Sunteți pe pagina 1din 44

__________________________________________________________________________________________

BIOTEHNOLOGIA OBTINERII PREPARATELOR


ENZIMATICE. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

1. BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE – DEFINIŢIE. OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI

Biotehnologia este o ştiinţă complexă, ce se caracterizează prin utilizarea integrată


a biochimiei, microbiologiei, biologiei celulare şi a ingineriei genetice. (fig. 1).

Figura 1.
Biotehnologia este aplicată in diverse domenii, cum ar fi: agricultură, industria
alimentară, producţie industrială, mediu şi medicină.
Biotehnologia alimentară se referă la prelucrarea industrială a diferitelor
materii prime cu ajutorul microorganismelor şi enzimelor proprii sau a unor agenţi
biologici (microorganime, enzime) adăugaţi în scopul realizării unor produse sau a
ameliorării unor procese tehnologice.
Rolul biotehnologiei este covârşitor în industria alimentară. În fapt, industria
alimentară este o biotehnologie, deoarece materiile prime agroalimentare sunt
produse biologice şi prin urmare conservarea lor până la consum, în stare proaspătă
(cazul fructelor şi legumelor) sau până la industrializare (cazul tuturor produselor
agroalimentare) implică controlul activităţii enzimatice proprii ţesuturilor vegetale şi
animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare.
Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în
transformările pe care le oferă produsele agroalimentare: maturarea fructelor şi
legumelor, cerealelor şi făinurilor sau diferitelor produse alimentare pe bază de
cereale germinate, maturarea brânzeturilor, maturarea cărnii.
Enzimele pot avea însă şi rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea
caracteristicilor senzoriale şi a valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare până
la prelucrarea termică a acestora.
De asemenea, rolul microorganismelor este hotărâtor, unele dintre ele având
acţiune dăunătoare, altele având rol esenţial în obţinerea unor produse alimentare
datorită acţiunii lor fermentative: produse lactate acide, brânzeturi, bere, vin, spirt,
pâine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale şi leguminoase.
Microorganismele intervin şi în fermentarea unor produse vegetale: varza,
murături, măsline, castraveţi, cacao, etc.
Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat impresionant prin
folosirea enzimelor exogene (industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii,
sucurilor de fructe, zahărului, panificaţiei, etc.) şi a culturilor starter (industria berii,
laptelui, cărnii, panificaţiei, etc.) La toate acestea trebuie să avem în vedere
obţinerea de metaboliţi secundari (alcool etilic, acetonă, acizi organici, aminoacizi,
etc.) prin folosirea de microorganisme precum şi de biomasă alimentară şi furajeră,
etc.
Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele
biochimice, se pot perfecţiona procesele de producţie, se poate îmbunătăţi calitatea
produselor alimentare şi se poate mări gradul de diversificare a producţiei
alimentare.

2. PREPARATE ENZIMATICE
2.1. Aspecte generale
Enzimele sunt din punct de vedere structural proteine constituite din
aminoacizi, iar din punct de vedere funcţional acţionează ca nişte biocatalizatori
biologici care au rolul de a permite realizarea unor reacţii cu o viteză mărită.
Enzimele sunt utilizate drept catalizatori în condiţiile în care există şi
catalizatori chimici, deoarece prezintă următoarele avantaje:
1. Au capacitatea de a cataliza reacţiile chimice în condiţii blânde de
temperatură, pH, presiune. Aceasta permite un consum mai redus de energie şi nu
necesită echipamente scumpe rezistente la coroziune.
2. Enzimele sunt catalizatori specifici, deseori stereoselective, care nu conduc
la obţinerea de produşi de reacţie secundari nedoriţi. În aceste condiţii nu sunt
necesare cheltuieli mari privind rafinarea şi purificarea produsului ce urmează a fi
fabricat.
3. Comparativ cu procesele chimice, enzimele sunt din punctul de vedere al
mediului compuşi biodegradabili care nu necesită costuri semnificative de epurare.
4. Anumite enzime nu sunt limitate numai la acţiunea în mediul apos, putând
acţiona şi la interfaţa dintre două faze, apă: solvent organic sau apă:ulei etc.
Totuşi există şi o serie de dezavantaje:
- au stabilitate limitată;
- de cele mai multe ori sunt utilizate industrial o singură dată.

2.2.Clasificarea enzimelor.
Enzimele se clasifică conform sistemului stabilit de Comisia de Enzime a
Uniunii Internaţionale de Biochimie (1979). Conform acestei clasificări există 6 clase
principale grupate conform cu reacţiile pe care le catalizează astfel:
1. Oxidoreductaze care catalizează reacţii de oxidoreducere, transfer de atomi
de hidrogen, oxigen sau electroni;
2. Transferaze care catalizează transferul unei grupări de pe o moleculă pe alta;
3. Hidrolaze ce catalizează scindarea hidrolitică (implică apa) a legăturilor
chimice covalente;
4. Liaze, care catalizează scindarea legărutilor chimice altfel decât prin hidroliză
sau oxidare;
5. Izomeraze ce catalizează rearanjarea structurală a moleculelor;
6. Ligaze sau sintetaze care catalizează formarea de noi legături te tip C-N, C-
O, C-C, C-S, cu consumare de ATP.

2.3. Utilizări ale enzimelor în industrie:


Principalele domenii în care enzimele şi-au găsit utilizări sunt:
- Fabricarea unor produse prin transformarea enzimatică a amidonului;
- La fabricarea altor produse alimentare : produse lactate, bere, sucuri, vin, panificaţie;
- În compoziţia detergenţilor;
- Industria textilă, hârtiei şi a furajelor pentru animale;
- Sinteza catalitică a unor substanţe chimice;
- Analiza alimentelor, diagnoză chimică şi terapie;
- Inginerie genetică;
Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu de bază al
biotehnologiei, având drept scop studierea tehnicilor de obţinere a preparatelor
enzimatice folosind materii prime de origine animală, vegetală şi microbiană, sub
formă liberă sau imobilizată pentru a fi folosite ca agenţi biologici în industria
alimentară, industria furajelor, industria textilă, detergenţilor, farmaceutică,
cosmetică, chimică, etc. Prin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile
tradiţionale se transformă în biotehnologii, devenind mai eficiente şi mai puţin
poluante. În figura 2. este prezentată ponderea de utilizarea a preparatelor
enzimatice în diferite ramuri.

Figura 2. Ponderea utilizării preparatelor enzimatice


Aşa cum se observă din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are
utilizarea în industria alimentară, urmată de industria detergenţilor.
În figura 3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse
pe plan mondial. Cea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de
amilaze.

Figura 3. Principalele tipuri de preparate enzimatice.

2.4. Tipuri de preparate enzimatice.


Preparatele enzimatice se comercializează sub diverse forme şi grade de
purificare:
Preparate enzimatice solide:
1. Preparate enzimatice brute, sub formă de pulbere, obţinute prin uscarea şi
măcinarea mediului fermentat;
2. Preparate sub formă cristalizată, enzime pure utilizate preponderent în chimia
analitică şi ingineria genetică;
3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate în amestec cu substanţe
crioprotectoare, care sunt urcate în vacum la temperaturi de -20......-50C.

Preparate enzimatice lichide


1. Preparate enzimatice brute, formă sub care se livrează enzimele extracelulare
(eliberate de către microorganisme în mediul de cultură în timpul fermentaţiei).
2. Preparate parţial purificate, în care se adaugă conservanţi pentru a le mări
stabilitatea în timp.
2.5. Surse de enzime
Preparatele fabricate la scară industrială folosesc trei tipuri de surse: ţesuturi
animale şi vegetale sau microorganisme.
Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din industria cărnii (ficat,
pancreas, inimă, rinichi, creier, mucoasă stomacală şi intestinală). Utilizarea acestr
surse este pe scară din ce în ce mai redusă, fiind înlocuite de sursele microbiene,
deoarece sursele animate prezintă o serie de dezavantaje, cum ar fi: producţia
limitată, apariţia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiformă la bovine.
Principalele enzime de origine animală care se obţin sub formă de preparate sunt
chimozină (renina) care se extrage din stomacul de miel sau viţei care se utilizează
pentru coagularea laptelui la fabricarea brânzeturilor. O altă enzimă este -amilaza
pancreatică care are utilizări în industria farmaceutică.
Sursele vegetale sunt reprezentate de seminţe(germinate sau negerminate),
rădăcini, fructe, sevă, latexuri, frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obţinerea
preparatelor enzimatice ridică o serie de probleme, cum ar fi: prezenţa unor
substanţe potenţial dăunătoare sănătăţii omului (ex. Compuşii fenolici) sau a unor
compuşi toxici de comtaminare. Aceste dezavantaje face ca sursele de origine
vegetală să fie destul de puţin utilizate. Principalele enzime obţinute din surse
vegetale sunt.
- papaina, protează obţinută din latexul fructelor de Caryca Papaia. Enzima este
utilizată pentru tenderiyarea cărnii sau în industria berii;
- ficina, protează obţinută din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizată
pentru degradarea proteinelor miofibrilare.
- bromelina, protează obţinută din sucul de ananas ( Ananas comosus ), folosită
pentru hidroliya proteinelor colagenice.
Alte enzime de origine vegetală sunt lipoxigenaza din soia şi complexul
enzimatic din malţ ( amilaze, proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale
acestor enzime nu sunt purificate, fiind sub formă de făină de soia sau de malţ.
Microorganismele reprezintă principala sursă pentru obţinerea de preparate
enzimatice. Avantajele utilizării microorganimelor constau în:
- microorganismele se pot obţine în cantităţi mari (biomasă) prin cultivare în instalaţii
speciale pe medii de cultură ieftine (tărâţă de grâu, extract de porumb, melasă,
şroturi de soia sau floarea soarelui, zer),
- ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt faţă de cel al plantelor
sau animalelor;
- producţia de enzime de către microorganisme poate fi mărită prin selectarea şi
utilizarea de tulpini mutante, înalt performante (productive) şi prin stabilirea condiţiilor
optime fizice şi chimice pentru producerea de enzime;
- proprietăţile enzimelor şi specificitatea de acţiune diferă cu natura
microorganismelor producătoare, astfel industrial se pot obţine preparate care
corespund întocmai scopului dorit.
- preparatele enzimatice obţinute pot avea activităţi diferite cu predominanţa unei
activităţi.
2.6.Tehnologii de obţinere a preparatelor enzimatice
Tehnologia de obţinere a preparatelor enzimatice implică operaţiile indicate în
schema prezentată în fig. 4. din care rezultă ca preparatele enzimatice pot fi obţinute
sub formă de:
- preparate enzimatice brute-uscate;
- preparate enzimatice brute – lichide concentrate;
- preparate enzimatice purificate – concentrate, respectiv şi uscate.

Figura 4. Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice

Procesele biotehnologice de obţinere a preparatelor microbiene sunt


complexe, realizarea lor presupune parcurgerea a trei etape:
1. Pregătirea mediului de cultură, prin prelucrarea mecanică şi fizico chimică a
materiilor prime ce intră în compoziţia mediului de cultură (fermentativ). Această
etapă presupune operaţii de dozare, mărunţire, solubilizare, sterilizare etc.
2 Etapa biologică care constă în obţinerea culturilor starter intermediare şi a culturii
de producţie, urmată de etapa fermentativă prorpiu-zisă.
3. Etapa de separare, purificare şi standardizare a enzimelor.

