Practica 6

“TINCIÓN DE BACTERIAS CON AZUL DE METILENO”

Equipo 1

Alcantar Huerta Esmeralda, Díaz Aguilar Juan José

RESUMEN
Se realizó la preparación de los frotis de las muestras de nódulos de planta,
madre de vinagre, yogurt natural, saccharomyces cerevisiae, bucal y de 2
celulares diferentes en el cual para su tinción se utilizó el colorante azul de
metileno para poder cambiar el color de los microorganismos y poder
realizar la observación de las muestras en el microscopio óptico.
Palabras clave: Tinción, frotis.

INTRODUCCIÓN
La tinción es un proceso por el cual
las moléculas de un colorante se
absorben a una superficie. El uso
de colorantes permite cambiar el
color de las células de los
microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio
óptico. Dado que las bacterias son
casi incoloras, no presentan
contraste con el medio en el cual
se encuentran suspendidas y no
pueden observarse claramente sin
algún tratamiento previo. De
acuerdo a la reacción que ocurre,
existen diferentes tipos de tinción:
 Simple: el colorante utilizado
sirve solo para denotar la
morfología celular.
 Diferencial: el colorante
utilizado pone de manifiesto
diferencias entre células
bacterianas o entre partes
de una misma célula, estas
técnicas utilizan más de un
colorante o bien ciertos
reactivos complementarios
para la tinción.
Los colorantes más usados son: azul
de metileno, cristal violeta,
safranina, estos son catiónicos y se
combinan fuertemente con
componentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos
nucleicos y los polisacáridos
ácidos.
El azul de metileno (C16H18ClN3S) es
un compuesto químico
heterocíclico aromático, cuyo
nombre científico es cloruro de
metiltionina, tiene una forma de
cristales o polvo cristalino y
presenta un color verde oscuro,
con brillo bronceado, es inodoro y
estable al aire. Sus disoluciones en
agua o en alcohol son de color
azul intenso, es fácilmente soluble
en el agua y en cloroformo. Se
utiliza en el área de la Medicina,
Acuicultura, Química etc.
Imagen 1) Azul de metileno.
Algunas de sus aplicaciones más
importantes
son:
 Agente de tinción en la
microscopia
 Trato en la enfermedad
llamada
metahemoglobinemia.
 Antiséptico en la terapia
clínica
 Tintura para teñir ciertas
partes del cuerpo antes o
durante la cirugía
 Tratar las infecciones
fúngicas de peces
tropicales.
 Retrasa el deterioro de las
funciones cognitivas de los
enfermos de Alzheimer.
OBJETIVO
Aplicar la técnica de tinción con
azul de metileno para varios
grupos bacterianos provenientes
de diferentes fuentes y adquirirá
mayor destreza en la preparación
de frotis, tinción y diferenciación
morfológica de los
microorganismos.
MATERIALES Y MÉTODOS
Antes de comenzar la práctica fue
importante limpiar la mesa con
Oxonia de Azufre, seguidamente
se colocó 1 mecheros y se
encendió para tener un área de
esterilización.
Se llevaron 7 muestras a la práctica
para poder analizarlas en el
microscopio las cuales fueron: 1
planta arrancada desde la raíz, 1
yogurt natural, madre de vinagre,
1 muestra bucal, 1 muestra de un
cultivo de saccharomyces
cerevisiae y por ultimo 2 celulares.
Técnica para bacterias nitrificantes con el objetivo de mayor aumento
de las leguminosas (100x, inmersión).

