ELECTROFOREZA

Curs 9-10

Notiuni introductive
Electroforeza reprezintă o metodă de analiză și separare bazată pe migrarea particulelor solide încărcate electric (ioni,
macromolecule cu sarcină electrică, coloizi, unele celule, precum bacterii sau eritrocite) dispersate într-un lichid sub
acțiunea unui camp electric. Mediul în care se pot deplasa speciile încărcate electric pot fi:
1) mediu liber nelegat (pe o coloanăde lichid);
2) mediu fixat (pe suport poros).
Astfel, daca se stabileste o diferenta de potential intre extremitatile unei solutii sau benzi de hartie (gel sau alte
materiale), impregnata cu un electrolit convenabil, pe care se depune o picatura de analit, constituientii ionici ai analitului
se vor deplasa sub actiunea campului electric cu viteza lor proprie. Aceasta viteza poate fi urmarita si masurata.

Prin electroforeza se pot determina marimea, forma si sarcina unei molecule, masa moleculara etc.

O specie chimica cu sarcina q , aflata intr-un camp electric de intensitatea E(volti/cm) va fi supus unei forte FE data de
relatia:

Deplasarea specie ionice se realizeaza intr-un fluid, acestei deplasari i se opune forta de frecare Stokes data de relatia :

în care η este vâscozitatea mediului lichid în care sarcina se deplasează, r este raza speciei ionice (considerata sferică), iar
ve este viteza de deplasare.

Componenta echipamentului de electroforeza

Echipamentul de electroforeza consta in:
• Camera de electroforeza cu doua compartimente care contin solutia sistemul electroforetic si in care se gasesc
electrozii
• Electrozi de carbon sau platina
• Sursa de curent electric continuu cu tensiune variabila
• Capac care minimalizează evaporarea
Sistemul electroforetic consta din:
- o faza lichida (un electrolit in solutie, solutie tampon)
- o faza solida ce este in contact cu faza lichida (hartia cromatografica, foi de acetat de celuloza, geluri de agaroza 1%,
agar-agar 1,5%, amidon)
- in cazul in care corpul solid este poros, poate fi prezenta si o a treia faza, o faza gazoasa ce este in echilibru cu cea
lichida.

Mobilitatea electroforetica a particulelor se defineste ca distanta parcursa pe secunda intr-un camp electric de
forta electrica egala cu o unitate de potential si se determina si de caracteristicile constructive ale celulei de electroforeza
si de caracteristicile componentelor analizate astfel:
𝑙 𝑙′
µe = d 𝑡 𝑉 ( 𝑙 )
unde : µe - mobilitatea electroforetica a ionului (cm2/Vs);
d - distanta parcursa de component pe hartie (cm);
l - lungimea benzii de hartie (cm);
t - durata electroforezei (s);
V - diferenta de potential (Volti);
l’/l - factor de corectie care caracterizeaza sinuozitatea fasciculelor capilare ale hartiei si depinde de tipul de hartie folosit

Rolul si caracteristicile elementelor componente ale celulei de electroforeza

Solutiile de electroliti - Soluţii Tampon
• Solutia de electrolit (sau sistemul tampon) trebuie sa fie in asa fel aleasa incat sa permita separarea neta a compusilor
probei de analizat, fara sa reactioneze cu acestia.
-Ca electroliti se utilizeaza solutii tampon (aminoacizi), solutii diluate de electroliti tari (KCI, KNO3, etc.), solutii ale acizilor
slabi (acid tartric, acid citric, acid acetic) sau a sarurilor lor cu baze tari, etc
• Forta ionica a electrolitului μ - este o mărime care determină potenţialul câmpului electric existent în soluţie importanta
in alegerea diferentei de potential care i se va aplica celulei


1
2
  1 n
c1 z12  c2 z 22  c3 z32    cn zn2   ci zi2
2 i 1
unde c1, c2, ..., cn sunt concentraţiile molare ale diverşilor ioni în soluţie şi z1, z2, ..., zn sarcinile lor
-Trebuie sa fie bine corelata cu tensiunea aplicata precum si cu timpul de electroforeza. Daca se utilizeaza solutii tampon
cu o forta ionica μ = 0,05 - 0,1 trebuie sa se aplice o tensiune mica pe o durata de timp mai lunga.
Reducerea duratei de migrare se realizeaza prin scaderea fortei ionice (μ = 0,05 sau mai mica) si ridicarea tensiunii.

