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UNIVERSIDAD DE LA SABANA

FACULTAD DE INGENIERÍA
LABORATORIO QUÍMICA DE LOS SISTEMAS BIOLÓGICOS

INFORME DE LABORATORIO
CARBOHIDRATOS: ACTIVIDAD AMILASA SOBRE ALMIDÓN

ANA MARÍA BORDA GUTIERREZ


Docente. Ingeniería de Producción Agroindustrial

YESICA VANESA ROJAS MUÑOZ


Cód. 201513976

10 de octubre de 2016
OBJETIVOS respectivamente) y como precursores de la
producción de otras biomoléculas (p. ej., los
General: aminoácidos, los lípidos, las purinas y las
pirimidinas). Los carbohidratos se clasifican en
- Determinar monosacáridos, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y
disacáridos y polisacáridos presentes polisacáridos, según el número de unidades de
en diferentes muestras mediante azúcares sencillos que contengan. Los
pruebas químicas. carbohidratos también son partes integrales
de otras biomoléculas. Determinados
Específicos: carbohidratos (los azúcares ribosa y
- Identificar azúcares por prueba de desoxirribosa) son elementos estructurales de
Molish. los nucleótidos y de los ácidos nucleicos
- Utilizar pruebas que permitan (Frankilin, 2011).
diferenciar monosacáridos y
disacáridos tales como Benedict, Los monosacáridos o azúcares sencillos son
Barfoed, Fehling. aldehídos o cetonas polihidroxilados. Los
- Identificar polisacáridos (almidón) con monosacáridos con un grupo funcional
prueba de lugol. aldehído se denominan aldosas, mientras que
- Comprender la relación entre grados los que tienen un grupo ceto se denominan
brix y el índice de refracción cetosas. Las aldosas y las cetosas más sencillas
- Verificar la actividad de la amilasa son, respectivamente, el gliceraldehído y la
sobre el almidón a través de la dihidroxiacetona. Los azucares se clasifican
cuantificación de su producto de también según el número de átomos de
hidrólisis carbono que contienen. Por ejemplo, los
azúcares más pequeños, denominados triosas,
contienen tres átomos de carbono. Los
INTRODUCCIÓN azúcares de cuatro, cinco y seis átomos de
carbono se llaman tetrosas, pentosas y
hexosas, en tal orden. Los monosacáridos más
Los carbohidratos, las biomoléculas más
abundantes en las células son las pentosas y
abundantes de la naturaleza, son un vínculo
las hexosas.
directo entre la energía solar y la energía de
los enlaces químicos de los seres vivos. (Más
Entre los monosacáridos más importantes de
de la mitad de todo el carbono "orgánico" se
los seres vivos se encuentran la glucosa, la
encuentra en los carbohidratos.) Se forman
fructosa y la galactosa.
durante la fotosíntesis, un proceso bioquímico
en el que se captura la energía luminosa y se Fructosa: La D-fructosa, originalmente
utiliza para impulsar la biosíntesis de denominada levulosa, suele llamarse azúcar
moléculas orgánicas con energía abundante a de la fruta por su contenido elevado en los
partir de las moléculas con poca energía: CO2 frutos. Se encuentra también en algunos
y H20. La mayoría de los carbohidratos vegetales y en la miel. Esta molécula es un
contienen carbono, hidrógeno y oxígeno en miembro importante de la familia de azúcares
una proporción (CH20)n, de aquí su nombre. cetosas. Por gramo, la fructosa es dos veces
Se han adaptado a una amplia diversidad de más dulce que la sacarosa. Por lo tanto, puede
funciones biológicas, como fuentes de energía utilizarse en cantidades menores. Por esta
(p. ej., la glucosa), como elementos razón, la fructosa se utiliza a menudo como
estructurales (p. ej., la celulosa y la quitina en agente edulcorante en los productos
los vegetales y en los insectos, alimenticios procesados.
Los disacáridos son moléculas formadas por almidón están densamente empaquetados
dos monosacáridos unidos mediante un por medio de enlaces de hidrógeno intra e
enlace glucosídico. Cuando un monosacárido inter moleculares, formando un estado
está unido a través de su átomo de carbono policristalino que los hace insolubles en agua
anomérico al grupo hidroxilo del carbono 4 de fría y frecuentemente resistentes a
otro monosacárido, el enlace glucosídico se tratamientos químicos y enzimáticos. La
denomina 1,4. Debido a que el grupo hidroxilo cristalinidad es el resultado de la formación de
anomérico potencialmente puede estar en la hélices dobles entre las cadenas exteriores de
configuración α o en la β, pueden formarse amilopectina y las cadenas de amilosa (Martín,
dos disacáridos posibles cuando se unen dos 2009).
moléculas de azúcar: α (1,4) o β (1,4).
Para un almidón determinado, la velocidad de
La sacarosa (el azúcar común de mesa: azúcar hidrólisis es dependiente del tipo de enzima,
de caña [Saccharum officinarum] o azúcar de de las condiciones de hidrólisis y de las
remolacha [Beta vulgaris]) se produce en las modificaciones físicas y químicas previas a la
hojas y en los tallos de las plantas. Es una hidrólisis. El calentamiento del almidón en
fuente de energía que se transporta por toda suspensión acuosa mejora tanto la hidrólisis
la planta. La sacarosa, que contiene un residuo ácida como la susceptibilidad a la acción de las
de glucosa α y otro de fructosa β, los enzimas amilolíticas, ya que cambia la
monosacáridos están unidos por un enlace estructura granular (Martín, 2009).
glucosídico entre ambos carbonos
anoméricos. El presente informe expondrá los resultados
obtenidos, luego de aplicar distintas pruebas a
Los polisacáridos, también llamados glucanos, muestras de alimentos, con el fin de reconocer
están formados por grandes cantidades de el tipo de carbohidratos que estos poseen.
monosacáridos conectados por enlaces Además de estudiar en detalle la actividad de
glucosídicos. Los glucanos más pequeños, la amilasa sobre un carbohidrato específico:
llamados oligosacáridos, son polímeros que almidón.
contienen hasta unos 10 o 15 monómeros y
que con mayor frecuencia se encuentran PROCEDIMIENTO
unidos a polipéptidos en ciertas
glucoproteínas. Durante la experiencia de laboratorio se
realizaron específicamente dos prácticas,
Los polisacáridos pueden dividirse en dos
descritas a continuación.
clases: homoglucanos, formados por un solo
tipo de monosacárido, y heteroglucanos, que En cuanto a la primera, se basa en el
contienen dos o más tipos de monosacáridos. reconocimiento general de carbohidratos,
Los homoglucanos que abundan en la identificando el tipo de estos, presentes en
naturaleza son el almidón, el glucógeno, la diferentes muestras, tales como, jugo de
celulosa y la quitina. Cuando se hidrolizan el manzana light, jugo de durazno, syrup y azúcar
almidón, el glucógeno y la celulosa, todos light.
producen D-glucosa

