TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS Y DE TIPADO MOLECULAR

DE MICROORGANISMOS
A. TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS DE TIPADO DE
MICROORGANISMOS

A. 1. CONCEPTOS GENERALES DE INMUNOLOGÍA

1. LOS LINFOCITOS COMO COMPONENTES DEL SISTEMA INMUNITARIO.

El sistema inmunitario está formado por todos

los órganos donde se originan, transforman y
acumulan linfocitos. Los linfocitos se originan por
diferenciación de las células madres de la
médula ósea, que se transforman en uno u otro
tipo de linfocito según el lugar donde maduren.
Las estructuras en las que se produce tal
maduración son los órganos linfoides primarios:

-El timo, que produce linfocitos T.

-La médula ósea, productora de linfocitos B.

Al abandonar estos órganos, las células

linfocitarias circulan por la sangre y la linfa
hasta las estructuras donde se acumulan, que
son los órganos linfoides secundarios (ganglios,
bazo, amígdalas, apéndice, placas de Peyer y
adenoides).

Los linfocitos B producen inmunoglobulinas-

anticuerpos- (cada linfocito B lleva en su
membrana un solo tipo de inmunoglobulina), capaces de detectar y neutralizar
específicamente a los antígenos. Estos linfocitos son los encargados de dar la
llamada “respuesta humoral”.

Los linfocitos T, por otra parte, poseen moléculas receptoras específicas que
reconocen antígenos en la
superficie de otras células del
organismo y son los responsables
de desencadenar la llamada
“respuesta celular”.

2. ANTICUERPOS
Los anticuerpos son glicoproteínas, del tipo inmunoglobulinas, que son
producidas por los linfocitos B como respuesta a la exposición a una sustancia
extraña (antígeno)

Los anticuerpos están compuestos por cuatro cadenas polipeptídicas:

- dos cadenas pesadas iguales (cadenas H) y dos cadenas ligeras también

idénticas (cadenas L), unidas entre sí por puentes disulfuro, constituyendo una
estructura simétrica en forma de Y griega, flexible.

Las moléculas de los distintos anticuerpos son muy parecidas, aunque

lógicamente existen diferencias estructurales. En realidad, en cada
inmunoglobulina se pueden diferenciar dos tipos de regiones:

- Los extremos de las cadenas H y L se llaman porción variable ya que la

secuencia de aminoácidos varía de un anticuerpo a otro. Los dos extremos de
la Y son los centros de unión a los antígenos, de forma que los anticuerpos son
bivalentes.

- El resto se denomina porción constante y no tiene la propiedad de unirse a

los antígenos.

Existen 5 tipos de Ig que se diferencian por el tipo de cadena H. De todas

ellas, las Ig G, son las más numerosas y las únicas capaces de atravesar la
placenta y penetrar en el feto.

Un individuo requiere gran variedad de anticuerpos para reconocer cientos,

miles o millones de epitopos*. Los mamíferos, en concreto, son capaces de
sintetizar muchos millones de anticuerpos diferentes, pero toda esa gran
variedad de inmunoglobulinas difiere, esencialmente y como ya indicamos, en
la región variable.

*Los epitopos o determinantes antigénicos son cada uno de los sitios discretos de una
macromolécula que son reconocidos individualmente por un anticuerpo específico o por un TCR
(receptores de células T) específico. Son las regiones inmunológicamente activas de un
inmunógeno (las que se unen de hecho a un receptor de linfocitos o a un Ac libre). Por lo tanto,
los antígenos son estructuras complejas que suelen constar de varios tipos de epitopos, cada uno
de ellos capaz de unirse con un Ac o un TCR específico diferente. En este sentido, las
macromoléculas son antígenos multivalentes, con muchos tipos de determinantes antigénicos
distintos.

Un solo antígeno puede presentar diferentes

epítopos en su superficie, es decir, puede
estimular la producción de diferentes anticuerpos,
cada uno de los cuales es específico para un
epítopo concreto. Una sustancia extraña que
contenga diferentes epítopos, al entrar en el
organismo provocará la producción de distintos
anticuerpos procedentes de diferentes clones de linfocitos B. Por ellos, estos anticuerpos reciben el
nombre de anticuerpos policlonales.