A. Pregătirea mediului de cultură


Materii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de cultură.
Materiile prime trebuie să asigure principalii nutrienţi microorganismelor în vederea
dezvoltării lor în timpul fermentaţiei.
Surse de carbon. Principala sursă de carbon (sursă de energie) pentru
microorganisme o constituie glucidele, sub formă de glucoză, fructoză, galactoză
care sunt uşor asimilabile, în timp ce maltoză, zaharoza şi lactoza sunt asimilate
doar dacă microorganismele posedă enzime capabile să le transforme în
monoglucide. Poliglucidele pot fi utilizate doar de către microorganismele apte să
sitetizeze enzimele care să le hidrolizeze extracelular în monoglucide capabili să
difuzeze prin membrana celulară.
Ca surse de carbon în reţetele mediilor industriale se folosesc urmatoarele:
- Melasele care provin de la rafinarea zahărului.
- Extractul de porumb, este reprezentat de extractul obţinut din industria amidonului
după ce suferă o concentrare până la 50% S.U.
- Leşiile sulfitice provin din industria hârtiei ca urmate a transformării masei
lemnoase în pulpă celulozică sub acţiunea bisulfitului de calciu.
Surse de azot. Azotul din mediul de cultură are rol anabolic, participând la
biosinteza proteinelor structurale, a enzimelor şi acizilor nucleici.
Principalele surse de azot sunt:
- azot anorganic: amoniac, săruri de amoniu, sulfatul de amoniu, forfatul acid de
diamoniu,
- azot organic: hidrolizate proteice de cazeină, soia, carne etc.
Surse de ioni anorganici. Pentru dezvoltarea microorganimelor în timpul
procesului de fermentaţie este necesară prezenţa ionilor anorganici, aceştia
reprezintă circa 8% din substanţa urcată a a celulelor microbiene. Principalii ioni
anorganici care trebuie să fie prezenţi în mediul de cultură sunt: macronutrienţii
(azot, fosfor, sulf, potasiu, şi magneziu) şi micronutrienţii (sodiu, calciu, clor, fier,
cobalt, zinc, molibden, cupru, mangan, nichel şi seleniu).
Surse de factori de creştere. Factorii de creştere sunt compuşi organici a
căror prezenţă în mediul de cultură este necesară în cantităţi mici, având un rol
catalitic sau structural pentru microorganisme. Factorii de creştere includ vitaminele,
purine, pirimidine, nucleotide şi nucleozide, aminoacizi, acizi graşi, steroli şi
poliamide.
Principalele vitamine necesare ca factori de creştere sunt: biotina, acid pantotenic,
acidul nicotinic, tiamina.
Tratamentul termic al mediilor de cultură. Pentru buna desfăşurare a
procesului de fermentaţie este necesară cultivarea microorgnimelor pe un mediu de
cultură steril pentru a preveni contaminarea. Sterilizarea mediului de cultură se poate
realiza direct în bioreatorul în care se realizează fermentaţia sau într-un vas sub
presiune separat, ulterior fiind transferat în bioreactor.
B. Etapa biologică.
Obţinerea culturilor starter de producţie
Pentru producerea enzimelor, fermentaţiile industriale se desfăşoară în
volume de 150 – 250 de mc de mediu, motiv pentru care trebuie pregătită o cantitate
suficientă de inocul. Cultura folosită drept inocul trebuie să fie în faza exponenţială
de creştere. La microorganismele care au viteză de creştere redusă, se recomandă
să se folosească o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata iniţieirii
fermentaţiei. Cultura starter de producţie trebuie să conţină celule active, adaptate la
mediul industrial pentru ca fermentaţia să se declanşeze rapid. În cazul fermentaţiilor
desfăşurate pe mediul solid, pentru care se utilizează inocule sporifere se
recomandă să se asigure prin inoculare concentraţii de 10 5-106 spori pe g mediu, iar
în cazul celor submerse cultura starter de producţie să fie de circa 10% din mediul
de cultură.

Figura 5. Schema bloc de obţinere a preparatelor enzimatice microbiene brute


Tehnici de fermentaţie
Pentru producţia de preparate enzimatice de origine microbiană se
poate aplica două tehnici de bază :
Fermentaţia de suprafaţă în care se utilizează un mediu solid pe care
se cultivă microorganismul (de regulă un mucegai filamentos). Această tehnică
are avantajul că mediul de cultură va deveni un mediu bogat în activitate
enzimatică ;
Fermentaţia de submersă, în care mediul este lichid ce se află într-un
reactor unde toţi parametrii fermentaţiei sunt perfect controlaţi. Această ultimă
tehnică este superioară primei metode din punct de vedere tehnologic şi
biochimic.
Dintre speciile de microorganisme ce se folosesc menţionăm
următoarele : Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces
cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium emersonii, Kluyveromyces lactis,
Bacillus amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus,
Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola.
La sfârşitul fermentaţiei microorganismul trebuie distrus cu condiţia
păstrării intacte a activităţii enzimatice.
Microorganismele cultivate pot produce enzime extracelular sau intracelular.
În funcţie de tipul acestora variază şi procedeul de extracţie. În ceea ce priveşte
tipurile de culturi submerse, ne putem situa în unul din următoarele cazuri:
Procedeul nealimentat, în care caz toate ingredientele mediului de
fermentare sunt pregătite în fermentator la pH-ul şi temperatura dorită înainte
de a introduce inoculum. După introducerea inoculum, fermentaţia
principală începe şi finalizarea ei se urmăreşte prin prelevarea de probe, în
mod steril, care arată :
- creşterea microorganismelor (biomasă, vâscozitatea mediului) ;
- concentraţia în enzimă (activitatea enzimatică a mediului) ;
- consumul de glucide ;
- nivelul de proteine.
La procedeul nealimentat se pot monta diferiţi senzori care arată :
- pH-ul – care se poate regla prin adaus de baze sau acid ;
- temperatura – care se poate regla prin debitul de circulaţie al apei reci în
mantaua fermentatorului sau în serpentina din interiorul fermentatorului ;
- nivelul de spumă – care se poate combate cu un antispumant aflat într-un
rezervor ataşat fermentatorului;
- presiunea – care se reglează prin supape care se deschid la presiuni de 1
până la 3 bar ;
- coeficientul respirator QR – care se măsoară prin cantitatea de CO 2 produsă
faţă de cantitatea de oxigen consumată ;
- nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluenţilor.
Procedeul alimentat, în care se începe cu un volum de 10 – 30% de
substrat în care se introduce inoculum, după care fermentatorul se alimentează
cu restul de mediu, după care oprirea fermentaţiei se face după un anumit
timp fixat experimental. Acest procedeu se aplică în cazul în care sinteza
enzimelor ar fi reprimată de concentraţiile ridicate într-unul din nutrienţii
mediului de cultură sau în cazul când creşterea microorganismelor, în funcţie
de concentraţia în unul din componenţii mediului, ar provoca creşterea
vâscozităţii, care trebuie să fie reglată în timp. Alimentarea fermentatorului
poate fi repetată de mai multe ori efectuându-se sutiraje (evacuări) programate,
dar întotdeauna trebuie lăsat în fermentator un volum de  30%, care serveşte
în acest caz drept cultură de productie.

Procedeul continuu necesită alimentarea continuă a fermentatorului cu


mediu şi folosirea unei culturi concentrate de microorganisme. În acest caz,
bioreactorul (fermentatorul) de dezvoltare a celulelor este cuplat cu o unitate
de micro sau ultrafiltrare. În figura 1.9. se arată schiţa unei astfel de instalaţii
formată dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la care există şi
posibilitatea de a recicla biomasa.

Avantajele unui astfel de procedeu sunt următoarele :


-se poate detoxifica mediul de cultură prin eliminarea produsului de inhibare ;
-celulele reciclate devin perfuzate ;
-cantitatea de mediu de cultură care se introduce în bioreactor este controlată
de cantitatea de permeat care traversează membrana de ultrafiltrare ;
-celulele au posibilitatea de a se dezvolta până la concentraţii relativ mari ( 
300 g substanţă uscată/l, în cazul drojdiilor) ;
-aceste concentraţii mari de celule se constituie ca o barieră eficace faţă de
contaminarea exterioară ;
-retenatul poate fi evacuat şi el periodic, fiind constituit din biomasă care
conţine enzime intracelulare, după care este trecut la prelucrare ulterioară
(extracţie) ;
-permeatul de la ultrafiltrare, care conţine enzime nu mai are celule microbiene
şi poate fi, deci, stocat sau dirijat direct la o operaţie în aval de purificare sau
concentrare.
Neajunsurile acestui procedeu de obţinere a biomasei şi enzimelor sunt
următoarele :
-membranele trebuie să fie rezistente la sterilizarea cu vapori de apă şi la
igienizare cu substanţe chimice ;
-costurile energetice sunt destul de ridicate;
-mediul de cultură poate fi colmatant pentru membrana de ultrafiltrare;
-chiar la densităţi mari de celule, la sfârşitul ciclului de dezvoltare este posibilă
o oarecare liză a celulelor, ceea ce face necesară o purjare a bioreactorului
prin unitatea de ultrafiltrare, fapt care conduce la micşorarea vârstei medii a
celulelor care rămân în sistem.
O variantă a procedeului continuu de obţinere a biomasei/ enzimelor constă în
folosirea bioreactorului cu membrană.
C. Etapa de separare a enzimelor
Extracţia. La procedeul discontinuu (nealimentat) şi cel alimentat, după
terminarea fermentaţiei se separă partea solidă insolubilă (celule şi produse
insolubile) de partea lichidă care conţine enzimele, separare care se poate
face prin centrifugare, filtrare frontală sau microfiltrare. Soluţia sterilă obţinută
este apoi ultrafiltrată pentru a concentra enzimele. În cazul în care enzimele
sunt destinate a intra în compoziţia unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul
se stabilizează cu polioli (sorbitol, glicerol) şi/sau săruri (NaCl, MgSO 4), respectiv
se adaugă bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).
În cazul în care enzima (enzimele) intră în compoziţia unui preparat comercial
pulbere, ultrafiltratul se suplimentează cu un suport şi se usucă prin atomizare
(suplimentarea se face cu amidon, dextrine). Înainte de atomizare mai poate fi
realizată o filtrare sterilă.
Pentru a obţine şi enzimele intracelulare, biomasa din fermentator,
separată de partea lichidă, este supusă lizei. Liza poate fi realizată chiar de
enzimele proprii microorganismelor ce alcătuiesc biomasa, fie prin folosirea de
preparate exogene, cum ar fi lizozimul din albuşul de ou, preparate enzimatice
exogene complexe de natură bacteriană care conţin chitinază, mananază, -
1,6–glucanază, proteaze, câteodată în combinaţie cu adaosul de metabisulfit.
În cazul în care enzima este periplasmică, un şoc osmotic este suficient
pentru a elibera enzimele. Se poate realiza şi o liză mecanică (folosire de
presiuni mari de 600 – 1000 bar, urmată de detenta brutală) Se pot folosi şi
ultrasunetele cu frecvenţe mai mari de 20 MHz pentru liza celulelor şi deci
pentru eliberarea enzimelor intracelulare. Odată eliberate, enzimele intracelulare
sunt supuse operaţiilor aplicate şi enzimelor extracelulare.
Preparatele enzimatice se comercializează de regulă sub formă de
pulbere, de microgranule, precum şi sub formă lichidă.
Preparatele enzimatice sub formă de pulbere sunt formulate cu un
suport cum ar fi amidonul, maltodextrinele, zahărul, sarea. La aceste preparate
se controlează granulometria, umiditatea ( 6%). Suportul trebuie să nu fie
higroscopic pentru a se evita formarea de cocoloaşe. În preparatele comerciale
pulbere sau lichide, conţinutul de enzimă este redus raportat la suport şi de
aceea cantitatea de preparat comercial este mult mai mare, în comparaţie cu
nivelul de enzimă conţinut.
În ceea ce priveşte preparatele comerciale microgranulate, acestea se
obţin dintr-un ultrafiltrat care se amestecă cu un suport (sare, amidon solubil,
maltodextrine etc.). Cantitatea de substrat este astfel calculată încât să se
obţină titrul enzimatic dorit în microgranule. Amestecul respectiv este pulverizat
împreună cu un agent liant care reprezintă 0,1% până la 0,5% faţă de masa
suportului. Picăturile pulverizate sunt uscate într-un turn de uscare, cu aer la
70 - 90C.
Preparatele comerciale lichide sunt formulate în general cu polioli
(gliceroli, sorbitol) care se utilizează în proporţie de 20 – 50% faţă de preparatul
lichid. La aceste formulări se adaogă o substanţă bacteriostatică (de exemplu
benzoat de sodiu în proporţie de 0,1 – 0,2%).

2.7. Enzime imobilizate


Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncţional) înseamnă
legarea sau fixarea acesteia de un suport care trebuie să îndeplinească
următoarele condiţii :
-să fie insolubil în apă ;
-să asigure păstrarea proprietăţilor catalitice ale enzimelor, respectiv
specificitatea de acţiune ;
-să asigure acţiunea enzimei la un pH şi temperatură optime, apropiate de cele
ale enzimelor libere (neimobilizate).

Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele :


 creşterea stabilităţii enzimei, ca proteină şi ca activitate catalitică. Această
stabilitate este în legătură cu diminuarea gradului de libertate al
macromoleculei, ceea ce are consecinţă asupra variaţiilor de conformaţie a
enzimei (se diminuează aceste variaţii). Imobilizarea conduce şi la creştere a
concentraţiei locale a protein-enzimei care are un efect stabilizant;
 se poate lucra în flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice,
dar şi din punct de vedere al reglării automate a parametrilor de lucru;
 enzima nu pătrunde în substratul ce se tratează în cursul catalizei
enzimatice;
 se poate modula micromediul în care acţionează enzima imobilizată
(concentraţie substrat, încărcarea suportului cu enzimă, grupările hidrofile);
 refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeaşi cantitate de enzimă se
poate transforma o cantitate mai mare de substrat;
 se poate lucra în sistem semicontinuu sau continuu, putându-se automatiza
procesul, ceea ce asigură un control riguros al parametrilor de lucru;
 are loc o creştere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului
de substrat şi al concentraţiei acestuia;
 se poate stopa reacţia enzimatică la momentul dorit şi se evită trecerea
enzimei în produsul transformat;
 costurile globale de producţie sunt mai mici în comparaţie cu procedeele
în care se folosesc enzime libere;
 se pot folosi şi enzime care nu sunt trecute în liste GRAS (Generally
Reconized as Safe);

Există şi dezavantaje, cum ar fi:


 costuri privind imobilizarea;
 pierderi ale activităţii enzimatice,
 o investiţie iniţială în utilaje mai mare,
 un proces mai complex din punct de vedere tehnic şi o supraveghere mai atentă;
 utilizarea numai a unor substraturi solubile.

Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate.


În cazul enzimelor imobilizate se observă un comportament cinetic diferit faţă
de cel al enzimelor libere, solubile. Activitatea enzimatică scade ca urmare a
imobilizării. Acest lucru se datorează schimbărilor conformaţionale ale enzimei după
imobilizare. O astfel de modificare apare în primul rând în cazul legării covalente a
enzimelor de suport. Un alt aspect este influenţa mediului, în cazul enzimelor
imobilizate acesta este diferit de cel apos. Astfel, grupările funcţionale acide
La imobilizare, în funcţie de enzimă şi catalizator se poate vorbi de :
- randament de fixare care reprezintă cantitatea efectivă de enzimă imobilizată
în raport cu cantitatea de enzimă introdusă în procesul de imobilizare :

enzimă fixată pe suport


 =  · 100
enzimă utilizată

- randament de activitate care reprezintă activitatea reziduală a enzimei


imobilizate:
Activitatea (E0) după fixare
 · 100
Activitatea (E’0) înainte de fixare

Factorii critici care trebuie luaţi în consideraţie la folosirea


enzimelor imobilizate
Aceşti factori se referă la :
- eficienţa economică a imobilizării determinate de : costul enzimei, costul
suportului, costul tehnicii de imobilizare ;
- activitatea enzimei imobilizate care este influenţată de : tehnica de
imobilizare; caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a substratului la
enzimă şi a produsului (lor) de transformare ;
- caracteristicile substratului ce trebuie transformat ;
- stabilitatea enzimei care trebuie menţinută activă un timp cât mai îndelungat
- contaminarea microbiologică a sistemului enzimă/suport în timpul utilizării
reactorului respectiv.
Figura 6. Metode de imobilizare a enzimelor

Metode de imobilizare a enzimelor


a) Metode fizice, la care enzima se leagă de un suport prin intermediul
legăturilor slabe sau relativ puternice (legături Van der Waals, legături de
hidrogen, interacţiuni proteină – proteină, legături ionice).
Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi :
- prin adsorbţie pe suporturi organice : amidon, colagen, Sepharoză modificată,
polistiren modificat, răşini schimbătoare de ioni (DEAE celuloză, DEAE
Sephadex, carboximetil-celuloză, Amberlit, Dowex 50 etc.) ;
- prin adsorbţie pe suporturi minerale : alumină, argilă (bentonită, montmonirolită
etc.), ceramică, hidroxiapatită, sticlă poroasă sau silice poroasă, titanit (punţi
metalice cu TiCl4). Adsorbţia se realizează prin contactul dintre o soluţie
apoasă de enzimă cu suportul solid şi va fi influenţată de : pH, tipul de
solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionică, calitatea enzimei,
temperatura şi durata de contact a enzimei cu suportul. Practic imobilizarea se
face prin amestecul dintre soluţia de enzimă şi suport într-un reactor cu
agitator sau prin trecerea soluţiei de enzimă într-o coloană în care suportul
este menţinut sub forma unui pat. Adsorbţia enzimei de suport poate fi
îmbunătăţită prin ataşarea de suport a unor cofactori, cum ar fi piridoxal-
fosfatul sau lanţuri cu grupări hidrofile.
Adsorbţia este influenţată de raportul dintre suprafaţa şi volumul
suportului, mărimea particulelor, raportul dintre grupările hidrofile şi hidrofobe.
Avantajele şi dezavantajele imobilizării prin adsorbţie
Avantaje
Simplicitate în execuţie (incubarea enzimei cu suportul, agitare câteva
minute, enzima care rămâne în soluţie fiind eliminată prin spălare).
Absenţa reacţiilor chimice (numai dacă nu se formează punţi metalice).
Posibilitatea de regenerare a complexului enzimă/suport.

Dezavantaje
 Stabilizare slabă.
 Riscul de desorbţie a enzimei de către : fluxul de substrat, variaţie lejeră
de pH, forţa ionică, temperatură

-prin includere într-un suport, în care caz se pot include şi microorganisme.


Includerea poate fi făcută în gel, microincapsulare, includere în fibre.

Avantajele şi dezavantajele imobilizării enzimelor prin incluziune

Avantaje
 Reacţiile de polimerizare sau gelificare sunt bine cunoscute
 Reacţiile chimice dintre suport şi enzimă sunt limitate (enzima este inclusă
în geluri naturale)
 Se poate aplica la toate enzimele (chiar şi la amestec de enzime)
 Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme, fibre, bile.
 Riscul de “evadare” a enzimei este redus prin reticularea suportului după
imobilizare
Dezavantaje
 Anumite polimerizări necesită agenţi denaturanţi sau radicalici
 Se pun probleme de transfer de masă (inaccesibilitatea unor substraturi la
enzimă)
 Riscul de evadare al enzimei prin micropori
 Proprietăţile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfăcătoare

Avantajele şi dezavantajele imobilizării enzimelor prin incluziune

b) Metode chimice de imobilizare, în care caz imobilizarea se face


prin intermediul legăturilor covalente de suporturi insolubile, care posedă
grupări reactive sau care pot fi activate prin diferite reacţii chimice. Se poate
realiza imobilizarea şi prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer reactiv
şi legarea încrucişată (Cross-linking) sau reticulară intra şi intermoleculară a
enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncţional.
La legarea prin legături covalente, imobilizarea poate fi făcută : prin
fixare de un suport insolubil, dar trebuie să se ţină seama de gruparea
funcţională care poate reacţiona cu protein-enzima şi de caracteristicile fizico-
chimice ale suportului. Adesea este necesar să se creeze, pe cale chimică,
funcţii reactive pe suport; prin coreticulare utilizând agenţi bi- sau
polifuncţionali. Cel mai mult utilizată pentru reticulare este glutaraldehida.

Avantajele şi dezavantajele legării enzimelor de suport prin legături


covalente

Avantaje
 Stabilitate mărită datorită faptului că legăturile covalente sunt cele mai
puternice dintre toate legăturile menţionate anterior
 Varietatea mare a suporturilor : sticlă, silice, ceramică, celuloză, polimeri sintetici
etc.
 Posibilitatea de a efectua imobilizarea în prezenţa unui substrat pentru a se
evita inactivarea (protecţia situsului activ).

Dezavantaje
 Trebuie realizate reacţii chimice, adesea complexe
 Etapa de activare a suportului este lungă
 Randamentul de fixare este  100%
 Există riscul modificării chimice a enzimei (pierdere de activitate)
 Este necesar ca enzima să fie purificată în prealabil
 Investiţia (costul) este importantă

Suporturi de imobilizare comerciale


Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea
enzimelor sunt:
- polizaharide : agaroză, celuloză şi derivaţi, alginaţi, carageenani, dextrani ;
- poliacrilamide utilizate sub formă de bile ;
- polistiren (bile şi tuburi) ;
- silicea şi sticla poroasă.
2.8. Condiţiile de inocuitate pe care trebuie să le îndeplinească
preparatele enzimatice
Număr total de germeni (NTG), maximum 5.10 4/g ;
Coliformi, maximum 30/g ;
Escherichia coli – absent/ 25 g ;
Salmonella – absent/ 25 g ;
Activitate antibiotică de origine microbiană – absentă ;
Aflatoxina B1, ochratoxină A, sterigmatocistină, toxina T – 2 (zearalenona) în cazul
preparatelor de origine microbiană – absente ;
Metale grele :
-arseniu  3 mg/Kg ;
-plumb  10 mg/Kg ;
-alte metale grele  40 mg/Kg (exprimată la Pb).

3. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

Microorganismele sunt utilizate în industria alimentară pentru:


- Obţinerea de celule (culturi starter = culturi pure) care la rândul lor sunt folosite
pentru fermentarea produselor lactate acide sau brânzeturi, la fabricarea produselor
de carne (salamuri crude uscate), produse tradiţionale vegetale, produse lactate
acide, pâine etc. În acest produsele se consumă fie împreună cu celulele respective
fie după îndepărtarea celulelor cum este cazul băuturilor de tipul berii, vinului.
- Obţinerea de biomasă care poate fi utilizată ca ingredient de fermentare (drojdia
de panificaţie ) sau de îmbogăţire a unor produse alimentare cu proteine, respectiv
ca furaje proteice pentru păsări, peşte, porcine.
În ceea ce priveşte metodele de cultivare ale microorganismelor se folosesc metode
periodice (discontinui) şi metode continui, în ambele cazuri fiind necesară
optimizarea procesului.

Metoda periodică de cultivare a microorganismelor prevede alimentarea


continuă a aparatului de cultivare cu substanţe nutritive şi înlăturarea culturii de
microorganisme. În acest fel, se creează condiţii optime de acumulare a cantităţii
necesare de biomasă sau a metaboliţilor. La cultivarea periodică concentraţia
substanţelor nutritive scade, iar cea a celulelor şi metaboliţilor creşte, fapt care
conduce la modificarea cineticii creşterii microorganismelor.
La metoda periodică trebuie să avem în vedere două situaţii şi anume:
- când substratul este inhibitor pentru producţia de biomasă şi metaboliţi;
- când produsul este inhibitor.
Prima situaţie se întâlneşte la obţinerea biomasei de drojdie de panificaţie,
represiunea catabolică de către glucide antrenează şi o producţie de alcool etilic,
producţie ce trebuie evitată prin două soluţii şi anume: evitarea excesului de substrat
şi lucru cu cultura “în pat” şi respectiv plasarea unui detector de alcool în efluentul
de gaz (CO2) care permite să se cunoască ce aport de substrat trebuie furnizat.
A doua situaţie se întâlneşte la producţia de culturi lactice a căror dezvoltare
este însoţită de acumularea de acid lactic (bacterii lactice homofermentative) sau
acid lactic şi acetic (bacterii lactice heterofermentative).
Soluţia care se impune în acest caz este o dializă a culturii sau centrifugarea
substratului cu celule, celulele fiind apoi reciclate.
Dacă dezvoltarea culturii are loc fără acumularea de metaboliţi, alimentarea
cu substrat se poate face la un debit constant, dar la o concentraţie crescătoare a
acestuia, respectiv la o concentraţie constantă a substratului dar la un debit
programat exponenţial.
Metoda continuă, în care caz are loc alimentarea constantă a aparatului de
cultivare a microorganismelor cu substanţe nutritive şi eliminarea neîntreruptă a
biomasei sau metaboliţilor. Această metodă poate fi realizată prin cultivarea de
suprafaţă sau de adâncime a microorganismelor.
La fermentarea continuă se are în vedere natura catalizatorului (imobilizat sau
nu; sistem eterogen sau nu; celule incluse, adsorbite, grefate prin covalenţă); gradul
de reciclare al celulelor microbiene; gradul de amestecare a fluidelor în reactorul cu
funcţionare continuă.
Creşterea concentraţiei de celule se poate realiza prin: folosirea tehnicilor de
membrană sau centrifugarea; folosirea de celule imobilizate; reciclarea celulelor.