Los gránulos de almidón están formados por 1. Reconocimiento general


dos polímeros de glucosa: amilosa, que es Prueba Molish
lineal, y amilopectina, que es ramificada. Estos
polímeros forman una estructura en capas
alternadas de regiones amorfas y cristalinas de
baja y alta densidad. Los polisacáridos del
- Agregar gotas de agua más cristales - Adicionar 1 ml de solución de azúcar a
de azúcar a analizar con dos gotas de evaluar
Naftol 15% y mezclar con cuidado. - Colocar a baño de maría a 92°C por
- Añadir por las paredes lentamente 2
5min
gotas de ácido sulfúrico.
- Observar capas formadas y coloración - Un precipitado rojo es positivo para
- La coloración violeta rojiza en la zona azucares reductores.
de contacto con el ácido sulfúrico con
la solución, es indicador de Grados brix e índice de refracción
carbohidratos.
- Utilizar refractómetro para
Prueba Benedict determinar grados brix e índice de
refracción de las diferentes muestras
- Colocar en 4 tubos de ensayo 5 ml de evaluadas.
reactivo de Benedict.
- Calentar hasta ebullición.
- Añadir 8 gotas de solución a evaluar 2. Actividad amilasa sobre almidón
en cada tubo.
- Dejar hervir por 3 minutos Mientras que la segunda, busca evidenciar la
acción de la amilasa sobre el almidón.
Turbidez verde indica 0.1 -0.3% de azúcar
reductor. Precipitado rojo-naranja indica Preparar una serie de 7 tubos de ensayo
concentración de azúcar superior al 1.5% debidamente etiquetados de acuerdo a la
siguiente Tabla No. 1, utilizando 5 diluciones
Prueba Barfoed diferentes de enzima amilasa:

- Colocar 5 ml de reactivo de Barfoed Tabla No. 1 Reactivos diluciones amilasa


en cada tubo
- Adicione 1 ml de los carbohidratos a
prueba y caliente a baño maría
hirviendo durante 2 minutos
- Sacar los tubos, dejar reposar y
anotar sus observaciones.
- Prueba positiva monosacáridos,
precipitado color rojo ladrillo antes de
7 min. Prueba positiva disacáridos,
precipitado color rojo ladrillo después
de 7 min.

En la Tabla 1 se muestran los reactivos y la cantidad de


estos, necesarios para realizar distintas diluciones de la
Prueba Fehling
enzima.

- Agregar 2,5 ml de sulfato cúprico en 4 Antes de agregar la enzima y a intervalos de 1


tubos de ensayo minuto después de adicionada, haga la prueba
- Adicionar 2,5 ml de solución alcalina de gota del contenido de cada tubo con
de tártaro solución diluida de yodo (lugol).
Transcurridos 10 minutos, haga las El jugo de durazno, manzana y syrup dieron
determinaciones cada dos minutos hasta que positivo para la prueba Molish, ya que se
la prueba sea negativa. Hacer las lecturas evidenció la coloración característica en la
comparando con el tubo testigo. zona de contacto con el ácido sulfúrico y la
Anotar el tiempo inicial y final de la digestión solución.
en cada tubo.

RESULTADOS - Prueba Benedict

Reconocimiento general de carbohidratos Fig. No 3 Prueba Benedict: Muestras 1-4

A través de distintas pruebas químicas se


observó la presencia de carbohidratos y el tipo
de estos en alimentos:

- Prueba Molish
La reacción fue exotérmica debido a que
libero calor después de reaccionar.
Imagen luego de aplicar la prueba Benedict a
todas las muestras

Fig. No 1 Prueba Molish: Muestra 1


El jugo de manzana light (muestra 3) mostró
turbidez verde indicando la presencia en un
rango de 0.1 -0.3% de azúcar reductor.
Mientras el jugo de durazno y el syrup
(muestras 2 y 4) revelaron un precipitado rojo-
naranja indicando concentración de azúcar
superior al 1.5%. Por el contrario el azúcar dio
negativo, exhibiendo una coloración azul.

Imagen luego de aplicar la prueba de Molish a la


primera muestra: azúcar de mesa. - Prueba Barfoed
Fig. No 4 Prueba Barfoed: Muestras 2 y 4
El azúcar de mesa mostró una coloración
violeta rojiza, dando positivo para la prueba
Molish.

Fig. No 2 Prueba Molish: Muestras 2-4

2 4
La Fig. No 4 evidencia las muestras de jugo de durazno y
3
syrup luego de aplicada la prueba Barfoed antes de los 7
minutos

Las muestras 2 y 4 presentaron precipitado


rojo antes de los 7 minutos, dando positivo
para monosacáridos en la prueba Barfoed.
La Fig. No 2 corresponde a las muestras 2: Jugo de
durazno, 3: Jugo de manzana y 4: Syrup, luego de
aplicar la prueba de Molish.
Fig. No 5 Prueba Barfoed: Muestras 3
En la Tabla 2 se exponen los resultados obtenidos de
evaluar los grados brix y el índice se refracción de cada
muestra

El jugo de durazno y el syrup debieron ser


diluidos en una relación 1:1 y 1:2
En la Fig. 5 evidencia la muestra 3, jugo de manzana, respectivamente, debido a que son muestras
luego de aplicada la prueba Barfoed antes de los 7 espesas, y el equipo no puede leerlas
minutos correctamente.
La muestras 3 presentó precipitado rojo antes
Actividad amilasa sobre almidón
ni s de los 7 minutos, dando positivo para
monosacáridos, mientras la muestra 1
A continuación se presenta la Tabla No. 3 la cual
(azúcar) no presento precipitado antes de los
expone los tiempos representativos
7minutos.
encontrados en la práctica experimental