2.1. ANTICUERPOS MONOCLONALES

Un anticuerpo monoclonal es aquel capaz de reconocer específicamente una

parte del antígeno, es decir un epítopo en concreto, y que es producido por un
clon de linfocitos B.

Los linfocitos B naturales no pueden producir suficientes cantidades de estos

anticuerpos para que puedan ser empleados con fines terapéuticos o de
diagnóstico. En 1975, se consiguió resolver este problema fusionando
linfocitos B productores de anticuerpos con células inmortales de un tumor
llamado mieloma. Las células resultantes constituyen una fuente de
anticuerpos homogéneos (monoclonales) que se pueden producir en grandes
cantidades.

La técnica clásica utilizada para producir anticuerpos monoclonales,

consiste en inyectar un animal (en general ratones, ratas o conejos) con la
sustancia contra la que se desea obtener anticuerpos. La presencia de la
sustancia extraña induce a los linfocitos B a fabricar anticuerpos. Estas células
son extraídas y fusionadas con una línea celular de mieloma. Las células no
fusionadas se eliminan. Llegados a este punto, cada célula fusionada - llamada
hibridoma - fabrica un único tipo de anticuerpo, llamado anticuerpo
monoclonal. El hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal deseado, se
identifica, y esta nueva línea celular se utiliza para producir grandes
cantidades del anticuerpo.

El primer anticuerpo monoclonal terapéutico comercial producido mediante la

técnica del hibridoma, de origen murino (ratón), fue aprobado en 1986. Su uso
clínico presenta importantes limitaciones derivadas de su origen no humano,
como por ejemplo una corta vida media en sangre, un ineficiente
reclutamiento de funciones efectoras y problemas inmunológicos. En una
proporción importante de los pacientes tratados con este anticuerpo se
desarrolla una respuesta de anticuerpos humanos antiinmunoglobulinas
murinas (HAMA, del inglés Human Anti-Murine Antibodies), provocando, en
algunos casos, la pérdida de eficacia y, en otros, una reacción inmune
generalizada. Esto ha dado lugar al desarrollo de nuevas tecnologías de
producción de anticuerpos monoclonales, en las que, mediante ingeniería
genética, es posible construir anticuerpos quiméricos, humanizados y
completamente humanos. Así se logra disminuir la antigenicidad, a la vez
que se mantiene la afinidad y especificidad de unión de los anticuerpos. Los
anticuerpos quiméricos conservan únicamente secuencias génicas de ratón
para las regiones variables del anticuerpo. Los anticuerpos humanizados
poseen hasta un 90% de secuencia genética humana y, finalmente, los
anticuerpos totalmente humanos derivan completamente de genes humanos.
 Los anticuerpos monoclonales son los productos principales de los laboratorios de
diagnóstico, con aplicaciones muy variadas que van desde las pruebas de embarazo, hasta la
determinación de los niveles que alcanzan los fármacos una vez inyectados en el organismo
humano. A nivel terapéutico, se ha aprobado el uso clínico de varios anticuerpos
monoclonales para el tratamiento del cáncer.

Anticuerpo quimérico en el que se conserva

la región variable de ratón de las cadenas
pesadas y ligeras (VH y VL) y se une con una
región constante de las cadenas humanas
ligeras y pesadas.

Anticuerpo humanizado en el que se conservan

las regiones hipervariables o CDR (regiones
determinantes de complementariedad) de ratón,
unidas a una estructura humana.

