Análisis de la función lineal

El análisis de la función lineal es un área familiar para todos los involucrados en los
experimentos de calibración, y tal vez esta familiaridad haya llevado a la introducción de
algunos defectos fatales cuando se evalúa la linealidad de una calibración. Hoy en día, estos
procedimientos erróneos se describen en presentaciones orales, informes de laboratorio y
documentos, y se aceptan como correctos.

La linealidad, en el contexto del sistema de análisis descrito anteriormente que consiste en los
elementos básicos entrada → convertidor → salida, es la suposición de que existe una relación
de línea recta entre las variables de entrada (x) y salida (y) que puede ser escrita
matemáticamente por la expresión y = f (x) si la línea recta cruza a través del origen o por la
expresión y = f (x) + 𝛿 si la línea recta no cruza a través del origen.

Es una práctica común verificar la linealidad de una curva de calibración mediante la

inspección del coeficiente de correlación r. Un coeficiente de correlación cercano a la unidad (r
= 1) se considera evidencia suficiente para concluir que el experimentador tiene una
calibración lineal perfecta. Aunque el Comité de Métodos Analíticos y algunos artículos sobre
la validación analítica desalentaron el uso del coeficiente de correlación en el contexto de las
pruebas de linealidad, muchos laboratorios alrededor del mundo basan la linealidad de sus
métodos instrumentales en un llamado (por el autor del presente artículo) "R-test".
Innumerables artículos publicados refuerzan la idea, quizás de manera indirecta, de utilizar la
prueba r para verificar la linealidad al informar en sus resúmenes, discusiones y conclusiones,
como

"Este método tiene un rango de calibración lineal de 1.00–1000 ng / ml con un coeficiente de

correlación de 0.9999".

"Los gráficos de calibración fueron lineales con coeficientes de correlación superiores a 0.999
para todos los compuestos".

"Estaba claro que la calibración era lineal como resultado de un coeficiente de correlación
cercano a 1 (rexperimental = 0.9996)".

El autor del presente artículo no afirma que las citas anteriores sean incorrectas, sin embargo,
debe decirse que, en cierto sentido, son engañosas en el contexto de la evaluación de la
linealidad. Además, no indican qué métodos estadísticos se utilizaron para evaluar su relación
lineal.

La guía de la FDA para la validación de procedimientos analíticos, que se basa en el Texto de

validación de procedimientos analíticos emitido por el ICH, recomienda que el coeficiente de
correlación se presente al evaluar una relación lineal y que la linealidad se evalúe mediante
métodos estadísticos apropiados. Esta guía no sugiere que el valor numérico de r pueda
interpretarse en términos de grados de desviación de la linealidad. Por lo tanto, es
extremadamente importante enfatizar que no existe una "prueba r" para verificar la linealidad.
No podemos decir que r = 0.999 es más lineal que r = 0.997. Es sorprendente que, a pesar de
las recomendaciones de los organismos acreditados, pocos artículos publicados informen el
uso de métodos estadísticos para la evaluación de la linealidad. Esta observación parece
indicar que el problema, señalado hace más de medio siglo, sobre el análisis de datos
estadísticos como un tema descuidado por los practicantes que validan los métodos sigue
siendo un tema de relevancia contemporánea que requiere una atención imperativa por parte
de quienes actualmente participan en la validación de métodos analíticos. y por los
responsables de educar y capacitar a las personas para que se embarquen en los diversos
aspectos de esta importante área de la química analítica.

Función de calibración lineal

La expresión y = f (x) + 𝛿 se puede reescribir como

……………….(1)

donde yˆi y xi representan la respuesta experimental estimada y la concentración analítica

respectivamente, ambas a un nivel de concentración i. Los coeficientes φ y 𝛿 representan la
sensibilidad del análisis y la intercepción, respectivamente.

La función de calibración descrita por la ecuación (1) debe tener una r cercana a 1, pero la
condición dada por "si es lineal, entonces r = 1" no es equivalente a "si r = 1, entonces lineal".
En términos de análisis lógico, la mejor estrategia para demostrar que una condición no es
equivalente a su inverso es proporcionarle un contraejemplo. Para encontrar un
contraejemplo para "si es lineal, entonces r = 1" es suficiente para mostrar que hay algo que
tiene r = 1 pero no es lineal. El Apéndice A proporciona un contraejemplo completo basado en
el análisis estadístico de los diversos cuadrados de suma de errores y componentes de varianza
de un conjunto de datos de calibración lineal reportado en la literatura. Antes de estudiar el
Apéndice A, algunos aspectos importantes como la replicación, los cuadrados de suma de
errores y los grados de libertad deben discutirse con anticipación.

