BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

LABORATORIO No 3: EXTRACCIÓN DE ADN HUMANO

PRESENTADO POR: DAYANA FANDIÑO SANABRIA GRUPO: E

PRELABORATORIO

1. Mencione y explique detalladamente el método de extracción de ADN, denominado salting out:

FUNDAMENTO: A partir de un lisado celular se pueden separar las moléculas de proteínas y otros
contaminantes del ADN mediante la adición de altas concentraciones de sal que hacen que disminuya la
solubilidad de las moléculas orgánicas en la fase acuosa. En este método se utiliza frecuentemente la proteinasa
K, el TRIS-HCl para regular el pH y otros reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las enzimas
que pueden actuar sobre las moléculas de ADN. Para la extracción se utilizan sales inorgánicas como el
perclorato de sodio y el cloruro de sodio en concentraciones muy altas que hacen precipitar a las moléculas
orgánicas. El precipitado formado se separa por centrifugación y luego se puede extraer el ADN de la disolución
acuosa mediante la adición de alcohol, por precipitación.
Este método es sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN obtenido en muchas ocasiones debe ser
purificado antes de ser usado en posteriores aplicaciones. La ventaja es que se elimina el uso de disolventes
orgánicos.

El salting out es una técnica de extracción de proteínas que consiste en concentrar la fase liquida tanto como
sea requerido para que las proteínas se precipiten, lo que se produce es que al solubilizar la sal, esta se rodea
de agua, limitando las moléculas que solubilizan a las proteínas, logrando que al final, no haya moléculas
disponibles de agua precipitando las proteínas. La característica que deben de tener la fase liquida es que sea
polar para poder disolver la sal.

PROCEDIMIENTO:

1.- Colocar 6 ml de sangre periférica en tubos de centrífuga de plástico de 15 ml. Agregar el Buffer lisis frío hasta
completar los 15 ml. Dejar en congeladora por 15 minutos agitándolo de vez en cuando. ( 3-5 veces)
2.- Centrifugar a 5,000 rpm por 20 minutos. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante.
3.- Re suspender el pellet (golpeándolo con la mano) y añadir 15 ml de Buffer lisis frío. Mezclar 30 segundos por
inversión. Centrifugar a 5,000 rpm por 20 minutos.
4.- Repetir el paso 2 y 3 varias veces (3 a 4) para lavar el pellet. (hasta que el líquido sobrenadante quede
transparente).
 5.- Re suspender el pellet con 3 ml del Buffer lisis caliente. Disgregar el pellet golpeando suavemente el fondo
del tubo con los dedos.
6.- Agregar SDS 10% 0.5 ml utilizando una jeringa de tuberculina. Mezclar suavemente por rotación.
7.- Agregar 0.1 ml de Proteinasa K (20 mgr/ml), utilizando una jeringa de Tuberculina. Colocar los tubos en Baño
María a 50ºC por 17 a 24 horas.
8.- Agregar al contenido 2 ml de Cloruro de Sodio 6M. Mezclar por inversión por 2 minutos.
9.- Centrifugar a 5000 rpm por 20 minutos a otro tubo nuevo de centrífuga de 15 ml. 10.- Repetir el paso 8 y 9
una vez más si fuera necesario.
11.- Al sobrenadante obtenido se le agrega igual volumen de Alcohol Isopropílico ó Etanol Absoluto helado.
12.- Mezclar suavemente por inversión y observar la formación de la medusa de ADN (hebra de ADN genómico).
Si es necesario dejar en congelación por 30 minutos para una mejor precipitación.
13.- Utilizando una pipeta pasteur coger la hebra de ADN y colocarla rápidamente en un tubo eppendorf de 2 ml.
Dejar secar en estufa.
14.- Agregar 1 ml de TE 1X. y disolver el ADN mezclando por inversión. Guardar el ADN extraído a Tº. de
refrigeración hasta su cuantificación.

2. Mencione algunas de las diferentes muestras o tejidos de donde se puede obtener ADN humano o animal.

Se puede obtener ADN de muestras como: tejidos humanos, sangre, pelo, tejidos de roedores, hojas, bacterias,
levaduras, fungi, insectos, heces, fluidos corporales, esporas, suelo, muestras clínicas (por ej. muestras de
biopsias, aspirados), muestras forenses (por ej. manchas de sangre seca, hisopados bucales, saliva, cabello,
semen) y huellas dactilares.

3. ¿Qué precauciones se deben tener para evitar la degradación del ADN en muestras biológicas?.
 Conservación adecuada de las muestras.
 Evitar las altas temperaturas y la humedad principalmente para evitar la acción de las exonucleasas.
 Estar seguros de los productos utilizados para la preservación hasta la cuantificación de la muestra.
 Evitar que se contamine la muestra con alguna sustancia química o biológica adicional.