3.1. Microorganisme utilizate în industria alimentară

BACTERIILE utilizate în industria alimentară aparţin următoarelor genuri:


Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii sub formă de
coci sferici sau ovali cu   2, grupate în diplo sau formă de lanţuri. Sunt Gram
pozitive, facultativ anaerobe, neciliate, nesporulate, unele specii fiind capsulate.
Importanţi pentru industria alimentară sunt:
Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis),
Str. cremoris (Lactococcus lactis subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus
lactis subsp. diacetilactis);
Streptococii termofili: Str. thermophilus.
Aceşti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc acid lactic L(+) şi
prezintă următoarele activităţi:
- activitate fermentativă: fermentează lactoza şi glucoza;
- activitate proteolitică;
- produc diacetil şi acetoină din acid citric ( în principal Str. diacetilactis).
Fermentarea lactozei de către streptococii lactici se face prin transformarea
iniţială a acesteia în glucoză şi galactoză – 6P prin intermediul fosfo--
galactozidazei. În continuare, glucoza este apoi fermentată pe calea hexozo –
difosfatului în acid lactic, iar galactoza – 6P este utilizată pe calea tagatozei în
vederea producerii unei cantităţi suplimentare de acid lactic (fig. 7.).
Figura 7. Calea tagatozei de degradare a lactozei de către streptococii lactici

Fermentarea glucozei de către streptococii lactici poate fi făcută pe cale


homofermentativă cu producerea în principal de acid lactic şi pe cale
heterofermentativă, în condiţile în care glucoza este limitată, calea
heterofermentativă fiind calea ribulozei – 5P cu formare de acid acetic, etanol şi acid
lactic (fig. 8.).

Figura 8. Calea homo şi heterofermentativă de degradare a glucozei de către


bacteriile lactice
Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoină şi 2,3 butilenglicol
este arătată în figura 9. Acelaşi mecanism îl folosesc şi leuconostocii.

Figura 9. Transformarea citratului de către Str. lactis subsp. diacetilactis şi


Leuconostoc

Genul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu formă sferică, lenticulară,


grupate în perechi sau lanţuri, imobile, asporogene, Gram negative, facultativ
anaerobe.
Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine (acid nicotinic, tiamină,
biotină) şi zaharuri fermentescibile. Nu sunt proteolitici şi nu reduc azotaţii. Specii de
Leuconostoc formează polimeri (dextran). Se dezvoltă bine la 20-30C.
Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc cremoris (citrovorum);
Leuconostoc lactis; Leuconostoc dextranicum; Leuconostoc mezenteroides.
Aceste specii sunt heterofermentative şi se dezvoltă greu în laptele fără
adaos de stimulatori. În produsele lactate, leuconostocii au două funcţii de bază:
- produc compuşi de aromă (diacetil, acetoină);
- produc ochiuri de fermentare prin formare de CO 2 în unele tipuri de brânzeturi
(Edam, Goude, Tilsit).
Ambele funcţii sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii
produc CO2 şi din lactoză. Leuconostocii intervin deci în metabolismul glucidelor şi al
citratului.
Metabolismul glucidelor. Fermentarea glucidelor de către leuconostoci se
face pe calea fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoză regenerându-se câte un
mol de ATP. Genele care codifică etapele iniţiale ale fermentării lactozei (ca de altfel
şi ale metabolizării citratului, producerii de proteaze) sunt localizate în plasmide.
Metabolismul citratului. Metabolismul citratului de către leuconostoci este
acelaşi ca şi la streptococi cu menţiunea că leuconostocii produc diacetil şi acetoină
la pH scăzut. Acetoina se poate forma pe două căi:
- prin decarboxilarea acetolactatului;
- din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, într-o reacţie care necesită
NADH sau NADPH. Această ultimă cale este redusă sau chiar lipseşte în cazul lui
Str. diacetilactis, din cauza capacităţii limitate a acestuia de a produce acetil- CoA,
unul din precursorii diacetilului.
Leuconostocii (ca de altfel şi lactobacilii) pot produce la unele brânzeturi unele
defecte şi anume:
- crăparea pastei la brânza Cheddar ( defect numit “Blit opennes”);
- apariţia timpurie de gaze la brânza Goude (Str. diacetilactis poate produce şi el
defectul de “plutire” a coagulului, la brânza Cottage).
Aceste defecte se datorează formării de CO 2. Pentru a se preveni defectul de
“plutire” a coagulului, brânza Cottage se fabrică cu o cultură care nu conţine Str.
diacetilactis, adăugându-se apoi în brânza obţinută o cultură de Leuconostoc
citrovorum cultivată pe lapte cu adaos de citrat sau o cultură concentrată de
Leuconostoc citrovorum.
În afară de industria laptelui, leuconostocii se utilizează şi pentru:
- fermentarea unor produse vegetale (varză, castraveţi, măsline) intervenind în
cadrul microflorei spontane sau sub formă de culturi concentrate;
- fermentarea malolactică a vinurilor;
- producţia de dextran.
În industria laptelui se folosesc culturi lactice care conţin streptococi
acidifianţi (Str. lactis şi Str. cremoris), precum şi bacterii producătoare de aromă şi
unele specii de Leuconostoc şi Str. diacetilactis, ultimul fiind aromatizant şi acidifiant.
Genul Pediococcus. Acest gen aparţine familiei Streptococaceae şi cuprinde
bacterii sub formă de coci perechi sau tetrade. Metabolismul acestor bacterii este
predominant fermentativ, homolactic. Se produce acid lactic racemic (DL) din
glucoză, fructoză, manoză. Sorbitolul şi amidonul nu sunt fermentaţi. Multe specii
sunt catalază-negative, dar se întâlnesc şi specii care au activitate catalazică
independentă de hem.
Principalele criterii de diferenţiere între diferitele specii de pediococi sunt
menţionate în tabelul 10.
P. acidilacti, în culturi starter, este utilizat pentru obţinerea de produse din
carne fermentate la temperaturi mai ridicate, deoarece are o dezvoltare bună la 42-
52C, producând rapid acidul lactic şi deci scade efectiv pH-ul, produsul obţinut
având gust acrişor. Atunci când se utilizează la fermentarea unor produse de carne
la temperatura de 16-27C, producţia de acid lactic este mai lentă şi implicit se pot
dezvolta şi microorganismele care contaminează carnea, durata de fermentaţie fiind
mai mare.
P. pentosaceus produce o fermentaţie rapidă când substratul conţine un
glucid fermentescibil, temperatura de fermentare fiind cuprinsă între 15-27C.
Tabel 10. Criterii de diferenţiere între diferitele specii de pediococi
Culturi starter Temperatura de Durata, ore pH-ul
incubare, C

P. pentosaceus 26,7 20 5,00


P. acidilacti 26,7 38 5,65
P. pentosaceus 29,4 13 5,00
P. pentosaceus 29,4 28 5,40

Din tabelul de mai sus rezultă că P. pentosaceus este mai eficace în ceea ce
priveşte producţia de acid lactic atât la 26,7C cât şi 29,4C în comparaţie cu P.
acidilactici.
Având în vedere că pediococii produc acid lactic şi bacteriocine, ei exercită o
acţiune inhibitoare faţă de microorganismele patogene şi cele de alterare (stafilocici,
salmonele, Cl. botulinum, bacili, enterobacterii gram negative, drojdii).
În produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-ul de la 5,6 la 4,5-5,2
ceea ce face ca proteinele să fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce
favorizează sinereza şi deci uscarea produsului.
Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce
contribuie la realizarea unei texturi ferme a produsului finit.
Genul Lactobacillus. Acest gen aparţine familiei Lactobacillaceae. Această
familie cuprinde bacterii sub formă de bastonaşe de lungimi şi grosimi variabile,
precum şi cocobacili scurţi, aşezaţi obişnuit în lanţuri în faza de înmulţire logaritmică.
Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe.
În general sunt catalază –negative citocrom-oxidază –negative, nu reduc azotaţii, nu
lichefiază gelatina. Au activitate proteolitică şi lipolitică redusă. Glucidele cele mai
bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza (mai ales în faza de dezvoltare),
apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza).
Pentru dezvoltare necesită substanţe minerale şi toate vitaminele din grupul
B. Se dezvoltă bine în mediu cu pH 5,5-5,8, dar şi la pH  5 . Se pot dezvolta în
limite largi de temperatură (5-53C), dar temperatura optimă este cuprinsă între 30 şi
45C.
În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare lactobacilii pot fi:
- termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, temperatura optimă
fiind 37-45C;
- mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura optimă de dezvoltare
fiind 26-30C.
Orla Jensen a împărţit genul Lactobacillus în următoarele grupe:
1. grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili homofermentativi termofili: L.
lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii;
2. grupa Streptobacterium – care cuprinde lactobacilii homofermentativi mezofili: L.
casei, L, plantarum;
3. grupa: Betabacterium – care cuprinde lactobacili heterofermentativi, ce
contaminează frecvent brânzeturile: L fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. viridiscens.
Streptobacteriile la rândul lor, au fost clasificate de către unii autori în
neacidorezistente şi acidorezistente.
Lactobacilii neacidorezistenţi produc compuşi aromatici (diacetil, acetoină). Se
prezintă sub formă de bastonaşe de lungimi variabile şi rar formează lanţuri .
Se pot dezvolta la 2-15C. Nu se dezvoltă la pH  5,6. Se utilizează în culturi
starter la fermentarea salamurilor crude cu pH = 5,6 – 6,1, produsele având o
durată mare de maturare, iar gustul final fiind slab acrişor dulceag.
Lactobacilii acidorezistenţi au formă de bastonaşe scurte care formează
lanţuri. Se dezvoltă bine la pH  5,0.
Activitatea metabolică a lactobacililor în produsele alimentare fermentate se
referă la metabolismul lactozei, galactozei şi glucozei. Zaharoza este fermentată
numai după hidroliza acesteia în glucoză şi fructoză.
Metabolismul lactozei. Pentru a se dezvolta în lapte, lactobacilii
homofermentativi hidrolizează lactoza cu ajutorul -galactozidazei şi/sau -D–
fosfogalactozid– galactohidrolazei, aşa cum arată în schema din figura 11.

Figura 11. Transformarea lactozei în glucoză şi galactoză respectiv glucoza şi


galactoza 6P de către lactobacilii homofermentativi

-D-galactozid–galactohidrolaza este utilizată de Lb. casei iar -galactozidaza


este utilizată de majoritatea lactobacililor (L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus etc.),
deşi aceştia din urmă au şi activitate -D–fosfogalactozid–galactohidrolazică, însă
mai redusă.
L. bulgaricus are -galactozidază activă la pH = 7,0 şi este activată de Mg 2+,
Mn2+ şi Fe2+. În cele mai multe cazuri, lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca sursă
de energie în comparaţie cu lactoza şi galactoza. Unii lactobacili eliberează în mediu
galactoză care se acumulează.
Metabolismul hexozelor. După hidroliza lactozei în celulele lactobacililor
homofermentativi, hexozele rezultate sunt metabolizate pe calea Embden –
Meyerhof.
Lactobacilii heterofermentativi fermentează hexozele pe calea
hexozomonofosfatului, aceşti lactobacili neavând aldolază şi triozofosfat izomerază
care sunt enzime cheie în calea Embden – Meyerhof. Aceasta este de fapt şi
diferenţa dintre cele două grupe de microorganisme, adică lactobacilii
homofermentativi posedă atât aldolază cât şi triozofosfatizomerază, în timp ce
lactobacilii heterofermentativi nu posedă aceste enzime.
Galactoza, rezultată din lactoză, pentru a fi fermentată trebuie mai întâi să fie
transformată într-un derivat fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi suferă
transformări pe calea Embden – Meyerhof (fig. 12.).

