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como péptidos, proteínas,Ácidos y lípidos, en el marco de las relaciones entre sus estructuras,
funciones y propiedades, así como Su aplicación a áreas tales como el desarrollo de nuevos
biomateriales, biosensores, bioimágenes y diagnósticos clínicos y terapéutica. La nanotecnología
también se puede utilizar para diseñar y ajustar los tamaños, formas, propiedades y
Nanomateriales. Como tal, existen considerables superposiciones entre la nanotecnología y la
ingeniería biomolecular, Que ambos se ocupan de la estructura y el comportamiento de los
materiales a escala nanométrica o menor. Por lo tanto, En combinación con la nanotecnología, se
espera que la ingeniería biomolecular abra nuevos campos de nanobio / Bionanotecnología y
contribuir al desarrollo de nuevos nanobiomateriales, nanobiodevicios y nanobiosistemas.
Esta revisión destaca estudios recientes que usan moléculas biológicas modificadas (por ejemplo,
oligonucleótidos, péptidos, Proteínas, enzimas, polisacáridos, lípidos, cofactores biológicos y
ligandos) combinados con nanomateriales funcionales En aplicaciones nanobio / bionanotecnología,
incluyendo terapéutica, diagnóstico, biosensing, bioanálisis y biocatalizadores.
Además, esta revisión se centra en fve áreas de los últimos avances en la ingeniería biomolecular:
(a) ácido nucleico Ingeniería, (b) ingeniería genética, (c) ingeniería de proteínas, (d) tecnologías de
conjugación química y enzimática, Y (e) ingeniería de engarces. Se anticipa nanobiomateriales,
nanobiodevicios y nanobiosistemas de ingeniería precisa
La nanobiotecnología se utiliza en relación con las formas en que la nanotecnología se utiliza para
crear materiales, dispositivos y sistemas para estudiar sistemas biológicos y desarrollar nuevos
sistemas de ensayo biológico, diagnóstico, terapéutico, almacenamiento de información e
informática, entre otros. Estos sistemas utilizan la nanotecnología para avanzar en las metas de los
campos biológicos. Algunas nanobiotecnologías escalan desde arriba hacia abajo, como
microfluídicas a biochips nanofluídicos (por ejemplo, el laboratorio sobre un chip para la separación
de flujo continuo y la detección de tales macromoléculas como el ADN y las proteínas [2],
biosensores de punto de atención Para la detección de biomarcadores y el diagnóstico clínico [3 -
7], y nanopore sensores de estado sólido para la secuenciación del ADN [8]). Otras
nanobiotecnologías escalan desde abajo hacia arriba para la fabricación de materiales híbridos a
nanoescala, tales como complejos que consisten en nanopartículas (NPs) (por ejemplo, NPs
magnéticos, AuNPs y AgNPs, sílice NPs, puntos cuánticos (QDs), micelas poliméricas, liposomas,
dendrímeros, Y fullerenos) y moléculas biológicas, que son muy útiles para biosensing, bioimagen,
diagnóstico y aplicaciones terapéuticas en la asistencia sanitaria [9 - 15].
Por otro lado, la bionanotecnología se refiere a las formas en que la biotecnología se utiliza para
mejorar las nanotecnologías existentes o crear nuevas a través del estudio de cómo funcionan los
sistemas biológicos y las aplicaciones de las moléculas y sistemas biológicos a la nanotecnología.
Nanotecnologías de ADN y ARN, la utilización de las propiedades de acoplamiento de bases y
autoensamblaje molecular de los ácidos nucleicos para crear materiales útiles, como el ADN origami,
las nanomáquinas de ADN, los andamios de ADN para la electrónica, la fotónica y los arrays de
proteínas y los aptámeros de ADN y ARN, Ribozimas y riboswitches, son importantes ejemplos de
bionanotecnología [16, 17]. Otra área importante de investigación consiste en aprovechar las
propiedades de autoensamblaje de péptidos, proteínas y lípidos para generar estructuras 3D bien
definidas, complejos de proteínas funcionales, nanofilms y otras nanoestructuras, como micelas,
micelas inversas y liposomas, que podrían utilizarse Como nuevos enfoques para la producción a
gran escala de los nanomateriales programables [18 - 20]. La aplicación de los polímeros de hidratos
de carbono combinados con la nanotecnología en la ingeniería de tejidos y la medicina son también
posibles campos de investigación para el desarrollo de biomateriales novedosos para biosensing,
bioimaging, diagnóstico y drugdelivery sistemas [21]. Ya sea con nanobiotecnología o
bionanotecnología, las moléculas biológicas son indispensables para fabricar nanomateriales
funcionales, nanodispositivos y nanosistemas. Sin embargo, desde el punto de vista de la aplicación
de materiales biológicos a la nanotecnología, los materiales biológicos encontrados en la naturaleza
siempre tienen suficientes funciones y propiedades. Los avances recientes en la ingeniería
biomolecular, tales como ingeniería genética, ingeniería de ADN y ARN, ingeniería de proteínas,
tecnologías de conjugación enzimática y enzimática específicas del sitio, tecnología de
autoensamblaje y métodos masivos de detección de alto rendimiento, nos han permitido mejorar,
estabilizar, integrar Y alterar las funciones y propiedades de los materiales biológicos. Por lo tanto,
es posible crear materiales biológicos de ingeniería con funciones y propiedades optimizadas para
diversos usos en los campos de bioelectrónica, biosensores, biocatálisis, imágenes moleculares,
actuadores biológicos, sistemas de administración de fármacos, biomateriales para ingeniería de
tejidos y medicina regenerativa. En esta revisión, se discuten estudios recientes que aplican
materiales biológicos modificados a nanobio / bionanotecnología y se destacan varias tecnologías
de ingeniería biomolecular.
La modificación superficial de NPs con ligandos biológicos, tales como folato, péptidos de arginina-
glicina-aspartato (RGD), aptámeros, transferrina, anticuerpos o pequeños fragmentos de
anticuerpo, facilita la selección de NP, formación de imágenes e internalización en células
específicas, por ejemplo células cancerosas y Tejidos tumorales. El folato es una molécula pequeña
bien conocida frecuentemente usada como un ligando de la célula de cáncer que se dirige a los
receptores de folato con alta afinidad. La conjugación química de folato en la superficie de NPs
puede promover significativamente su entrega dirigida a las células cancerosas que sobreexpresan
los receptores de folato [37]. Se sabe que los tumores proliferantes generan nuevos vasos
sanguíneos. Este proceso es una característica importante del desarrollo tumoral caracterizado por
la única sobreexpresión de las integrinas ανβ3 y ανβ5 por las células endoteliales nacientes durante
la angiogénesis en diversos tumores, pero no por las células endoteliales ordinarias. Los péptidos
que poseen la secuencia RGD unen las integrinas ανβ3 y ανβ5 con alta afinidad. Cyclic RGD péptidos
muestran mayor afinidad y estabilidad que los péptidos lineales RGD, lo que permite su uso para el
desarrollo de integrina selectiva, dirigida NPs [38]. Los aptámeros son ARN de cadena sencilla o
oligonucleótidos de ADN (15-40 bases) que se pueden unir a moléculas diana con alta afinidad y
especificidad debido a la capacidad de las moléculas para doblarse en conformaciones únicas con
estructuras tridimensionales (3D). Se ha seleccionado un gran número de aptámeros contra
proteínas activadas aberrantemente en células cancerosas, tales como endoteliales vasculares
La modificación de la superficie de NPs con péptidos celulares (CPPs) [43], como el péptido Tat,
penetrain,PVEC, transportan, MPG, Pep-1 y polyarginines, podría facilitar la internalización de NP
en las células a través de la entrada directa en el citosol o vías endosómicas. El péptido Tat, penetrain
y pVEC son péptidos cortos (~ 20-mers) derivados del dominio básico del trans-activador del VIH-1
de la proteína de transcripción (Tat), la tercera hélice del homeodominio de Antennapedia y la
cadherina, respectivamente. Transportan, MPG y Pep-1 son péptidos quiméricos (~ 30-mers) que se
forman por la fusión de dos secuencias naturales derivadas de galanina / mastoparán, antígeno-T
de HIV-gp41 / SV40 y antígeno-T de transcriptasa inversa / SV40 de HIV , Respectivamente. Estos
CPPs llevan principalmente una carga positiva neta y consisten en secuencias de aminoácidos (AA)
con unidades AA básicas repetidas y AAs hidrófobos o aromáticos. Las unidades AA básicas repetidas
podrían contribuir no sólo a la unión de CPPs a la superficie de la célula cargada negativamente, sino
también al escape endosómico de los CPP a través del cambio conformacional bajo las condiciones
de pH ácido de los endosomas tardíos.
En muchos casos, NPs en los endosomas o el citoplasma debe colapsar para permitir la liberación
de sus cargas útiles. Varias estrategias de uso de estímulo-reactivos motities construido en NPs se
han utilizado para mejorar la eficiencia de la liberación controlada [31]. Estos incluyen los polímeros
sensibles al pH y sensibles a la temperatura, que controlan las interacciones entre las cargas útiles
y NPs [52], y externos reticulantes estimulantes sensibles, que conjugan las cargas útiles con NPs
[53], tales como pH-lábil, enlazadores fotosensibles y enzima-escindibles , Y reticulantes disulfuro
que son sensibles a un entorno intracelular reductor. Se ha utilizado ampliamente la diferencia en
los valores de pH existentes entre los tejidos sanos (pH 7,4) y el ambiente extracelular de los
tumores sólidos (pH 6,5-6,8), así como entre el citosol (pH 7,4) y los endosomas (pH 5,6) Para activar
la liberación de fármacos en un órgano o compartimento intracelular específico. Los polímeros con
grupos funcionales que pueden alterar la estructura e hidrofobicidad de NPs como resultado de la
protonación o desprotonación en respuesta a la variación del pH pueden utilizarse en NPs
poliméricos sensibles al pH. Ejemplos notables de polímeros sensibles al pH incluyen poli
(acrilamida) (PAAm), poli (ácido acrílico) (PAA), poli (ácido metacrílico) (PMAA), poli (acrilato de
metilo) (PMA), poli (metacrilato de dietilaminoetilo) PDEAEMA), poli (cloruro de dialil
dimetilamonio) (PDDA) y poli (metacrilato de dimetilaminoetilo) (PDMAEMA). Los polímeros e
hidrogeles sensibles a la temperatura presentan una transición de fase de volumen a cierta
temperatura, lo que provoca un cambio drástico en el estado de hidratación. Esta transición de fase
refleja las propiedades competidoras de enlace de hidrógeno, donde el hidrógeno intra e
intermolecular
Los agregados de proteínas fotolíticas (P-Aggs) para nanoportadores controlables por luz también
se han desarrollado utilizando SA [62]. Se construyeron P-Aggs a escala submicrónica mezclando SA
y proteínas de carga marcadas con un reactivo de enjaular biotinilado (BCR) y se utilizaron como
una plataforma fácil y versátil para la liberación inducida por luz de proteínas de carga (Figura 4). El
tamaño de P-Aggs podría ser controlado ya sea añadiendo un exceso de biotina a la mezcla anterior
para detener el aumento en el tamaño de P-Agg o llevando a cabo una reacción de mezcla en una
piscina de agua de micelas inversas y añadiendo PEG biotinilado para detener el En el tamaño de P-
Agg. Por ejemplo, los P-Aggs se prepararon mezclando SA, un conjugado de transferrina-
doxorubicina enjaulado con BCR (Tf-DOX)
Y AF647 biotinilado. Estas P-Aggs multifuncionalizadas con Tf, Alexa Fluor 647 y DOX se introdujeron
en células de cáncer de colon humano mediante endocitosis vía TfR, seguido por la liberación
selectiva de DOX a partir de P-Aggs en células irradiadas con luz, dando como resultado la inducción
espacio-temporal de la diana Apoptosis de células cancerígenas (Fig. 5). También se desarrolló un
método para la preparación de SA nanohydrogels redox-inmovilizado inmovilizado vía péptido
taginduced disulfide formación mediada por peroxidasa de rábano picante (HRP) (Fig. 6a) [63]. En
este sistema, los péptidos con secuencias de HHHHHHC (C-tag) y GGGGY (Y-tag) se fusionaron
genéticamente a los terminales N y C de SA (C-SA-Y), respectivamente. Aquí, H, C, G e Y denotan
histidina, cisteína, glicina y tirosina, respectivamente. El C-SA-Y se mezcló con PEG de 4 brazos
funcionalizado con HRP y tiol para producir un hidrogel inmovilizado en C-SA-Y (gel C-SA-Y)
reticulado con enlaces disulfuro sensibles a redox. El C-SA-Y inmovilizado en el hidrogel conserva su
afinidad por la biotina, permitiendo la incorporación de cualquier biomoléculas funcionales
biotiniladas o sustancias químicas sintéticas Agentes en el hidrogel a través de la interacción biotina-
SA. El gel C-SA-Y se preparó adicionalmente dentro de un sistema de micelas inversas para producir
un hidrogel nanométrico, haciéndolo un vehículo de suministro de fármaco potencial. Se preparó
un nanogel C-SA-Y funcionalizado con CPP biotinilado (biotina-G3R15GYC-Alexa Fluor 546) y la
saporina marcada con Alexa Fluor 488, e investigamos su eficacia como un sistema de
administración de fármacos para las células DLD1 de adenocarcinoma de colon humano (Figura 6a
). Los resultados del ensayo de viabilidad celular revelaron que el nanogel C-SA-Y preparado sin CPP
o saporina apenas afectó la viabilidad de las células DLD1. Por el contrario, el tratamiento de las
células de cáncer de colon humano con el gel C-SA-Y funcionalizado con CPP y saporina dio como
resultado una marcada disminución de la proliferación celular (Figura 6b). Estos resultados indicaron
que el nanogel C-SA-Y había sido internalizado en las células a través de la CPP, reduciendo la
variabilidad celular por citotoxicidad de la saporina. La capacidad de internalización de CPP y la
citotoxicidad de la saporina se integraron con éxito en el nanogel C-SA-Y, con ambas propiedades
trabajando cooperativamente para producir un nanogel C-SA-Y citotóxico.
Durante la última década, varios nanomateriales prometedores (por ejemplo, QDs, NPs, nanotubos
de carbono (CNTs) y grafeno) con superficies modificadas por biomoléculas han sido ampliamente
utilizados en los campos de biosensing, bioanálisis y diagnóstico [67-70]. Por ejemplo, uno de los
primeros nanomateriales que tuvo un impacto en los biosensores amperométricos fue CNTs, que
tienen ventajas tales como un tamaño pequeño con una gran área superficial, una excelente
capacidad de transferencia de electrones y una fácil inmovilización de biomoléculas. Los electrodos
modificados CNT mejoraron las densidades de corriente y aumentaron la reactividad de
biomoléculas, cofactores redox y enzimas redox. Además, los bosques alineados CNT facilitó la
transferencia directa de electrones con los centros de redox de las enzimas, lo que resulta en un
mejor desempeño general de los electrodos de enzimas y enzimas etiquetados inmunosensores
[71].
Varios nanomateriales han demostrado gran promesa en la imagen debido a sus características
intrínsecas de la proyección de imagen, tales como su brillo, ancho de banda agudo y estabilidad a
largo plazo (por ejemplo, agentes fluorescentes, tales como QDs [72], NP magnéticos en MRI [73] y
AuNPs coloidales [74]). Para la obtención de imágenes, los nanomateriales pueden ser dirigidos a
sitios específicos de la enfermedad dentro del cuerpo conjugando los materiales con biomoléculas
específicas de biomarcadores. Estos agentes de formación de imágenes basados en biomateriales
también pueden proporcionar información además de datos anatómicos, por ejemplo, información
relacionada con la fisiología y la función, lo que permite un diagnóstico más preciso y temprano de
la enfermedad, como la detección altamente sensible del cáncer en estadio temprano.
