Biotransformação de
PESQUISA Isoflavonas de Soja
Aplicação da biotecnologia enzimática na conversão de isoflavonas com maior atividade biológica
Yong Kun Park
Prof. Dr. Laboratório de Bioquímica, Fac.
Engenharia de Alimentos, UNICAMP,
Campinas – SP,
ykpark@fea.unicamp.br
Cláudio Lima Aguiar
Doutorando em Ciência de Alimentos, Fac.
Engenharia de Alimentos, UNICAMP,
Campinas – SP,
claguiar@yahoo.com.br
Severino Matias Alencar
Doutorando em Ciência de Alimentos, Fac.
Engenharia de Alimentos, UNICAMP,
Campinas – SP,
matias@ fea.unicamp.br
Adilma Regina Pippa Scamparini,
Profa. Dra., Fac. Engenharia de Alimentos,
UNICAMP, Campinas – SP.
Brasil é o segundo
maior exportador
de grãos de soja
(Glycine max) e o
principal exporta-
dor de farelo de soja, com 32% do
mercado mundial, que represen-
tam 75% da produção brasileira
(Roessing, 1995). Há possibilidade de
que, em 2001, haja um aumento de
cerca de 10% a mais que no ano passa-
do, ou seja, alcançará aproximadamen-
te, 12,7 milhões de toneladas. As previ-
sões para a receita do complexo soja
(grão, óleo e farelo) mostram um au-
mento de até 14%, algo em torno de US$
4,8 bilhões. A área plantada foi de 13,7
milhões de ha na safra 2000/2001.
A soja vem sendo utilizada há muito
tempo como alimento devido ao seu
elevado teor protéico, muito embora
também possua em sua composição
química compostos polifenólicos como,
por exemplo, os isoflavonóides (Figu-
ra 1) que têm sido relacionados a impor-
tantes propriedades biológicas, tais
como: atividade anti-oxidante (Esaki et
al., 1999; Esaki et al., 1998; Shahidi et al.,
1992), atividade antifúngica (Naim et al.
1974), propriedades estrogênicas (Mur-
phy, 1982) e atividade anticancerígena
12 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 20 - maio/junho 2001
(câncer de mama e próstata) (Coward et
al., 1993; Peterson & Barnes, 1993; De-
nis et al., 1999).
Figura 1: Estruturas de
isoflavonas encontradas na soja
Países orientais, como Japão e Chi-
na, já utilizam há muitos anos a soja
fermentada na alimentação e, atual-
mente, tem-se percebido um crescente
consumo dessa leguminosa e de seus
derivados em países europeus e nos
Estados Unidos, como alimento funcio-
nal. Nos Estados Unidos, em 2000, a
produção de alimentos funcionais como
a soja foi de, aproximadamente, 20
bilhões de dólares, contudo, estima-se
que haverá um crescimento exponenci-
al, que, no ano 2010, atingirá a cifra de
quase 60 bilhões de dólares (Henry,
1999). Isoflavonas são a maioria dos
compostos fenólicos da soja (Ahluwalia
et al., 1953). Soja e farinha desengordu-
rada de soja, que tenham sofrido leve
aquecimento durante o processamento,
contêm, principalmente, 6-O-malonil-
glicosil isoflavonas, com menor quanti-
dade de b-glicosil isoflavonas e traços
de 6-O-acetil-glicosil isoflavonas. Lei-
te de soja, tofu e outros alimentos à
base de soja, que sofrem aquecimen-
to a 100ºC durante o processamento,
contêm, principalmente, b-glicosil iso-
flavonas. Farinha torrada e proteína
isolada de soja têm quantidades
moderadas de cada conjugado
de isoflavonas (Barnes, 1995).
Isoflavonas agliconas são absor-
vidas na parte superior do intes-
tino delgado com muitos medi-
camentos de estrutura similar (Co-
ward et al., 1993). b-Glicosil iso-
flavonas são excelentes substra-
tos para b-glicosidase e seria es-
perado que fossem absorvidos
no intestino delgado. As malonil
e acetil-glicosil isoflavonas mo-
dificadas são substratos inade-
quados para a hidrólise enzimá-
tica, sendo absorvidas no intesti-
no grosso após hidrólise induzi-
da por enzimas bacterianas no intes-
tino (Ebata et al., 1972).