Esta técnica se realizó con la Técnica para bacterias de vinagre

muestra de la planta donde con
Con el asa bacteriológica
unas pinzas se cortaron los nódulos
esterilizada se tomó una pequeña
en forma de pequeñas verrugas,
porción de la madre de vinagre,
después de esto se colocaron en
simultáneamente se secó un
un vaso de precipitado con agua
portaobjetos y se añadió una gota
para lavar la tierra o arena que
de agua destilada, después de
estos pudieran tener, al mismo
haber realizado esto se siguió a
tiempo se tomó un portaobjetos
mezclar la gota de agua que se
limpio, se secó y se le colocó una
encontraba sobre el portaobjeto
gota de agua para poder
con la muestra de vinagre que
preparar la muestra, enseguida se
tenía el asa por todo el
tomaron los nódulos que estaban
portaobjeto, enseguida se secó
en el vaso para colocarlos sobre la
pasando el portaobjetos 3 veces
gota del portaobjeto y con una
sobre la llama del mechero,
asa bacteriológica previamente se
posteriormente se impregno el
empezó a frotar los nódulos con la
portaobjeto con azul de metileno
gota de agua para que estos se
dejándolo actuar durante 15
mezclaran, ya mezclados se
minutos, se escurrió el exceso de
retiraron los residuos del nódulo
colorante después del tiempo
para que se pudiera llevar el
transcurrido con una pizeta que
portaobjeto sobre la llama del
contenía agua lavándolo de una
mechero pasándola 3 veces para
forma inclina para no afectar el
secarla, se colocó el frotis
frotis, se dejó secar y ya que estuvo
preparado sobre el puente de
seco se agregó una gota de
vidrio que se encuentro sobre la
aceite de inmersión sobre el frotis,
charola, posteriormente se
y se observó al microscopio con el
impregno el portaobjeto con azul
objetivo de mayor aumento (100x,
de metileno dejándolo actuar
inmersión).
durante 15 minutos, se escurrió el
exceso de colorante después del Técnica para bacterias del yogurt
tiempo transcurrido con una pizeta
Se tomó una muestra del fondo de
que contenía agua lavándolo de
un yogurt natural con asa
una forma inclina para no afectar
bacteriológica esterilizada,
el frotis, se dejó secar y ya que
simultáneamente se secó un
estuvo seco se agregó una gota
portaobjeto y se añadió una gota
de aceite de inmersión sobre el
de agua destilada, después de
frotis, y se observó al microscopio
haber realizado esto se siguió a
mezclar la gota de agua que se
encontraba sobre el portaobjeto
con la muestra de yogurt que tenía
el asa por todo el portaobjeto,
enseguida se secó pasando el
portaobjetos 3 veces sobre la
llama del mechero,
posteriormente se impregno el
portaobjeto con azul de metileno
dejándolo actuar durante 15
minutos, se escurrió el exceso de
colorante después del tiempo
transcurrido con una pizeta que
contenía agua lavándolo de una
forma inclina para no afectar el
frotis, se dejó secar y ya que estuvo
seco se agregó una gota de
aceite de inmersión sobre el frotis,
y se observó al microscopio con el
objetivo de mayor aumento (100x,
inmersión).
Técnica para bacterias en medio
de cultivo de saccharomyces
cerevisiae
De un medio de cultivo de
saccharomyces cerevisiae se
tomó una muestra de una colonia
con asa bacteriológica esterilizada
, simultáneamente se secó un
portaobjeto y se añadió una gota
de agua destilada, después de
haber realizado esto se siguió a
mezclar la gota de agua que se
encontraba sobre el portaobjeto
con la muestra de saccharomyces
cerevisiae que tenía el asa por
todo el portaobjeto, enseguida se
secó pasando el portaobjetos 3
veces sobre la llama del mechero,
posteriormente se impregno el
portaobjeto con azul de metileno
dejándolo actuar durante 15
minutos, se escurrió el exceso de
colorante después del tiempo
transcurrido con una pizeta que
contenía agua lavándolo de una
forma inclina para no afectar el
frotis, se dejó secar y ya que estuvo
seco se agregó una gota de
aceite de inmersión sobre el frotis,
y se observó al microscopio con el
objetivo de mayor aumento (100x,
inmersión).
Técnica para bacterias en la boca
Con un hisopo se empezó a tallar
las muelas de un voluntario hasta
poder observar algún cambio en el
hisopo ya fuera de color o físico,
simultáneamente se secó un
portaobjeto y se añadió una gota
de agua destilada, después de
haber realizado esto se siguió a
mezclar la gota de agua que se
encontraba sobre el portaobjeto
con la muestra bucal que tenía el
hisopo por todo el portaobjeto,
enseguida se secó pasando el
portaobjetos 3 veces sobre la
llama del mechero,
posteriormente se impregno el
portaobjeto con azul de metileno
dejándolo actuar durante 15
minutos, se escurrió el exceso de
colorante después del tiempo
transcurrido con una pizeta que
contenía agua lavándolo de una
forma inclina para no afectar el
frotis, se dejó secar y ya que estuvo
seco se agregó una gota de
aceite de inmersión sobre el frotis,
y se observó al microscopio con el DISCUSION DE RESULTADOS
objetivo de mayor aumento (100x,
inmersión). Técnica para bacterias nitrificantes
de las leguminosas