- Prueba Fehling
Tabla No. 3 Resultados Actividad amilasa
Fig. No 6 Prueba Fehling sobre almidón

Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Lectura (color)
0min ++ ++ ++ +++ - - -
2 min ++ ++ ++ +++ - - -
10 min ± + + ++ - - -
La Fig. No 6 enseña todas las muestras luego de
20 min - ± ± + - - -
aplicada la prueba Fehling 35 min - ± ± + - - -
Las muestas 2-4 muestran un precipitado rojo, 60 min - - ± + - - -
lo que indica que el jugo de manzana light, el
juego de durazno y el syrup arrojaron positivo
110 min - - ± + - - -
para azucares reductores, en la prueba
Varios signos + representan un resultado
Fehling. tremendamente positivo, , de manera análoga para un
resultado eminentemente negativo el simbolo – aparece
resaltado.
- Grados brix e índice de refracción
La lectura de color de los tubos 1-4 luego de
Tabla No. 2 Grados brix e índice de refracción según preparar las soluciones e incubarlas, presenta
muestras evaluadas gradualmente un cambio, en la Tabla 3 se
Azúcar Jugo Jugo Manzana exhiben los tiempos en los que ese cambio
Muestra tuvo mayor visibilidad.
light Durazno light Syrup
Grados Brix 32,5 5,5 4,6 27,5 El tubo 1 cambia considerablemente a los 35
Índice de minutos, por lo que pasa de ser positivo a
Refracción 1,385 1,341 1,337 1,377 negativo, mientras que el tubo 2 lo hizo a los
110 minutos.
Fig. No 7 Actividad amilasa sobre almidón Minuto: 0 y 2 Fig. No12 Actividad amilasa sobre almidón Minuto: 110

1 6 4
1 2 3

Las Figs. 7-12 muestran el cambio de la lectura


Fig. No 8 Actividad amilasa sobre almidón Minuto: 10
de color a través del tiempo. Especificando el
minuto en el cual se dan las evidentes
2 4
1 3 transformaciones según cada tubo.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Reconocimiento general de carbohidratos


Tabla No. 4 Clasificación de Carbohidratos
Fig. No 9 Actividad amilasa sobre almidón Minuto: 20
CLASIFICACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS
1 3 5
2 4
Glucosa, fructosa,
Monosacáridos
galactosa

Disacáridos Sacarosa, lactosa, maltosa

Isomaltosa, sorbitol,
Polioles
maltitol
Fig. No 10 Actividad amilasa sobre almidón Minuto: 35 Maltodextrina, fructo-
Oligosacáridos
oligosacáridos
1 2 3 4 5 Almidón: Amilosa,
Polisacáridos
amilopectina

Sin almidón: Celulosa,


Polisacáridos
pectinas, hidrocoloides

La Tabla 4 clasifica carbohidratos según la


cantidad de unidades de sacáridos, de acuerdo
Fig. No 11 Actividad amilasa sobre almidón Minuto: 60 a lo expuesto anteriormente, el azúcar
contiene sacarosa, el jugo de manzana,
1 2 3 4
durazno y syrup (miel) fructosa.
4

Prueba de Molisch: Esta prueba se utiliza para


el reconocimiento general de carbohidratos.
Al haberse depositado en el fondo del formar complejos coloreados poco ionizados
recipiente el ácido sulfúrico este actúa sobre con algunos metales pesados. Con el cobre
la glucosa arrancándole una molécula de agua produce un complejo de color azul. Si se le
y volviendo la molécula de glucosa un derivado agrega al reactivo una solución de azúcar
del furfural en este caso el reductos y se calienta hasta ebullición, el
hidroximetilenfurfural. azúcar en solución alcalina a elevadas
temperaturas se convertirá en D-gluconato y
Fig. No 13 Reacción prueba Molish paso 1
su ene-diol, rompiéndose luego en dos
fragmentos altamente reductores, los cuales
con sus electrones expuestos, reaccionarán
con el Cu++. Se obtiene un azúcar oxidado y dos
iones Cu+ (1)