Las microarrays [76] y las plataformas microfluídicas [77, 78] combinadas con nanomateriales
conjugados con biomoléculas (por ejemplo, QDs, NPs o CNTs conjugados con enzimas, anticuerpos,
ADN o aptámeros) han permitido la detección multiplex simultánea de muchos biomarcadores de
enfermedad para el cáncer , Enfermedades infecciosas, diabetes, enfermedades cardiovasculares y
enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, la nueva matriz de microcélula de
electroquimioluminiscencia (ECL) [79] y microfluídica [80]
Para superar estos problemas, se han desarrollado muchas estrategias para la inmovilización de
enzimas. Un enfoque se conoce como "nanopartículas de una sola enzima (SEN)", en las que una
red de polímero híbrido orgánico-inorgánico de menos de unos pocos nanómetros de espesor se
construye a partir de la superficie de una enzima. La síntesis de SEN implica tres reacciones: en
primer lugar, los grupos amino en la superficie de la enzima reaccionan con cloruro de acriloilo para
producir grupos vinilo superficiales; Entonces, los radicales libres inician la polimerización de vinilo
a partir de la superficie de la enzima utilizando un grupo monómero de vinilo y grupos trimetoxi-
silano colgantes; Finalmente, la polimerización ortogonal se produce mediante reacciones de
condensación de silanol para reticular las cadenas de polímero unidas a una red (figura 9). Se
demostró que las SEN pueden ser inmovilizadas en sílice mesoporosa; Además, se demostró que
este método de inmovilización proporciona un sistema enzimático inmovilizado mucho más estable
que el de las enzimas nativas inmovilizadas por adsorción o unión covalente en el mismo material
[90]. Otro enfoque consiste en introducir interfaces moleculares entre una superficie sólida y
enzimas. Varios métodos basados en este enfoque han sido reportados, como la modificación
superficial de soportes sólidos con polímeros sintéticos hidrófilos [91, 92] y péptidos [93] con
especificidades y afinidades hacia las enzimas, y la fusión de enzimas con etiquetas peptídicas [94]
O proteínas de anclaje [95, 96].
Los péptidos con una afinidad para los nanomateriales se han identificado a partir de una biblioteca
de péptidos combinatoria, y estos péptidos son herramientas prometedoras para la tecnología de
fabricación bottom-up en el campo de la bionanotecnología. Mediante el uso de estos péptidos, las
enzimas pueden inmovilizarse directamente sobre una superficie de sustrato con las orientaciones
deseadas y sin necesidad de modificar la superficie del sustrato o de complicados procesos de
conjugación. Por ejemplo, se aplicó un péptido de unión a Au para dirigir el autoensamblaje de la
hidrolasa de organofosforado sobre un chemosensor de grafeno revestido con AuNP. Este sistema
de biosensores electroquímicos podría detectar plaguicidas con un tiempo de respuesta rápido, un
bajo límite de detección, una mejor estabilidad operativa y una alta sensibilidad [97].
La proteína anfifílica HFBI (7,5 kDa), clase II hidrofobina, producida por Trichoderma reesei, se
adhiere a superficies sólidas y exhibe autoorganización en las interfaces agua-sólido. Se construyó
una proteína de fusión entre HFBI y glucosa oxidasa (GOx-HFBI) con un enlazador flexible 21-AA
(secuencia de enlace: SGSVTSTSKTTATASKTSTST). Esta proteína de fusión exhibió los niveles más
altos tanto de adsorción de proteínas como de alta actividad de GOx debido a la presencia del
espaciador de HFBI y del ligador flexible, que forma una capa de proteína auto-organizada sobre
superficie sólida y permite que el componente de GOx en la proteína de fusión sea altamente
Móviles, respectivamente [95].
Las proteínas de la capa superficial de células bacterianas cristalinas (capa S) de los organismos
procariotas constituyen un sistema único de autoensamblaje que puede emplearse como elemento
de formación de patrones para diversas moléculas biológicas, por ejemplo glicanos, polisacáridos,
ácidos nucleicos y lípidos. Una de las propiedades más excelentes de las proteínas de la capa S es su
capacidad para autoensamblarse en redes de proteínas monomoléculas en superficies artificiales
(por ejemplo, plásticos, metales nobles o obleas de silicio) o en películas o liposomas lipídicos de
Langmuir. Una proteína de fusión entre la proteína SbpA de la capa S de Bacillus sphaericus CCM
2177 y la enzima laminarinasa (LamA) de Pyrococcus furiosus retuvo completamente la capacidad
de autoensamblaje del resto de la capa S y el dominio catalítico de LamA fue expuesto en el exterior
Superficie de la red de proteínas formada. La actividad enzimática de la monocapa de la proteína de
fusión de la capa S sobre obleas de silicio, diapositivas de vidrio y diferentes tipos de membranas
poliméricas se comparó con la de sólo LamA inmovilizada con técnicas convencionales. LamA
alineado dentro de la capa de S de la proteína de fusión reticulado catalizada de dos veces mayor
liberación de glucosa de la laminar polisacárido sustrato en comparación con la enzima inmovilizada
aleatoriamente. Por lo tanto, las proteínas de la capa S se pueden utilizar como bloques de
construcción y plantillas para generar nanoestructuras funcionales en las escalas meso y
macroscópica [98].
En muchos organismos, las arquitecturas enzimáticas complejas se ensamblan ya sea por simple
fusión genética o agrupamiento enzimático, como en el caso de los metabolos, o por la organización
cooperativa y espacial utilizando andamios biomoleculares, y estas estructuras enzimáticas mejoran
el comportamiento general de la vía biológica (Figura 10) [103, 106, 107]. En los metabolos, tales
como la sintasa de péptido no ribosomal, la sintetasa de poliquétido, la sintasa de ácido graso y la
acetil-CoA carboxilasa, los compuestos intermedios de reacción están unidos covalentemente a
dominios o subunidades funcionales y transferidos entre dominios o subunidades.
Alternativamente, la canalización de sustratos en tales complejos multienzimáticos como
metabolos, incluyendo por glucolisis, ciclos de Calvin y Krebs, sintasa de triptófano, fosfato sintetasa
de carbamoilo y síntesis de durrina, se utiliza para evitar la pérdida de intermedios de baja
abundancia, para proteger intermedios inestables de interactuar Con disolventes y para aumentar
la concentración efectiva de reactivos. Además, las proteínas del andamio están implicadas en
muchas cascadas enzimáticas en vías de señalización (por ejemplo, el andamiaje MAPK en la ruta de
la cascada de fosforilación de MAPK) y procesos metabólicos (por ejemplo, celulosomas de
Clostridium thermocellum). Desde un punto de vista práctico, existen varios obstáculos para la
fusión genética de más de tres enzimas para construir complejos multienzimáticos. En primer lugar,
las proteínas de fusión recombinantes grandes se pliegan fácilmente y posteriormente se
proteolizan o forman cuerpos de inclusión inactivos en E. coli. Además, las condiciones óptimas de
replegamiento de cada motivo enzimático en proteínas de fusión no son siempre idénticas. Por
último, los métodos de diseño racional para los enlazadores peptídicos entre las enzimas que
permiten el control o enlazador de la disposición espacial y la orientación aún no se han desarrollado
[106]. Además, la ingeniería de las interacciones interfaciales necesarias para el agrupamiento
eficiente de enzimas es extremadamente difícil. Por lo tanto, los métodos postraduccionales
flexibles que usan conjugación enzimática de proteína-proteína específica de sitio y andamios
sintéticos empleando dominios de interacción ortogonales para el montaje han sido
particularmente atractivos debido a la naturaleza modular del diseño biomolecular.
Las proteínas de andamio permiten la colocación espacial precisa de los componentes de una
cascada de reacción multienzimática a escala nanométrica. Los andamios están involucrados en
muchas cascadas de reacción enzimática en vías de señalización y procesos metabólicos [110], y
pueden proporcionar ventajas sobre reacciones catalizadas por enzimas libremente difusoras
segregando reacciones, aumentando el rendimiento y proporcionando modularidad para la
construcción de redes de reacción novedosas. Recientemente, se han desarrollado varios sistemas
multienzimáticos utilizando proteínas de andamios naturales [111] y andamios sintéticos [112]
compuestos de elementos de proteínas de andamios naturales, como celulosomas [113] y andamios
de transducción de señales [114].
El antígeno nuclear de proliferación de células (PCNA) es una abrazadera de DNAsliding que forma
una estructura simétrica en forma de anillo que rodea al ADN bicatenario (dsDNA) y actúa como un
andamio para enzimas relacionadas con el ADN, tales como ADN polimerasa y helicasa. El archaeon
Sulfolobus solfataricus tiene tres genes PCNA distintos con las tres proteínas PCNA expresadas,
PCNA1, PCNA2 y PCNA3, que forman un complejo heterotrimérico. Estos tres PCNA se fusionaron a
las proteínas de tres componentes (es decir, PdR, PdX y P450cam) que componían el sistema P450
de P. putida (Figura 12a). Las proteínas de fusión resultantes, PCNA1-PdR, PCNA2-PdX y PCNA3-
P450cam, retuvieron completamente las funciones de las proteínas componentes, incluyendo la
heterotrimerización de los PCNAs, las actividades catalíticas de PdR y P450cam y la función de
transferencia de electrones de PdX. Las tres proteínas de fusión formaron inmediatamente un
complejo heterotrimérico in vitro por mezcla. Comparado con una mezcla equimolar de PdR, PdX y
P450cam, el complejo mostró un aumento de 52 veces en la actividad de monooxigenasa de
P450cam debido a la transferencia de electrones eficiente dentro del complejo de PdR a PdX y de
PdX a P450cam [111]. Este sistema basado en el andamio PCNA se extendió adicionalmente a un
sistema de P450cam autosuficiente impulsado por fosfito in vitro mediante la incorporación de
fosfito deshidrogenasa (PTDH) para la regeneración del cofactor NADH (Fig. 12b) [115]. El valor de
Km de PUPPET incorporado a PTDH (PTDH-PUPPET) para NAD + (51,0 ± 2,7 μM) en presencia de d-
alcanfor
Y el fosfito fue ligeramente menor que el de una mezcla equimolar de PUPPET y PTDH (69,7 ± 4,8
μM). Este resultado indica que la oxidación de NADH por el dominio PdR en PTDH-PUPPET podría
incrementar la concentración local efectiva de NAD + alrededor del dominio PTDH y que este efecto
de proximidad sobre la canalización de cofactor podría potencialmente ser mejorado optimizando
la disposición de PTDH y PdR en el Andamio PCNA.
Se han descrito celulosomas de dise~no que contienen cuatro enzimas diferentes (dos celulasas y
dos xilanasas) de Thermomifida fusca, en donde se incorporaron cuatro enzimas celulolıticas
fusionadas con dockerina en localizaciones especıficas en un armazón artificial, quimérico, que
contenıa cuatro cohesinas correspondientes a cada dockerina. Como era de esperar, en
comparación con su sistema de mezcla enzimática libre sin el andamio quimérico, los complejos
multienzimáticos resultantes mostraron una mayor actividad (~ 2,4 veces) en la paja de trigo como
un sustrato celulósico complejo [116]. Recientemente, Deuber et al. Demostraron la formación de
complejos multienzimáticos in vivo en células de E. coli a través de la expresión de scaffold de
proteína sintética. Se construyeron andamios de proteínas con diversas disposiciones de dominios
de fusión a partir de los dominios de interacción de las proteínas de señalización, los dominios SH3
y PDZ de ratón y el dominio de unión a proteínas de GTPasa de rata (GBD). Las tres enzimas
acetoacetil-CoA tiolasa, hidroximetilglutaril-CoA sintasa y hidroximetilglutaril-CoA reductasa, que
catalizan una reacción en cascada de acetil-CoA a mevalonato, se marcaron genéticamente con sus
ligandos peptidilo afines. Estos andamios de proteínas y enzimas con ligandos de peptidilo fueron
coexpresados en células de E. coli. Un significativo aumento de 77 veces en la producción de
mevalonato se logró mediante la expresión del andamio optimizado: (GBD) 1- (SH3) 2- (PDZ) 2 [114].
Las nanoestructuras de ADN 2D proporcionan una oportunidad aún mayor de organizar sistemas
multienzimáticos en patrones geométricos más complicados. Los ácidos nucleicos tiolados se
unieron covalentemente a la glucosa oxidasa (GOx) ya la peroxidasa de rábano picante (HRP)
utilizando éster N - [(1 - maleimidocapropiloxi) sulfosuccinimida] como un reticulante bifuncional.
La cascada de enzimas GOx / HRP se organizó en tiras de ADN hexagonal 2D mediante
autoensamblaje. La distancia entre dos enzimas se controló variando las posiciones de dos cordones
de ADN libres en las tiras de ADN hexagonal. Las enzimas conjugadas con ADN complementarias
organizadas en las tiras de dos hexágonos (distancias más cortas) mostraron una actividad 1,2 veces
mayor que las tiras de cuatro hexágonos. Con distancias más cortas, la difusión intermedia (H2O2)
fue más eficiente, lo que dio como resultado una mayor eficiencia de la reacción en cascada. Sin
embargo, la enzima en cascada no se activó en ausencia de los andamios de ADN o en presencia de
ADN extraño [122]. Estas observaciones indican que la disposición espacial a escala nanométrica
utilizando una nanoestructura 2D que comprende un dúplex de ADN rígido podría controlar el flujo
de un intermedio desde una enzima primaria a una enzima secundaria y que el control de flujo
dominaba la velocidad de reacción en cascada multienzima.
Un control más preciso de la distancia de la cascada enzimática de GOx / HRP se realizó utilizando
azulejos de origami de ADN como un andamio. La distancia entre las enzimas se varió
sistemáticamente de 10-65 nm, y se evaluaron las actividades correspondientes. El estudio reveló
la existencia de dos diferentes procesos cinéticos dependientes de la distancia asociados con los
pares de enzimas ensambladas. Se observó una fuerte intensificación de la actividad cuando las
enzimas estaban muy separadas, mientras que la actividad disminuyó drásticamente para enzimas
de tan sólo 20 nm de separación. El aumento de la distancia mostró una dependencia mucho más
débil de la distancia (Fig. 13a-c). Este estudio reveló que la transferencia intermedia entre enzimas
podría ocurrir en las conchas de hidratación conectadas para las enzimas estrechamente espaciadas.
Este mecanismo se verificó construyendo diferentes tamaños de puentes de proteínas no catalíticas
(β-galactosidasa (β-Gal) y NeutrAvidina (NTV)) entre GOx y HRP para facilitar la transferencia
intermedia a través de las superficies de las proteínas. La proteína puente modificó la difusión
browniana, resultando en la difusión restringida de H2O2 a lo largo de la capa de hidratación de las
superficies de la proteína contactada y aumentando la actividad de reacción en cascada enzimática
(Fig. 13d, e) [123]. Se construyó un nanorreactor en cascada enzimática acoplando GOx y HRP
usando una orientación rectangular plana y NTs de origami de ADN cortos. El GOx y HRP biotinilados
se colocaron en la hoja de ADN rectangular planar marcada con estreptavidina a través de la
interacción biotina-avidina con una distancia inter-enzima específica (es decir, la distancia entre GOx
y HRP) de 15 nm. Esta lámina de ADN equipada con GOx y HRP se enrolló a continuación en un NT
confinado, dando como resultado la encapsulación de las enzimas en un nanorreactor.
Sorprendentemente, la eficiencia de acoplamiento enzimático de esta cascada de enzimas dentro
de NTs de ADN cortos fue significativamente mayor que la de la hoja de ADN rectangular plana.
Cuando ambas enzimas estaban confinadas dentro de los ADN NTs, el H2O2 no podía difundirse
fuera de la capa de difusión, que era mucho más gruesa que el diámetro del ADN NTs (20 nm),
resultando en un alto acoplamiento del intermedio de reacción H2O2 entre las enzimas [ 124].
Un tipo modular similar de nanoreactor de cascada de enzimas fue construido usando bloques de
construcción 3D de origami de ADN. Cada una de las unidades de ADN origami contenía tres hebras
conjugadas con biotina que sobresalían de la superficie interna de la estructura tubular. La avidina
desglicosilada y NTV se inmovilizaron en la superficie interna de las unidades a través de la
interacción biotina-avidina para facilitar la unión adicional de enzimas biotiniladas. El GOx y el HRP
biotinilados se anclaron dentro del compartimiento del origami con la ayuda de NTV. Las estructuras
de origami de ADN tubular inmovilizadas por GOx y HRP resultantes fueron conectadas entre sí por
hibridación de 32 secuencias cortas (3-6 bases). La reacción en cascada de GOx / HRP del
nanorreactor de dímero montado mostró una actividad significativamente mayor que aquella sin
un armazón de ADN [125].
Los ácidos nucleicos, como el ADN y el ARN, presentan una amplia gama de funciones bioquímicas,
que incluyen el almacenamiento y la transferencia de información genética, la regulación de la
expresión génica, el reconocimiento molecular y la catálisis. La ingeniería de ácidos nucleicos basada
en las características de emparejamiento de bases y de autoensamblaje de los ácidos nucleicos es
clave para las nanotecnologías de ADN / ARN, como las que implican ADN / ARN origami, aptámeros
y ribozimas [16, 17, 127].
