UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROJETO DE PESQUISA

Modelos in vitro 3D pulmonares para a investigação de

toxicidade pulmonar de diferentes toxicantes

Participantes:

Bruna Ferreira Tollstadius

Thais Rosa

Orientadora: Profa. Dra. Marize Campos Valadares

GOIÂNIA
2017
1.0 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

Doenças pulmonares ou disfunções pulmonar são um problema de saúde

publica de grande relevancia para a sociedade. Pesquisas indicam doenças como a
bronquite crônica, e enfisema, bem como o câncer de pulmão são as principais
doenças associadas a eventos adversos pulmonares induzidos por toxicantes
(RODEN, CAMUS, 2018). Embora os fatores genéticos e de suscetibilidade
desempenhem papéis importantes na incidência da doença pulmonar, a grande maioria
dos casos resulta de exposições ambientais, dietéticas ou ocupacionais a agentes
tóxicos (PLEIL, 2016). Por exemplo, mais de 80% de todos os casos de câncer de
pulmão se devem ao tabagismo (LATIMER, 2018). Na asma, várias proteínas inaladas,
agentes químicos, particulas podem sensibilizar o trato respiratório e desencadear
sintomas clínicos, incluindo crisis de asma. A vulnerabilidade do pulmão aos toxicantes
decorre principalmente do fato de que ele está exposto tanto ao ambiente externo
quanto a todo o débito cardíaco. A principal consequência toxicológica disto é que os
toxicantes podem entrar no trato respiratório por via da inalação e afetar diretamente o
tecido pulmonar ou por outras vias (por exemplo, dietética ou dérmica) atingir o
pulmão através da circulação sistémica. A inalação é uma das principais vias de
exposição a substâncias tóxicas sistêmicas que têm alvos extrapulmonares, como o
dissulfeto de carbono, que, quando inalado, causa efeitos neurológicos, inclusive a
encefalopatia (NORDGREN TM & BAILEY, 2016). O número de substâncias tóxicas
pulmonares conhecidas é impressionante com o potencial de toxicidade de inúmeros
outros ainda não caracterizados. O estudo da toxicidade pulmonar e um grande desafio
pelo fato de muitos toxicantes estarem onipresentes no meio ambiente e em misturas
variadas mas sobretuto por falta de uma modelo experimental adequado.
O sistema Vitrocell® é um modelo recentemente desenvolvido para avaliar
exposições in vitro a toxicantes em uma interface ar-líquido, podendo se aproximar de
um modelo de exposição inalatória. Esse sistema estabelece uma configuração que
melhor representa a exposição humana a contaminantes que podem ser volatilizados
ou particulados e, desta forma serem inalados, facilitando a extrapolação de dados de
toxicidade obtidos in vitro para in vivo (WEBER et al., 2013). Nesse modelo, as células
entram em contato direto com aerossóis/partículas gerados por contaminantes líquidos
ou suspensões, em concentrações controladas, que se depositam de forma uniforme
sobre a cultura celular em uma interface ar-líquido, mimetizando a exposição humana a
compostos voláteis/partículas (WEBER et al., 2013).
Outra vantagem desse modelo, é que ele permite a exposição em um tempo
mais prolongado, possibilitando um cenário que represente tanto a exposição ambiental
crônica, quanto a aguda. Assim, a associação desse sistema com culturas celulares em
3D pode ser uma ferramenta promissora para a avaliação de mecanismos de
toxicidade induzidos por compostos voláteis/particulados (LIU et al., 2013). Dados da
literatura, mostram que o sistema Vitrocell® representa um modelo in vitro valioso para
rastrear e avaliar mecanismos de toxicidade ao DNA de células expostas a toxicantes
voláteis/particulados, por meio da utilização do ensaio do cometa (WEBER et al., 2013)
ou ainda, investigações no campo da epigenética, como metilação global do DNA.