Luego de esa reacción se mezcla con el alfa- Algunos azúcares tienen la propiedad de
naftol en presencia de ácido sulfúrico oxidarse en presencia de agentes oxidantes
atacando la zona del doble enlace del grupo suaves como el ion Fe+3 o Cu+2. Esta
carbonilo uniéndose en un compuesto mixto característica radica en la presencia de un
pues presenta sustituyentes ácidos y fenólicos grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y
que toma una coloración rojiza violeta en un genera un grupo carboxilo. Por lo tanto,
anillo del tubo de ensayo (Fernández, 2004). aquellos azucares con un grupo carbonilo libre
son llamados azúcares reductores, entre ellos
Fig. No 13 Reacción prueba Molish paso 2 se encuentran: glucosa, fructosa, lactosa,
maltosa, ribosa. Aquellos en los que el grupo
carbonilo se encuentra combinado en unión
glicosídica se conocen como azúcares no
reductores. El azúcar no reductor más
conocido es el disacárido sacarosa.
Las 4 muestras evaluadas dieron positivo para
la prueba Molish, lo que demuestra la De acuerdo a lo obtenido, el azúcar dio
presencia de carbohidratos en el azúcar, jugo negativo para esta prueba, lo que quiere decir
de manzana light, juego de durazno y syrup. que es un azúcar no reductor, mientras que el
Según literatura el azúcar contiene sacarosa, jugo de manzana light, jugo de durazno y syrup
mientras los tres últimos poseen en mayor arrojaron positivo, lo que los clasifica como
proporción fructosa. agentes reductores.

Ensayo de Barfoed: Esta prueba permite


Prueba de Benedict: Permite el
diferenciar entre monosacáridos y
reconocimiento de carbohidratos reductores,
disacáridos, también contiene ion cúprico que
al igual que el reactivo de Felhing, el de
se reduce hasta óxido cuproso más
Benedict contiene ion cúprico en medio
rápidamente con los monosacáridos que con
alcalino que se reduce hasta óxido cuproso en
los disacáridos.
presencia de azúcares con el hidroxilo
hemiacetálico libre. Cabe resaltar que el reactivo de Barfoed se
prepara disolviendo 13.3 gramos de acetato
El reactivo de Benedict contiene soluciones de
de cobre neutro cristalizado en 200 ml de agua
carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato
destilada si es necesario se filtra y luego se
de sodio. El citrato de sodio mantiene al ion
agrega 5 ml de agua destilada si es necesario
Cu+2 en solución ya que tiene la propiedad de
luego se agrega 5 mililitros de ácido acético.
determinado índice de refracción (el índice de
refracción de un medio es el cociente entre la
velocidad de la luz en el vacío (3.108 m/s) y la
velocidad de la luz en ese medio, no tiene
Como vemos la reacción procede siempre y unidades y siempre es mayor o igual que 1)
cuando se adicione calor proveniente del baño
maría en este caso se forma el gluconato de Tabla No. 5 °Brix e Índice de Refracción
cobre o gluconato cúprico que es una sal
orgánica, depositándose en el fondo del
recipiente el oxido cuproso de color rojizo y la
solución sobrante es el agua (Morales, 2005).

En cuanto a la prueba Barfoed, las muestras 2,


3 y 4; jugo de manzana, durazno y syrup
respectivamente dieron positivo para
monosacáridos, debido a contienen fructosa. Información tomada de: 1990. Manuales para educación
agropecuaria. Control de calidad de productos
agropecuarios. Editorial Trillas. Segunda edición. México,
D.F.
Prueba de Fehling: Se caracteriza
fundamentalmente por su utilización como Según la Tabla No. 5 y de acuerdo a los
reactivo para la determinación de azúcares resultados presentados en la Tabla 2 la
reductores. Su acción se centra en el poder muestra 1 (azucar light) tendria un rango de
reductor del grupo carbonilo de los aldehídos, 427 a 532 g de azucar por litro de agua, las
el cual se oxida a ácido y se reduce a sal de
muestra 2 y 3 (jugo de manzana y durazno)
cobre en medio alcalino a oxido de cobre,
arrojaron datos menores a los que la literatura
formando un precipitado color rojo, este color
demuestra que la muestra contiene como comprende, por lo que ambos tendrian menos
carbohidrato un monosacárido. de 111g de azucar por litro de agua, por
ultimo, la muestra 4 (Syrup) posee entre 332 y
Reacción: 427g de azucar por litro de agua.
Cupritartatro de sodio + CH2OH(CHOH)nCHO + H2O →
CH2OH(CHOH)nCOONa + 4COONa(CHOH)nCOONa + Según la tabla nutricional:
Cu2O + 3NaOH
- El jugo de durazno hay 26g de
Al igual que la prueba Benedict, la prueba azucares por cada 1000ml del jugo.
Fehling dio como resultado positivo para las
- Syrup 11g por cada 350ml.
muestra 2-4, lo que quiere decir que son
- Azucar light: carbohidratos totales 5g
azucares reductores, pues contienen fructosa.
por cada 450g.
- Jugo de manzana 5g de carbohidratos
totales por cada 1 Litro
Grados Brix e Índice de Refracción