Surse de alimentare
• Sursă de alimentare: curent continuu intre 2 electrozi
• Flux de curent produce căldura care incalzeste proba
- Creşterea vitezei de migraţie si determina extinderea tipurilor de probe
- Formarea de curenti de convectie care determina amestecarea probelor
- Instabilitate termică a probelor sensibile la căldură
• Evaporarea apei determina concentrarea ionilor, creşterea vascozitatii soluţiei tampon si scade rezistenţa electrica
• Pentru a minimiza problemele: se utilizeză surse de alimentare cu putere constantă si mare

Electroforegrama
§ Detectoarele sunt plasate la catod/anod, in conditii comune, toate speciile sunt conduse in aceasta directie de catre
forta electromotoare.
§ Detectoare de tip spectrometre cu absorbtie UV, de fluorescenta si MS etc.
§ Detectoare sensibile sunt necesare pentru concentratii mici.

TIPURI DE ELECTROFOREZA

Electroforeză in gel de agaroză

Electroforeză in acetat de celuloză
Electroforeză in gel de poliacrilamidă Concentrare izoelectrică
Electroforeză bidimensională
Electroforeza capilara

Electroforeza zonala (ZE)

ZE utilizeaza un mediu stabilizant (hartie) care este impregnat cu o solutie de electrolit, ce prezinta o anumita
conductibilitate specifica (un mediu - gel- fixat pe un suport poros). Ca medii se pot utiliza agaroza, acetat de celuloza si
poliacrilamidă.
Concentrarea (Focusing) izoelectrica (IEF)
- Concentrarea izoelectrica (IEF) permite moleculele de amfoteri, cum ar fi proteinele, care urmeaza sa fie separate prin
electroforeza in gradient de pH-ul generat intre catod si anod. Aceasta tehnica este frecvent folosita la caracterizarea
proteinelor pentru a determina punctul izoelectric al acestora.
Izotacoforeza (ITP)
- Isotacoforeza este o tehnica de concentrare (focusing) componentii probei sunt separati in zone distincte, cuprinse intre
doua solutii de electroliti, prima continind un ion conducator si cealalta un ion terminal. Ionul conducator are o mobilitate
mai mare, iar cel terminal mai mica. Substantele ce constituie amestecul sunt separate in functie de mobilitatile lor
efective. Izotacoforeza se aplica pentru analiza calitativa si cantitativa a unor, zaharuri, peptide.

Caracteristici
• Migraţia moleculelor incărcate
• Mediu de migrare depus pe un suport
-Medii poroase de gel de tip: agaroză, acetat de celuloza, poliacrilamidă
- Pot fi uscate şi reutilizate
• Acelaşi pH şi domeniu de rezistenţă electrica
• Separare bazată pe mobilitate electroforetică
• Separă coloizi macromoleculari de exemplu: proteine in ser, urină, LCR, eritrocite, acizi nucleici
 Electroforeza in gel de agaroza
-Cea mai comuna metoda de separare in laboratorul biomedical
-Separarea este bazata pe diferenta de mobilitate a moleculelor incarcate sub infuenta campului electric.
Se cunosc mai multe tipuri de electroforeza in gel de agaroza:
-tehnica standard,
-electroforeza in gel de SDS-agaroza (la care adaugarea SDS - sodium dodecil sulfat in compozitia suportului electroforetic
permite separarea fractiunilor pe baza masei moleculare)
•Avantaje:
-gradul mare de rezolutie, specificitate si sensibilitate
-rapiditatea, conferita de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca urmare a independentei totale a
celor doua module (de migrare si colorare)
-gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minima a factorului uman la metodele manual;
-diversificarea parametrilor investigati (proteine, lipoproteine, izoenzime, hemoglobine normale si patologice)
-aplicabilitatea in cazul mai multor lichide biologice (ser dar si urina, LCR si altele), precum si faptul ca pentru aceste
lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind astfel inlaturat un neajuns important.