Figura 12. Transformarea galactozei în glucoză-6P de către lactobacili

Activitatea proteolitică. Activitatea proteolitică a lactobacililor contribuie atât


la textura cât şi la aroma unor produse alimentare (produse lactate, produse
vegetale fermentate, produse din carne fermentate etc.), dar şi la eliberarea unor
aminoacizi care stimulează creşterea şi activitatea altor bacterii lactice folosite în
culturile starter în amestec cu lactobacilii. Se consideră că activitatea
endoproteinazică a lactobacililor este asociată cu membrana celulelor, iar activitatea
exopeptidazică este localizată intracelular. Enzimele din membrana celulelor produc
hidroliza parţială a macromoleculelor proteice, din care se formează peptide suficient
de mici pentru a fi transportate în interiorul celulelor unde se continuă degradarea lor
până la aminoacizi, necesari creşterii (figura 13.).
Activitatea proteolitică a lactobacililor este optimă la pH 5,2- 5,8 şi
temperatura de 45-50C. La temperaturi mai mari de 55C activitatea proteolitică
este mult redusă datorită termodenaturării enzimei iar la 70C/1min enzimele sunt
complet inactivate.
În cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L. bulgaricus sunt active faţă
de -cazeină, apoi în ordine descrescătoare şi faţă de Қ şi  cazeină.
Figura 13. Acţiunea endoproteinazelor extracelulare şi a exopetidazelor intracelulare
în cazul lactobacililor

Producerea de compuşi de aromă şi H 2O2 . Principala contribuţie a


lactobacililor este producţia de acid lactic. În cazul produselor lactate acide, deşi
speciile de lactobacili implicate sunt homofermentative, acestea însă produc şi alţi
metaboliţi, printre care produşi volatili ca: acetaldehida, diacetil şi alcool. In cantitate
mai mare fiind produsă acetaldehida. În plus, L. casei produce diacetil din citrat, mai
ales atunci când laptele se suplimentează cu citrat (L. casei nu este însă un
producător major de diacetil). Anumiţi lactobacili produc H 2O2 care se acumulează în
mediul şi jenează dezvoltarea altora. Acumularea H 2O2 în mediul de cultură este
posibilă pentru ca lactobacilii sunt catalază – negativi. Incapacitatea lactobacililor de
a distruge metabolic H2O2 explică de ce aceştia nu se dezvoltă bine în condiţii
puternic aerobe, oxigenul fiind toxic pentru lactobacili care nu posedă
superoxiddismutază, enzimă care se constituie ca un sistem de protecţie faţă de
toxicitatea oxigenului, cum este cazul altor bacterii.
Acţiunea lactobacililor este îmbunătăţită prin interacţiuni cu alte bacterii
lactice. De exemplu, cultura mixtă formată din L. bulgaricus şi Str. thermophilus este
adecvată pentru fabricarea iaurtului, deoarece cultura mixtă produce mai rapid acid
lactic.
Interacţiunea dintre cele două bacterii lactice este benefică din următoarele
motive:
- L. bulgaricus produce aminoacizi liberi, în particular histidină, care stimulează
producţia de acid lactic a lui Str. thermophilus;
- Str. thermophilus, pe de altă parte, produce acid formic, care stimulează activitatea
lui L. bulgaricus;
- Str. thermophilus, deşi produce o cantitate suficientă şi de CO 2 care stimulează
dezvoltarea lui L. bulgaricus, totuşi dezvoltarea acestuia este mai redusă, deoarece
Str. thermophilus utilizează mai rapid anumite substanţe nutritive esenţiale
pentru dezvoltarea lui L. bulgaricus. În plus, lactobacilii, în general, sunt sensibili
chiar la niveluri foarte reduse de antibiotice, în comparaţie cu Str. thermophilus ( de
aici şi necesitatea ca laptele să nu conţină urme de antibiotice).
Utilizarea culturilor de lactobacili:
 În industria laptelui se utilizează Lactobacillus lactis şi Lactobacillus bulgaricus,
singuri sau în amestec la fabricarea iaurtului, chefirului, cumâsului, brânzei
Ementhal, brânzeturilor italiene. Lactobacillus helveticus este şi el implicat în unele
din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este folosit la fabricarea laptelui
acidofil, laptelui acidofil nefermentat şi a altor produse acidofile. Lactobacillus casei
se utilizează pentru obţinerea produsului yakult.
 În industria cărnii interesează Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus şi în
special Lactobacillus plantarum care se caracterizează prin faptul că nu produce
CO2 la fermentarea glucozei dar produce CO2 din gluconat. Riboza este fermentată
la acid lactic şi acid acetic. Posedă activitate aldolazică, glucozo – 6P –
dehidrogenazică. Prin fermentaţie lactică se produce acid lactic racemic (DL).
Lactobacillus plantarum este facultativ anaerob, nu produce NH 3 din arginină.
Poate acidifica laptele şi are temperatura optimă de dezvoltare la 30-35C. Nu
necesită pantotenat, tiamină, niacină pentru dezvoltare.
Lactobacillus plantarum ca şi Lactobacillus sake pot descompune acidul gluconic
cu formare de acid acetic ceea ce este dezavantajos în cazul salamurilor la care se
foloseşte glucono – delta – lactona ca acidifiant chimic. Lactobacillus plantarum
poate reduce NaNO3 dacă pH-ul mediului este mai mare de 6,0 şi nu există zaharuri
fermentescibile în mediul de cultură. Lactobacillus sake şi Lactobacillus curvatus
produc H2O2 în prezenţa O2 atmosferic. Cei doi lactobacili se întâlnesc frecvent în
salamurile crude fără adaos de culturi starter (sunt componenţi ai microflorei
spontane a compoziţiei de carne).
 Alte utilizări Lactobacilii interesează şi în fermentarea măslinelor, verzii,
castraveţilor, gogonelelor, în producerea spirtului şi drojdiei presate în vederea
acidifierii plămezilor, la fermentarea unor produse fermentate din cereale (bragă,
cvas), la fabricarea acidului lactic prin fermentare etc.

Genul Micrococcus şi Staphylococcus. Microorganismele din genurile


Micrococcus şi Staphylococcus aparţin familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii
sub formă de coci. Se pot dezvolta în medii care conţin 15% NaCl.
Pentru industria cărnii interesează anumite specii de micrococi şi stafilococi
care sunt folosite pentru:
- capacitatea lor de a reduce azotaţii la azotiţi (contribuie la formarea culorii cărnii
sărate în prezenţă de azotaţi);
- activitatea lor catalazică;
- activitatea de acidificare, proteolitică şi lipolitică.
Dintre speciile de micrococci interesează Micrococcus aurantiacus şi
Micrococcus varians.
Pentru industria laptelui, micrococii formează partea principală a populaţiei
nelactice din laptele crud şi respectiv brânzeturile fabricate din laptele crud. Din
brânza Cheddar fabricată din lapte crud a fost izolat Micrococcus freundenreichii,
care a fost ulterior utilizat sub formă de cultură pură în scopul accelerării formării
aromei brânzei fabricate din lapte pasteurizat datorită activităţii proteolitice şi
lipolitice. Tot în scopul maturării unor brânzeturi cu pastă presată s-a utilizat un
preparat enzimatic şi anume Rulactina ce conţine o metal-protează cu activitate strict
endoproteinazică obţinută din Micrococcus caseolyticus.
Din genul Staphylococcus interesează speciile de stafilococi coagulază-
negativi, nepatogeni cum ar fi: Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus,
Staphylococcus simulans.
Combinaţiile de micrococi şi stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-
reductazică şi catalazică. În aceste combinaţii, Staphylococcus carnosus acţionează
mai bine decât micrococii în formarea culorii, reducând azotaţii la azotiţi şi respectiv
azotiţii la oxid de azot, chiar în condiţii de aciditate ridicată a substratului. Aroma
produselor la care este utilizată cultura starter de Staphylococcus carnosus este
superioară.

Genul Streptomyces. Specii din genul Streptomyces pot altera alimentele,


producând mirosuri şi gusturi dezagreabile, altele (puţine la număr) sunt patogene.
Streptomyces griseus senso Hötter este însă inofensiv şi a fost folosit pentru
capacitatea sa de a reduce azotatul la azotit, putându-se dezvolta bine în substraturi
care conţin ~ 8% NaCl şi care au pH = 5,8-8,5. Temperatura optimă de dezvoltare
este la 30C. Este catalază – pozitiv având capacitate proteolitică dar nu şi lipolitică.
Poate fi asociat cu micrococii şi/sau lactobacilii. În salamurile crude se inoculează la
nivel de 5·103 /g compoziţie.

Genul Propionibacterium. Bacterile din genul Propionibacterium fac parte


din familia Propionibacteriaceae. Bacteriile propionice fermentează carbohidraţii,
piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice “tip lapte” sunt: Propionibacterium
freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum şi shermani), Propionibacterium
theonii, acidipropionici şi jensenii.
Principalii produşi de fermentaţie a bacteriilor propionice sunt CO 2, cantităţi
mari de acid propionic şi acetic şi cantităţi mici de acid izovalerianic, formic, succinic,
lactic. Toate speciile produc acid lactic din glucoză. Se dezvoltă foarte bine la 30-
37C şi la pH = 7,0.
Producerea de propionat, acetat şi CO 2 . Lactatul (respectiv piruvatul) este
transformat în propionat prin reacţia:
3CH3-CHOH-COOH 2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 +
H2O
Propionatul, acetatul şi CO2 se formează în proporţie de 2/1/1. Diferitele
tulpini de bacterii propionice se deosebesc între ele prin raportul acid propionic /acid
acetic format, o influenţă în acest sens având şi aciditatea substratului, cantitatea de
lactat şi adaosul de carbonat şi succinat.
Producerea de prolină . Prolina este considerată ca principalul component
care conferă aromă dulceagă brânzeturilor de tip şvaiţer, prezenţa prolinei fiind
asociată cu dezvoltarea bacteriilor propionice la maturarea brânzeturilor de tip
şvaiţer. Se consideră că există trei căi pentru producerea de prolină:
- proteoliza generală;
- hidroliza peptidelor care conţin prolină;
- biosinteza prolinei.
La prima cale se ia în considerare producerea de prolină prin hidroliza
cazeinei.
La a doua cale se ia în considerare formarea de prolină din hidrolizatul
cazeinic prin acţiunea peptidazelor (Propionibacterium shermanii posedă
imidopeptidază şi proliniminopeptidază intracelulare cu optim de pH la 5,5-6,0).
La a treia cale se are în vedere biosinteza prolinei din arginină şi mai puţin din
acid glutamic, dar calea de biosinteză este nesemnificativă în raport cu cea de-a
doua cale menţionată.
În orice caz, concentraţia de prolină din interiorul celulelor este mai mică
decât cea a prolinei din mediul de cultură .
Eliberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea enzimelor celulare în
mediu. Bacteriile propionice singure hidrolizează încet cazeina, dar producerea de
prolină în brânzeturi este sporită prin dezvoltarea anterioară sau concomitentă a
bacteriilor lactice. Viteza formării prolinei la valorile pH şi concentraţia de NaCl atinsă
în brânza şvaiţer este temporar încetinită, dar maturarea prelungită anulează
efectele de inhibare ale pH-ului şi concentraţia de NaCl. Se consideră că ionii de
cupru ar inhiba producerea de prolină pe unele căi, această inhibare parţială fiind
benefică, deoarece permite evoluarea altor procese de aromatizare.
Producerea de diacetil şi acetoină . Bacteriile propionice pot produce
diacetil şi acetoină, cantităţile formate fiind mai mari la 21C decât la 32-37C.
Producţia de diacetil este urmată de reducerea acestuia la acetoină şi 2,3
butilenglicol. Cantitatea de diacetil creşte prin adaos de citrat, piruvat sau glucoză în
mediu de cultură. În culturile mixte de Str. lactis şi bacterii propionice, producţia de
diacetil se intensifică ca o consecinţă a scăderii pH-ului de către streptococi.
Bacteriile propionice produc şi alte substanţe care contribuie la aroma
brânzeturilor: aldehidă acetică, aldehidă propionică, alcool etilic, alcool propilic,
dimetilsulfură, acid izovalerianic.
Alte activităţi metabolice. Bacteriile propionice pot avea şi activitate
proteolitică şi lipolitică.
Bacteriile propionice pot contribui într-o măsură mai mică la activitatea
proteolitică din brânza Şvaiţer prin enzimele proteinazice (~12 enzime) şi peptidazice
(~ 7 enzime), dar activitatea proteolitică a bacteriilor propionice este inferioară
bacteriilor lactice (L. bulgaricus, L. helveticus, Str. thermophilus).
Bacteriile propionice pot contribui şi la lipoliza trigliceridelor, eliberând acizi graşi cu
lanţ lung, dar această activitate lipolitică este nesemnificativă.