3.1.1 Origami de ADN / ARN El origami de ADN / ARN de origami, un nuevo sistema de ensamblaje
de ácido nucleico programado, utiliza la naturaleza de la complementariedad de ácidos nucleicos
(es decir, la especificidad del emparejamiento de bases de Watson-Crick) para la construcción de
nanoestructuras mediante interacciones intermoleculares De los hilos de ADN / ARN. Se han creado
nanoestructuras de ADN / ARN 2D y 3D con una amplia variedad de formas y tamaños definidos con
un control preciso sobre sus geometrías, periodicidades y topologías [16, 128, 129]. Rothemund
desarrolló una
Y el método simple del "uno-pote" 2D del origami del ADN nombrado "origami del ADN del
andamio", que implica el plegamiento de una sola hebra larga del ADN viral en un andamio del ADN
de una forma deseada, tal como cuadrado, rectángulo, triángulo, Estrella acentuada, e incluso una
cara sonriente usando múltiples hebras cortas de "grapa" [130]. Para fabricar y estabilizar diversas
formas de azulejos de ADN, los motivos cruzados han sido diseñados a través del intercambio
recíproco de backbones de ADN. Los azulejos de ADN ramificado también se han construido
utilizando extremos pegajosos y motivos de unión cruzada, tales como triángulos de tensegridad
(estructuras rígidas en forma de matriz periódica) y triángulos algorítmicos de Sierpinski
autoensamblados (un fractal con la forma general de un triángulo equilátero). Estos azulejos de ADN
puede auto-ensamblar más en NTs, hélice haces y complejos motivos de ADN y arrays [17]. Las
estructuras 3D de origami de ADN se pueden diseñar extendiendo el sistema de origami de ADN 2D,
por ejemplo, empaquetando dsDNAs, donde la posición relativa de dsDNAs adyacentes es
controlada por crossovers o plegando dominios 2D de origami en estructuras 3D usando hebras de
interconexión. Las redes de ADN 3D con topologías tales como cubos, poliedros, prismas y
buckyballs también se han fabricado usando un conjunto mínimo de hebras de ADN basadas en la
flexibilidad de la unión y la rigidez de los bordes.
Debido a que las propiedades de plegado de ARN y ADN no son exactamente iguales, el conjunto de
ARN se desarrolló generalmente bajo una perspectiva ligeramente diferente debido a las
interacciones secundarias en una cadena de ARN. Por esta razón, la tectónica de ARN basada en las
interacciones terciarias se han introducido para el autoensamblaje del ARN. En particular, horquilla-
horquilla o horquilla-receptor interacciones se han utilizado ampliamente para construir estructuras
de ARN [16]. Sin embargo, los principios fundamentales del origami de ADN son aplicables al origami
de ARN. Por ejemplo, el uso de uniones de tres y cuatro vías para construir nuevas y diversas
arquitecturas de ARN es muy similar a los enfoques de ramificación utilizados para el ADN. Tanto el
ARN como el ADN pueden formar rompecabezas y desarrollarse en paquetes [17]. Una de las
características más importantes de ADN / ARN origami es que cada posición individual de la
estructura 2D contiene información de secuencia diferente. Esto significa que las moléculas
funcionales y las partículas que están unidas a las hebras de la grapa se pueden colocar en las
posiciones deseadas en la estructura 2D. Por ejemplo, NPs, proteínas o tintes se posicionaron
selectivamente en estructuras 2D con control preciso conjugando ligandos y aptámeros a las hebras
de grapas. Estos andamios de ADN / ARN origami se podrían aplicar a la funcionalización
biomolecular selectiva, una sola molécula de imágenes, ADN nanorobot, y el diseño de la máquina
molecular [131]. El uso potencial de nanoestructuras de ADN / ARN como andamios para
cristalografía de rayos X y nanomateriales para dispositivos nanomecánicos, biosensores, sistemas
biomiméticos para transferencia de energía y fotónica, y diagnósticos clínicos y terapéuticos se han
revisado a fondo en otro lugar [16, 17, 127-129] ; Los lectores son referidos a estos estudios para
obtener información más detallada.
3.1.2 Aptámeros
Los aptámeros son ácidos nucleicos monocatenarios (ARN, ADN y ARN o ADN modificado) que se
unen a sus blancos con alta selectividad y afinidad debido a su forma 3D. Se aislan de 1012 a 1015
bibliotecas oligonucleotídicas combinatorias sintetizadas químicamente mediante selección in vitro
[132]. Se han desarrollado muchos protocolos, incluyendo secuenciación de próxima generación de
alto rendimiento y bioinformática para la selección in vitro de aptámeros, y han demostrado la
capacidad de los aptámeros para unirse a una amplia variedad de moléculas diana, que van desde
pequeños iones metálicos, moléculas orgánicas, Y los péptidos de grandes proteínas e incluso
células complejas o tejidos [39, 133 - 136]. El procedimiento general de selección in vitro para un
aptámero, SELEX (figura 15), es el siguiente: se prepara una acumulación de ADN sintético por
síntesis química. Los ADN consisten en una región de secuencia aleatoria o mutagenizada
flanqueada en cada extremo por una secuencia constante y con un promotor de ARN polimerasa de
T7 en el extremo 5 '. Este ADN se amplifica mediante unos pocos ciclos de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y posteriormente se transcribe in vitro para formar el pool de ARN. Las moléculas
de ARN son entonces seleccionadas en base a su afinidad de unión a la molécula diana, por ejemplo,
pasándolas a través de una columna de afinidad inmovilizada por diana. Los ARN retenidos son
eluidos, inversos
Transcrito, amplificado por PCR y transcrito; Entonces, se repite todo el ciclo. Después de múltiples
rondas de selección (generalmente 6-18 rondas), se pueden tamizar poblaciones bastante grandes
(> 1013 secuencias diferentes), aumenta la proporción de secuencias de ARN activo a inactivo y
finalmente el grupo se ve dominado por moléculas que pueden unirse al blanco molécula.
Los nucleótidos modificados químicamente proporcionan varias ventajas, tales como una
resistencia mejorada a la nucleasa, una afinidad de unión mejorada, una mayor diversidad de
agrupaciones de oligonucleótidos y una tasa de éxito mejorada de selección. Por lo tanto, un grupo
de oligonucleótidos modificado se está volviendo más popular para la selección de aptámeros.
Aunque los nucleótidos modificados químicamente y los desoxinucleótidos trifosfatos no pueden
ser reconocidos por las polimerasas de ARN T7 de tipo salvaje y las ADN polimerasas de tipo A, tales
como Taq polimerasa, afortunadamente, los nucleótidos trifosfatos modificados (2'-fluoro
pirimidinas, 2'-O-metil nucleótidos) y (P. Ej., Restos de indol, bencilo o alquino) pueden ser
reconocidos por algunas polimerasas de ARN mutantes [137] y polimerasas de tipo B, y Pwo y Vent
(exo) ADN polimerasas [ 138], respectivamente.
3.1.3 Ribozymes
Las ribozimas naturales son moléculas de ARN que tienen actividad enzimática para escindir enlaces
fosfodiéster. Por lo tanto, las ribozimas tienen un potencial significativo para el uso en cáncer,
enfermedades genéticas y terapéuticas víricas mediante la inhibición específica de la expresión
génica a través de la escisión de sustratos de ARN, como el ARNm, con el genoma viral del ARN que
contiene una secuencia complementaria al centro catalítico de los ribozimas. ].
Las ribozimas naturales se unen a los ARN del sustrato a través del emparejamiento de bases de
Watson-Crick, que ofrece la división secuencial de los ARN del sustrato. Dos ribozimas, la "martillo
cabeza" ribozima y la "horquilla" ribozima, han sido ampliamente estudiados [142]. El motivo
catalítico de una ribozima está rodeado por una secuencia flanqueante que es responsable de 'guiar'
la ribozima a su ARN diana y dar estabilidad a la estructura. Con la ribozima de cabeza de martillo,
la escisión depende de iones metálicos divalentes, como el magnesio, y puede ocurrir después de
cualquier triplete NUH (donde N = cualquier nucleótido y H = A, C o U) dentro de la secuencia de
ARN diana. La cinética de la reacción puede variar significativamente (hasta uno o más órdenes de
magnitud) con diferentes combinaciones de secuencias flotantes de tripletes; Por lo tanto, la
elección de un apropiado sitio de escisión de ribozima es el primer paso y más importante en el
diseño de ribozyme cabeza de martillo [143].
Se han aislado ribozimas artificiales con propiedades catalíticas mediante selección in vitro a partir
de bibliotecas de ácido nucleico aleatorias o combinatorias. Pueden usarse variaciones de las
estrategias de selección de aptámeros para aislar secuencias de ácido nucleico catalíticas cambiando
el paso de selección de unión del proceso de selección de aptámero a un paso de selección de
actividad (figura 15). Tales aproximaciones se han utilizado para cambiar la función de ribozimas
conocidas y para crear completamente nuevas de una piscina de ácido nucleico aleatoria o
combinatoria [144]. Se podría catalizar una amplia gama de reacciones químicas, tales como la
formación, escisión y reordenación de diversos tipos de enlaces covalentes. Ejemplos que incluyen
no sólo la escisión o ligadura de sustratos de ARN por transferencia de fosfoester en el centro de
fósforo [144, 145], sino también reacciones de Diels-Alder, formación de enlaces N-glicosídicos,
alquilaciones, acilaciones y formaciones de enlaces amídicos en los centros de carbono. , 146]. El
rendimiento catalítico, la resistencia a las nucleasas y la diversidad de las agrupaciones de
oligonucleótidos de ribozimas también podrían ser mejorados mediante la incorporación de
nucleótidos modificados químicamente, tal como se utiliza en los protocolos de selección de
aptámeros [146].
Las ribozimas se pueden expresar a partir de un vector, que ofrece la ventaja de la producción
intracelular continua de estas moléculas. Sin embargo, las tasas de rotación de las ribozimas son
bastante bajas en algunos casos, ya que la disociación del producto de escisión es la etapa de
limitación de la velocidad que controla su utilidad. Además, algunas ribozimas requieren altas
concentraciones de iones metálicos divalentes para una escisión eficiente del sustrato, lo que puede
limitar su uso en ambientes intracelulares. Todas estas preocupaciones,
Así como la actividad fuera de la diana, la resistencia a las nucleasas séricas y celulares y el
suministro dirigido específico de células, necesitan ser abordados y superados para utilizar
ribozimas en terapias. Las ribozimas se pueden apenas incorporar en las células en sus formas
desnudas y con frecuencia requieren un vehículo para un suministro eficiente. Se han utilizado
muchas clases de nanomateriales incluyendo liposomas catiónicos, micelas de polímero catiónico
[147] y ácidos nucleicos esféricos compuestos de núcleo inorgánico y cáscara de ácido nucleico
altamente orientada y densamente empaquetada [148] como vehículos de suministro para prevenir
la degradación dependiente de nucleasa y para mejorar la célula -targeting y la transducción
intracelular [143].
La ingeniería genética es una poderosa herramienta para crear genes artificiales para proteínas y
enzimas con propiedades deseadas, mejoradas y múltiples, tales como reconocimiento molecular,
unión molecular, autoensamblaje, catálisis, transporte molecular, transducción de señales,
transferencia de energía, transferencia de electrones y luminiscencia, Que contribuyen a desarrollar
nuevos nanobiomateriales, nanobiodevices y nanobiosistemas. Esta tecnología se ha empleado para
desarrollar genes in vitro a través de un proceso iterativo que consiste en la generación
recombinante. Junto con el poderoso HTS o métodos de selección, la ingeniería genética se ha
aplicado ampliamente para resolver problemas en la ingeniería de proteínas. Esta tecnología incluye
tecnologías para la manipulación directa de genes, tales como mutagénesis génica, amplificación de
secuencia de ADN [por ejemplo, PCR y amplificación de círculo rodante (RCA)], mezcla de ADN y
fusión génica.
Existen muchos métodos para generar diversidad genética y crear bibliotecas combinatorias. Por
ejemplo, en la última década se han desarrollado diversas técnicas de manipulación génica in vitro
que permiten diversos tipos de cambios dirigidos en un gen mediante la modificación (inserción,
deleción o sustitución) de uno o más codones (mutagénesis génica), intercambio de dominios entre
los genes relacionados (DNA shuffling) y fusionando dominios de diferentes secuencias de genes
funcionales (fusión de genes), dando como resultado la creación de diversas colecciones de clones
de genes mutantes. Existen dos tipos principales de mutagénesis, es decir, la mutagénesis aleatoria
y dirigida.
La mutagénesis dirigida a un sitio es un método para alterar una secuencia génica en una
localización seleccionada usando PCR de extensión superpuesta. Las mutaciones puntuales,
inserciones o deleciones se introducen incorporando cebadores de ADN que contienen la
modificación deseada con una ADN polimerasa en una reacción de amplificación. La mutagénesis
de saturación de sitios permite además la sustitución de sitios de proteína predeterminados contra
los veinte posibles AAs a la vez empleando cebadores degenerados en los que las tres bases del
codón dirigido son reemplazadas por mezclas, más comúnmente NNN o NNK (N = A, C, G O T, K = G
o T). Un codón completamente aleatorio, NNN, da como resultado un tamaño de biblioteca de 64
secuencias diferentes que codifican todos los 20 AA y 3 codones de parada. Por otra parte, los
codones NNK reducen el tamaño de la biblioteca a la mitad, todavía codificando 20 AA, con la
ventaja de tener sólo un codón de parada. En esta configuración, los AAs W, F, I, Y, Q, N, H, K, D, E,
M y C están codificados por un solo codón, mientras que G, A, V, P y T y L , S, y R son codificados por
dos y tres codones, respectivamente [154].
El mezclado de ADN es un método para la recombinación in vitro de genes homólogos para generar
rápidamente una gran biblioteca de genes de progenie quiméricos que incorporan fragmentos de
secuencia de un número de genes progenitores mediante fragmentación aleatoria mediante DNasa
I y extensión de PCR sin cebadores para reensamblaje; Este proceso es seguido por amplificación
por PCR con cebadores para generar quimeras de longitud completa adecuadas para la clonación
en un vector de expresión (Fig. 16a) [155]. Un inconveniente significativo de este método de
barajado de ADN es la baja frecuencia de genes quiméricos en la biblioteca barajada, lo que puede
ser debido a la formación homo-dúplex de fragmentos de ADN derivados de los mismos genes
parentales en la etapa de recocido, cuya probabilidad es Mucho mayor que la de la formación
heterodúplex. Para resolver este problema, se
Puede usarse el método de mezclado de ADN; Este método implica la fragmentación de los genes
parentales utilizando enzimas de restricción en lugar de DNasa I [156] o utiliza singlestranded ADN
(ssDNA) plantillas en lugar de dsDNA plantillas para DNase I fragmentación [157]. Puesto que el uso
de ssDNA como plantillas disminuirá la probabilidad de formación homo-dúplex, el porcentaje de
los genes parentales en la biblioteca barajada debe ser reducido significativamente.
Educado El mezclado de ADN se ha extendido a familias de genes distantes o completamente no
relacionadas, que requieren métodos que no dependen de la recombinación homóloga debido al
grado de divergencia de secuencias. Secuencia homología independiente de la recombinación de
proteínas [158] y truncamiento incremental para la creación de enzimas híbridas conducen a la
formación de genes quiméricos (Fig. 16b] [159]. La reordenación de estas quimeras por barajar
produce híbridos funcionales [160]. La principal ventaja de estos métodos es que el conocimiento
sobre la estructura de la proteína detallada no es necesario [161].
Exon barajar es un mecanismo molecular natural para la formación de nuevos genes eucariotas. Las
nuevas combinaciones de exones pueden ser generadas por recombinación dentro de las
secuencias de intrones intermedias, dando nuevos genes reordenados con funciones alteradas. El
proceso natural de exon barajar puede imitarse in vitro mediante la generación de bibliotecas de
genes exon-barajados y, posteriormente, la detección de ADN objetivo de las bibliotecas [162]. En
este método, los exones o combinaciones de exones que codifican dominios de proteínas se
amplifican mediante PCR usando mezclas de oligonucleótidos quiméricos que determinan qué
exones se empalman juntos. Por medio de una reacción de polimerasa de superposición de
autocebado, las mezclas de estos fragmentos de PCR se combinan combinatoriamente en genes de
longitud completa. La recombinación se realiza conectando un exón de un gen a un exón de un gen
diferente. De esta manera, dos o más exones de diferentes genes se pueden combinar
conjuntamente ectópicamente, o el mismo exón puede ser duplicado, para crear una nueva
estructura exón-intrón.