Algumas isoflavonas, com genis-
teína (forma aglicona) têm grande
poder de controle de células cance-
rosas. Genisteína também inibiu o
crescimento de células tumorais da
próstata humana quando comparada
à sua forma glicosilada (Matsuda et
al., 1994). Além disso, foi reportado
que a atividade antioxidante de ge-
nisteína ou outras isoflavonas aglico-
nas foram superiores àquelas de gli-
cosil isoflavonas (Onozawa et al.,
1998). A conversão de b-glicosil em
isoflavonas agliconas resulta em quan-
tidades maiores de compostos bené-
ficos à saúde humana. O objetivo
deste trabalho foi converter b-glicosil
isoflavonas em agliconas, e estabele-
cer um processo adequado para con-
versão de formas glicosiladas em agli-
conas.
 METODOLOGIA que b-glicosidase endógena de soja hi- Como mostra a figura 2 – A, os isômeros
drolisa as glicosil isoflavonas à suas for- de malonil isoflavonas foram transforma-
A soja foi obtida no Instituto Agronô- mas agliconas (Ha et al., 1992; Carrão- dos por decomposição térmica a 121ºC
mico de Campinas. Os padrões de genis- Panizzi et al., 1999). Foi verificada produ- por 40 minutos. As formas glicosadas de
teína e daidzeína, bem como o substrato ção de b-glicosidase por todos esses isoflavonas, por sua vez, podem ser bio-
para reação enzimática, p-Nitrofenil-b-gli- microrganismos, incluído Aspergillus transformadas pelo complexo enzimáti-
copiranosídio (pNPG), foram obtidos da oryzae, que é usado na fermentação de co produzido por bactérias do intestino,
Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., USA). soja em meio semi-sólido, muito embora ou, ainda, biotecnologicamente, pode-se
Os padrões de genistina e daidzina foram A. oryzae tenha produzido maior ativida- obter a conversão de glicosil isoflavonas
obtidos da Funakoshi Chemical Co. (Tó- de enzimática (17,1 UI/mg) que outros. em suas formas agliconas por ação de
quio, Japão). Portanto, b-glicosidase de A. oryzae foi enzimas fúngicas, como b-glicosidase de
Os grãos de soja foram moídos até que utilizada neste estudo. Aspergillus oryzae (Figura 2-B e C). A
se obtivesse uma farinha bem fina. Essa conversão de glicosil em isoflavonas agli-
farinha foi desengordurada com hexano Conversão de glicosil conas foi devido à presença de b-glicosi-
por 30 minutos, a temperatura ambiente. isoflavonas em agliconas, dase (Figura 2). De fato, os esporos de A.
A farinha desengordurada de soja (FDS) por processo enzimático oryzae germinaram e a atividade enzimá-
foi misturada a 10 mL de solução 80% de tica foi também detectada após 24 horas
metanol a 60ºC, por uma hora, para extra- Durante fermentação de FDS por 48 de fermentação. No entanto, é aparente
ção das isoflavonas (b-glicosiladas e agli- horas (Tabela 1), a maioria das 724 mg/g que a conversão ocorreu principalmente
conas) presentes naquela FDS. O sobre- de glicosil isoflavonas foram convertidas após as 24 horas. Conclui-se que, durante
nadante contendo as isoflavonas foi utili- em agliconas (564 mg/g). Malonil isofla- a fermentação, a quantidade total de
zado para análise do teor de isoflavonas vonas podem ser convertidas em suas isoflavonas agliconas aumentou cerca de
em cromatografia líquida de alta eficiência correspondentes formas glicosadas por 27 vezes, quando comparada com valo-
em fase reversa (CLAE-FR), e para os tratamento térmico da farinha de soja.
estudos de conversão enzimática.