Replicación. La replicación es un aspecto importante que debe considerarse cuando el

experimentador desea probar si un modelo de calibración experimental en particular, por
ejemplo, la ecuación. (1), es lineal. El experimentador debe tener un número razonable de
soluciones estándar y réplicas instrumentales. Se ha señalado que las mejores estrategias de
calibración son aquellas con réplicas de solución estándar superiores a las réplicas
instrumentales. Un error de preparación 26 veces mayor que el error instrumental ha sido
reportado en experimentos de calibración de triacilgliceroles por LCMS. Esto implica que los
problemas más graves están relacionados con la preparación y no con la estabilidad
instrumental. Los experimentos de calibración con un solo estándar por nivel de concentración
son una estrategia de calibración deficiente y deben evitarse a menos que las soluciones
estándar estén efectivamente libres de errores. Para el establecimiento de la linealidad, el
Comité de Métodos Analíticos sugiere preparar un mínimo de seis niveles de concentración en
duplicados. A pesar de que la duplicación en cada nivel de concentración se considera una
estrategia de diseño óptima por parte de esta organización acreditada, es un enfoque
deficiente que no debe seguirse. Un estudio del comportamiento de la incertidumbre en
función del número de réplicas para el modelo descrito por la ec. (1) demostró que realizar
entre cuatro y seis repeticiones en cada nivel experimental disminuye significativamente la
incertidumbre a lo largo del rango experimental y produce una región de predicción de
confianza uniforme alrededor del centro del gráfico de calibración, que es una característica
importante para los experimentos de cuantificación. Basándose en el comportamiento
informado de la incertidumbre en función de la replicación y teniendo en cuenta que el
número mínimo de niveles de concentración propuestos por varias directrices y artículos sobre
validación analítica varía entre cinco y seis, es razonable medir la linealidad de una función de
calibración mediante Preparando un mínimo de cinco niveles de concentración por triplicado.
Error suma cuadrados. Después de seleccionar un número razonable de niveles de
concentración (I) y replicar cada nivel de concentración J veces en un experimento de
calibración particular, la suma de tres diferencias al cuadrado, es decir, la suma de error
residual de cuadrados (SSr), la suma de cuadrados de error experimental pura (SSε) ) y la suma
de cuadrados de error de falta de ajuste (SSlof), se debe calcular de acuerdo con las siguientes
ecuaciones:

El término yij representa la respuesta experimental, Yˆi es la respuesta estimada obtenida

mediante el uso de la ecuación. (1), y Y¯i es la respuesta promedio en cada nivel de
concentración.

Grados de libertad. Los grados de libertad (DF) asociados a las ecuaciones. (2) - (4) son
respectivamente:

El número 2 entre corchetes en las ecuaciones. (5) y (7) y asociados con las ecuaciones. (2) y
(4) respectivamente, representan el número de parámetros descritos por la ec. (1) (la
pendiente φ + la intercepción 𝛿 = 2 parámetros). Si un modelo con un número diferente de
parámetros a los descritos por la ec. (1) se estudiaron, por ejemplo:

Los grados de libertad asociados a las ecs. (2) y (4) serían (IJ - 3) y (I - 3) respectivamente. El
número 3 entre corchetes en este caso, representa los tres parámetros (φ + ϕ + 𝛿) de la
ecuación. (8). Usando la ec. (1) y los criterios mínimos de cinco niveles de concentración (I = 5)
por triplicado (J = 3) establecidos en la sección anterior, es posible estimar 13, 10 y 3 grados de
libertad para SSr, SSε y SSlof respectivamente.

Aceptabilidad de los datos de linealidad. Se realizó una búsqueda en ScienceDirect utilizando

las palabras clave "prueba de linealidad" y reveló que varios artículos utilizaron estas dos
palabras como una medida real de la linealidad en la validación del método de cromatografía.
Se ha informado repetidamente que un analista involucrado en cualquier validación analítica
debe ser consciente de que no existe una prueba de linealidad como tal. El Comité de métodos
analíticos sugiere utilizar la prueba F como un enfoque confiable para verificar la linealidad de
cualquier función de calibración. El procedimiento es el siguiente:
• La varianza puramente experimental y la varianza por falta de ajuste designadas por 𝜎2ε y
𝜎2lof se estiman calculando los cocientes SSε / (IJ-I) y SSlof / (I-2) respectivamente.