Os fungicidas benzimidazóis são utilizados no tratamento de sementes e de

solos e em aplicações foliares (SILVA et al., 1999; PICININI, 1994). Dentre os
fungicidas desse grupo, a carbendazina ou MBC está entre um dos mais utilizados
(MAZELLIER, LEROY e LEGUBE, 2002). No Brasil, a carbendazina é aplicada em
culturas de algodão (sementes), citros (folhas), feijão (sementes e folhas), soja
(sementes e folhas), trigo (folhas) e numa grande variedade de frutas e vegetais
(AGROFIT, 2016) (Tabela 1). Os limites máximos que podem ser utilizados desse
fungicida em alimentos são descritos na base de dados AGROFIT - Sistema de
Agrotóxicos Fitossanitários do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(AGROFIT website).

Limite Máximo de Resíduo

mg/kg do Produto Comercial Intervalo de Ingestão Diária Aceitável
Cultura(s)
Segurança (DIAS) (IDA) mg/kg Peso Corporal
Nacional Codex
 Algodão 0,1 (1) 0,02

Arroz 0,05 2 0,02

Citros 5 7 0,02

Feijão 2 0,5 14 0,02

Maçã 5 14 0,02

Milho 0,05 0,02

Soja 0,5 0,5 14 0,02

Trigo 0,1 35 0,02

Tabela 1 - Limite Máximo, Intervalo de Segurança e Ingestão Diária aceitável do fungicida carbendazina
nas culturas especificas.