Los genes de fusión se crean mediante la fusión genética de los marcos de lectura abiertos de dos
o más genes en el marco a través de la ligadura o PCR de extensión de solapamiento. Para construir
tales genes de fusión, son posibles dos tipos de conexión. Una es la fusión "de extremo a extremo",
en la que el extremo 5 'de un gen está unido al extremo 3' del otro gen. La segunda es la fusión
insercional, en la que un gen se inserta en el marco en el centro del otro gen padre [163]. Estos
métodos ofrecen varias ventajas para la producción de genes de fusión con alto rendimiento en
diferentes orientaciones e incluyendo secuencias enlazador para maximizar el rendimiento de los
socios de fusión [164].
[161]. Sin embargo, el principal inconveniente del rediseño de proteínas es que el conocimiento
estructural detallado de una proteína a menudo no está disponible, e incluso cuando está
disponible, las sustituciones en sitios enterrados dentro de las proteínas son más propensas a
romper sus estructuras y funciones. Por lo tanto, todavía es muy difícil predecir los efectos de
diversas mutaciones en las propiedades estructurales y funcionales de la proteína mutada, aunque
muchos estudios se han hecho para predecir los efectos de las sustituciones de AA en las funciones
de proteínas [168]. Otro método racional de diseño de proteínas es el diseño de proteínas
computacionales, que tiene como objetivo el diseño de nuevas moléculas de proteínas con una
estructura de proteínas diana plegable, función y / o comportamiento novedoso. En este enfoque,
las proteínas se pueden diseñar mediante la configuración trascendental de AA secuencias
compatibles con estructuras existentes o postulados plantilla de la columna vertebral (de novo
diseño) o haciendo variaciones calculadas a una estructura de proteínas conocidas y su secuencia
(proteína rediseño) [169]. Los enfoques de diseño de proteínas racionales hacen predecir secuencias
AA de proteínas que se doblarán en estructuras 3D específicas. Posteriormente, estas secuencias
predichas deben ser validadas experimentalmente a través de la síntesis química de un gen artificial,
seguido por la expresión y purificación de la proteína. Los detalles de los métodos computacionales
de diseño de proteínas no serán cubiertos en esta revisión; Los lectores se remiten a varias
revisiones recientemente publicadas [170, 171].
El enfoque de evolución dirigida (Figura 17, el panel de la derecha) implica muchas tecnologías,
tales como la diversificación de bibliotecas de genes, las tecnologías de vinculación genotipo-
fenotipo, tecnologías de visualización, síntesis de proteínas libres de células y tecnologías de
detección y evaluación de fenotipo. ]. Este enfoque imita el proceso de selección natural (evolución
darwiniana) para evolucionar las proteínas hacia una meta objetivo. Implica someter un gen a
rondas iterativas de mutagénesis (creación de una biblioteca molecular con diversidad suficiente
para la función alterada), selección (expresión de las variantes y miembros aislantes con la función
deseada) y amplificación (generación de una plantilla para la siguiente ronda). Este proceso se
puede realizar in vivo (en células vivas), o in vitro (libre en soluciones o microgotas). La diversidad
molecular se crea típicamente mediante diversos métodos de mutagénesis aleatoria y / o
recombinación génica in vitro, como se describe en "Gene engineering".
Las variantes funcionalmente mejoradas se identifican mediante un método HTS o de selección y
luego se usan como los padres para la próxima ronda de evolución. El éxito de la evolución dirigida
depende de las opciones de ambos
Los métodos de generación de la diversidad y los métodos de selección / HTS. La tecnología clave
de HTS / métodos de selección es la vinculación del genotipo (el ácido nucleico que se puede
replicar) y el fenotipo (el rasgo funcional, como la unión o la actividad catalítica). La selección de
aptámeros y ribozimas a partir de las bibliotecas de ácido nucleico se puede realizar mucho más
rápido que las de las proteínas funcionales porque los propios ácidos nucleicos tienen actividades
de unión o catalíticas (es decir, fenotipos seleccionables), de tal manera que el genotipo y el fenotipo
son idénticos. Sin embargo, puesto que las proteínas no pueden ser amplificadas, es necesario tener
un enlace entre el fenotipo exhibido por la proteína y el genotipo (ARNm o ADN) que lo codifica para
desarrollar proteínas.
Las tecnologías de visualización in vitro se basan en sistemas CFPS. Los avances recientes en las
tecnologías y aplicaciones del CFPS se han revisado en otra parte [182-185]. La tecnología de
visualización de ARN incluye la visualización de ARNm y la visualización de ribosomas [186]. MRNA
muestra de forma covalente una proteína a su ARNm de codificación a través de un enlazador de
puromicina que está unido covalentemente a la proteína a través de la formación de enlaces
peptídicos catalizada por ribosomas. La presentación de ribosomas vincula no covalentemente una
proteína a su ARNm de codificación genéticamente fusionado a una secuencia espaciadora que
carece de un codón de parada a través de un ribosoma porque la proteína naciente no se disocia
del ribosoma. Tales tecnologías de visualización que utilizan reacciones de traducción in vitro
pueden detectar proteínas que serían
Tóxicas para las células y pueden cubrir bibliotecas bastante grandes (1015) evitando el cuello de
botella restringido del tamaño de la biblioteca de las tecnologías de visualización in vivo (Tabla 1).
Existen varias tecnologías de visualización de ADN in vitro, tales como visualización CIS [187],
visualización de M. Hae III [188], visualización STABLE [189], visualización de microbead [190] y
compartimentación in vitro (IVC) [191]. CIS mostrar enlaces no covalentemente RepA (proteína de
unión a ADN) proteína de fusión y su plantilla de ADN de codificación a través de la interacción entre
RepA y el elemento CIS de la plantilla de ADN. Para la presentación de M. Hae III, la ADN
metiltransferasa M. HaeIII enlaza covalentemente una proteína y su plantilla de ADN. La tecnología
IVC utiliza las gotitas acuosas en emulsiones agua-aceite para compartimentar genes individuales y
productos génicos. Las tecnologías de exhibición STABLE y de microperlas utilizan la unión de
biotina-estreptavidina no covalente para unir plantillas de ADN marcadas con biotina y proteínas
fusionadas con estreptavidina.
Los detalles de HTS y métodos de selección, como la fluorescencia de células activadas por
clasificación de fenotipo basado en la detección y evaluación de tecnologías junto con estas
tecnologías de visualización [172, 192-195], así como las aplicaciones de la evolución dirigida de las
enzimas, anticuerpos, receptores Y otras proteínas en áreas tales como cuestiones ambientales,
catálisis, terapia génica y desarrollo terapéutico de proteínas y vacunas no serán cubiertas en esta
revisión; Los lectores se refieren a varios artículos y revisiones recientemente publicados [42, 172,
175, 177, 180, 181, 186, 187, 193-208].
Recientes, los avances significativos en la ingeniería de proteínas han llegado a través de métodos
computacionales, tales como SCHEMA, ProSAR y ROSETTA. El diseño computacional basado en estos
métodos disminuye en gran medida la necesidad de probar espacio de secuencia aleatorizado,
haciendo la ruta a nuevos biocatalizadores mucho más eficiente [195, 209-212]. Por lo tanto, en el
futuro, un conocimiento más detallado sobre la relación entre las estructuras y funciones de las
proteínas, así como los avances en la tecnología de alto rendimiento, puede ampliar enormemente
las capacidades de la ingeniería de proteínas.
Materiales orgánicos para uso en nanobio / bionanotecnología. Estas tecnologías van desde las
clásicas tecnologías de bioconjugación química dirigidas a los AA naturales hasta enfoques más
sofisticados, como la incorporación antinatural de AA (SAU) basada en la supresión del codón de
detención ámbar, las conjugaciones químicas bio-ortogonales, las ligaciones proteicas químicas y
las conjugaciones enzimáticas
Las tecnologías de conjugación quımica estándar para proteınas se dirigen a las cadenas laterales
de AA naturales, tales como los grupos amina primarios (R-NH2) del residuo Lys y el extremo N, los
grupos ácido carboxılico (R-COOH) de Asp, Glu y C , El grupo tiol (R-SH) de Cys, el anillo de fenilo de
tirosina (Tyr) y el anillo de indol de triptófano (Trp) (Fig. 19) [213].
Lys es uno de los residuos AA más comunes en proteínas con una abundancia media de
aproximadamente 6% y es a menudo expuesto a la superficie debido a su hidrofilicidad; Por lo tanto,
es un excelente sitio objetivo para la conjugación. Por otra parte, el extremo N-terminal proporciona
una posición más sitética, pero no siempre está expuesta a la superficie. La amina primaria de Lys
se ha funcionalizado predominantemente con ésteres de N-hidroxisuccinimidilo (ésteres de NHS),
sulfatos de éster de NHS o isotiocianatos. En estos reactivos electrófilos, los ésteres de NHS son muy
utilizados para la funcionalización dirigida a amina primaria debido a la sencillez de reacción. Una
limitación de los ésteres NHS es una reacción secundaria de hidrólisis en agua (<5 horas de vida
media), que se acelera a medida que el pH aumenta por encima de 7. Esta hidrólisis compite con las
reacciones deseadas y reduce la eficiencia de la reacción [214]. El N-terminal puede selectivamente
dirigirse para modificación cuando es suficientemente accesible y no se modifica después de la
traducción. La reacción de transaminación mediada por piridoxal-5-fosfato puede aplicarse a la
modificación del residuo N-terminal sin la presencia de codisolventes orgánicos de Cu (II) o
desnaturalizantes, aunque las proteínas que poseen serina N-terminal (Ser), treonina (Thr ), Cys o
Trp serán incompatibles con este método debido a reacciones secundarias conocidas con aldehídos
[215].
Asp y Glu son también los residuos AA más comunes en las proteínas naturales; Tienen una
abundancia media de aproximadamente el 12%, están a menudo expuestos a la superficie y son
excelentes sitios de conjugación objetivo. Las cadenas laterales de ácido carboxílico de Asp, Glu y el
extremo C pueden ser funcionalizadas por química de carbodiimida, típicamente usando EDC, que
ha sido ampliamente utilizado para reticular covalentemente un ácido carboxílico y amina. Sin
embargo, la abundancia relativamente alta de Lys, Asp y Glu y la alta accesibilidad al disolvente de
sus cadenas laterales hacen imposible modificar un único sitio sobre la superficie de la proteína
usando estos métodos.
Los métodos convencionales para la conjugación de Trp, que tiene una abundancia media de
aproximadamente el 1%, requieren metales pesados tóxicos o condiciones bioquímicamente
incompatibles. Algunos de estos métodos también muestran reactividad cruzada con otros AA
(particularmente Tyr), limitando así la gama de aplicaciones. Recientemente, se informó un método
libre de metal de transición usando 9-azabiciclo [3.3.1] nonano-3-on-N-oxilo (ceto-ABNO) para la
conjugación de Trp. Este nuevo método mostró novedosas características, como la alta selectividad
de Trp, la formación de conjugados únicos con alta homogeneidad, una fácil conjugación a
temperatura ambiente y un pH casi neutro y un corto tiempo de reacción [218].
Aunque la sustitución específica del sitio de los AA con AA raros, tales como Cys o Tyr, proporciona
múltiples opciones para la funcionalización covalente de las proteínas, es posible dañar el
plegamiento o función de las proteínas cuando las modificaciones genéticas para tales
conjugaciones químicas llegan a ser demasiado extenso. La incorporación de SAU en proteínas
permite una mayor flexibilidad en las modificaciones de proteínas. A diferencia de los residuos
naturales de AA, estos UAA pueden contener restos reactivos totalmente únicos, tales como grupos
azida, ciano, yodo, bromo, boc y dansilo, y por lo tanto proporcionar una reactividad
completamente bioortogonal que puede ocurrir dentro de sistemas vivos sin interferir con procesos
bioquímicos nativos . La incorporación específica de sitio (SSI) de SAU utiliza codones sin sentido
para incorporar uno o unos pocos SAU en una única o múltiples localizaciones definidas en una
proteína. Normalmente se emplea la supresión del codón de detención ámbar, en la que el codón
de localización de destino se transforma en un codón de parada ámbar [219]. Para incorporar la
SAU, se diseña un ARNt y una ARNt-sintetasa de aminoacil (aaRS) para emparejarse con la SAU y
reconocer el codón ámbar como un codón de sentido. SSI sustituye un AA natural por un análogo
antinatural, en el que la aminoacil tRNA-sintetasa endógena (aaRS) acepta la UAA y aminoacila el
ARNt apropiado con la SAU. La incubación de un huésped de expresión auxotrófica en medio de
cultivo que contiene la SAU análoga en lugar del AA natural específico conduce a la incorporación
de SAU en casi todos los lugares en los que se habrían incorporado los AA naturales específicos. El
SSI de SAU se ha ampliado a los sistemas CFPS [219, 221].
Las proteínas o péptidos incorporados en UAA pueden conjugarse quimiolectualmente con otras
biomoléculas y materiales inorgánicos / orgánicos sintéticos que llevan grupos funcionales bio-
ortogonales. Otras biomoléculas, tales como ácidos nucleicos, lípidos y materiales inorgánicos /
orgánicos sintéticos modificados con grupos funcionales bio-ortogonales, pueden someterse
también quimioselectivamente a una reacción de bioconjugación. Esta reacción debe producirse en
una solución acuosa a un pH casi fisiológico, tener una cinética rápida incluso con concentraciones
submilimolares de reactivos y ocurrir a temperaturas fisiológicas. Las reacciones químicas que
satisfacen estos requisitos incluyen las condensaciones de ceton / hidroxiamina, la cicloadición de
Huisgen [3 + 2], la ligadura de Staudinger, las cicloadiciones de Diels-Alder y las cicloadiciones de
foto-Click (Fig. 20) [224, 225].
Los grupos carbonilo de aldehídos y cetonas pueden reaccionar específicamente con fuertes
nucleófilos de efecto α, tales como hidrazidas (R-N-NH2) y alcoxiaminas (R-O-NH2), en condiciones
ácidas (pH 4-6) para producir hidrazonas estables Y oximas, respectivamente. Dado que estas
condensaciones de cetona / aldehído muestran una cinética más bien lenta con constantes de
velocidad de segundo orden, son necesarios grandes excesos del reactivo de conjugación para
conseguir una buena eficacia de marcado. En general, las condensaciones de cetona / aldehído son
las más adecuadas para las reacciones de conjugación in vitro o en la superficie celular porque la
reacción requiere un pH ácido y altas concentraciones del reactivo de marcaje, que son
problemáticas en términos de toxicidad celular [224].
La ligadura química nativa (NCL) se ha convertido en el método más general y robusto para la
conjugación de proteínas-péptidos, proteínas-proteínas, proteínas-ADN y proteínas-NP, ya que es
simple, general y de alto rendimiento. ]. NCL es una reacción de acoplamiento quimioselectiva Fig.
20 Reacciones de bioconjugación quimioselectiva. A Condensaciones de cetona / hidroxilamina. B
Cicladiciones de huisgén alquino-azida catalizadas con cobre. C Cicloadiciones de alquino-azida
promovidas por la deformación. D Ligadura de Staudinger. E Diel-Alder cicloadiciones. F Photo-click
cycleadditions) que genera un enlace peptídico nativo por una transioesterifcación reversible entre
un fragmento peptídico que contiene un resto Cys N-terminal (α- Cys) y otro fragmento peptídico
que porta un grupo α-tioéster C-terminal, seguido por un cambio de acilo NS intramolecular
irreversible (Figura 21). Esta reacción procede efi cientemente en condiciones fisiológicas y es
compatible con todas las cadenas laterales naturales de AA. Por lo tanto, a través de la preparación
recombinante de proteínas que tienen un residuo α-Cys, NCL puede usarse para generar proteínas
que contienen modificaciones en sus extremos N. Es ventajoso llevar a cabo NCL en una solución
acuosa a un pH neutro incluso aunque un derivado de α-tioéster C-terminal pueda ser hidrolizado
competitivamente. Se han revisado extensiones recientes de NCL, como la aceleración de la
velocidad de ligación, las modificaciones quimioselectivas después de la ligadura y la ligadura
aerodinámica de múltiples fragmentos peptídicos [227].