A.2. INMUNOENSAYOS:

1. AGLUTINACIÓN

1. Aglutinación con bacterias completas: Es una de las técnicas serológicas más sencillas. El
suero problema se enfrenta con bacterias que contienen en su superficie los antígenos reconocidos
por los anticuerpos que se buscan. Si la muestra contiene estos anticuerpos, se unen a las bacterias,
agregándolas y provocando que se aglutinen en precipitados visibles macroscópicamente. Por esta
razón estos anticuerpos se denominan aglutininas. La prueba suele realizarse sobre portaobjetos. Es
muy importante homogeneizar muy bien el suero con la suspensión de bacterias y mantener en
agitación el tiempo indicado por el fabricante. La superficie bacteriana se encuentra cargada
negativamente y por eso las bacterias se repelen entre sí. Para evitar falsos negativos, la aglutinación
se realiza en presencia de iones positivos. Es un método utilizado para la determinación rápida de
anticuerpos frente a Brucella, Francisella tularensis, Clostridium tetani, y Leptospira, (algunas de
ellas difíciles de cultivar). Se han desarrollado también pruebas de aglutinación para algunos
parásitos como Plasmodium o Toxoplasma.

2. Aglutinación de partículas: No utiliza células completas, sino partículas inertes a las que se
conjuga los antígenos específicos del agente que se busca. Suelen utilizarse partículas de látex.
Cuando existen anticuerpos específicos estas partículas se agregan y precipitan. Sistemas similares
pueden utilizarse para detectar antígenos si lo que se conjuga a las bolas de látex son los anticuerpos.
Los resultados obtenidos dependen de multitud de factores, sobre todo de la cantidad y de la avidez
de los anticuerpos, del tiempo de incubación y de las condiciones fisicoquímicas del ensayo. Por eso
siempre debe seguirse con exactitud el protocolo estandarizado e incluir controles positivos y
negativos, normalmente incluidos en los kits comerciales.

3. Hemaglutinación: La hemaglutinación es una técnica muy similar, que utiliza hematíes unidos
a los antígenos. Si existen anticuerpos específicos, los eritrocitos floculan formando grumos
detectables a simple vista. Es uno de los métodos más utilizados para la detección de anticuerpos
frente a Treponema pallidum, que produce la sífilis. También puede usarse para detectar muchos
otros anticuerpos dirigidos frente a gérmenes o sus toxinas. Algunos virus son capaces de provocar la
aglutinación de hematíes in vitro. Puede aprovecharse esta circunstancia para detectar anticuerpos
específicos frente a estos agentes a través de la técnica de inhibición de la hemaglutinación. Para
realizarla se coloca el suero problema en una suspensión de hematíes y en presencia del virus en
cuestión. Si existen anticuerpos se pegarán a la superficie de los virus impidiendo su interacción con
los eritrocitos y por tanto inhibiendo la hemaglutinación. Se puede usar esta técnica para medir
anticuerpos correspondientes al virus de la rubéola o al de la gripe entre otros.

2. INMUNOFLUORESCENCIA

La inmunofluorescencia se diferencia de otras técnicas inmunoquímicas en que aquí la marca unida

al anticuerpo es una molécula fluorescente, como por ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína. El
anticuerpo marcado se hace reaccionar contra un preparado biológico y luego se expone la muestra
tratada a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul) seleccionada por medio de un
monocromador. Esta luz de onda corta genera un fenómeno de fluorescencia en la molécula
marcadora que a su vez emite luz a una longitud de onda mas larga (verde, amarillo o naranja). Esta
luz emitida puede ser cuantificada con facilidad por fotometría o en el caso de tratarse de preparados
histológicos, puede ser observada por medio de un microscopio de fluorescencia.

 Variedades principales de inmunofluorescencia:

- Inmunofluorescencia directa: sobre un porta depositamos una muestra en la que buscamos la

presencia de un determinado antígeno. Añadimos un suero específico del antígeno problema
marcado con isotiocianato de fluoresceína (conjugado). Si el antígeno problema se encuentra
presente en la muestra, se une el conjugado. En caso contrario el conjugado se elimina con un lavado
del porta.