A carbendazina é utilizada no Brasil no combate de pragas por pulverização,

como a Guignardia citricarpa (pinta preta) e Colletotrichum acutatum (estrelinha), que
são fungos comuns em lavouras de laranjas (KUPPER et al., 2012). Entretanto,
segundo a Food and Drug Administration (FDA), o consumo do fungicida está
associado a um aumento no risco de tumores de fígado e, por essa razão, a substância
é proibida no País (FDA website, 2016). Além disso, a carbendazina também é proibido
em diversos países da União Européia (EU Pesticides database, 2016). Segundo as
especificações da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) (ANVISA, 2007)
e da U.S. Environmental Protection Agency (EPA) (U.S. Environmental Protection
Agency, 2005), a carbendazina é um fungicida de classe toxicológica III, considerado
de toxicidade média. Em conformidade com a tabela toxicológica da EPA, a
carbendazina é considerada grupo C, classificada como possível carcinógeno em
humanos (MCCARROLL et al., 2002). Cabe aqui destacar que o câncer de pulmão é
um dos cânceres de maior incidência mundial, em muitos casos, induzidos por
toxicantes, como praguicidas (FERLAY et al., 2015).
O glifosato [N-(fosfono-metil)glicina] é usado desde a década de 1970 para controle e
manejo da vegetação e, apesar, de apresentar uma fórmula molecular simples, é o
herbicida mais usado no mundo tendo seu consumo estimando em meio milhão de
toneladas por ano. O êxito em vendas é em função do baixo custo, rápida absorção
pelas plantas, lento desenvolvimento de resistência das ervas daninhas e por ser
categorizado, por diversos órgãos regulamentadores, como baixa ou nenhuma
toxicidade em humano (BAI, S.H.; OGBOURNE, S.M.,2016).
O glifosato é um herbicida de amplo espectro e pós-emergente, o que significa
que seu uso é recomendado para após a emersão e crescimento da planta daninha.
Além dessas características, não é seletivo o que, de forma geral, mata ou suprime o
crescimento de todos os tipos de plantas.
A fim de solucionar a questão do amplo espectro, foram desenvolvidas variações
de culturas de interesse econômico geneticamente modificadas. Resistentes a
herbicidas, as sementes de milho, algodão e de soja, também chamada de Roundup
Ready em referência ao principal representante da classe, foram desenvolvidas. O
resultado disso é a possibilidade de uma aplicação prolongada do herbicida o que
propcia maior exposição, permitindo ainda que a aplicação seja indiscriminada sobre
toda a plantação com pulverização inclusive por via aérea (BENBROOK, C.M., 2016) A
problemática não se restringe as formulações somente com glifosato mas também com
as formulações associadas com outros ativos, pois essa combinação pode resultar em
toxicidade sinérgica (KIM, Y; et al., 2013)
O glifosato é regulamentado em pelo menos 130 países. No Brasil, são
registrados 60 formulações com glifosato indicadas para aplicação em pós-emergência
das plantas daninhas infestantes nas culturas de algodão, ameixa, arroz, banana,
cacau, café, cana-de-açúcar, citros, coco, feijão, fumo, maçã, mamão, milho, nectarina,
pastagem, pêra, pêssego, seringueira, soja, trigo e uva. O Ministério da Agricultura e
Pecuária complementa as indicações de glifosato para outras modalidades que não
agricultura como aplicação em margens de rodovias e ferrovias, áreas sob a rede de
transmissão elétrica, pátios industriais, oleodutos e aceiros além de seu uso
domissanitário inclusive para jardinagem amadora (AGROFIT, 2016).
A baixa toxicidade citada se baseia no mecanismo de ação do glifosato já que o
mesmo está relacionado à fixação do carbono. O mecanismo de ação do glifosato é
inibição da enzima 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fostato sintase (EPSPS). A via do
chiquimato produz aminoácidos aromáticos utilizados para a síntese de proteínas. A
inibição dessa enzima desregula a via do chiquimato que tem importante papel na
produção de metabólicos secundários fundamentais para a planta. Por fim, a
interrupção dessa via impede a fixação do carbono pelas plantas (BAI, S.H.;
OGBOURNE, S.M.,2016).
A recente reclassificação do glifosato como uma substância provavelmente
carcinogênica para seres humanos pela Agência Internacional de Pesquisas em
Câncer (IARC) ressalta a necessidade de novos estudos toxicológicos considerando
que essa substância foi, por muitas décadas, considerada pouco tóxica. A nova
classificação foi baseada em evidências de casos de câncer em seres humanos
expostos naturalmente, ou seja, situações não simuladas, e também baseada em
provas suficientes de câncer em animais de laboratório expostos ao glifosato puro, sem
considerar as combinações entre outras substâncias. Segundo a IARC, também há
fortes evidências de genotoxicidade tanto para o glifosato puro quanto para as
formulações à base de glifosato (IARC, 2015).
Ademais, outras patologias tem sido relacionadas ao uso de glifosato: doença
celíaca, Parkinson, Alzheimer, infertilidade entre outras doenças (SENEFF, A.;
SAMSEL, S.; 2015).
Alem dos dois toxicantes acima mencionados, o cigarro eletrônico, e-cigarretes
representam hoje uma preocupação sobre o seu uso e segurança. O sistema eletrônico
de liberação de nicotina que está gerando controvérsias, tanto entre a população
quanto entre profissionais da saúde. Dados sobre a segurança do uso do cigarro
eletrônico são limitados (LEE, et al,m 2018). Do mesmo modo, até o momento, não há
evidências de que o cigarro eletrônico seja efetivo para tratar a adição à nicotina.
Ademais, alem da nicotina ao cigarro eletronico são adicionados aromatisantes, sem
dados de toxicidade desta mistura de compostos que o usuario fica exposto
cronicamente. Poucas são as informações de segurança do produto, o qual e proibido
no Brasil desde de 2009. Entretanto, o cigarro eletronico e facilemente encontrado para
ser comercializado na internet. Existe uma crescente preocupação quanto a prsença de
produtos que serão inalados como o propilenoglicol, que é a substância na qual a
nicotina fica em suspensão e serve para gerar o vapor. Outras substâncias que podem
estar presentes no cigarro eletronico, incluien irritantes e toxinas, como dietilenoglicol,
formaldeído, acetaldeído e acroleína. Nitrosaminas, que são carcinógenos bem
reconhecidos assim como impurezas específicas do tabaco. O cigarro eletronico pode
ainda conter, substâncias aromatizantes, que embora sejam consideradas
ingredeinetes alimentares usados na rotina, os efeitos da inalação das mesmas não
são conhecidos.
Aproximadamente 80% dos cânceres de pulmão são agrupados como
carcinoma de células não-pequenas, como o adenocarcinoma que compreende cerca
de 40 a 50% de todos os canceres de pulmão (FERLAY et al., 2015; SHTIVELMAN et
al., 2014). Estes são clinicamente e patologicamente diferentes do Carcinoma de
Células Pequenas, o qual é altamente relacionado com cigarro (PROJECT, The Clinical
Lung Cancer Genome, 2013). Os principais genes alterados somaticamente para
adenocarcinoma mostram a seguinte frequência: 50% por mutação no gene TP53, 20%
por perca no número de cópias do TP53, 30% dos casos por mutações no gene KRAS,
e 20-30% por mutações ou amplificações no gene EGFR. Para o carcinoma de células
pequenas os principais genes afetados são: 100% mutações no RB1 e 80-90% por
mutação ou perca no número de cópias do TP53 (SHTIVELMAN et al., 2014).
2.0 OBJETIVOS
2.1 Geral:

2.2 Específicos
 Avaliar o potencial citotóxico do toxicante em cocultura das células MCR-5,
EA.hy926 e THP-1 reproduzindo uma exposição crônica;
 Avaliar os mecanismos de ação e vias metabólicas responsáveis por
desencadear morte celular em células pulmonares em cocultivo;
 Avaliar o potencial efeito genotóxico do toxicante em células de pulmão em
cocultivo;
 Investigar efeito de metilação nas células pulmonares em cocultivo após a
exposição a aerossóis do toxicante;
 Investigar a expressão gênica dos genes TP53, KRAS e EGFR nas células
pulmonares após a exposição a aerossóis do toxicante.

3.0 METODOLOGIA
3.1 – Glifosato, Carbendazina, Solução de cigarro eletronico, etc

3.2 Linhagens e cultivo celular

Para a formação da tricultura de epitélio alveolar serão usadas as células MCR-5
de epitélio alveolar humano normal que serão obtidas do Banco de Células do Rio de
Janeiro (BCRJ), a linhagem endotelial humana EA.hy926 que será obtida do Banco de
Células do Rio de Janeiro (BCRJ) e a linhagem THP-1 de monócito humano originado
da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA.
As linhagens celulares serão mantidas em estufas de cultivo celular a 37ºC com
atmosfera úmida e 5,0% de CO2. As linhagens MCR-5 e a EA.hy926 serão mantidas
em meio DMEN e a linhagem THP-1 será mantida em meio RPMI, sendo todas as
linhagens suplementadas com 10% de soro fetal bovino.
3.3 Modelo de exposição em tricultura 3D
O inserto com a tricultura formada pelas linhagens MCR-5, EA.hy926 e THP-1
será exposto a uma interface ar/líquido estabelecida pelo sistema Vitrocell® Cloud 12
(Waldkirch, Alemanha), especialmente projetado para depositar concentrações
controladas e uniformes de aerossóis provenientes de substâncias líquidas e
suspensões, com controle eletrônico de temperatura.

3.4 Ensaio de citotoxicidade pelo método de redução do MTT

É um método comumente usado para estimar os efeitos citotóxicos de
compostos que eventualmente conduzem à morte celular. O princípio está na
incorporação do sal brometo de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio por células
viáveis com metabolismo ativo que possuem a capacidade de converter o sal em
cristais de formazan de cor violeta, ação realizada pela enzima succinato
desidrogenase presente nas mitocôndrias. Células não viáveis perdem a capacidade
de realizar essa conversão sendo a quantidade de formazan diretamente proporcional
ao número de células viáveis. Os cristais são insolúveis e precipitam dentro das
células, na superfície celular e no meio de cultura, assim, é necessário que esses
cristais sejam solubilizados antes da leitura da absorbância que é medida em 570 nm
(MOSMANN, 1983; RISS et al., 2013).