Splicing (PTS) son ambas tecnologías de conjugación química basadas en inteina que permiten el
ensamblaje de una proteína a partir de bloques constructivos de polipéptidos sintéticos sintéticos
más pequeños y / o recombinantes (Figura 22). Una inteina es un dominio de proteína interno que
puede autocatalíticamente excisarse a sí mismo a partir de una proteína precursora. El empalme en
cis de inteina mediante la adición de altas concentraciones de derivados de tiol puede usarse para
generar un α-tioéster C-terminal de una proteína de fusión de proteína-inteina. En EPL, uno o más
de los péptidos son de origen recombinante, pero el paso de ligación real es todavía un proceso
químico y puede realizarse bajo una amplia gama de reacciones para introducir una variedad de
materiales funcionales, tales como fuoróforos, SAU, etiquetas isotópicas , Y modificaciones post-
translacional, en un gran número de proteínas [228]. Por el contrario, PTS enlaza
posttranslacionalmente dos fragmentos de proteína recombinante. Un dominio de intein se divide
en dos fragmentos (intein de división o interinidad de interconexión de trans), IntN e IntC, que se
fusionan con los polipéptidos de desvío, denominados exteínas N y C (ExN y ExC). El paso de ligadura
en PTS debe realizarse en condiciones compatibles con el plegamiento de proteínas, ya que el
proceso implica la reconstitución funcional de una inteina dividida. En este paso, ExN-IntN e IntC-
ExC se asocian, se pliegan para formar un intein funcional, restauran la actividad autocatalítica de
empalme de proteínas para excisar el IntN-IntC y ligan el ExN y ExC de fanking con un enlace
peptídico de Cys.
Aunque los avances en NCL, EPL y PTS permitieron introducir con precisión una variedad de
materiales funcionales en péptidos y proteínas, estas tecnologías también tienen algunos
inconvenientes, como sigue. (1) La preparación de α-tioésteres de péptidos sintéticos sigue siendo
técnicamente difícil. (2) Dado que el proceso de ligación es una reacción química, se requieren las
concentraciones más altas de ambos o de cualquiera de los reactivos. (3) La aplicación de EPL a
muchas proteínas que contienen enlaces disulfuro es restringida o complicada debido a que se
necesita el uso de altas concentraciones (usualmente más de varias decenas de mM) de derivados
de tiol para inducir la tiolisis de las fusiones proteína-inteina. (4) La expresión de proteínas de fusión
basadas en inteina da lugar a menudo a la formación de cuerpos de inclusión debido a los grandes
tamaños de proteínas y la escasa solubilidad, lo que requiere etapas de replegamiento adicionales.
Fig. 21 Ligadura química nativa. La unión química nativa (NCL) es una reacción de acoplamiento quimioselectiva que enlaza
un fragmento peptídico que contiene un resto Cys (α-Cys) N-terminal y otro fragmento peptídico que lleva un grupo α-
tioéster C-terminal por un enlace peptídico nativo Permiso de: Ref. [106] Copyright (2012) Springer)
Fig. 22 Conjugación química basada en Intein. A La ligación de proteínas expresada (EPL) es una versión semisintética de
NCL en la que los polipéptidos sintéticos y recombinantes son ligados quımicamente juntos. Las proteínas (A) expresadas
como fusiones de inteina pueden escindirse de la inteina con una variedad de tioles para dar el correspondiente derivado
de α-tioéster. Las proteínas (B) que contienen Cys N-terminal se pueden fabricar de forma recombinante enmascarando la
Cys con una etiqueta de proteasa que puede ser removida más tarde. B El trans-splicing de proteína (PTS) vincula post-
traduccionalmente dos fragmentos de proteína. Un dominio intein se divide en dos fragmentos, IntN e IntC, que se fusionan
con las exteins de desvío, ExN y ExC. ExN-IntN e IntC -ExC se asocian y se doblan para formar un inteín funcional. Esta
inteína funcional puede restaurar la actividad de empalme de proteínas para excisarse a sí misma y para conjugar ExN y
ExC con un enlace peptídico (Figuras adaptadas con permiso de: Ref. [106] Copyright (2012) Springer)
3.4.5.2 La PFTasa PFTasa es una enzima heterodímero α / β que cataliza la transferencia de un grupo
farnesil isoprenoide del pirofosfato de farnesilo (FPP) a través de un enlace tioéter a un átomo de
azufre sobre una Cys en una secuencia tetrapeptídica (denominada CA1A2X-box, Aquí C es Cys, A1
y A2 son AA alifáticos, y X es uno de una variedad de AA) cuatro residuos del extremo C (Fig. 23b).
Debido a que la PFTasa puede tolerar muchas modificaciones sencillas al sustrato isoprenoide que
contiene aldehído, puede usarse para introducir una gama diversa de funcionalidades en proteínas
que contienen una caja CA1A2X situada en el extremo C-terminal. Posteriormente se pueden usar
reacciones quimioselectivas subsiguientes con la proteína resultante para una amplia gama de
aplicaciones. La actividad catalítica de la PFTasa hacia diversos análogos de FPP se ha mejorado
enormemente mediante la mutagénesis dirigida al sitio alrededor de la bolsa de unión al sustrato
de la PFTasa [234].
3.4.5.3 La NMTasa NMTasa de Candida albicans cataliza la transferencia de acilo de ácido mirístico
de myristoylCoA al grupo amino de un residuo de glicina N-terminal (Gly) de una proteína para
formar un enlace amida. NMTasa reconoce la secuencia GXXX (S / T), donde X puede ser cualquier
AA (Figura 23c). Esta enzima puede transferir con éxito análogos de ácido mirístico que contienen
alquino y azida que incorporan los grupos bioortogonales en el extremo distal del lípido al residuo
Gly N-terminal de proteínas recombinantes que contienen un motivo de miristoilación N-terminal.
Este método proporciona un método conveniente y potencialmente general para el marcado de
proteínas recombinantes con especificación N-terminal [235].
3.4.5.4 BirA BirA de E. coli cataliza la formación de enlace amida dependiente de trifosfato de
adenosina (ATP) entre el grupo carboxílico de la biotina y el grupo ε-amino de un Lys en una
secuencia de péptido aceptor (23 residuos AA) (figura 23d ). Tis aceptor secuencia fue optimizado a
una 15-AA aceptor péptido secuencia (GLNDIFEAQKIEWHE) [236]. BirA puede usarse para conjugar
especıficamente un resto de biotina a proteınas recombinantes mediante la fusión genética de la
secuencia del péptido aceptor de reconocimiento de BirA con la proteına diana. El marcaje
enzimático de biotina a una proteína permite la formación subsiguiente de conjugado no covalente
muy fuerte con avidina debido a la baja constante de disociación entre biotina y avidina (~ 10-15
M). Otra secuencia aceptor ortogonal para la levadura BirA se ha desarrollado más para permitir
twocolor imágenes [237]. La tolerancia al sustrato de BirA también se expandió a análogos de
biotina, incluidos los grupos cetona, azida y alquino, que contienen funcionalidades alternativas
adecuadas para las reacciones bioortogónicas [238].
3.4.5.5 LAL LAL de E. coli cataliza la formación de enlace amida dependiente de ATP entre el grupo
carboxílico del ácido lipoico y el grupo ε-amino de una lisina en una secuencia optimizada de aceptor
de reconocimiento 13-AA (GFEIDKVWYDLDA) (Figura 23e). El residuo Te Trp 37 en la bolsa de unión
al ácido lipoico de LAL se sustituyó con pequeños residuos AA para aceptar una gama más amplia
de análogos de ácido lipoico que contenían un resto azida alifática, aril-aldehído o aril-hidrazina
[239]. Estos análogos de ácido lipoico se unen a un residuo de Lys en la secuencia aceptor de una
proteína y luego se usan para conjugar diversas moléculas funcionales mediante reacciones
bioortogonales.
3.4.5.6 MTGasa La transglutaminasa es una enzima única que cataliza la reacción de transferencia
de acilo entre el grupo γ-carboxiamida de un residuo Gln en proteínas y una amplia variedad de
aminas primarias no ramificadas, comúnmente el grupo ε-amino de un residuo Lys y las formas Un
enlace isopéptido entre la cadena lateral de residuos de Gln y aminas primarias (figura 23f). Debido
a que esta reacción de conjugación es irreversible, implica la liberación de amoníaco y procede
rápidamente incluso en condiciones de baja temperatura (~ 15 ° C), el producto de conjugación es
estable y se puede obtener un alto rendimiento. MTGase se aísla de Streptomyces mobaraensis,
que es ampliamente utilizado en la industria alimentaria, y reconoce varias secuencias de péptidos
que consisten en residuos de Gln. Se observó una correlación notable entre las regiones de la cadena
polipeptídica del factor de alta temperatura (factor B) determinado cristalográficamente y los sitios
de ataque de MTGasa, indicando así el papel de la movilidad de la cadena polipeptídica o el
despliegue local al dictar modificaciones enzimáticas específicas del sitio [240]. En consecuencia, la
fexibilidad mejorada de la cadena del polipéptido MTGasa limita la reacción enzimática con residuos
Gln sobre polipéptido rígido en proteínas globulares. Por lo tanto, es posible predecir el sitio o sitios
de las modificaciones de residuos de Gln por MTGasa sobre la base de la estructura local y la
dinámica de la cadena polipeptídica que contiene el residuo de Gln. Debido a su apertura con
respecto al sustrato de amina primaria, la MTGasa es un catalizador atractivo para generar
conjugados de proteínas con pequeñas moléculas funcionales, lípidos, ácidos nucleicos, polímeros
sintéticos, por ejemplo, PEG, péptidos e incluso otras proteínas. Aunque la especificidad del sustrato
de la MTGasa hacia la secuencia polipeptídica que contiene un residuo de Gln (etiqueta Q) no ha
sido todavía clarificada, la etiqueta Q derivada de los polipéptidos de proteínas globulares, el
ribonucleasa S-péptido (KETAAAKFERQHMDS y su Lys a Ala- El péptido de hélice F de la mioglobina
de corazón de caballo (PLAQSH) o el marcador oligo-Gly N-terminal diseñado (N-Gly5), que se
reconocen como un sustrato de Gln por MTGasa, pueden utilizarse como Q- Etiqueta sustratos [108,
241-244]. Para la modificación de la proteína por MTGasa, estas marcas Q se incorporan en el
extremo N o C o dentro de la región de bucle de las proteínas por medios genéticos. Posteriormente,
la MTGasa puede conjugar especıficamente el sitio Q-tag en la proteına con un enlazador sintético
corto que contiene amina primaria o una etiqueta de polipéptido que contiene residuo Lys (KTag)
que alberga un resto funcional. Sin embargo, uno de los inconvenientes de las proteínas de
conjugación que poseen muchos residuos de Lys y Gln es que la actividad de MTGasa hacia los
residuos de Gln y Lys hace difícil el control del sitio o sitios de modificación.
3.4.5.8 GST GST cataliza las reacciones de conjugación entre el residuo Cys de glutatión (GSH, γ-Glu-
CysGly) y varios electrofilos y permite a la célula desintoxicar xenobióticos in vivo (Figura 23h). La
naturaleza ubicua de GST facilita esta bioconjugación con polipéptidos que llevan un GSH N-terminal
en medios acuosos y permite la funcionalización quimio- y regioselectiva de un único grupo Cys tiol
de GSH basado en una reacción de sustitución aromática nucleófila entre restos Cys y
perfluoroarenos incluso en La presencia de otros residuos Cys no protegidos y grupos funcionales
reactivos sobre la misma cadena polipeptídica. Esta reacción de conjugación puede llevarse a cabo
en una amplia gama de temperaturas (4-60 ° C) y en un sistema co-disolvente con la adición de
disolventes orgánicos (hasta el 20%) [256]. Sin embargo, esta tecnologıa se limita actualmente a
acoplamientos basados en péptidos debido a la necesidad de una secuencia de γ-Glu-Cys-Gly N-
terminal y de una pareja de reacción de perfluorilo. 3.4.5.9 SpyLigase SpyLigase es una ligasa
artifacial obtenida mediante la ingeniería de un dominio (CnaB2) a partir de la proteína de adhesión
a Fbronectina FbaB de Streptococcus pyogenes (Spy), que es esencial para que las bacterias Invaden
las células humanas. Dentro de CnaB2, hay una modificación postraduccional para formar un enlace
isopéptido entre los residuos Lys31 y Asp117, que es catalizado por un residuo Glu77 adyacente.
Basándose en la estructura 3D y el mecanismo de formación de enlaces isopeptídicos de CnaB2, el
dominio se dividió racionalmente en tres partes, SpyTag (AHIVMVDAYKPTK), KTag (ATHIKFSKRD) y
SpyLigase (11 kDa, que contiene el residuo catalítico Glu77). SpyLigase se derivó de CnaB2 frst por
la eliminación de SpyTag y KTag, y luego por permutación circular a través de la sustitución de
residuos de la C-terminal de CnaB2 con un Gly / Ser vinculante, seguido de N-terminal CnaB2
residuos. SpyLigase no sólo puede ligar KTag y SpyTag fusionado en el extremo C o N de los péptidos,
sino que también puede dirigir la ligadura de KTag a SpyTag insertado en el centro de una proteína
(Figura 23i). El rendimiento de los productos de conjugación disminuyó de aproximadamente 50-
10% al elevar la temperatura de reacción de 4 a 37 ° C, probablemente debido a un cambio dinámico
en la estructura secundaria de SpyLigase [257].
3.4.5.9 SpyLigase SpyLigase es una ligasa artifacial obtenida mediante la ingeniería de un dominio
(CnaB2) de la proteína FbaB de adherencia de fbronectina de Streptococcus pyogenes (Spy), que es
esencial para que las bacterias invadan células humanas. Dentro de CnaB2, hay una modificación
postraduccional para formar un enlace isopéptido entre los residuos Lys31 y Asp117, que es
catalizado por un residuo Glu77 adyacente. Basándose en la estructura 3D y el mecanismo de
formación de enlaces isopeptídicos de CnaB2, el dominio se dividió racionalmente en tres partes,
SpyTag (AHIVMVDAYKPTK), KTag (ATHIKFSKRD) y SpyLigase (11 kDa, que contiene el residuo
catalítico Glu77). SpyLigase se derivó de CnaB2 frst por la eliminación de SpyTag y KTag, y luego por
permutación circular a través de la sustitución de residuos de la C-terminal de CnaB2 con un Gly /
Ser vinculante, seguido de N-terminal CnaB2 residuos. SpyLigase no sólo puede ligar KTag y SpyTag
fusionado en el extremo C o N de los péptidos, sino que también puede dirigir la ligadura de KTag a
SpyTag insertado en el centro de una proteína (Figura 23i). El rendimiento de los productos de
conjugación disminuyó de aproximadamente 50-10% al elevar la temperatura de reacción de 4 a 37
° C, probablemente debido a un cambio dinámico en la estructura secundaria de SpyLigase [257].
3.4.6.1 La etiqueta SNAP de SNAP (20 kDa) se derivó de la proteína O6-alquilguanina-DNA alquil-
transferasa (AGT) de reparación del ADN humano. La función normal de AGT es reparar la guanina
alquilada con O6 en ADN transfiriendo el grupo alquilo en una reacción SN2 a un residuo Cys145
reactivo en AGT. El mecanismo de reparación es inusual debido a que la proteína está
irreversiblemente inactivada. Por consiguiente, la reacción de proteínas de fusión AGT con
derivados O6-bencilguanina (BG) que albergan restos funcionales conduce al etiquetado irreversible
y covalente de las proteínas de fusión ya que los restos funcionales sobre BG se transfieren junto
con el grupo bencilo de BG al Cys reactivo , Creando un enlace covalente tioéter estable. El marcaje
mediado por SNAP de proteínas en bacterias y levaduras es específico, puesto que las AGT
endógenas respectivas no aceptan BG como sustratos, mientras que las líneas celulares defcientes
a AGT deben usarse para el etiquetado en células de mamíferos [258].
3.4.6.3 HaloTag La haloalcano deshalogenasa de Rhodococcus (DhaA) elimina los haluros de los
hidrocarburos alifáticos mediante un mecanismo de desplazamiento nucleofílico. Durante la
catálisis se forma un enlace éster covalente entre un residuo de Asp106 en la enzima y el sustrato
de hidrocarburo. La hidrólisis catalizada por la base de este intermedio covalente libera
posteriormente el hidrocarburo como un alcohol y regenera el nucleófilo Asp106 para ciclos
adicionales de catálisis. Te basado en la catalización de clivaje está mediada por un residuo
conservado His272 situado cerca de la Asp106 nucleophile. HaloTag (33 kDa) se derivó de un DhaA
mutante, cuyo residuo catalítico His272 está sustituido con un residuo Phe y no exhibe la actividad
enzimática de la escisión intermedia. Sin embargo, las velocidades de unión aparentes de
haloalcanos a este mutante son bajas comparadas con las de interacciones basadas en la afnidad
comunes, tales como la biotina-estreptavidina, que obstaculizan potencialmente la utilidad práctica
de este mutante como una etiqueta proteica. Para superar esta cuestión, se identificaron varias
variantes con tasas de unión mejoradas dramáticamente usando una estrategia semi-racional,
modelación de complejo de unión de proteína-ligando, mutagénesis de saturación de sitio y HTS
para una cinética de unión más rápida. Un mutante con tres puntos de sustitución, Lys175Met / Cys-
176Gly / Tyr273Leu, es decir, HaloTag, tiene una constante de velocidad aparente de segundo orden
aparente, permitiendo así que la reacción de marcado alcance la terminación incluso bajo
concentraciones bajas de ligandos de haloalcano. La formación de enlaces covalentes entre el
HaloTag y el cloroalcano (14 átomos de longitud con 6 átomos de carbono proximales al cloro
terminal) funcionalizado con moléculas sintéticas pequeñas es muy específico, se produce
rápidamente en condiciones fisiológicas y es esencialmente irreversible. Por lo tanto, la proteína
fusionada con HaloTag puede marcarse covalentemente con una diversidad de ligadores de
cloroalcano modificados por grupos funcionales y puede aplicarse a una amplia gama de
marcadores fluorescentes, asas de alimentación o soportes sólidos.