- Inmunofluorescencia indirecta: sobre un porta que lleva pegado un antígeno conocido,

añadimos el suero problema. Si éste contiene anticuerpos específicos, se unen al antígeno. Los
anticuerpos del suero no específicos del antígeno del porta se eliminan mediante un lavado.
Posteriormente se añade un suero anti-inmunoglobulina humana marcada con isotiocianato de
fluoresceína (conjugado). El conjugado se une a los anticuerpos específicos o se elimina mediante
lavado si dichos anticuerpos específicos no se encuentran presentes en el suero problema.

La observación de luz verde fluorescente “tiñendo” un objeto del porta indica la presencia del
antígeno en la muestra o de anticuerpos específicos en el suero, según el caso.

3. TÉCNICA ELISA (Enzyme linked immunodsorbent assay)

El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una

enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno
o anticuerpo), marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente), la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y,
por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un sustrato
especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista
o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Existen distintas técnicas de ELISA
que se enumeran a continuación:

• Anticuerpos marcados:
- ELISA Directo
- ELISA Indirecto
- ELISA sándwich
- Doble (DAS))
• Antígeno marcado
- ELISA competitivo

Pasos generales de un ELISA.

1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o
anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno
tapizado en el pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo
no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del substrato
9. Unión del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color

ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de los antígenos problema. A
continuación, se realiza un lavado para eliminar los antígenos fijados
deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los
anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado.
Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

ELISA Indirecto.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos
objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o
no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán
específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los
anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan
con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se
encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

ELISA Sandwich “DAS” (Double Antibody Sandwich).

Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no
fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,
etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico
(antígeno), reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte.
Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la
muestra no fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un
epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte)
conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos
con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado
para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.

ELISA Competitivo.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a
detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no
fijados.
• Adición en concentración conocida de una mezcla de antígenos del
anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antígenos
desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, añadir únicamente antígenos
del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para
eliminar los antígenos que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima
marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado de ambas pruebas
y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son análogas, el
antígeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para
tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el
antígeno objeto de estudio, está relacionado serológicamente con el anticuerpo
empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad óptica, es
proporcional a la concentración del antígeno problema en la muestra.
. Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos:
• ELISAs para detectar antígenos: ELISAs sándwich.
• ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos

La fase sólida debe ser de un tipo que permita un

fácil manejo (especialmente en los procesos de
lavado) y la reproducibilidad de la unión de antígenos
o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de
96 pocillos y un volumen de 350μL son
especialmente ventajosas para procesar un elevado
número de muestras y una vez tapizadas, el material
inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo
siempre que se mantenga seco y a baja temperatura.
Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden
adquirirse estériles y con o sin tapa.

B. MÉTODOS MOLECULARES DE TIPADO DE MICROORGANISMOS

1. Ribotificación:

El Ribotipado es un método que permite identificar y clasificar bacterias en función del los genes del
RNA ribosómico.

Los genes del rRNA se encuentran dentro de las regiones mejor conservadas del genoma bacteriano.
Existen varias copias de genes para el rRNA en cada célula y su número y localización específica en
el cromosoma varían según las especies. Por tanto, los patrones de bandas (su número, tamaño e
intensidad) del DNA cromosómico digerido e hibridado con sondas marcadas para los genes rRNA,
son específicos de cada cepa bacteriana, por lo que pueden ser utilizados para reflejar diferencias a
nivel de especies y subespecies, es decir, para identificar y caracterizar bacterias al comparar dichos
patrones con los obtenidos a partir de bacterias conocidas.

La técnica del Ribotipado consiste en los siguientes procesos:

1. Extracción y digestión del DNA a partir de una colonia bacteriana en placa.

2. Separación mediante electroforesis de los fragmentos de DNA.
3. Transferencia de los fragmentos separados a una membrana de Nylon.
4. Hibridación con una sonda del operón rRNA de E. coli marcada químicamente.
5. Adición de un conjugado enzima-anticuerpo que se une al marcaje de la sonda.
6. Detección de las bandas mediante quimioluminiscencia.
7. Análisis y comparación de las bandas frente a una base de datos, lo que permite la
caracterización y presunta identificación de la cepa bacteriana.