3.5 Avaliação dos mecanismos de morte celular

3.5.1 Avaliação da apoptose
A anexina V se liga a fosfatidilserina e, por isso, é usado como um marcador
precoce para detecção de apoptose podendo identificar células na fase inicial da morte
celular por apoptose bem como na necrose. Com esse marcador, é possível identificar
alterações morfológicas e bioquímicas das células analisadas (JAKUBOWSKA, 2015).
Assim, a avaliação do potencial indutor de apoptose e necrose será realizada mediante
a marcação das células expostas às substâncias no sistema Vitrocell® Cloud 12 com
Anexina V conjugada à Ficoeritina (FITC) e Iodeto de propídeo a 1%, ambos diluídos
em tampão de ligação com pH 7,4. A suspensão celular obtida será analisada em
citômetro de fluxo (BD FACSCANTO II, BD Biosciences, New Jersey, EUA).

3.5.2 Avaliação da expressão das caspases 3/7, 8 e 9

As caspases que são as executoras do processo apoptótico podem ser de dois
tipos: caspases efetoras como a caspase 3 ou iniciadoras como as caspases 8 e 9. A
ativação das caspases iniciadoras desencadeia o processo que leva a ativação da
caspase 3 resultando em morte celular (RIEDL, SHI, 2004; RUFINI; MELINO, 2011).
A avaliação da expressão de caspases pelas células expostas será realizada
com o Kit CaspaTagTM (Millipore, Temecula, CA, EUA), utilizando-se os reagentes
específicos para cada proteína a ser avaliada. Após a marcação, a suspensão celular
obtida será analisada em citômetro de fluxo (BD FACSCANTO II, BD Biosciences, New
Jersey, EUA).

3.5.3 Avaliação do estresse oxidativo (ERO)

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas fisiologicamente na
respiração celular, mas também podem ser resultado da ação de radiação, estímulos
apoptóticos e mesmo da ação de produtos químicos (MACHADO, W.A. 2011).
Para a investigação do estresse oxidativo do inserto exposto no sistema
Vitrocell® Cloud 12, uma solução a 10 μM do reagente Diacetato de
Diclorofluoresceína (DCFH-DA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) será adicionado
ao inserto mantido em estufa de cultivo por 1 hora. Após a incubação, as células serão
analisadas utilizando a citometria de fluxo.

3.5.4 Avaliação do Potencial de Membrana Mitocondrial (Δψm)

A mitocôndria é fundamental no processo de morte celular e alterações no
potencial da membrana dessa organela pode afetar sua integrigadade, comprometendo
o processo de respiração celular. (MACHADO, W.A. 2011). Para a verificação da
influência do glifosato sobre a integridade da membrana mitocondrial das células, o
inserto será incubado em estufa por 1 hora com uma solução a 1 μg/mL do corante
Rodamina-123 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), sendo posteriormente analisado
utilizando citometria de fluxo.

3.6 Ensaios toxicogenéticos

3.6.1 Ensaio do cometa
O teste de cometa é utilizado para detectar quebras nas fitas simples e duplas
do DNA, sítios álcali-lábeis e lesões oxidativas específicas (TICE, et al., 2000). O teste
do cometa será realizado após exposição do inserto no sistema Vitrocell® Cloud 12
para avaliação do potencial genotóxico. Para tal, serão realizadas as seguintes etapas:
lise celular, desnaturação do DNA e separação eletroforética (300mA, 25V, 20
minutos). As lâminas serão coradas com o corante Gelred, examinadas em
microscópio de fluorescência.