DROJDIILE, ciuperci unicelulare care se înmulţesc prin înmugurire, mai rar


prin sciziparitate şi care formează ascospori (sunt şi drojdii care nu formează spori,
acestea denumindu-se drojdii/false torule şi micoderme), sunt agenţi tipici ai
fermentaţiei alcoolice.
Se prezintă sub formă de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces
cerevisiae), eliptice (Saccharomyces elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces
pasteurianus), de forma unei lămâi (Saccharomyces apiculans), de forma unei sticle
(Saccharomyces ludwigii) sau sub formă de cilindru (Pichia).
Dintre drojdii interesează (în sens util) cele aparţinând familiei
Saccharomycetaceae, genul Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene
folosite în industria berii, vinului, pâinii, spirtului, genul Kluyveromices care
fermentează lactoza, genul Debaryomices care se utilizează în industria cărnii.
Mai interesează drojdiile familiei Cryptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis)
care se folosesc ca agenţi de fermentare şi producători de biomasă.
Utilizări ale drojdiilor
1. Utilizarea pentru fermentarea alcoolică Pentru fermentaţia alcoolică se folosesc
drojdiile adevărate care aparţin genului Saccharomyces (Meyen) Ress şi care se
caracterizează prin aceea că nu formează micelii tipic, produc 1-4 spori, iar puterea
de fermentare depăşeşte puterea de respiraţie. Sunt adaptate la condiţii de
anaerobioză şi prin urmare nu formează voaluri la suprafaţă.
După modul de comportare în timpul fermentaţiei drojdiile pot fi:
 de fermentaţie superioară care se ridică în cantităţi mari la suprafaţa
lichidului de fermentare sub forma unui strat gros de spumă care se păstrează astfel
până la sfârşitul fermentării. După sedimentare aceste drojdii rar dau un precipitat
dens. Au optim de temperatură la 28…30C şi fermentează 1/3 din rafinoză. În
categoria drojdiilor de fermentare superioară se încadrează cele care produc
fermentarea alcoolică în cazul obţinerii alcoolului etilic, pâinii şi unele suşe pentru
bere (Saccharomyces cerevisiae);
 de fermentaţie inferioară care se dezvoltă în lichidul fermentat, nu se ridică la
suprafaţă în spumă, dar formează flocoane şi se sedimentează repede. Au optim la
temperatura de 8…12C şi fermentează complet rafinoza. Drojdiile de fermentare
inferioară se folosesc la obţinerea berii, vinului, cidrului (Saccharomyces
carlsbergensis, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini, Saccharomyces
uvarum).
Fermentaţia alcoolică produsă de drojdii este influenţată de:
- concentraţia zahărului fermentescibil din mediu;
- temperatură ;
- conţinutul în alcool din substrat;
- felul drojdiei.
Concentraţia favorabilă de zahăr fermentescibil este de 10-15%. Fermentaţia
alcoolică se desfăşoară lent la pH 4-4,5, în mediu alcalin sensul fermentaţiei fiind
schimbat.
Viteza maximă de fermentare este la 30C, dar în practică se realizează la
4…28C. Alcoolul pe măsura acumulării în mediu devine toxic pentru drojdii. Există
drojdii care se dezvoltă la 16-18% alcool (Saccharomyces chevalieri Guilliermond,
Saccharomyces oviformis), însă în cele mai multe cazuri fermentaţia se opreşte la
12-14% (Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces
vini, Saccharomyces cerevisiae).
Odată cu creşterea temperaturii de fermentare se măreşte toxicitatea
alcoolului. Fermentaţia alcoolică este un proces anaerob. Prin trecerea la aerobioză,
drojdiile se înmulţesc rapid şi produc biomasă.
Fermentarea alcoolică nu este o fermentaţie pură. Se mai formează glicerină (
8% din totalul zaharurilor existente în mediu), acid lactic, acid acetic, substanţe
acetoinice (acetil metil carbinol = acetoină şi diacetil), acid malic, acid succinic, acid
propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric, alcooli superiori: izobutilic, izoamilic,
amilic, care provin din aminoacizii rezultaţi la degradarea substanţelor pectice din
musturi şi plămezi.
Aceşti alcooli superiori se formează prin reacţii de dezaminare şi
decarboxilare ale aminoacizilor leucină, izoleucină şi valină.
Fermentaţia alcoolică se aplică la:
 obţinerea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secară), produse
care conţin zaharoză (sfeclă, melasă), produse care conţin lactoză (zer), produse
care conţin glucoză (hidrolizate celulozice, leşii sulfitice);
 obţinerea berii şi vinului, cidrului inclusiv cvas din pâine, rom, whisky;
 obţinerea de băuturi fermentate pe bază de cereale şi leguminoase;
 obţinerea unor tipuri de produse lactate (chefir);
 obţinerea de băuturi fermentate pe bază de zer.
2. Utilizarea pentru obţinerea de biomasă (s-a menţionat anterior);
3. Utilizarea în industria cărnii, în care caz se foloseşte drojdia Debaromyces
hansenii care este tolerantă la NaCl, nu reduce NaNO 3 şi necesită oxigen atmosferic
pentru dezvoltare.
Se dezvoltă bine în straturile periferice ale salamurilor neafumate sau puţin
afumate. Această drojdie are capacitatea de a consuma oxigenul din pastă şi de a
distruge peroxizii produşi de bacteriile lactice. De regulă, Debaromyces hansenii se
foloseşte în combinaţie cu Staphylococcus carnosus şi Lactobacillus plantarum sau
Staphylococcus xilosus şi Lactobacillus sake. Se consideră că prin folosirea drojdiei
menţionate produsele capătă o aromă cu totul deosebită.
4. Utilizarea în industria laptelui La fabricarea brânzeturilor, drojdiile se dezvoltă la
suprafaţa brânzeturilor dar şi în interiorul brânzeturilor cu pastă moale sau cu
mucegai în pastă în timpul presării, zvântării şi maturării, având următoarele acţiuni
pozitive:
 consumă lactatul şi în acest fel contribuie la neutralizarea pastei, îmbunătăţind prin
aceasta consistenţa şi favorizând implantarea bacteriilor;
 produc factori de creştere pentru dezvoltarea bacteriilor;
 produc o peliculă de “acoperire” la anumite tipuri de brânzeturi;
 produc proteoliză şi lipoliză şi prin urmare contribuie la consistenţa şi aroma
brânzei respective;
 produc compuşi volatili de aromă.
Dintre drojdii, Candida hansei a fost cultivată în asociaţie cu lactobacili şi Str.
thermophilus, favorizând oxidarea lactatului, scăderea potenţialului de oxidoreducere
şi producerea de factori de creştere, precum şi dezvoltarea culturilor starter în care
este asociată. Drojdia Candida lipolitica este uneori folosită la fabricarea
brânzeturilor cu mucegai în pastă, datorită faptului că prin lipazele conţinute
realizează o hidroliză a lipidelor din brânză, fapt ce favorizează utilizarea acizilor
graşi de către Penicillium în reacţiile de -oxidare. Drojdia Torulopsis candida găsită
pe brânzeturi se dezvoltă bine în medii acide şi suportă concentraţii de NaCl până la
10%. Drojdia Candida kefir şi alte drojdii din granula de chefir realizează fermentaţia
alcoolică în produsul lactat acid dietetic chefir.
Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează la obţinerea de
lactază care are multe utilizări. Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se
utilizează la obţinerea de biomasă prin cultivare aerobă pe zer (procedeul Bell –
Franţa).
Kluyveromices fragilis şi Candida pseudotropicalis se utilizează pentru
obţinerea alcoolului etilic din zer (procedeul Carbery –Irlanda).