Mobilitatea electroforetica este influenţata de următorii factori:

-concentraţia de agaroză,
-conformaţia moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau superrăsucit),
-prezenţa compusului fluorescent în gel,
-tamponul utilizat,
-ipul de agaroza şi
-voltajul aplicat

Electroforeză in acetat de celuloză (EAC)

Electroforeza in acetat de celuloză (EAC) se caracterizeaza prin faptul ca:
• Utilizeaza anhidridă acetică + celuloză => AC
• Are 80% spaţiu interstitial => se umple cu lichid atunci cand este scufundat in tampon
• Pot fi făcute transparente pentru densitometrie
• Avantaje:
- Viteza de separare
- Posibilitatea de a stoca membrane transparente
• Dezavantaje:
- Presare inainte de utilizare
- Curăţare pentru efectuarea densitometriei

Electroforeză in gel de poliacrilamidă (PAGE)

Separarea se realizeaza in functie de greutatea moleculara a proteinelor si dimensiunea componentelor probelor
• Celula electroforetica in formă tubulară
ÞSe toarnă gel de separare cu pori mici
ÞSe adaugă gel cu pori mari in partea de sus
ÞSoluţie de monomer cu pori mari + proba deasupra celui de-al doilea gel
• Principiul metodei de separarea prin electroforeza
ÞToţi ionii proteinelor migreaza prin gelurile cu pori mari
ÞSe concentrează in gelul de separare
ÞSe separă dupa denaturarea unor proteine
• Dimensiunea medie a porilor in 7,7% din gelul de separarea PAGE este de aproximativ 5 nm
ÞPermite proteinelor serice să migreze
 Impiedică migrarea proteinelor mari de exemplu: fibrinogen, b1-lipoproteine, a2-macroglobuline
 Concentrarea izoelectrică (isoelectrofocusing)
Caracteristici:
• Se utilizeaza pentru a separa amfoteri (de exemplu: proteine)
• Proteinele se deplaseaza in zona in care: pH-ul mediu = pI => sarcina = 0
• pI este limitat intr-un domeniul de pH ingust =>zone ascuţite pentru proteine
Metoda de lucru :
- Folosirea gelurilor orizontale pe sticlă / folii de plastic
- Să introduc amfoliţii in gel => se crează gradientul de pH

- Se aplică o diferenţă de potenţial in gel

- Anod => zona cu pH-ului cel mai mic
- Catod => zona cu pH-ului cel mai mare
- Proteinele migrează pană cand se ajunge la pH = pI
Se spală cu soluţie de fixare pentru eliminarea amfoliţilor
- Colorare, decolorare, vizualizare

Separarea proteinelor plasmatice

Permite separarea proteinelor serice in 5 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la pH 9.2 sau in 6 fractiuni
(albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la pH 8.5.
Utilizarea amidoschwarz-ului drept colorant confera rezolutie, specificitate si sensibilitate metodei, putand fi detectate,
chiar si benzi monoclonale slab reprezentate.
Metode:
–Electroforeza in: amidon gel, agar gel, acetat celuloza, PAGE, EC
-Se optin: Spoturile de proteine
-Se vizualizeaza / localizeaza fracţiunile separate de proteine
Coloranţi: intensitatea colorarii depinde de:
-Tipul proteinei
-Gradul de denaturare a proteinelor prin agenţii de fixare