3.4.6.4 El tag TMP (TMP) -tag (18 kDa) se derivó de la dihidrofolato reductasa de E. coli (eDHFR), que
se une al TMP de inhibidor de molécula pequeña con una alta afnidad (~ 1 nM KD) y selectividad
(afnities para DHFR de mamífero son KD> 1 μM). La etiqueta TMP de primera generación aprovechó
la interacción de alta afnidad entre eDHFR y TMP para formar una unión de larga duración y sin
embargo reversible sin formación de enlace covalente. La marca TMP de segunda generación,
diseñada por autoetiquetado (Leu28Cys) explotó una reactividad de adición de Michael inducida
por proximidad entre un residuo Cys28 manipulado en la superficie eDHFR cerca del sitio de unión
de TMP y un electrofilo suave, tal como un α, β- Carbonilo insaturado, por ejemplo, el carbono \
beta de acrilamida, o un grupo sulfonilo instalado en los derivados de TMP. Para optimizar el
posicionamiento del residuo Cys nucleófilo y el electrófilo acrilamida de los derivados TMP, el sitio
de mutación puntual sobre la superficie eDHFR y la longitud de átomo del espaciador entre el grupo
4'-OH del TMP y el carbono β reactivo Del grupo funcional de acrilamida se investigaron basándose
en el modelado molecular de los complejos derivados de eDHFR y TMP. Después de la selección
combinatoria posterior in vitro, se seleccionó la combinación de la marca TMP (Leu28Cys) y los
derivados de TMP con un espaciador de 10 átomos y exhibió especificidad y efciencia superiores en
el marcaje de proteínas con fuóforos para la obtención de imágenes de células vivas [261]. Dado
que la etiqueta TMP covalente se basa en una reacción orgánica modular en lugar de una
modificación enzimática específica, es más fácil construir características adicionales en la etiqueta
TMP covalente. Las etiquetas de proteínas auto-etiquetadas, tales como las etiquetas SNAP, CLIP,
Halo y TMP, presentan especificidad exquisita y amplia aplicabilidad a las áreas de imágenes
subcelulares de proteínas en células vivas, la fabricación de proteína-ADN, proteína-péptido y
proteína-proteína Complejos e inmovilización de proteínas en materiales sólidos, pero están
limitados por su gran tamaño molecular (20-30 kDa) y derivados de sustratos caros, excepto para
HaloTag.
La ingeniería de enlaces es también una tecnología importante para controlar las distancias,
orientaciones e interacciones entre componentes funcionales reticulados en conjugados. Los
enlazadores son unidades indispensables para la fabricación de biomateriales multidimensionales o
complejos de materiales bio / orgánicos / inorgánicos. Dichos enlazadores se pueden clasificar como
enlazadores químicos o biológicos, tales como oligonucleótidos o polipéptidos.
Los enlazadores químicos se han utilizado ampliamente para modificar o reticular biomoléculas,
tales como proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y fármacos, polímeros sintéticos y superficies
sólidas con moléculas y materiales funcionales. Los enlazadores químicos pueden caracterizarse por
las siguientes propiedades: especificidad química, grupos reactivos, longitud del brazo espaciador,
solubilidad en agua, permeabilidad de la membrana celular, grupos espontáneamente reactivos o
fotorreactivos y escisión por estímulos tales como pH, redox y luz. Particularmente, la longitud del
brazo separador y la solubilidad en agua son parámetros importantes para modificaciones de
proteínas y reticulación usando ligadores químicos. Por ejemplo, cuando las biomoléculas están
funcionalizadas con moléculas pequeñas, tales como fuoróforos o grupos funcionales
bioortogonales, se utilizan brazos de metileno rígidos y cortos como espaciadores. Varios
photocleavable, ligadores químicos cortos también se desarrollaron para controlar las funciones de
las biomoléculas reticuladas [54, 262, 263]. Por el contrario, cuando las proteínas se funcionalizan
con materiales hidrófobos o grandes, los brazos espaciadores hidrófilos, fexibles, largos formados a
partir de cadenas de PEG se utilizan a menudo para aumentar la solubilidad en agua de los
enlazadores químicos funcionalizados y evitar el impedimento estérico entre proteínas y materiales
funcionalizados. Utilizamos cadenas de PEG como enlaces químicos para preparar un
inmunoconjugado de proteína fluorescente verde Fab' (GFP) para un inmunoensayo homogéneo
[264], un conjugado enzima-estreptavidina para el control de la actividad enzimática [265, 266], y
un Synechocystis sp. DnaB intein-TMP conjugado para la ligadura de proteínas in vitro [267], y los
resultados mostraron que la longitud de los enlazadores químicos PEG afecta tanto la eficacia de la
conjugación y la controlabilidad de la función de la proteína. También produjo conjugados de
anticuerpo-lípido y péptido-lípido para la visualización de la superficie celular [268-270] usando
conectores de cadena PEG. Aunque hay enormes aplicaciones de bioconjugación de biomoléculas
utilizando enlaces químicos, los detalles de las aplicaciones recientes se revisan en otra parte [271-
279].
3.5.2.3 Enlaces peptídicos flexibles Los enlazadores flexibles se adoptan frecuentemente como
enlazadores peptídicos interdominales naturales en proteínas multidominio cuando los dominios
unidos requieren cierto grado de movimiento o interacción. Basándose en el análisis de las
preferencias de AA para los residuos contenidos en estos enlazadores fexibles naturales, se ha
revelado que están generalmente compuestos de residuos pequeños, no polares (por ejemplo, Gly)
o polares (por ejemplo, Ser, Tr) [325]. El pequeño tamaño de estos residuos AA proporciona
fexibilidad y permite la movilidad de las unidades funcionales conectadas. La incorporación de Ser
o Tr puede mantener la estabilidad del enlazador peptídico en soluciones acuosas formando enlaces
de hidrógeno con moléculas de agua, reduciendo con ello las interacciones desfavorables entre las
porciones enlazadora y proteica. El enlazador fexible sintético más utilizado es el enlazador G4S,
(G4S) n, donde n indica el número de repeticiones de motivo G4S. Al cambiar el número de
repetición "n", la longitud de este enlazador G4S puede ajustarse para conseguir una separación
apropiada de la unidad funcional o para mantener las interacciones necesarias entre las unidades,
permitiendo así un plegado adecuado o logrando una actividad biológica óptima [324]. Los
enlazadores de Poly-Gly (Gn) también forman una estructura alargada similar a la de la
conformación inestable de 310 hélices. Puesto que Gly tiene la mayor libertad en los ángulos diedro
de la columna vertebral entre los AA naturales, se puede suponer que los enlazadores Gn son los
enlazadores polipeptídicos más "fexibles" [326]. Además de los enlazadores G4S y los enlazadores
poli-Gly, se han diseñado muchos otros enlaces fexibles, tales como KESGSVSSEQLAQFRSLD y
EGKSSGSGSESKST para la construcción de un fragmento variable de cadena única (scFv), buscando
bibliotecas de estructuras de péptidos 3D derivadas de datos de proteínas Bancos para la
reticulación de péptidos con adecuada VH y VL dimensiones moleculares [327]. Estos enlaces
fexibles son también ricos en AA pequeños o polares, tales como Gly, Ser y Tr, y contienen AA
adicionales, tales como Ala, para mantener fexibilidad, así como grandes AA polares, tales como Glu
y Lys, para aumentar La solubilidad de las proteínas de fusión.
3.5.2.4 Enlaces peptídicos rígidos Los ligadores rígidos actúan como espaciadores stif entre las
unidades funcionales de las proteínas de fusión para mantener sus funciones independientes. Los
ligadores rígidos tıpicos son ligadores peptıdicos formadores de hélice, tales como la poliprolina
(Pro) hélice (Pn), la hélice poli-Ala (An) y el péptido rico en Ala α-helixformante (EA3K) n, que se
estabilizan por los puentes salinos Entre Glu- y Lys + dentro de los motivos [328]. Las proteínas de
fusión con péptidos de enlace helicoidal son más térmicamente estables que aquellas con enlaces
fexibles. Esta propiedad se atribuyó a la estructura rígida del enlazador α-helicoidal, lo que podría
disminuir la interferencia entre los restos enlazados, lo que sugiere que los cambios en la estructura
del ligador y la longitud pueden afectar la estabilidad y la bioactividad de los restos funcionales. El
péptido rico en Pro (XP) n, con X designando cualquier AA, preferiblemente Ala, Lys, o Glu, también
puede restringir el enlazador a una conformación extendida con fexibilidad relativamente limitada.
El residuo Pro es un AA muy singular; Es un AA cíclico, y su cadena lateral se cicla de nuevo a la amida
en la columna vertebral, lo que restringe la confrmación de su columna vertebral a una pequeña
gama de ángulos de la columna vertebral. Dado que el residuo Pro no tiene hidrógeno amida para
formar un enlace de hidrógeno con otros AA, puede evitar las estructuras ordenadas y evitar las
interacciones entre los enlazadores y los dominios vecinos [324, 329]. Por lo tanto, Pro reside en
(XP) n los enlazadores pueden aumentar el stifness del enlazador y separar efectivamente los
dominios vecinos.
3.5.2.5 Enlazadores peptídicos específicos del sitio La tecnología de fusión genética proporciona un
medio eficaz para la expresión y purificación de proteínas recombinantes. Una revisión completa de
las etiquetas de afnity se puede encontrar en otra parte [292, 330]. Ejemplos de etiquetas de afnity
incluyen poli-His, FLAG, HA, estreptociclo II, el péptido de unión a calmodulina y el dominio de unión
a quitina. Estas etiquetas interactúan específicamente con sus moléculas asociadas y permiten que
la proteína fusionada sea capturada por las correspondientes matrices modificadas por moléculas
asociadas. En la mayoría de los casos, las etiquetas se eliminan de las proteínas de fusión después
de un proceso de purificación de asma asistida por afiliación para obtener el producto final
consistente en proteína diana pura. Tis se alcanza usualmente mediante escisión enzimática o
química en la unión entre la etiqueta y la proteína diana. Las endoproteasas comúnmente utilizadas
para escindir las etiquetas de fusión incluyen factor Xa (I (E / D) GR ↓ X), enterocinasa (DDDDK ↓
X), trombina (LVPR ↓ GS), proteasa del virus de ataque químico del tabaco (ENLYFQ ↓ (G / S) Un
derivado genéticamente modificado de la proteasa 3C del rinovirus humano, PreScission ™ (LEVLFQ
↓ GP) [329, 330]. Los productos químicos que son específicos y efcientes para la escisión química
de proteínas en solución son CNBr (Met $ ₁ $), 2- (2 '- nitrofenilsulfonil) - 3 - metil - 3 -
bromoindolenina (Trp $ ₁ $), ácido 2 nitro 5 tiocianobenzoico (Cys ↓), ácido fórmico (Asp ↓ Pro) e
hidroxilamina (Asn ↓ Gly) [331]. Aquí, la flecha hacia abajo y X entre paréntesis indican el sitio de
escisión del sitio de reconocimiento y cualquier AA, respectivamente. En general, la escisión
enzimática es específica del sitio y puede llevarse a cabo bajo condiciones suaves. Sin embargo, la
efciencia de escisión puede variar con diferentes proteínas de fusión. El impedimento estérico o la
presencia de residuos desfavorables alrededor del sitio de escisión podrían resultar en un
procesamiento inefciente. En contraste con la escisión enzimática, la escisión química es una
alternativa menos costosa pero requiere condiciones duras que pueden causar modificaciones en
las cadenas laterales. Además, puesto que la división química suele estar dirigida a residuos
especıficos o enlaces dipeptıdicos, la presencia frecuente del sitio de un solo o doble residuo
reconocido por estos productos quımicos dentro de la secuencia AA de la proteına diana limita su
uso [332]. Las etiquetas de autoclave son un grupo especial de etiquetas de fusión que están
basadas en módulos de proteína (por ejemplo, inteina, SrtA, el módulo FrpC y el dominio de
proteasa Cys) y poseen actividades proteolíticas inducibles. Las proteınas de fusión que las
contienen pueden estar auto-escindidas especıficamente por el sitio mediante el gatillo de un
compuesto de bajo peso molecular o un cambio en su conformación. Combinado con las etiquetas
de la afnity apropiadas, las etiquetas self-cleaving permiten la purificación de la proteína de fusión,
la división y la separación de la proteína de la blanco se logran en una sola etapa [332]. En el caso
de Intein-tag, la proteína diana se fusiona con el extremo N-terminal de inteina [por ejemplo, VMA
intein de Saccharomyces cerevisiae (51 kDa) o DnaB intein de Synechocystis sp. Cepa PCC6803 (17
kDa)], cuyo extremo C-terminal está conjugado con una etiqueta de afnity (figura 26a). La escisión
específica del sitio mediada por Intein puede desencadenarse mediante reactivos de tiol, tales como
ditiotreitol o β-mercaptoetanol. En cuanto a SrtA-tag, la proteína de fusión consiste en una etiqueta
de afnity N-terminal, un núcleo catalítico de SrtA, el motivo LPXTG y la proteína diana (Figura 26b).
La escisión de la resina se puede inducir por incubación en un bufer que contiene iones Ca2 +, y la
proteína diana liberada, con un resto Gly adicional en su extremo N, puede entonces ser recogida.
Sin embargo, este sistema tiene un inconveniente potencial. Aunque la actividad de SrtA de S.
aureus es inducible por los iones Ca2 + y condiciones moderadas, no se suprime completamente
durante la expresión de la proteína porque los iones Mg2 + solubles abundantes (103 a 104 veces
más en concentración que los iones Ca2 +) en el citosol pueden parcialmente Reemplazar los iones
Ca2 + en la función [333], que provoca indeseable fusión fusión en una etapa temprana.
El módulo Te FrpC es una proteína regulada por hierro producida por la bacteria Gram negativa
Neisseria meningitides. La construcción de fusión contiene la proteína diana, que está en el resto N
- terminal, y el módulo de auto - procesamiento marcado por la afiliación (SPM) (figura 26c). La
secuencia de codificación de ADN para las cuatro primeras AA de la SPM, que son Asp-Pro-Leu-Ala,
contiene un sitio de restricción NheI que puede usarse para la clonación. La adición de iones Ca2 +
induce la escisión mediada por SPM, dando como resultado la liberación de la proteína diana con
un resto de Asp extra en el extremo C-terminal. Vibrio cholerae segrega una toxina con repeticiones
grandes, multifuncionales, de auto-procesamiento; Esta toxina experimenta una escisión
proteolítica durante la translocación en las células huésped. La proteólisis de la toxina está mediada
por un dominio de proteasa Cys interno conservado (CPD), que se activa tras la unión de la molécula
pequeña de polifosfato de inositol (IP6). Afnity-etiquetados CPD puede fusionarse con el C-terminal
de la proteína objetivo (Figura 26d]. La adición de IP6 desencadena la segmentación mediada por
CPD, que permite liberar la proteína diana. Dependiendo del sitio de clonación utilizado, pueden
añadirse uno o más residuos adicionales al extremo C-terminal de la proteína diana. Otras
aplicaciones de enlazadores escindibles son sistemas de liberación de fármacos para liberar
unidades funcionales libres de proteínas de fusión in vivo. Estos enlazadores están diseñados para
escindirse en condiciones específicas, tales como la presencia de reactivos reductores o proteasas.