2. Secuenciación del gen 16 s ARNr. La parte de ADN que se utiliza comúnmente en la

taxonomía bacteriana es el gen 16 S ARNr. Su tamaño es de 1550 pb, y está compuesto por zonas
conservadas y variables a lo largo de su secuencia.
El gen es suficientemente grande como para generar polimorfismos interespecíficos para poder
distinguir e identificar cepas.
El parecido entre dos secuencias indica siempre la existencia de algún tipo de relación filogenética,
de forma que el análisis comparativo de su secuencia permite, además de identificar
inequívocamente a los microorganismos, construir un árbol filogenético que muestra la posición
evolutiva de dichos microorganismos.

3. Sistemas BAX. Utilizan el poder de la PCR para lograr resultados rápidos y confiables. Cada
prueba está diseñada para amplificar un segmento de ADN específico de cada organismo,
produciendo en pocas horas niveles tales como para ser detectados.
Los sistemas BAX simplifican la PCR, ya que incluyen todos los cebadores requeridos, polimerasa y
nucleótidos en una pastilla única, empaquetada dentro del tubo de muestra, evitando así errores de
manipulación.
La Salmonella es una de las causas más frecuentes de enfermedad presente en los alimentos, Se han asociado diversos
serotipos con carne, aves, huevos, leche, pescado, salsas, postres rellenos de crema, y otros alimentos. Con un aumento
en la resistencia a los antibióticos y una tendencia ascendente de la prevalencia en pollos, los procesadores de alimentos
necesitan unos métodos de prueba rápidos y precisos. El aislado tradicional a partir de un cultivo requiere muchos pasos
y más de cuatro días para la obtención de resultados.

4. Código de barras bacteriano. Se basa en las secuencias no codificantes repetitivas presentes

a lo largo del genoma de las bacterias.
Se realiza una PCR con los cebadores complementarios a las secuencias amplificadas que flanquean
regiones repetitivas. Las secuencias amplificadas se separan mediante electroforesis. El patrón de
bandas obtenido, o el código de barras, es característico de cada cepa de bacterias, y es equivalente a
la huella dactilar en humanos. Los análisis de los patrones obtenidos se hacen mediante programas
de ordenador, que permiten la generación de dendrogramas indicando las relaciones existentes entre
las diferentes cepas analizadas.

5. RAPD. (Polimorfismo de la amplificación aleatoria de ADN). Generalmente usada para la

tipificación de microorganismos, consiste en una PCR asimétrica, puesto que se utiliza solo un
cebador. Está basado en el uso de oligonucleótidos pequeños (6-12 pb) que se unen
inespecíficamente y aleatoriamente al genoma del microorganismo, generando la amplificación de
muchas bandas de diversos tamaños. Para que se genere un fragmento RAPD es necesario que las
dos hebras del ADN en estudio presenten sitios de hibridación con el oligonucleótido en
orientaciones opuestas suficientemente cercanas (menos de 3000bp) como para permitir la
amplificación. El análisis de los perfiles producidos por el RAPD se basa en examinar y comparar el
la presencia o ausencia de fragmentos de ADN amplificado, permitiéndolos agrupar de acuerdo a la
coincidencia. Presenta la ventaja de que es una técnica anónima, es decir no se requiere un amplio
conocimiento del genoma para llevarla a cabo

6. Ausencia de un microorganismo específico. Para detectar con gran probabilidad la

ausencia de un determinado organismo, se necesita un enriquecimiento del cultivo hasta obtener 10 3
células/ml. A continuación se lisan las células, se extraen los ácidos nucleicos y se realiza una PCR
con cebadores específicos del microorganismo que se sospeche que puede estar en la muestra. Tras
una electroforesis, los ácidos nucleicos pueden detectarse por quimioluminiscencia, mediante el uso
de sondas de ADN o secuencias de ARNr.

Células inmunocompetentes.
Célula madre Línea mieloide granulocitos Neutrófilos polimorfonucleares
pluripotencial Eosinófilos
Basófilos (mastocitos)
agranulocitos
Monocitos y macrófagos
 Linfocitos TyB
Línea linfoide
Células NK