Interpretarea principalelor modificari pe electroforeza proteinelor serice

Modificari la nivelul albuminelor
• bisalbuminemii tranzitorii sau permanente
• analbuminemie congenitala
• hipoalbuminemia apare in:
-insuficienta aportului albuminelor in alimentatie (malnutritie cronica severa)
-diminuarea sintezei: insuficienta hepatica (ciroze, hepatite) si inflamatii
-pierderea lor accentuata pe cale urinara (sindrom nefrotic), digestiva (gastroenteropatie exudativa) sau cutanata(arsuri)
-hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse (tireotoxicoza, sindrom Cushing)
• hiperalbuminemia fara semnificatie patologica importanta apare frecvent la pacientii cu hemoconcentratie locala
sau sistemica sau in urma perfuziilor cu albumina

Beta globulinele cresc in: anemia feripriva, dislipidemii, boala Cushing, gamapatii monoclonale(Ig A, Ig G, lanturi usoare
Kappa sau Lambda), hepatite toxice, ciroze, inclusiv alcoolice, sindrom nefrotic
Scaderi ale beta globulinelor pot apare in:
• insuficienta hepatica, malnutritie, pierderi proteice corelate cu diminuarea valorii transferinei in mobilitatea
electroforetica in zona beta-1
• scaderea fractiunii C3 a complementului, asociata cu o scadere a fractiunii beta-2

Alfa-1 globulinele si Alfa-2 globulinele

Cresc in: sindrom nefrotic, diabet zaharat, miocardoscleroza, endocardite bacteriene, arsuri, boli infectioase, rheumatism,
reactii inflamatorii
In reactii de faza acuta se intesifica atat banda alfa-1 cat si alfa-2.
Cresterea exclusiva a componentelor alfa-1 poate fi observata in: hepatita cronica, reactii de faza acuta insotite de
hemoliza, terapie cu estrogeni, sarcina
Cresterea predominanta a componentelor alfa-2 se intalneste in:
poliartrita reumatoida, boli cu complexe imune circulante
Scaderea alfa-1 globulinelor apare:
• in urma unei insuficiente hepatocelulare, malnutritiei sau pierderii de proteine
• in cazul deficitului congenital de alfa-1 antitripsina

Gama globulinele cresc in: infectii bacteriene, parazitoze, colagenoze, poliartrita reumatoida, obstructie biliara
• hepatita acuta sau cronica
• ciroza hepatica
• leucemii
• mielom multiplu
• boli inflamatorii
Estomparea sau absenta benzii gama sugereaza un deficit imun (agamaglobulinemie

Electroforeza are loc in tuburi capilare ce contin un electrolit

• Fiecare tub capilar are un diametru interior de circa 25-75 μm
• Cand se aplica o tensiune electrica solutiei, moleculele migreaza catre electrodul de sarcina opusa
• In functie de sarcina acestora, moleculele pot migra cu viteze diferite
– In final are loc separarea componentilor

Electroforeza capilara permite separarea moleculelor incarcate electric functie de mobilitatea proprie intr-un tampon cu
un pH dat si functie de fluxul electro-osmotic.
Electro-osmoza: miscarea relativa a masei de lichid catre electrozi datorita campului electric creat.
Fluxul electro-osmotic (EOF): se produce din cauza sarcinilor de pe capilar la un pH peste 3 sub actiunea campului
electric.

Aplicatii
Aplicatii (in cadrul bioanalizei) sunt largi:
§Exemplu: EC este puternic aplicata in cadrul industriei farmaceutice, ca o alternativa la LC in diferite situatii.
§Exemplu: detectarea contaminarii rapide bacteriene / microbiene folosind EC:
-un tampon cationic radioactiv diluat este folosit pentru a marca microorganisme din proba si un "agent de blocare" –
dopul care anuleaza mobilitatea celulelor si induce agregarea.
-metoda detecteaza celule bacteriene intregi.
Electroforegramele arata detectarea unei singure varietati de bacterii, cu un bun raport S / Z.