organites par ultracentrifugation différentielle (la ou les réponses
justes):

a- est une technique préparatoire rapide, simple.

b- elle permet permettant de manipuler de petites quantités de matériel.

c- elle donne des fractions parfaitement pures.

d- elle ne donne pas des fractions parfaitement pures.

e- est une série de centrifugations de plus en plus longues donnant des champs de gravité de plus en plus
élevés.

4/Concernant la Séparation des organites par ultracentrifugation sur gradient de densité préformé (la
ou les réponses justes):

a- on utilise une solution de saccharose ou de glycérol.

b- on utilise une solution concentrée de chlorure de césium (CsCl).

c- il s’agit de centrifugation à vitesse élevée pendant quelques heures.

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d- permettant d’obtenir une séparation des constituants cellulaires en une seule étape.

e- d’un grand degré de pureté.

5/ Concernant la séparation des organites par centrifugation sur gradient de densité auto formé (la ou
les réponses justes):

a- on utilise une solution concentrée de chlorure de mercure (CsHg).

b- La Centrifugation de cette préparation se fait en plusieurs séries de vitesse et de temps.

c- La Centrifugation de cette préparation à plus de 200 000g pendant plusieurs heures.

d- Cette technique permet de séparer les molécules indépendamment de leur taille et avec des différences
de densité très faibles.
e- on utilise une solution concentrée de chlorure de césium (CsCl).
6/ Conditions à respecter sur Culture cellulaire (la ou les réponses justes):
a- Température 37ºc.

b- pH alcalin.

c- Présence de facteurs de croissance.

d- Présence de nombreux éléments nutritifs.

e- toutes les réponses sont justes.

7/ Conditions à respecter sur Culture cellulaire (la ou les réponses justes):

a- Température régulée la plus proche possible de la température naturelle.

b- pH neutre.

c- ajout automatique d’antibiotiques aux milieux de culture.

d- Support adapté en verre ou en plastique.

e- toutes les réponses sont justes.

8/ Différents types cellulaires utilisés (la ou les réponses justes):

a- Cellules issues de tissus normaux.

b- Cellules de lignées continues.

c- Cellules hybrides.

d- Cellules épithéliales.

e- Cellules embryonnaires.