MUCEGAIURILE
Pentru industria alimentară interesează clasa Phycomycetes cu următoarele
genuri:
Genul Mucor şi Rhizopus aparţinând familiei Mucoraceae. Aceste
mucegaiuri care se întâlnesc pentru diferite produse vegetale şi alimentare, sub
formă de colonii pufoase, au o acţiune fermentativă netă.
Specii de Mucor şi Rhizopus se folosesc pentru:
- obţinerea unor produse alimentare fermentate în Orientul Îndepărtat, pe bază de
cereale şi leguminoase;
- în producţia de spirt prin zaharificarea amidonului (procedeul Amilo care foloseşte
Amylomyces rouxi – Mucor rouxianus);
- în producţia de enzime, în principal amilolitice şi proteolitice.
Din clasa Ascomycetes interesează ordinul Plectascales cu genurile
Aspergillus şi Penicillium.
Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizează în:
- producţia de şuncă în SUA şi Spania (mai puţin);
- obţinerea de produse fermentate tradiţionale în Orientul Îndepărtat (ceva mai
mult);
- obţinerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime pectolitice.
Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizează în:
- industria brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă şi în pastă (Penicillium camemberti
şi Penicillium roqueforti);
- industria cărnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium nalgiovensis şi Penicillium
exposus);
- obţinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice.
În industria cărnii, culturile de spori de mucegai se utilizează pentru
maturarea unor şunci, care se însămânţează cu spori de Penicillium netoxicogen, în
special P. nalgiovensis, P. exposum, şi P. chrysogenum, respectiv Country curred
ham şi Jambon Serano, care se însămânţează cu spori de Aspergillus glaucus şi a
unor tipuri de salamuri crude fabricate în România , Italia, Ungaria, Elveţia, Spania,
Franţa, Bulgaria; Austria, Belgia, Germania (şi mai puţin în SUA, Israel, Iugoslavia,
Polonia).
În cazul salamurilor crude afumate/neafumate, mucegaiurile de acoperire
contribuie la:
- reglarea eliminării apei din produs şi a schimbului de gaze;
- formarea aromei;
- îmbunătăţirea aspectului comercial al produsului.
Aroma este mai evidentă la salamurile cu diametru mai mic. Produsele pot fi
livrate cu mucegaiul de acoperire intact sau după “ periere”. Culoarea miceliului
rămas este dependentă de varietatea mucegaiului folosit: alb-ivorie (preferabilă în
Italia); gri (preferabilă în Ungaria); alb-mat (preferabilă în România).
Prin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprimă apariţia la suprafaţa
salamurilor a mucegaiurilor toxicogene, în special a celor producătoare de aflatoxine
precum şi a mucegaiurilor de “pătare” care produc spoturi de culoare verde sau
neagră.
Penicillium nalgiovensis Se utilizează spori de Penicillium nalgiovensis pentru
salamurile crude cu miceliu alb la suprafaţă. Sporii, în suspensie, se pulverizează la
suprafaţa produselor. După 3-4 zile de la însămânţare se formează micelii, iar după
5-6 zile de la însămânţare apar corpii de fructificaţie purtători de conidii. Temperatura
optimă de dezvoltare a mucegaiului este de 22-23C.
Penicillium nalgiovensis foloseşte ca substrat nutritiv glucidele dar are şi
activitate proteolitică şi lipolitică. Nu are activitate celulazică şi nu produce
micotoxine.
Penicillium expansum se dezvoltă bine la 22C şi umiditatea relativă a aerului
este de ~ 82% pentru sporulare şi ~ 88% pentru germinare. Dezvoltarea bună este
la  = 92-95%. Sporii pulverizaţi la suprafaţa batoanelor formează un miceliu pufos
în circa 8 zile de la însămânţare, maturizarea deplină având loc după 30 zile de la
însămânţare. Penicillum expansum nu produce micotoxine dacă substratul conţine
proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude).
În industria laptelui culturile de spori de mucegai se utilizează, aşa cum deja
s-a menţionat, la fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă cât şi cu mucegai la
suprafaţă (brânzeturi cu pastă moale).
Pentru brânzeturile cu mucegai în pastă (Brânza Roquefort, Gorgonzola,
Stilton, Gammelost) se utilizează spori de Penicillium roquefort. Pentru brânzeturile
de tip Camembert se utilizează sporii de la două specii de Penicillium: P. camemberti
şi P. caseicolum.
Mucegaiurile dezvoltate în/pe aceste brânzeturi au rol fundamental în:
- formarea aromei şi gustului;
- formarea consistenţei;
- definitivarea aspectului, procesele care intervin în formarea aromei şi consistenţei
fiind proteoliza, lipoliza şi -oxidarea acizilor graşi.
Suspensiile de spori se pot adăuga/folosi:
- în laptele destinat brânzeturilor sau amestecarea cu coagulul obţinut în cazul
brânzei cu mucegai în pastă;
- în laptele destinat fabricării brânzei, sau pulverizare la suprafaţa brânzei formate în
cazul brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă. Mucegaiurile mai importante pentru
industria laptelui sunt:
Penicillium roqueforti Thom se dezvoltă bine la 20-25C şi pH 4,5-7,5.
Tolerează concentraţii de 5-8% NaCl. Are activitate proteolitică, lipolitică şi de -
oxidare a acizilor graşi. Activitatea mucegaiului este stânjenită de prezenţa acidului
propionic în brânză, la concentraţii mari de 30% CO 2 în aerul depozitului. Pentru
intensificarea formării aromei se recomandă ca lipidele din lapte să fie în prealabil
lipolizate cu esterază pregastrică, astfel ca pe măsură ce mucegaiul sporulează,
acizii graşi liberi să fie -oxidaţi până la metilcetone. P. roqueforti se dezvoltă în
canalele şi golurile practicate în pasta brânzei, sporii formaţi având culoare verde
închis care conferă brânzei un aspect marmorat.
Penicillium camemberti şi Penicillium caseicolum Sporii acestor mucegaiuri
se utilizează în producţia brânzeturilor de tip Camembert incluzând Camembert,
Brie, Neufchatel, Coulommier, Garré de l’Est, Olivet.
Penicillium camemberti Thom (Penicillium album) se utilizează la brânzeturile
tip Camembert cu pastă mai untoasă, mai parfumată, de culoare gri – alburie.
Penicillium caseicolum Bainer (Penicillium candidum) se utilizează la
brânzeturile de tip Camembert cu pasta mai compactă, o aromă mai delicată, mai
discretă şi de culoare alb – imaculat.
La însămânţare prin pulverizare de spori la suprafaţă a brânzeturilor cu
umiditate ~ 55-60% se formează miceliile de mucegai care consumă din aciditatea
pastei, consecinţa fiind creşterea pH-ului începând cu a 12 –a zi, iar după 27 de zile
pH-ul rămâne constant.
Mucegaiurile din genul Penicillium au activitate endoproteinazică faţă de - şi
 cazeină, dar au şi activitate exopeptidazică importantă, fiind demonstrat faptul că
atât P. roqueforti cât şi P. camemberti sintetizează 2 endopeptidaze (o metal
proteinază şi o aspartil proteinază) precum şi două exopeptidaze cu acţiune carboxi-
şi aminopeptidazică, activitatea celor două grupe de enzime fiind relativ echivalentă
în stratul de suprafaţă al brânzeturilor.
Unele specii de Penicillium camemberti pot produce o micotoxinâ (acidul
ciclopiazonic, dar activitatea toxicogenă a mucegaiului este aproape nulă la
temperatura tehnologică de maturare a brânzei (14-16C).
La brânza Camembert se pot utiliza şi spori de Geotricum candidum care se introduc
în lapte. Geotricum reduce pericolul formării peptidelor amare, inhibă dezvoltarea lui
Penicillium, consumă acidul lactic şi deci contribuie la neutralizarea pastei, având şi
acţiune protolitică şi lipolitică. Brânza Camembert obţinută din lapte pasteurizat cu
adaos de Geotricum candidum are o aromă asemănătoare cu cea a brânzei
Camembert tradiţionale, adică fabricată din lapte crud.
3.2. Culturi starter
Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obţin plecând de la o
cultură pură stoc şi care prin trecere prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de
a fi folosite pentru producţia unor alimente fermentate. Culturile starter pot fi formate
numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe microorganisme.
Culturile starter de microorganisme sunt utilizate în vederea:
 dirijării unor procese biochimice prin care se asigură produsului un anumit grad de
inocuitate (inclusiv capacitatea de conservare);
 asigurării unor însuşiri senzoriale;
 asigurării, în unele cazuri, şi a unor însuşiri nutritive.
La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie să se aibă în
vedere următoarele:
 să conţină un anumit număr de microorganisme viabile (g/ml) şi un număr cât mai
redus de germeni nedoriţi;
 produşii metabolici, primari şi secundari, să nu prezinte pericol pentru sănătatea
oamenilor;
 să nu conţină şi să nu producă antibiotice care se utilizează în scop terapeutic la
oameni;
 să aibă o anumită (anumite) activităţi specifice: de producere a acidului lactic, de
reducere a azotului etc;
 microorganismele existente în cultură să fie declarate cu numele ştiinţific întreg;
 speciile (suşele) noi care se introduc în producţie, trebuie să fie înregistrate la MS
şi să fie depozitate în colecţii cu nomenclator; înainte de utilizare în producţie să fie
testate din punct de vedere al inocuităţii în conformitate cu legislaţia în vigoare;
 suşele declarate a fi sigure trebuie controlate la intervale regulate de către institute
specializate, în ceea ce priveşte puritatea lor;
 speciile, care pe baza noilor cunoştinţe ştiinţifice au fost recunoscute ca având
potenţial patogen sau toxicogen, trebuie să fie supuse unui control riguros pentru
fiecare suşă, realizându-se studii de toxicitate pe termen lung, de carcinogenitate şi
mutagenitate.
Toate cele menţionate trebuie să se constituie ca o obligativitate absolută
deoarece:
 culturile starter se pot consuma în stare vie, odată cu produsul alimentar, aşa cum
este cazul produselor lactate acide, brânzeturilor, salamurilor şi cârnaţilor cruzi, a
unor sortimente de bere, a unor produse vegetale: varză murată, castraveţi muraţi,
gogonele murate, măsline verzi;
 culturile starter se pot consuma după distrugerea lor, rămânând în produsul
alimentar atât ele cât şi produşii lor de metabolism, aşa cum este cazul brânzei
proaspete de vaci şi a iaurtului care au fost pasteurizate, brânzeturilor topite,
produselor de panificaţie etc.;
 produşii de metabolism ai culturilor starter se consumă odată cu produsele
alimentare, însă microorganismele sunt eliminate în cea mai mare parte, aşa cum
este cazul berii, vinului, alcoolului, oţetului, acidului citric, acidului lactic etc.
Culturi starter de bacterii lactice
Culturile starter de bacterii lactice sunt folosite în diferite domenii: industria
laptelui, cărnii, produselor vegetale murate, industria vinului, industria panificaţiei,
industria sucurilor de fructe şi legume fermentate etc.
Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigură produselor alimentare în
care se introduc un anumit grad de inocuitate. Această asigurare este realizată
deoarece bacteriile lactice produc:
 acizi organici, în principal acid lactic, dar şi acid acetic, alcool, CO 2;
 substanţe bacteriocine eliberate în mediul de cultură;
 peroxizi organici (H2O2).
În plus, bacteriile lactice intră în competiţie cu microorganismele patogene şi
cele de alterare în ceea ce priveşte consumul de substanţe nutritive, iar datorită şi
acidifierii mediului, consecinţă a acumulării acizilor organici, bacteriile patogene şi de
alterare sunt inhibate în dezvoltarea lor. Dintre bacteriile patogene sunt inhibate
stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl. botulinum etc.
Datorită acidităţii se inhibă şi dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitică
şi decarboxilazică, deci se formează cantităţi mai reduse de amine biogene, iar în
cazul cărnurilor sărate în prezenţă de azotiţi, datorită acidităţii se favorizează
descompunerea mai completă a azotiţilor, deci scade producţia de nitrozamine, mai
ales la produsele care se supun coacerii şi prăjirii.
Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub formă de produse
lactate dietetice acide sunt benefice pentru sănătatea oamenilor deoarece:
 aciditatea lactică favorizează acţiunea pepsinei ce produce hidroliza proteinelor,
respectiv coagularea cazeinei laptelui care este în continuare degradată de tripsina
pancreatică;
 aciditatea mediului intestinal blochează dezvoltarea microflorei cu activitate
patogenă şi favorizează implantarea bifidobacteriilor cu consecinţe pozitive pentru
organismul uman (vezi capitolul probiotice).
În legătură cu bacteriocinele, în continuare se fac următoarele precizări:
- bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram negative;
- bacteriocinele sunt proteine şi activitatea lor dispare prin hidroliza lor de către
proteaze;
- bacteriocinele au acţiune bactericidă, dar nizina este şi bacteriostatic. Multe
bacteriocine sunt bacteriostatice la aplicarea lor în produsele alimentare;
- bacteriocinele sunt excretate în mediu în cea mai mare parte; o mică parte rămân
în celulele bacteriene;
- bacteriocinele diferă de antibiotice prin natura speciilor şi suşelor producătoare,
modalităţile de producere şi natura lor chimică;
- bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din culturile starter sau de protecţie au
un spectru de acţiune relativ limitat în raport cu mai multe specii sau mai multe suşe
ale aceleiaşi specii.
- bacteriocinele sunt sensibile la acţiunea enzimelor proteolitice metabolice, ceea ce
înseamnă că ingerarea de produse ce conţin bacteriocine nu modifică microbiota
tractului intestinal şi nu va conduce la riscuri în ceea ce priveşte folosirea de
antibiotice comune;
- bacteriocinele sunt stabile la căldură, deci rezistă în laptele pasteurizat la
63C/30s minimum sau la 72C/15 s; rezistenţa lor termică se datorează structurii
moleculare simple (excepţie face helveticina J care are o structură proteică mai
elaborată);
- bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid, ceea ce înseamnă că sunt
adaptate la condiţiile de mediu ale bacteriilor producătoare;
- eficacitatea bacteriocinelor în produsele fermentate este limitată de condiţiile de
conducere a fermentaţiei (temperatură, pH, aw)
Culturi starter utilizate in industria laptelui
La obţinerea culturilor starter trebuie să avem în vedere în mod deosebit
următoarele:
- mediul de cultură (laptele);
- tratamentul termic aplicat laptelui;
- condiţiile de incubare;
- interacţiunile dintre speciile/tulpinile din cultura starter;
- eventualele infectări cu bacteriofagi;
- instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.
De la început, facem precizarea că prin cultură starter înţelegem culturile
obţinute din cultura pură stoc (inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt
folosite la fabricarea unor produse lactate acide, smântână, unt, brânzeturi.
Culturile starter de bacterii lactice utilizate în industria laptelui pot fi clasificate în
mezofile şi termofile.
Culturile starter mezofile, care la rândul lor, pot fi clasificate în:
a) Culturi starter singulare (single strain starter) care conţin numai Str. lactis subsp.
lactis şi respectiv Str. lactis subsp. cremoris (Lactococcus lactis şi Lactococcus
cremoris) ambii homofermentaticvi care produc acid lactic (L+) în proporţie de 0,8%.
Folosirea acestor culturi starter singulare a apărut ca o necesitate de a se evita
formarea “ochiurilor” de fermentare la unele brânzeturi, “ochiuri” formate în urma
producerii de CO2 de către bacteriile aromatizante.
Culturile starter singulare mezofile prezintă următoarele avantaje:
- se poate utiliza continuu aceeaşi cultură cu activitate relativ constantă şi previzibilă;
- nu este necesară alternarea culturilor, eliminându-se riscul deprecierii acestora de
către fagi,
- se folosesc cantităţi mai mici de inoculum pentru obţinerea de cultură primară şi
secundară;
- influenţele compoziţionale sezoniere ale laptelui sunt mai reduse;
- se creează condiţii de realizare a unei producţii standardizate de produse lactate
de calitate superioară;
- cultura poate fi controlată şi supravegheată din punct de vedere al caracteristicilor
sale (sensibilitate la fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei, aglutinarea şi
eventual lisogenia).
Culturile starter singulare mezofile prezintă însă următoarele dezavantaje:
- pot fi depreciate de tulpinile producătoare de bacteriocine;
- pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la liză fagică;
- pot suferi pierderi de plasmide şi deci pot pierde una sau mai multe din funcţiile lor.
b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazează pe folosirea a
5-6 tulpini selecţionate, neînrudite pe plan fagic şi cultivate separat până la stadiul de
cultură primară sau chiar până la stadiul de cultură starter de producţie când se
amestecă între ele. În aceste condiţii, tulpinile nu se dezvoltă împreună decât cel
mult timp de 10 generaţii, ceea ce face ca nici o tulpină să nu devină dominantă.
Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni în şir fără a-şi pierde
capacitatea de acidifiere.
c) Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt formate, de regulă, din două
tipuri de bacterii lactice:
- bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str. cremoris;
- bacterii lactice producătoare de aromă: Str. diacetilactis (Lactococcus lactis var.
diacetilactis) sau specii de leuconostoci.
După tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte mezofile pot fi
clasificate în următoarele grupe:
 culturi starter mixte tip L care conţin numai specii din genul Leuconostoc:
Leuconostoc cremoris (citrovorum), Leuconostoc dextranicum şi/sau Leuconostoc
lactis care sunt toţi heterofermentativi şi produc acid lactic D(-);
 culturi starter mixte de tip D care conţin Str. lactis biov. diacetilactis ca singură
specie producătoare de aromă;
 culturi starter mixte tip LD care conţin atât specii de leuconostoci cât şi Str. lactis
subsp. diacetilactis ca producători de aromă.
La folosirea culturilor starter mixte trebuie să avem în vedere că:
- streptococii acidifianţi mezofili homofermentativi produc acid lactic din lactoză;
- leuconostocii, cei heterofermentativi, şi Str. lactis subsp. diacetilactis
(homofermentativ) produc diacetil şi acetoină din citrat, dar produc şi acid lactic,
acetic prin fermentarea lactozei şi glucozei;
Culturi starter termofile
Culturile starter termofile pot fi:
 acidifiante: Lactobacillus acidophilus;
 acidifiante/aromatizante care la rândul lor pot fi constituite din unul sau mai multe
specii de lactobacili şi dintr-o specie de streptococi. În această direcţie amintim:
- cultura starter termofilă pentru iaurt: Lactobacillus bulgaricus şi Str. therrmophilus;
- cultura starter termofilă pentru brânzeturi: Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus
lactis + Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Această cultură starter se
foloseşte la fabricarea brânzeturilor cu pastă tare şi semitare, deci la care se practică
încălzirea a doua a bobului de coagul.
Utilizarea culturilor starter termofile este benefică deoarece:
 produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui şi determină coagularea acestuia (cazul
iaurtului); la brânzeturi acidifierea favorizează eliminarea zerului din coagul;
 au activitate proteolitică şi prin urmare contribuie la ameliorarea proprietăţilor
reologice şi la aroma produselor fermentate; ca urmare a activităţii proteolitice
rezultă şi aminoacizi din proteine care stimulează dezvoltarea celorlalte bacterii din
culturile starter termofile;
 produc şi compuşi de aromă, dar în principal aldehidă acetică, acetonă, precum şi
urme de acetoină;
 produc şi substanţe cu caracter filant care influenţează vâscozitatea produsului
(Str. thermophilus în cultura pentru iaurt);
 produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus casei etc.);
 produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).
Având în vedere cantităţile mari de iaurt ce se fabrică pe plan mondial, este
necesar să cunoaştem factorii care influenţează performanţa optimă a culturilor
pentru iaurt. Aceşti factori se referă la:
 temperatura de incubare care este de 41-42C (apropiată de temperatura optimă
de dezvoltare a lui Lactobacillus bulgaricus ). După 3 ore de incubare se ajunge la ~
500 mil bacterii/g, raportul dintre L. bulgaricus şi Str. thermophilus fiind 1/1;
 tratamentul laptelui – pasteurizarea influenţează pozitiv dezvoltarea lui L.
bulgaricus prin:
- modificarea structurii proteinelor;
- eliminarea parţială a oxigenului şi realizarea unei microaerofilii propice;
- distrugerea inhibitorilor din lapte;
- formarea de acid formic care favorizează dezvoltarea culturii;
 disponibilitatea substratului Laptele este un bun substrat dar trebuie arătat că
Lactobacillus bulgaricus are preferinţă faţă de glucoză şi deci ar trebui ca lactoza
să fie prehidrolizată la -galactozidaza;
 metaboliţi produşi în mediu. Lactobacillus bulgaricus produce H2O2 în mediul de
cultură şi deci adausul de catalază va stimula producţia de acid lactic de către Str.
thermophilus care este mai sensibil la H2O2 decât Lactobacillus bulgaricus. Laptele
destinat iaurtului nu trebuie să fie agitat prea mult ca să nu includă aer (oxigen) care
ar strica condiţiile de microaerofilie pentru L. bulgaricus şi ar deveni toxic pentru Str.
thermophilus. Lactobacillus bulgaricus se apără de acţiunea oxigenului prin
intermediul manganului intracelular care înlocuieşte acţiunea superoxiddismutazei;
 interacţiunile dintre bacterii din cultura pură (inoculum) sau cultura starter. Între
cele două microorganisme există un sinergism deosebit. Lactobacillus bulgaricus
produce aminoacizi din cazeină care sunt necesari dezvoltării lui Str. thermophilus
care, la rândul său, favorizează dezvoltarea lui L. bulgaricus prin producerea de acid
formic şi CO2;
 calitatea laptelui ca substrat de fermentare. Acesta nu trebuie să conţină
antibiotice, substanţe conservante, dezinfectante şi să provină de la animale
sănătoase cu maximum 400000 leucocite/ml.