La imagen observada desde el

Técnica para bacterias en un microscopio de esta muestra es la
celular siguiente:
Con un hisopo se empezó a tallar
el celular a evaluar por toda la
pantalla hasta que en el hisopo se
observe un poco de suciedad,
simultáneamente se secó un
portaobjeto y se añadió una gota
de agua destilada, después de
haber realizado esto se siguió a
mezclar la gota de agua que se
encontraba sobre el portaobjeto
con la muestra de saccharomyces
cerevisiae que tenía el hisopo por
todo el portaobjeto, enseguida se
secó pasando el portaobjetos 3
veces sobre la llama del mechero,
posteriormente se impregno el Imagen 2) Nódulos de una plata
portaobjeto con azul de metileno observados desde un microscopio.
dejándolo actuar durante 15 Se puede observar 2 conjuntos de
minutos, se escurrió el exceso de estafilococos y algunos cocos
colorante después del tiempo alrededor de estos donde se notan
transcurrido con una pizeta que de un color azul provocado por el
contenía agua lavándolo de una azul de metilo que funciono como
forma inclina para no afectar el un agente de tinción simple ya que
frotis, se dejó secar y ya que estuvo el único color que se observa en la
seco se agregó una gota de imagen
aceite de inmersión sobre el frotis,
y se observó al microscopio con el Técnica para bacterias de vinagre
objetivo de mayor aumento (100x, Después de la metodología ya
inmersión). Este proceso se hizo por hecha en el microscopio se
duplicado ya que se analizaron 2 observó el siguiente resultado:
celulares diferentes.
 Se puede observar la presencia de
bacilos y de alguno diplobacilos en
una mayor concentración
considerando la muestra de
madre de vinagre, por teoría se
esperaba encontrar estos
organismos y también por teoría se
espera que sea lactobacilos.

El color presente en los

Imagen 3) Muestra de madre de
vinagre observada desde el
microscopio.
En esta se puede pueden observar
algunos bacilos y diplobacilos
donde el lugar más llamativo es
donde se observan 5 bacilos
juntos, se observa un color azul
provocado por la tinción del azul
de metileno.
Técnica para bacterias del yogurt
microorganismos fue por el efecto
del azul de metilo que actuó como
un agente de tinción.
Técnica para bacterias en medio
de cultivo de saccharomyces
cerevisiae
En la muestra de saccharomyces
cerevisiae se observó la siguiente
imagen:

La imagen observada desde el

microscopio de esta muestra es la
siguiente:

Imagen 5) Saccharomyces
cerevisiae con azul de metileno.

Imagen 4) Microorganismos Se observa una concentración

presente en una muestra de yogurt alta de estafilococos,
estreptococos, diplococos y cocos Técnica para bacterias en un
siendo de las muestras donde más celular
concentración de organismos se
Esta técnica se hizo 2 veces con 2
encontró, y era algo de suponerse
diferentes celulares las cuales las
porque la muestra fue diseñada
vamos a llamar muestra JJ y
especialmente para la práctica
muestra MM para poder
por el profesor, donde el color azul
diferenciarlas, las siguientes
fue provocado por la tinción del
capturas fueron la observación
azul de metileno.
desde el microscopio de estas
Técnica para bacterias en la boca muestras:

Después de un tiempo de observar

la muestra en el microscopio se
capturo la siguiente imagen:

Imagen 7) Muestra JJ observada

desde microscopio.