Tis permite a las proteínas de fusión reducir el impedimento estérico y mejorar tanto las acciones
independientes como las bioactividades de las unidades funcionales individuales después de la
escisión in vivo. La reducción de enlaces disulfuro in vivo se ha aplicado ampliamente para la
liberación de cargas útiles de sistemas de suministro de fármacos fabricados por tecnologías de
conjugación química. De manera similar, los enlazadores de disulfuro clivables in vivo fueron
diseñados para proteínas de fusión recombinantes [334, 335]. Uno de dichos enlaces disulfuro
(LEAGCKNFFPR ↓ SFTSCGSLE) se basa en un ditiociclopéptido que contiene un enlace disulfuro
intramolecular formado entre dos restos Cys en el enlazador, así como una secuencia de
reconocimiento de trombina (PRS) entre los dos restos Cys (figura 26e). Otro enlace disulfuro
(CRRRRRRREAEAC) también contiene un enlace disulfuro intramolecular y una secuencia peptídica
sensible a las proteasas de secreción de procesamiento de señales de la vía secretora de la levadura.
Durante la expresión de la proteína, este enlazador se escinde primero por la proteasa Kex2 en
CRRRRRR ↓ EAEAC, seguido por la eliminación de los dipeptidos RR y EA por las proteasas de
secreción de procesamiento de señales Kex1 y Ste13 (C ↓ RR ↓ RR ↓ RR, EA ↓ EA ↓ C),
respectivamente (figura 26f). Como resultado, los AA entre los dos residuos de Cys en el enlazador
se eliminaron por completo durante la secreción, El triángulo lleno indica los sitios de escisión y X
representa cualquier AA. A La construcción de la fusión de inteina C-terminal original en la que la
proteína diana se fusiona con el extremo N-terminal de la inteina marcada con CBD. B La
construcción de fusión de SrtA que contiene una etiqueta de afnidad N-terminal, núcleo catalítico
de SrtA, el motivo LPXTG y la proteína diana. La escisión en el sitio LPXTG permite la liberación de la
proteína diana con una glicina N-terminal adicional. C La construcción de fusión FrpC que consta de
la proteína diana y la SPM marcada con afnidad. La escisión en el sitio Asp-Pro (las dos primeras AA
de SPM) da como resultado la liberación de la proteína diana con un resto de aspartato extra en su
extremo C-terminal. D La construcción de fusión CPD en la que el CPD marcado con afnidad se
fusiona con el extremo C-terminal de la proteína diana. El residuo doble de VD en la secuencia de
unión procede del sitio de restricción SalI usado para la clonación mientras que ALADGK son residuos
contenidos dentro del CPD. E El enlace ditiociclopéptido con un sitio sensible a la proteasa. La
proteína de fusión está unida mediante un enlace ditiociclopéptido que contiene una secuencia
específica de trombina, PRS. El diseño del ligador ditiociclopéptido se basó en la estructura del
ciclopéptido, la somatostatina, con la sustitución de los restos AA 8-10, WKT, por una secuencia de
escisión de trombina específica, PRS. F El enlazador ditiociclopéptido con tres sitios de sensibilidad
a la proteasa que procesan señales de secreción. La proteína de fusión está unida mediante un
enlace ditiociclopéptido que contiene secuencias de escisión específicas de Kex1, Kex2 y Ste13. Kex2
escinde RR ↓ E. Kex1 y Ste13 retirar C-terminal RR y N-terminal EA, respectivamente, el disulfde
vinculados a la proteína de fusión fue expresado directamente por Pichia pastoris.
3.5.2.6 Efecto de la composición del ligador, fexibilidad / rigidez y longitud en las funciones y
conformaciones de las proteínas de fusión El plegamiento, la estabilidad, la sensibilidad proteolítica
y la función de las proteínas de fusión podrían verse afectados por la composición AA y la fexibilidad
/ rigidez y longitud del Péptidos. Por ejemplo, se construyeron proteínas de fusión constituidas por
un dominio de unión a celulosa de la celulasa A (Cel6A) de Neocallimastix patriarcum y la lipasa B
de Candida antarctica mediante la conexión de dos unidades funcionales con diferentes péptidos
enlazadores (4-44 residuos AA, diferentes números de residuos de Asn Y posiciones para sitios
potenciales de N - glicosilación) derivados del enlazador peptídico natural contenido en Cel6A. Se
llevaron a cabo análisis de la estabilidad del enlazador hacia la proteolisis y la actividad de unión a
la celulosa y la actividad de la lipasa de las proteínas de fusión; Los resultados revelaron que las
proteínas de fusión con ligadores más cortos (4-16 restos AA) eran más estables frente a la
proteolisis, pero tenían capacidades ligeramente menores de unión a la celulosa que las que
contenían enlaces más largos. Sin embargo, todas las proteínas de fusión retenido la lipasa-specifc
actividad de la proteína de tipo salvaje [336]. Se construyeron proteínas de fusión bifuncionales
compuestas de los dominios catalíticos de endoglucanasa (Endo5A) y β-glucosidasa (Gluc1C) de una
cepa de Paenibacillus cambiando el orden de conexión de dos dominios y enlazándolos con ligantes
peptídicos fexibles de diferentes longitudes (G4S) n = 0-3). Los resultados indicaron que el sustrato
afnity Km y la eficacia catalítica kcat / Km de Gluc1C eran sensibles a su posición, ya que mostró una
disminución tanto en la afnidad como en la eficacia catalítica cuando Gluc1C se colocó en el extremo
N de la proteína de fusión. Sin embargo, no hubo una relación directa de longitud de vinculante con
cualquiera de Endo5A o Gluc1C actividad [337]. Se construyeron proteínas de fusión en tándem de
albúmina sérica humana y onconasa (ONC) con ligadores fexibles (G4S) n (n = 0-3) y se expresaron
en P. pastoris. El nivel de expresión de las proteínas de fusión no tenía relación con la longitud del
engarce. Sin embargo, mientras que el resto ONC de la proteína de fusión sin un enlazador (n = 0)
no mostró citotoxicidad hacia las células tumorales, esto mejoró gradualmente con el aumento de
la longitud del enlazador [338]. Para el desarrollo de un inmunorreactivo bifuncional, se fusionó el
dominio B1 de la proteína estreptocócica G (SpG), que se une a la región Fc y el dominio CH1 de IgG,
con luciferasa de Vargula hilgendorfi (Vluc) usando ligantes peptídicos fexibles (G4S) n N = 0 - 1). La
proteína de fusión resultante, SpG- (G4S) n-Vluc, conservó la actividad de bioluminiscencia del resto
Vluc pero perdió la afnidad de unión de SpG a IgG. Sin embargo, la inserción de los tres hélices α-
haces D dominio de la proteína A de S. aureus (SpA) entre el SpG y el (G4S) enlazador con éxito
recuperó el afnity vinculante de SpG a CH1 dominio de IgG [339].
Para construir un dímero scFv inducible por ligando, se fusionó scFv anti-ErbB2 con FKBPF36V, que
es un mutante de la proteína 12 de unión a FK que puede ser dimerizado por el ligando
homodimérico sintético AP20187. Se introdujeron tres tipos de conectores, es decir, fexible (G4S)
3, hélice α rígida (EA3K) 3 y DKTHCP (G4S) 2, derivada de la región bisagra de IgG entre scFv y
FKBPF36V, y el efecto de las propiedades de unión en Se investigó la actividad del dímero de la
proteína de fusión, que puede dimerizar el receptor quimérico artifacial ErbB2-gp130 expresado en
la superficie celular e inducir la señalización de proliferación celular a partir del receptor quimérico
dimerizado. Los resultados mostraron que la proteína de fusión con el linker bisagra fue el mejor
para activar ErbB2-gp130 quimera inducida por la proliferación celular [320]. Se ha demostrado que
la formación de complejo selectivo de P450cam con sus proteínas redox de socio, PdX y PdR, puede
lograrse fusionando cada componente al extremo C de una subunidad diferente del PCNA
heterotrímero de Sulfolobus solfataricus para formar un sistema de autoensamblaje Scafold [111].
Para potenciar la actividad de este complejo multienzimático autoensamblado, se optimizó el enlace
peptídico que conecta PdX con PCN2 utilizando diversos enlazadores peptídicos, tales como
ligadores fexibles (G4S) n (n = 1-6), ligadores helicoidales y rígidos Pro-ricos G4S- (P5) n-G4S) (n = 1-
5) y otros enlazadores (G4S-LVPRGS-G4S). Aunque la actividad estaba afectada por las longitudes de
los dos ligadores rígidos Pro-ricos y los ligadores fexibles, los ligadores Pro-ricos proporcionaron el
mayor aumento de actividad. El enlazador Pro-rico optimizado (G4S- (P5) 4-G4S) aumentó la
actividad en 1,9 veces en comparación con el engarce G4S-LVPRGS-G4S, mientras que el enlazador
(G4S) n (n = 1-6) no produjo Actividad superior a la actividad máxima del enlazador Pro-rico
optimizado. Ambos péptido vinculante rigidez / fexibilidad y la longitud se encontraron para ser
importante para mejorar la actividad multienzima conjunto complejo (Fig. 27) [343].
Se construyeron proteínas de fusión tándem β-glucanasa (Gluc) / xilanasa (Xil) utilizando ligantes
peptídicos, tales como ligandos fexibles (G4S) n (n = 0-3), enlazadores α-helicoidales (EA3K) 3) y
otros (MGSSSN diseñado utilizando el software del servidor web LINKER [344], y
TGSRKYMELGATQGMGEALTRGM derivado de los dos hélices α hélice de Humicola insolens
endocelulasa). Se analizaron los efectos de los enlazadores sobre la estabilidad térmica y la eficacia
catalítica de ambas enzimas. Las fracciones Te Gluc de la mayoría de las construcciones de fusión
mostraron una mayor estabilidad a 40-60ºC que la Gluc parental y la proteína de fusión sin enlace.
Todos los restos Xil mostraron estabilidades térmicas similares a las del Xil parental, a ≥ 60 ° C.
También se reveló que las efi- ciencias catalíticas de los restos Gluc y Xyl de todas las proteínas de
fusión eran de 3,04 a 4,26 veces y de 0,82 a 1,43 veces las de los restos parentales, respectivamente.
El conector fexible (G4S) 2 dio como resultado las mejores proteínas de fusión, cuyas eficiencias
catalíticas se incrementaron en 4,26 veces para el resto Gluc y 1,43 veces para el resto Xilo. Te Gluc
y Xyl restos de la proteína de fusión con el enlazador rígido (EA3K) 3 también mostraron 3.62- y 1,31
veces los aumentos de eciencia catalítica [345]. Con el objetivo de aclarar los criterios para el diseño
de conectores peptídicos para la separación Efectiva de los dominios en una proteína de fusión
bifuncional, una investigación sistemática se llevó a cabo. Como modelo, las proteínas de fusión de
dos variantes de GFP de Aequorea, mejorado GFP (EGFP) y el aumento de proteína azul fuorescent
(EBFP), fueron empleados. Te estructura secundaria del enlazador y la distancia relativa entre EBFP
y EGFP fueron examinados utilizando dicroísmo (CD) espectros circular y la transferencia de energía
de resonancia fuorescent (FRET), respectivamente. Las siguientes secuencias de AA se diseñaron y
utilizaron como ligadores peptídicos: un ligador corto (SL); LAAA (4 AA) (derivado de los sitios de
escisión para HindIII y NotI); Ligandos fexibles (G4S) nAAA (n = 3, 4); Enlazadores α-helicoidales LA
(EA3K) nAAA (n = 3-5); Y un paquete de tres hélices α del dominio B de SpA (LFNKEQQNAFYEILH
LPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAAA). Te análisis espectros CD diferencial sugirió
que los enlazadores LA (EA3K) NAAA formaron una α-hélice y que el contenido alfa-helicoidal
aumentaron a medida que el número de los residuos de engarce aumento. En contraste, los enlaces
fexibles formaron una conformación aleatoria, en espiral. Te FRET de EBFP a EGFP disminuyó a
medida que la longitud de los enlazadores helicoidales aumentó, lo que indica que las distancias
aumentaron en proporción a la longitud de los enlazadores. Los resultados mostraron que los
enlazadores helicoidales podrían separar efectivamente los dominios vecinos de la proteína de
fusión. En el caso de las proteínas de fusión con los enlaces fexibles, la eficacia de FRET no era
sensible a la longitud del engarce y era altamente comparable a la de las proteínas de fusión con el
SL, aunque los enlaces fexibles eran mucho más largos que el SL, Fexible vinculantes tenían una
aleatoria, en espiral conformación [346]. Te real en conformaciones in situ de estas proteínas y
estructuras de los enlazadores de fusión se analizaron adicionalmente usando sincrotrón de rayos
X de dispersión de ángulo pequeño (SAXS). Los experimentos SAXS indicaron que las proteínas de
fusión con enlaces fexibles asumen una conformación alargada (figura 28a) en lugar de la
conformación más compacta (figura 28b) y que la distancia entre EBFP y EGFP no estaba regulada
por la longitud del engarce. Por otra parte, las proteínas de fusión con enlazadores helicoidales [LA
(EA3K) nAAA n = 4, 5] fueron más alargadas que aquellas con enlaces fexibles, y los modelos de alta
resolución (Figura 29) mostraron que los enlazadores helicoidales EBFP y EGFP en diagonal (Fig. 28c)
en lugar de longitudinalmente (Figura 28d]. Sin embargo, en el caso de los enlazadores helicoidales
más cortos (n = 2, 3, especialmente n = 2), se observó la multimerización de la proteína de fusión.
Dado que la mayoría de los residuos de los enlazadores helicoidales cortos están situados más cerca
de los dos dominios de la proteína de fusión, los residuos car- gados, Glu y Lys en la unidad (EA3K)
son probables formar pares de iones con los residuos cargados opuestamente sobre las superficies
superiores de EBFP Y EGFP. En consecuencia, esta formación de pares de iones provoca la
desestabilización de la hélice corta y los enlazadores de hélice fundidos pueden actuar como
atrayentes para la unión de moléculas vecinas debido a sus cargas e hidrofobicidad, causando de
este modo la multimerización de la proteína de fusión. Por otra parte, en el caso de la proteína de
fusión con los enlazadores helicoidales más largos (n = 4, 5), los enlazadores retenían la estructura
de hélice \ alpha y podían solvatar proteínas de fusión monoméricas. Estos resultados sugieren
claramente la excelente capacidad de los enlazadores helicoidales rígidos para controlar la distancia
y reducir la interferencia entre los dominios [347]. Este estudio es el primer ejemplo de modelado
de conformaciones de proteínas de fusión in situ y estructuras de ligando combinando datos SAXS
de proteínas de fusión, información estructural de las unidades funcionales del Banco de Datos de
Proteínas de Brookhaven (PDB) y cálculos de dinámica molecular de estructuras de enlaces
peptídicos. Recientemente, este método de modelado se aplicó para evaluar las conformaciones in
situ y las estructuras de proteínas de fusión compuestas por una proteína de haz de dos hélices de
novo y un solo dominio trimérico de fbritina del bacteriófago T4 conectado por un ligador peptídico
corto (KLAAA). La cromatografía de exclusión de tamaño, la dispersión de luz multianual, la
ultracentrifugación analítica y los análisis SAXS indicaron que las formas pequeña (forma S), media
(forma M) y grande (forma L) de los oligómeros de proteína de fusión existen como 6, 12 y 18-mers,
respectivamente. Los datos SAXS sugieren además que las formas S y M tienen formas de barril y
tetraedro, respectivamente [348]. La selección de un enlazador peptídico adecuado, que permite
una conformación deseable e interacción entre unidades funcionales en proteínas de fusión, es
clave para el diseño exitoso de proteínas de fusión. Generalmente, los enlazadores rígidos exhiben
estructuras relativamente sólidas adoptando estructuras α-helicoidales o conteniendo múltiples
residuos Pro con el isómero cis del enlace peptídico. Bajo muchas circunstancias, pueden separar
los dominios funcionales en la proteína de fusión con más eficacia que los enlazadores fexibles. La
longitud de los conectores se puede ajustar fácilmente cambiando el número de repetidor de la
unidad de engarce, tal como (EA3K), para conseguir una distancia óptima entre unidades
funcionales. Como resultado, cuando la separación espacial de las unidades funcionales es crítica
para evitar el impedimento estérico y para preservar el plegamiento, la estabilidad y la actividad de
cada unidad en las proteínas de fusión, se seleccionarían los enlazadores rígidos. Sin embargo,
existen otros tipos de proteínas de fusión, en las que se requiere que las unidades funcionales
tengan un cierto grado de movimiento / interacción o una disposición espacial proximal precisa y
una orientación para formar complejos. En estos casos, los enlazadores fexibles se eligen a menudo
porque pueden servir como un engarce pasivo para mantener una distancia o para ajustar la
disposición espacial proximal y la orientación de las unidades funcionales. Sin embargo, la
optimización de la secuencia del enlazador peptídico y la predicción de la disposición y orientación
del engarce espacial son más difíciles para los enlazadores fexibles que para los enlazadores rígidos.