3.6.2 Ensaio epigenético

Os ensaios epigenéticos estudam as modificações que podem ocorrer no DNA e
nas histonas. Essas modificações podem ser repassadas às gerações futuras, mas não
causam alterações na sequência de bases do DNA. A alteração que ocorre no DNA é
a metilação (OLIVEIRA, N.F.P., et al; 2010).
Para quantificar níveis de metilação global será utilizada a técnica de Dot Blot.
40ng do DNA extraído será desnaturado a 99˚C por 5 minutos e aplicado em uma
membrana de nitrocelulose. Após secagem de 30 minutos, o DNA será fixado na
membrana através de UV-cross link. A membrana com o anticorpo Anti-
5methylcytosine (33D3, mouse monoclonal, diluição 1:1000) será incubada por 12
horas a 4˚C. Após lavagem com TBST 1x, o anticorpo secundário será adicionado
(goat anti-mouse igG, diluição 1:10.000) (CLEMENT; BENHATTAR, 2005). A detecção
da ligação DNA anticorpo será realizada utilizando o método ECL.

3.7 Ensaio de RT-PCR Quantitativo

O PCR em tempo real foi desenvolvido com base na técnica de PCR associado
a um sistema de fluorescência realizado em ciclos. Esta técnica permite ampliação,
detecção e quantificação de DNA em menor tempo e tendo os riscos de contaminação
diminuídos (MACKAY, et al., 2002).
 O perfil transcricional dos genes TP53, KRAS e EGFR será analisado por PCR.
O RNA total das células será obtido usando o mini kit RNAeasy, seguindo as instruções
do fabricante. A concentração e a pureza do RNA isolado será medida por densidade
óptica de 260 e 280 nm (NanoDrop 8000 – Thermo Scientific). A integridade do RNA
será verificada por eletroforese com 1,5% de gel de agarose marcado com brometo de
etídio. QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen) será usado para síntese de cDNA
com 1µg RNA, seguindo as instruções do fabricante. A PCR em tempo real será
realizada com 2,5 µL cDNA diluído 1/2 e 300 nM dos primers usando o kit Rotor-Gene
SYBR Green PCR (Qiagen). O tratamento DNase I para a digestão do gDNA será
realizado com um mini kit RNAeasy e QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen)
seguindo as instruções do fabricante. A especificidade da PCR será determinada
analisando a curva de melting e eletroforese em gel.
A sequência dos primers dos genes TP53, KRAS e EGFR será definida a
posteriori. As condições para PCR serão definidas baseadas nas seguintes: 95°C por 5
min, seguido por 40 ciclos de 5s à 95°C e 10s à 60°C usando o equipamento Rotor-
Gene (Qiagen, USA). O gene endógeno usado para normalização será o GAPDH. A
expressão relativa será calculada usando o método REST2009 (PFAFFL, 2001). Os
resultados serão obtidos em três experimentos independentes, cada um será feito em
duplicata e repetido duas vezes.

3.8 Análise dos resultados

Os dados obtidos serão tratados estatisticamente no software GraphPad Prism
5.01 (San Diego, CA, EUA). Já a análise estatística dos mecanismos de morte celular
serão realizadas pelo teste t de Student, para comparar amostras não pareadas.
Considerando as médias significativas estatisticamente quando p < 0,05.
Para o teste de cometa, a análise dos resultados será feita utilizando o software
Comet IV (Perceptive Instruments Ltda, Reino Unido). Para as análises de RT-PCR,
serão consideradas as curvas-padrão.