La concentración en sólidos solubles de los


mostos se expresa en grados Brix. Actividad amilasa sobre almidón
Originariamente, los grados Brix son una
medida de densidad.
Las amilasas, enzimas glucolíticas, hidrolizan
Un grado Brix es la densidad que tiene (a los enlaces éter (glucosídicos) de las cadenas
20°C) una solución de sacarosa al 1 %, y a esta de los polisacáridos de las sustancias
concentración corresponde también a un
amiláceas, degradándolas a oligosacáridos, presente en mayor cantidad, será capaz de
disacáridos y monosacáridos, que son más reducir más rápido el almidón en moléculas de
solubles en medios acuosos. Es decir, la acción glucosa.
específica de estas enzimas es degradar
Unidades de Amilasa en cada tubo
moléculas catalizando la hidrólisis de uniones
de éteres (-C-O-C-), esteres (-CO-O-) y
aminoácidos (-CO-NH-). De esta manera es
posible eliminar el almidón de forma más CONCLUSIONES
sencilla(Cremosi,2002).
Se identificó la presencia de carbohidratos en
diferentes muestras de alimentos, tales como,
Fig. No 15 Hidrólisis del almidón con la amilasa azúcar de mesa, jugo de manzana light, jugo
de durazno y syrup (miel).

Mediante pruebas químicas se clasificaron los


carbohidratos de las muestras antes
mencionadas, en categorías como
monosacáridos, disacáridos, reductores, no
reductores. La fructosa, presente en mayor
proporción en los jugos y la miel, dio positivo
para monosacáridos y reductores, mientras
que la sacarosa, carbohidrato característico
Segal y Cooper aportaron la utilización de la α- del azúcar de mesa, arrojo positivo para no
amilasa para la retirada de pasta adhesiva de reductores, y negativo para monosacáridos.
almidón en manuscritos. La acción de la Resultados que tienen relación con la
enzima α-amilasa es romper las largas cadenas literatura expuesta.
de amilosa y amilopectina (polímeros de Se determinaron los los °Brix y el índice de
glucosa) del almidón en pequeñas moléculas refracción de todas las muestras (Tabla No. 2),
de dextrina. La degradación del almidón por a través de estos, es posible conocer los
vía enzimática es suficiente como para gramos de azúcar de la muestra en 1L de agua,
permitir retirarlo fácilmente. encontrando mayores cantidades en las
La saliva posee una variedad de amilasas que muestras, que las descritas en su tabla
actúa sobre el almidón y algodón, siendo ideal nutricional.
para romper las pequeñas manchas. La saliva La enzima amilasa cataliza la rotura de
no está concentrada (97,5 % es agua) y tiene macromoléculas, en este caso, el almidón fue
un pH de 6,8 (Smith, 1987). reducido a su estructura más simple: la
Esta prueba permite detectar el almidón, por glucosa.
lo que, a medida que la enzima actué Existe una estrecha relación entre la
degradando el almidón, la prueba en el tubo concentración de la enzima y la velocidad de
pasara de positivo a negativo. digestión del almidón, a mayor concentración,
En la práctica de laboratorio se observó un mayor velocidad de transformación.
mayor gasto de tiempo en la digestión de cada
tubo a mayor dilución de la enzima, lo que
resulta lógico, pues si la enzima (amilasa) está
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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CALLAO


FACULTAD DE INGENIERIA QUIMICA
RECONOCIMIENTO DE LOS MONOSACARIDOS,
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FRANCISCO MORALES ORCCOTTOMA LIMA
PERU AÑO 2005

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Disponible

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