A conversão de b-glicosil isoflavonas
em agliconas foi estudada sob fermenta-
ção semi-sólida com Aspergillus oryzae
ATCC 22786. A enzima, b-glicosidase, uti-
lizada foi obtida a partir de fungo filamen-
toso em meio semi-sólido (esterilizado a
121ºC, por 20 min) de farinha de soja e
água (1:1, p/v) a 30ºC, por 48 horas. A
atividade enzimática foi monitorada pelo
método do pNPG. Os extratos obtidos
após as conversões foram conseguidos
pela extração metanólica (solução 80%).
Esses extratos foram analisados em CLAE-
FR. Foi utilizado um cromatógrafo Shima-
dzu SPD-M10 AVP equipado com coluna
YMC PACK ODS-A e detector de arranjo
de fotodiodos. Usou-se um fluxo de 0,5
mL/min e eluição gradiente, que consis-
tue em aumento linear de 20% a 80% de
metanol em água e ácido acético (19:1).
A atividade antioxidante dos extratos
de isoflavonas foi avaliada pela oxidação
acoplada de b-caroteno e ácido linoléico,
como descrito por Hammerschmidt &
Pratt (1978).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Produção de b-glicosidase
Hidrólise enzimática de glicosil isofla-
vonas de soja por microrganismos tem
sido reportada por pesquisadores da área.
Esses microrganismos são Rhizopus oryzae
(György et al., 1964); Rhizopus oligospo-
rus (Ebata et al., 1972); e Lactobacillus
casei (Matsuda et al., 1994), que são Figura 2: CLAE-FR dos extratos metanólicos de
usados na manufatura de alimentos fer- isoflavonas durante a biotransformação
mentados de soja. Foi também reportado
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 20 - maio/junho 2001 13
 Tabela 1: Biotransformação de glicosil isoflavonas em agliconas
Glicosil isoflavonas, mg/g Isoflavonas agliconas, mg/g
Daidzina Glicitina Genistina Total Daidzeína Gliciteína Genisteína Total
Antes Fermentação 310 ± 11 78 ± 3 336 ± 23 724 9 ±2 ND 12 ± 1 21
Após Fermentação 48 ± 3 11 ± 1 17 ± 2 76 298 ± 26 27 ± 3 260 ± 10 585
Os dados representam microgramas de isoflavonas por grama de farinha desengordurada de soja. Média ± SD das
amostras em triplicata. ND = Não Detectado

res anteriores à reação. Nesse experi-
mento, 10 gramas de FDS após esterili-
zação a 121ºC continha 724 mg/g, en-
quanto 10 gramas de FDS sem esteriliza-
ção continha 1.179 mg/g. Considera-se
que, durante o tratamento térmico, quan-
tidades significativas de glicosil isofla-
vonas foram decompostas.
Atividade antioxidante
do extrato metanólico
da FDS fermentada
As atividades antioxidantes dos ex-
tratos metanólicos de FDS foram medi-
das antes e após a fermentação (Figura
3). O extrato metanólico de farinha de
soja após a fermentação mostrou maior
atividade antioxidante que antes da
fermentação. Esses resultados são devi-
do à conversão de glicosil isoflavonas
em agliconas, as quais têm maior ativi-
dade antioxidante, como já havia sido
percebido em testes anteriores.
CONCLUSÕES
A produção de b-glicosidase micro-
biana, que está envolvida
na hidrólise de glicosil iso- Figura 3:
flavonas de soja em aglico-
nas, foi obtida usando-se
várias linhagens de micror-
ganismos que entram na
fermentação da soja, e o
Aspergillus oryzae produ-
ziu alta atividade na con-
versão de glicosil em isofla-
vonas agliconas. A enzima
converteu eficientemente
glicosil isoflavonas extraí-
das de FDS em suas formas
agliconas, e altas concen-
trações de isoflavonas agli-
conas mostraram elevada
atividade antioxidante.
AGRADECIMENTO
Os autores agradecem à Fundação ted with Aspergillus saitoi. Biosci. Biotech-
de Amparo à Pesquisa no Estado de São nol. Biochem. 63(5):851-858.
Paulo pelo apoio a este projeto (Projeto
FAPESP nº 00/10611-7).
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