Las estrategias actuales son en su mayoría empíricas e intuitivas y tienen una alta incertidumbre.
Por lo tanto, las tecnologías de simulación computacional para predecir las conformaciones de
proteínas de fusión y las estructuras enlazadoras potencialmente estimularían el diseño de un
conector fexible racional con tasas de éxito mejoradas.
3.5.2.7 Algoritmos racionales y software para diseñar secuencias y estructuras de enlazadores
Diseño racional de la Fig. 29 Modelos de alta resolución (representación de dibujos animados) de la
EBFP y EGFP conectados con los enlazadores helicoidales. B-H4-G y B-H5-G indican EBFP-LA (EA3K)
nAAA-EGFP (n = 4, 5), respectivamente. Los modelos de baja resolución basados únicamente en
datos SAXS se muestran como marcos de alambre. El enlazador y los dos dominios son modelados
y se muestran dos puntos de vista diferentes (Figura reproducida con permiso de: Ref. [347]) con
una configuración, propiedades y funciones deseadas. La mayoría de los enfoques actuales de la
selección de enlazadores y los procesos de diseño de las proteínas de fusión siguen dependiendo en
gran medida de la experiencia y la intuición; Tales procesos de selección a menudo implican una
gran incertidumbre, particularmente en el caso de una selección fexible más larga del enlazador, y
pueden producirse muchas consecuencias no deseadas, tales como el plegamiento erróneo, el bajo
rendimiento y la actividad funcional reducida de las proteínas de fusión. Tis es principalmente
debido a nuestra limitada comprensión de la relación secuencia-estructura-función en estas
proteínas de fusión. Para superar este problema, la predicción computacional de la conformación
de la proteína de fusión y la estructura del enlazador puede considerarse una alternativa costo-
efectiva para la selección experimental de enlace de prueba y error. Basado en la información
estructural de las unidades funcionales individuales y enlazadores (ya sea a partir del PDB o
modelado de homología), se ha avanzado considerablemente en la predicción de las
conformaciones de proteínas de fusión y las estructuras de enlazadores [290]. Los enfoques para el
diseño o la selección de secuencias de enlace fexible para conectar dos unidades funcionales se
pueden clasificar en dos grupos. El primer grupo comprende enfoques basados en selección de
bibliotecas, en los que una secuencia de enlazador candidato se selecciona de una biblioteca de
secuencias de bucle sin tener en cuenta la conformación o colocación de unidades funcionales en
las proteínas de fusión. El segundo grupo comprende enfoques basados en modelos, en los que la
conformación de la unidad funcional y la estructura de colocación y enlace y la composición de AA
se optimizarían mediante simulación. En cuanto al primer enfoque, se desarrolló un programa
informático llamado LINKER. Este programa basado en la web
(http://astro.temple.edu/feng/Servers/BioinformaticServers.htm) generó automáticamente un
conjunto de secuencias peptídicas basadas en el supuesto de que las secuencias de bucle
observadas en las estructuras de cristal de rayos X o el núcleo Es probable que las estructuras de
resonancia magnética adopten una conformación extendida como conectores en una proteína de
fusión. Se extrajeron secuencias enlazadoras de bucle de varias longitudes del PDB, que contiene
proteínas globulares y de membrana, mediante la eliminación de secuencias de bucle corto de
menos de cuatro residuos y secuencias redundantes. LINKER buscó en su base de datos secuencias
de enlazadores de bucle con entradas especificadas por el usuario y generó varias secuencias de
enlazador candidato que cumplen los criterios. La entrada básica al programa era la longitud
deseada del enlazador, expresada como el número de residuos o una distancia en angstroms. Los
parámetros de entrada adicionales incluían sitios de escisión potencial para endonucleasas de
restricción o proteasas para evitar que los enlazadores seleccionados fueran resistentes contra las
enzimas de restricción y la proteasa especificada durante la clonación de ADN y el proceso de
purificación de proteínas, respectivamente. Los usuarios de Te también podrían incluir preferencias
de composición de AA (por ejemplo, eliminar residuos hidrofóbicos voluminosos) para seleccionar
adicionalmente sus enlazadores de interés. La salida de LINKER incluyó una lista de secuencias
peptídicas con las longitudes especificadas, características de secuencia y características químicas
de cada secuencia de engarce mostrada por diagramas de hidrofobicidad [344, 349]. Sin embargo,
aunque la base de datos PDB se ha expandido enormemente durante la última década, no se
realizaron más actualizaciones o mejoras en el sitio web LINKER desde su creación, y ya no es
accesible. El programa basado en la web LinkerDB (http: //www.ibi.vi.nl/programs/linkerdbwww/)
también proporciona una base de datos que contiene secuencias de enlazadores con varias
confrmaciones y un motor de búsqueda. El algoritmo de búsqueda acepta varios tipos de consulta
(por ejemplo, código PDB, encabezado PDB, longitud del enlazador, estructura secundaria,
secuencia o accesibilidad al disolvente). El programa puede proporcionar las secuencias enlazadoras
de los criterios de búsqueda, así como otra información, tal como el código PDB y una breve
descripción de la proteína fuente, la posición del enlazador dentro de la proteína fuente, longitud
del engarce, estructura secundaria y accesibilidad al disolvente. Los usuarios pueden buscar
secuencias con las propiedades deseadas y obtener las secuencias candidato natural de
multidominio proteínas [329]. Otro sitio web del servidor para facilitar la selección de enlazadores
y el modelado de proteínas de fusión es SynLinker (http: // bioinfo.bti.a-star.edu.sg/linkerdb).
Contiene información sobre 2260 enlazadores, que consiste en enlazadores naturales extraídos de
proteínas multidominio en el último PDB, así como artifcial y vinculadores empíricos recogidos de
la literatura y las patentes. Un usuario puede especificar múltiples criterios de búsqueda para buscar
SynLinker, como el ID PDB de las proteínas fuente, nombres de proteínas, el número de residuos AA
en un enlazador y / o la distancia de extremo a extremo de una conformación enlazadora en
Angstroms UN). Además, el usuario puede elegir un residuo de partida de enlazador, residuo final,
enriquecimiento de AA, agotamiento de AA y / o sensibilidad a la proteasa como una propiedad de
enlazador deseada en la proteína de fusión recombinante. Una vez que se envía una consulta, se
buscan simultáneamente los enlazadores naturales y artifciales / empíricos en SynLinker,
obteniéndose una lista de candidatos de enlazadores potenciales que satisfacen los criterios de
selección deseados junto con información sobre la carta radar de composición AA y la conformación
del enlazador seleccionado, tal como Así como la estructura de la proteína de fusión y el diagrama
de hidropatía [350]. En cuanto a los enfoques basados en modelos, se puede predecir la
conformación y la colocación de unidades funcionales en proteínas de fusión, de las cuales se
dispone de estructuras 3D a partir del modelo de PDB o de homología, mediante el modelado
asistido por ordenador. Se desarrolló una herramienta de modelado conocida como FPMOD que
puede generar modelos de proteínas de fusión conectando unidades funcionales con enlaces
fexibles de longitudes adecuadas, definiendo regiones de enlaces fexibles, tratando las estructuras
de todas las unidades funcionales como cuerpos rígidos y Nagamune Nano Convergence (2017)
Girando cada uno de ellos alrededor de su conector fexible para producir estructuras aleatorias.
Esta herramienta puede probar extensivamente el espacio conformacional de las proteínas de
fusión y finalmente generar modelos plausibles [351]. Esta herramienta ha sido aplicada al diseño
de biosensores de proteínas basados en FRET para el ión Ca2 + mediante la predicción cualitativa
de sus efciencias FRET, y las predicciones estuvieron fuertemente de acuerdo con los resultados
experimentales [352]. Se desarrolló una herramienta de modelado similar para ensamblar
estructuras de unidades funcionales aisladas para constituir proteínas de fusión multidominio. Sin
embargo, este enfoque de ensamblar unidades funcionales es diferente del método de probar el
espacio conformacional. En este método, se utiliza un método de modelado de proteínas ab initio
para predecir la estructura terciaria de las proteínas de fusión, la conformación y colocación de las
unidades funcionales y la estructura del engarce. Este método muestra los grados de libertad del
enlazador (en otras palabras, el ensamblaje de dominio como un problema de plegado de
conectores) en lugar de los de los cuerpos rígidos, tal como se adoptó en FPMOD. El método consiste
en una búsqueda inicial de baja resolución, en la que se explora el espacio conformacional del
enlazador utilizando el método de predicción de estructura de Rosetta de novo. A continuación, se
realiza una búsqueda en alta resolución, en la que todos los átomos se tratan explícitamente y se
optimizan simultáneamente los grados de libertad de la cadena principal y de la cadena lateral. Los
modelos obtenidos con la menor energía son a menudo muy cercanos a las estructuras correctas de
las proteínas multidominio existentes con una precisión muy alta [353]. Un método llamado
pyDockTET (docking-docking) utiliza el acoplamiento de cuerpo rígido para generar complejos de
dominios que son marcados por los términos de energía electrostática y de desolvatación, así como
un término de pseudoenergía que refina las restricciones de las distancias de extremo a extremo
del engarce; De esta manera, se seleccionan posturas de dominios en par entre casi nativos. Se
selecciona la longitud óptima de la secuencia enlazadora (en el número de residuos) con los
extremos del enlazador (definida como la distancia entre los átomos Cα de los dos extremos de un
enlazador) a partir de una base de datos fexible enlazadora que consiste en 542 enlazadores con
longitudes de secuencia que varían De 2 a 29 AAs derivados de los inter-dominio enlazadores de
multidominio estructuras en el PDB [354]. Se diseñó una proteína de fusión que consistía en una
proteína llamada proteína de recorrido celular para el antıgeno de ookinetes y esporozoitos
(CelTOS) de Plasmodium falciparum (la especie más mortal de la malaria) e IL-2 humana como
adyuvante para desarrollar una vacuna candidata contra la malaria. CelTOS e IL-2 se unieron entre
sí directamente o mediante el uso de diferentes enlazadores fexibles, incluyendo (G) 8, (G4S) y (G4S)
3. Dado que el N-terminal de IL-2 y el C-terminal de CelTOS son críticos para conservar su estabilidad
y bioactividad, la proteína de fusión fue diseñada mediante la unión del C-terminal de IL-2 con el N-
terminal de CelTOS. Las estructuras terciarias de las proteínas de fusión fueron predichas en silico
por el servidor en línea de I-TASSER (http://zhanglab.ccmb.med. Umich.edu/I-TASSER/) [355]. Te
modelo con el mayor puntaje de confdence (C-score: una función de puntuación basada en la
densidad estructural de clustering relativa y la puntuación de significancia de consenso de múltiples
plantillas de threading) fue considerado como el mejor modelo. A continuación, las estructuras
seleccionadas de las proteínas de fusión con diferentes enlazadores se validaron y analizaron
utilizando una evaluación de parcela de Ramachandran [356]. Todos los resultados verificado el
(G4S) 3 vinculante como el más adecuado para separar estas proteínas [357]. La cuestión importante
a tratar en la predicción de la estructura es el método de buscar el espacio conformacional grande
y complejo para alcanzar rápidamente la estructura de energía mínima, que se presume que es el
pliegue nativo. El algoritmo genético combinado con una técnica extremadamente rápida para
buscar exhaustivamente el espacio de conformación y construir una biblioteca de posibles
estructuras locales de baja energía para oligopeptidos (es decir, el método MOLS), se aplicó a la
predicción de la estructura de proteínas. En la primera etapa, la secuencia de proteínas se dividió
en fragmentos de superposición corta, y luego sus bibliotecas estructurales se construyeron
utilizando el método MOLS. En el segundo paso, el algoritmo genético explotó las bibliotecas de
estructuras de fragmentos y predijo la mejor estructura única para la secuencia de proteínas. En la
aplicación de este método combinado a péptidos y proteínas pequeñas, tales como el polipéptido
pancreático aviar (36 AA), la cabeza villin (36 AAs), la melitina (26 AAs), el activador transcripcional
Myb (52 AAs) y la cremallera Trp (16 AA), podría predecir sus estructuras casi nativas [358]. Los
métodos de diseño racional asistido por ordenador para proteínas de fusión son prometedores
porque estos métodos permiten predecir fácilmente la deseada conformación y colocación de las
unidades funcionales y estructuras de unión de proteínas de fusión y, consecuentemente,
seleccionar secuencias adecuadas de enlazador candidato. Sin embargo, es difícil determinar la
conformación única de los enlaces fexibles debido a muchos mínimos locales en energía libre.
Además, si los cambios en la conformación o disposición de las unidades funcionales son esenciales
para mostrar su actividad, la conformación del enlazador también debe cambiarse para permitir el
movimiento de unidades funcionales, por ejemplo, el dominio de unión a ATP N-terminal y la unión
de proteína sustrato desplegada Dominio conectado con un enlace peptídico hidrófobo en la
proteína de choque térmico 70 [359]. Este problema complicado de transición conformacional
dificulta el diseño de enlazadores óptimos para proteínas de fusión con conformaciones múltiples.
Por lo tanto, el diseño racional de las proteínas de fusión con las propiedades deseadas y el
comportamiento predecible sigue siendo un desafío abrumador.
4. Conclusión
Esta revisión destacó algunos de los recientes desarrollos en estudios relacionados con nanobio /
bionanotecnología, incluyendo las aplicaciones de moléculas biológicas diseñadas combinadas con
nanomateriales funcionales en terapia, diagnóstico, biosensing, bioanálisis y biocatálisis. Además,
esta revisión se centró en los avances recientes en la ingeniería biomolecular para nanobio /
bionanotecnología, tales como ingeniería de ácidos nucleicos, ingeniería de genes, ingeniería de
proteínas, tecnologías de conjugación química y enzimática y ingeniería de engarces. Basados en
tecnologías químicas y biológicas creativas, se describieron protocolos de manipulación de
biomoléculas, especialmente ácidos nucleicos, péptidos, enzimas y proteínas. También resumimos
las principales estrategias adoptadas en ingeniería de ácidos nucleicos, ingeniería genética,
ingeniería de proteínas, tecnologías de conjugación química y enzimática y ingeniería de engarces.
La ingeniería de ácido nucleico basada en las características de emparejamiento de bases y de
autoensamblaje de los ácidos nucleicos se destacó como una tecnología clave para las
nanotecnologías de ADN / ARN, tales como ADN / ARN origami, aptámeros, ribozimas. La ingeniería
genética incluye tecnologías de manipulación directa de genes, tales como la mutagénesis de genes,
la amplificación de secuencias de ADN, el shufing de ADN y la fusión de genes, que son poderosas
herramientas para generar enzimas, proteínas, vías metabólicas completas o incluso genomas
enteros con propiedades deseadas o mejoradas. Se discutieron dos estrategias generales para la
ingeniería de proteínas, es decir, el diseño racional de la proteína y la evolución dirigida (es decir,
los enfoques basados en la selección o en la selección de bibliotecas de alto rendimiento). En las dos
últimas décadas se han desarrollado tecnologías de conjugación para modificar específicamente las
proteínas con diversas funcionalidades naturales y no naturales. Estas tecnologías van desde las
tecnologías clásicas de bioconjugación química, las conjugaciones químicas bio-ortogonales, las
ligaciones químicas proteicas y las conjugaciones enzimáticas, que fueron revisadas. La ingeniería
de enlaces para controlar la distancia, la orientación y la interacción entre componentes funcionales
reticulados en conjugados es también una tecnología importante. Se describieron las estrategias de
diseño y optimización de los enlazadores químicos y biológicos, tales como oligonucleótidos y
polipéptidos.
Ahora se dispone de una variedad de estrategias para diseñar y fabricar nuevos nanobiomateriales
con dimensiones y complejidad altamente ordenadas basadas en características de autoensamblaje
biomoleculares gobernadas por interacciones moleculares entre nucleótidos, péptidos, proteínas,
lípidos y ligandos pequeños, cada uno de los cuales se centra en la simplicidad del diseño, Alto
control estructural y funcional, o alta precisión de fabricación [16-20, 106, 127, 132, 360- 365].
Fundamentalmente, estas propiedades no son mutuamente excluyentes, y las debilidades relativas
de cada enfoque serán resueltas en un futuro próximo. Dado el rápido y reciente progreso en la
ingeniería biomolécula y la nanotecnología, el diseño de dispositivos y sistemas moleculares
basados en biomateriales totalmente nuevos con funciones adaptadas a aplicaciones específicas
parece ser mucho más fácil y más factible que antes.