Imagen 6) Muestra bucal

observada desde el microscopio.

Se observan microorganismos con

una forma entre irregular y
filamentosa en la gran mayoría de
la muestra, mientras que en
algunas partes de pueden
observar la presencia de algunos
cocos sobre todo en los extremos
de la imagen, el color azul se debió Imagen 8) Muestra MM observada
a la tinción del azul de metileno. desde el microscopio.
Se puede observar que la en la
muestra JJ no se encontró ningún
microorganismo ya sea porque se
realizó mal la toma o preparación
de la muestra o de verdad el
celular se encontraba limpio,
mientas que la muestra MM se
puede observar algunos cocos
sobre todo uno indicando que este
celular se encuentra contaminado
de algunos microbios. El color azul
es por la tinción del azul de
metileno.
CUESTIONARIO
1.-Dar un ejemplo de algún
organismo que de manera típica
sea teñido con azul de metileno
R: Azul de metileno puede
agregarse a las preparaciones en
fresco de heces para observar la
presencia de leucocitos.
2.- ¿Cómo se denomina la tinción
en la que interviene la
combinación de azul de metileno
y fucsina fenicada? ¿En qué
consiste?
R: Tinción de Ziehl-Neelsen, Las
paredes celulares de ciertas
bacterias contienen ácidos grasos
(ácidos micólicos) de cadena
larga (50 a 90 átomos de carbono)
que les confieren la propiedad de
resistir la decoloración con
alcohol-ácido, después de la
tinción con colorantes básicos. Por
esto se denominan ácido-alcohol
resistente. Las microbacterias
como Mycobacterium tuberculosis
y M. marinum se caracterizan por
sus propiedades de ácido-alcohol
resistencia. La coloración clásica
de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el
colorante atraviese la pared
bacteriana que contiene ceras. Al
suspender el calentamiento y
enfriar con agua, provoca una
nueva solidificación de los ácidos
grasos de modo que el colorante
ya no puede salir de las bacterias.
Por otro lado, el calentamiento
aumenta la energía cinética de las
moléculas del colorante lo cual
también facilita su entrada a las
bacterias. Las bacterias que
resisten la decoloración son de
color rojo y las que no, se ven de
color azul ya que se utiliza azul de
metileno como tinción de
contraste. Debido a esto, está que
está muy influenciado con la
enfermedad de tuberculosis.
3.- ¿La tinción con azul de metileno
a qué tipo de tinción pertenece?
¿Por qué?
R: Tinción simple, porque se utiliza
un solo colorante, por lo que todas
las estructuras celulares se tiñen
con la misma tonalidad.
4.- Dar un ejemplo de inhibición
competitiva en la que el azul de
metileno intervenga
R: Deshidrogenas succinica
CONCLUSIONES
Juan José Díaz Aguilar
En esta práctica aprendí que
el azul de metileno es una
gran opción en la tinción
simple ya que aparte de su
gran rendimiento y afinidad
con la mayoría de los
materiales es una alternativa
muy económica sin contar
que aparte del campo
laboratorista tiene una gran
utilidad en otros campos
como lo es la medicina, la
química y la acuicultura entre
otras disciplinas.
REFERENCIAS
Madigan, M., Martinko, J. and Parker, J. (1997). Biology of microorganisms.
New Jersey: Prentice Hall.

Bioquimicamedicablog, V. (2019). Escuela Nacional de Medicina y

Homeopatía. [Online] Bioquímica Médica I. Available at:
https://bioquimicamedicablog.wordpress.com/2017/12/13/practica-7-
inhibidores-enzimaticos/ [Accessed 10 Mar. 2019].

Lifeder. (2019). Tinción de Ziehl-Neelsen: Fundamento, Reactivos y Técnica -

Lifeder. [Online] Available at: https://www.lifeder.com/tincion-ziehl-neelsen/
[Accessed 10 Mar. 2019].

Microinmuno.qb.fcen.uba.ar. (2019). Técnicas de tinción. [Online] Available

at: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
[Accessed 10 Mar. 2019].