• Los términos de varianza calculados de 𝜎2ε y 𝜎2lof se utilizan para calcular la relación de
varianza de Fisher o la prueba F mediante la expresión:

• El valor de F (I – 2) / (IJ – I) calculado experimentalmente se compara con el valor crítico de F que

se encuentra en las tablas estadísticas, generalmente al nivel de confianza del 95% para los
grados de libertad I - 2 e IJ - J en El numerador y el denominador respectivamente. Si el
conjunto de datos experimentales describe una calibración lineal genuina de la forma dada por
la ecuación (1), se debe cumplir la condición Ftabulated> F (I – 2) / (IJ – I). De lo contrario, hay motivos
para sospechar que un modelo diferente al descrito por Eq. (1) debe ser propuesto.

La estimación de los diversos cuadrados de suma de errores y la relación de Fisher para probar
la aceptabilidad de un modelo lineal propuesto en la literatura se analiza en el Apéndice A.

Distancia

En general, el rango de un procedimiento analítico se puede definir como el intervalo entre la

concentración superior e inferior de analito para el cual se han demostrado precisión,
precisión y linealidad adecuadas. La literatura sobre validación de métodos describe diferentes
rangos. Por ejemplo, rango lineal, rango analítico, rango de calibración, rango dinámico, rango
de trabajo. Sin embargo, pueden resumirse como rango de trabajo (o analítico) y rango lineal
(o de calibración o dinámico). El primer rango, que es más amplio que el segundo, describe el
intervalo entre la concentración más baja (límite de detección) y la concentración más alta,
donde la señal puede relacionarse con la concentración para la evaluación de errores
aleatorios y sistemáticos. El rango lineal corresponde al intervalo válido de dependencia
funcional de la señal en la concentración o masa, que generalmente se determina mediante el
método de mínimos cuadrados, que a su vez asume la homoscedía de las mediciones en el
rango lineal.
Para demostrar un rango lineal aceptable, generalmente se sugiere preparar cinco soluciones
estándar diferentes de 50 a 150% de la concentración analítica objetivo. Sin embargo, es
importante recordar que los rangos especificados a menudo difieren dependiendo de la
aplicación prevista del procedimiento. Por ejemplo, el ICH recomienda preparar cinco
soluciones estándar diferentes (más un blanco) de 80 a 120% para el análisis de un
medicamento o un producto terminado. Un analista interesado en validar un método
particular debe consultar las pautas para abarcar el rango mínimo recomendado recomendado
del método previsto.

Límite de detección

El límite de detección (LOD) se define comúnmente como la cantidad más baja de analito en
una muestra que puede detectarse de manera confiable pero no necesariamente cuantificada
por un método analítico particular. Hace una década, la Organización Internacional de
Normalización propuso utilizar el término "concentración neta mínima detectable" definida
como la confianza con la cual es posible detectar una cantidad de analito en la muestra mayor
que la de una muestra en blanco con un poder estadístico de (1 - 𝛽).

Se utilizan diferentes criterios para evaluar el LOD. Un resumen de los principales enfoques
propuestos para determinar el LOD en la literatura sobre validación se presenta en el Esquema
1. La determinación visual del LOD se realiza preparando muestras con concentraciones
conocidas del analito y estableciendo el nivel en el que el analito puede ser confiable
detectado La Fig. 3 muestra el LOD de cromatografía para PGE2 determinado visualmente
diluyendo sucesivamente soluciones de PGE2 replicadas a una concentración inicial de 0.4 ng /
ml. Las soluciones replicadas se diluyen hasta un nivel de concentración donde el analito ya no
se detecta visualmente. De acuerdo con la Fig. 3, el LOD visual corresponde a una
concentración de 0.1 ng / ml de PGE2. Las pautas para la validación de procedimientos
analíticos recomiendan la presentación de cromatogramas relevantes al presentar un informe
de validación donde la determinación de LOD se basa en un criterio visual. Otro enfoque
utilizado para estimar el LOD es el cálculo de la relación señal / ruido bajo el supuesto de que
se cumplen la normalidad de los datos, la homoscedasticidad y la independencia de los
residuos. Una inspección de la literatura sobre validación de métodos reveló que este es el
enfoque más popular entre los analistas que realizan estudios de validación.

La relación señal a ruido se determina comparando las señales analíticas en concentraciones

bajas conocidas con las de la muestra en blanco hasta una concentración analítica que produce
una señal equivalente a tres o dos veces la desviación estándar de la muestra en blanco (3 ×
𝜎blank o 2 × 𝜎blank).