4.0 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGROFIT - Sistema de Agrotóxicos Fitossanitários do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento -
http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons. Acessado em
Dezembro 2016
ANVISA - Consulta Pública no 113, de 19 de dezembro de 2007. D.O.U de 20/12/2007.
<http://www4.anvisa.gov.br/base/visadoc/CP/CP[20903-1-0].PDF> , acessada em
Dezembro de 2016.
CLEMENT, G., BENHATTAR, J. A methylation sensitive dot blot assay (MS-DBA) for
the quantitative analysis of DNA methylation in clinical samples. Journal of Clinical
Pathology. 58:155-8. 2005.
FERLAY, J., SOERJOMATARAM, I., DIKSHIT, R., ESER, S., MATHERS, C., REBELO,
M., PARKIN, D. M., FORMAN, D., BRAY, F. Cancer incidence and mortality worldwide:
sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International journal of
cancer, v. 136, n. 5, p. E359-E386. 2015.
KUPPER, K. C., CORRÊA, F. E., DE AZEVEDO, F. A., DA SILVA, A. C. Bacillus subtilis
to biological control of postbloom fruit drop caused by Colletotrichum acutatum under
field conditions. Scientia Horticulturae. 134, 139-143. 2012.
LATIMER KM. Lung Cancer: Smoking Cessation. FP Essent. Jan; 464:11-16. 2018.
LEE HW, PARK SH, WENG MW, WANG HT, HUANG WC, LEPOR H, WU XR, CHEN
LC, TANG MS. E-cigarette smoke damages DNA and reduces repair activity in mouse
lung, heart, and bladder as well as in human lung and bladder cells.
Proc Natl Acad Sci U S A. Feb 13;115(7):E1560-E1569, 2018.
LIU, F.F.; PENG, C.; ESCHER, B.I.; FANTINO, E.; GILES, C.; WERE, S.; DUFFY, L.;
NORDGREN TM1, BAILEY KL. Pulmonary health effects of agriculture. Curr Opin Pulm
Med. Mar;22(2):144-9. 2016.
NG, J.C. Hanging drop: an in vitro air toxic exposure model using human lung cells in
2D and 3D structures. Journal of Hazard Materials, v.261, p.701-10. 2013.
MAZELLIER, P.; LEROY, E.; LEGUBE, B. Photochemical behavior of the fungicide
carbendazim in dilute aqueous solution. Journal of Photochemistry and
Photobiology. A, v. 153, p. 221-227. 2002
MCCARROLL, N. E., PROTZEL, A., IOANNOU, Y., STACK, H. F., JACKSON, M. A.,
WATERS, M. D., & DEARFIELD, K. L. A survey of EPA/OPP and open literature on
selected pesticide chemicals: III. Mutagenicity and carcinogenicity of benomyl and
carbendazim. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 512(1), 1-35. 2002.
PFAFFL, M.W. A new mathematical model for relative quantification in realtime
RT-PCR. Nucleic Acids Res 29, e45. 2001.
PICININI, E.C. Fungicidas benzimidazóis. Revisao
̃ Anual de Patologia Vegetal, v. 2,
p. 357- 409. 1994.
PROJECT, The Clinical Lung Cancer Genome; NGM, Network Genomic Medicine. A
genomics-based classification of human lung tumors. Science translational medicine,
v. 5, n. 209, p. 209ra153. 2013.
PLEIL JD. Breath biomarkers in toxicology. Arch Toxicol. Nov;90(11):2669-2682, 2016.
RODEN AC, CAMUS P. Iatrogenic pulmonary lesions. Semin Diagn Pathol. 2018
Jul;35(4):260-271.
SHTIVELMAN, E., HENSING, T., SIMON, G. R., DENNIS, P. A., OTTERSON, G. A.,
BUENO, R., & SALGIA, R. Molecular pathways and therapeutic targets in lung cancer.
Oncotarget, 5(6), 1392-1433. 2014.
SILVA, C. M. M. S.; DE MELO, I. S.; MAIA, A. H.; ABAKERLI, R. B. Isolamento de
fungos degradadores de carbendazim. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 37, n. 7,
p.1255-1264. 1999.
United States Environmental Protection Agency - EPA.
http://www.epa.gov/pesticides/factsheets/chemicals/carbendazim_ra.pdf, acessada em
Dezembro de 2016.
U.S. Environmental Protection Agency (EPA). Thiophanate-Methyl. Reregistration
Eligibility Decision (RED) Facts. Prevention, Pesticides and Toxic Substances
7508C. Outubro 2005.
WEBER, S.; HEBESTREIT, M.; WILMS, T.; CONROY, L.L.; RODRIGO, G. Comet
assay and air-liquid interface exposure system: a new combination to evaluate
genotoxic effects of cigarette whole smoke in human lung cell lines. Toxicology In
Vitro, v.27, n.6, p.1987-1991. 2013.