Controlul culturilor starter de bacterii lactice


Controlul culturilor starter implică următoarele determinări:
 examenul microscopic care trebuie să arate raportul dintre coci şi bacili, raport care
trebuie să se situeze în limitele 1/1-1,5/1;
 activitatea acidifiantă care se urmăreşte prin determinarea acidităţii titrabile atunci
când cultura se află în fază logaritmică. În acest fel se pot pune în evidenţă culturile
“rapide” şi “lente” (fast and slow);
 rezistenţa la aciditate, ţinându-se seama că Lactobacillus bulgaricus rezistă până
la ~ 1,7% aciditate iar Str. thermophilus până la 0,8%. Rezistenţa la aciditate se
urmăreşte prin determinarea supravieţuitorilor după ce în mediul de cultură se
atinge o aciditate critică;
 rezistenţa la răcire care este importantă pentru produsele lactate ce se
congelează (iaurt, îngheţata de iaurt). Rezistenţa la răcire se urmăreşte la – 6  -
9C şi apoi la -18C sau -25C ;
 producerea de substanţe filante care constă în măsurarea vâscozităţii pe o probă
inoculată de lapte cu 12% s.u., cu adaos de CaCl 2 0,012%, incubată 4 ore/37C
până ce se atinge un pH de 4,2-4,3. Se pot depista în acest fel culturile filante;
 activitatea proteolitică se poate urmări pe o cultură păstrată la 4C la care se
determină tirozina sau aminoacizii liberi prin metoda formol titrimetrică;
 activitatea lipolitică se poate determina prin măsurarea indicelui de aciditate din
grăsimea culturii (lapte);
 proprietăţile senzoriale se determină la culturile de 24-48 ore la 20C (se pot
determina şi substanţele de aromă respectiv diacetilul, acetaldehida, acetoina).

CULTURI STARTER CONCENTRATE DE MICROORGANISME

Definiţie
Culturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi dezvoltate în condiţii
controlate, concentrate într-un volum mic şi conservate prin congelare sau uscare în
vederea depozitării şi transportului.
Culturile concentrate pot fi de bacterii, drojdii, spori de mucegai. În ceea ce
priveşte culturile starter concentrate de bacterii cele mai des utilizate sunt culturile
de bacterii lactice. Pe lângă acestea se folosesc şi alte culturi de bacterii
concentrate: micrococi, pediococi, stafilococi, streptomicii, bacterii propionice etc.
Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru:
 obţinerea culturilor starter de producţie (maiele de producţie);
 obţinerea produselor fermentate prin utilizare directă în lapte, compoziţii
carnate etc.
Indiferent de domeniul de utilizare, culturile starter concentrate pot fi obţinute prin
două procedee:
 procedeul de cultivare periodică;
 procedeul de cultivare continuă.
Tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate
Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii de bază:
 inocularea mediului de cultură cu microorganismul din cultura stoc;
 incubare pentru multiplicare la nivel maxim;
 concentrarea mediului împreună cu celulele sau separarea celulelor, de regulă
prin centrifugare şi resuspendare într-un lichid adecvat,
 conservare prin congelare şi uscare;
 depozitare în stare congelată şi uscată.
În tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate trebuie ales un mediu
de cultură care să asigure toate substanţele pentru dezvoltarea (multiplicarea)
culturii, realizându-se un control riguros al temperaturii şi menţinerii pH-ului la valori
optime.
Pentru eventuala neutralizare a acidităţii se utilizează hidroxid de amoniu
şi/sau hidroxid de calciu.
Conservarea prin congelare a concentratului de microorganisme se face în
două moduri:
- sub formă lichidă, în care caz, concentratul de bacterii se suspendă într-un
antigel solubil în apă (alcooli polihidrici) care se utilizează în proporţie de 40-50%
faţă de concentrat. Congelarea se face la -40C (de fapt se realizează o subrăcire).
Acest gen de conservare prezintă următoarele avantaje:
 se împiedică acţiunea dăunătoare a gheţii asupra celulelor de bacterii;
 manipularea concentratului este mai uşoară;
 concentratul se poate încălzi până la temperatura de utilizare chiar în timpul
manipulării fără ca celulele să-şi piardă viabilitatea şi activitatea;
- congelarea în azot lichid (-196C) în care caz concentratul se amestecă cu
un agent crioprotector: 10% glicerol, 7,5% lactoză în cazul bacteriilor lactice.
Pentru culturile starter concentrate de pediococi s-a propus ca la concentrat
să se adauge agenţi de stabilizare cum ar fi: glicerolul, lapte praf degresat, extract
de malţ, metalglicerofosfaţi alcalini, glutamat monosodic, acid glutamic, cistină şi/sau
dextran. Amestecul respectiv se introduce în pungi de plastic care se congelează în
azot lichid.
Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face:
a) la temperaturi de –20…-40C;
b) la temperatura de -196C (în azot lichid);
- conservarea prin reducerea conţinutului de apă se face prin liofilizare, în
care caz concentratul de bacterii se amestecă cu un suport adecvat (lapte praf
degresat, lactoproteine pulbere lactoză, zaharoză) după care se liofilizează. La
liofilizare (faza de desicare secundară) temperatura produsului nu trebuie să
depăşească 40-45C. După liofilizare se face ambalarea sub vid sau în atmosferă
de gaz inert. Depozitarea produselor liofilizate trebuie să se facă la temperaturi
scăzute (-18C).
Culturile starter concentrate trebuie să conţină între 2,5·10 10 – 5,5·1010 celule
viabile-active/ g sau ml.

Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii lactice în industria


laptelui
Culturile starter concentrate de bacterii lactice care se folosesc în industria
laptelui sunt acelea destinate:
 pentru brânza Cheddar, brânzeturi tip italian şi elveţian;
 pentru brânza de vaci, smântână, lapte bătut, iaurt.
Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice în
industria laptelui sunt arătate în tabelul de mai jos.

Tab. 14. Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii


acterii lactice
Avantaje Dezavantaje
 Activitatea culturilor poate fi controlată şi  Necesită spaţii de depozitare la
supravegheată înainte de expediere temperaturi scăzute atât la producător cât
 Se elimină operaţiile de întreţinere şi de şi la cumpărător pentru păstrare până la
preparare a maielelor intermediare (primară, folosire
secundară, terţiară)  Concentrarea nu este posibilă la toate
 Se face economie la forţa de muncă culturile starter
 Se pot stabili uşor sistemele de rotaţie în  Depozitarea în stare congelată sau
vederea evitării infecţiei cu bacteriofagi uscată, în funcţie de timp, poate conduce
 Se obţin produse de calitate mai constantă la micşorarea drastică a numărului de
 Se scurtează procesele tehnologice ale celule viabile
fabricării produselor prin accelerarea  Culturile pot să fie influenţate negativ în
acidifierii, deoarece se suprimă faza de ceea ce priveşte unele plasmide ce
dezvoltare logaritmică în laptele de fabricaţie codifică anumite funcţiuni

Culturi starter concentrate de bacterii propionice pentru industria


laptelui
Mediul de cultură pentru realizarea culturilor starter concentrate de bacterii
propionice poate fi laptele degresat cu adaos de 1% tripticază, 1% extract de drojdie
ca sursă de vitamine şi factori suplimentari de creştere 1% lactat de sodiu; 0,025%
KH2PO4; 0,0005% MnSO4. Mediul de cultură se ajustează la pH = 7,0 şi se
sterilizează.
Incubarea mediului de cultură inoculat cu bacterii propionice din cultura stoc
se face la 32C/3 zile.
Dacă mediul de cultură conţinând bacterii propionice dezvoltate după
incubare se utilizează ca o cultură (maia) de producţie, atunci dezvoltarea bacteriilor
propionice se opreşte înainte de coagularea laptelui, deoarece în stare de coagul,
cultura starter se repartizează greu în laptele destinat fabricării brânzeturilor.
Celelalte operaţii de obţinere a culturii starter concentrate de bacterii
propionice sunt aceleaşi ca cele descrise la celelalte tipuri de culturi starter
concentrate.
Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice se face la 5C
în care caz celulele îşi păstrează viabilitatea şi activitatea 8 săptămâni. Depozitarea
la 25C poate fi făcută pentru cel mult 2 săptămâni.
Culturile starter concentrate se adaugă direct în laptele destinat fabricării
brânzeturilor (deci nu se mai folosesc obţinerea de culturi intermediare).
Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii în industria cărnii
Culturile starter concentrate de bacterii folosite în industria cărnii pot fi
singulare sau în amestec. Ele pot fi formate din bacterii lactice (L. plantarum, L.
sake, L. pentosus, L. alimentarius), pediococi (P. acidilacti, P. pentosaceus),
stafilococi (S. carnosus, S. xilosus), micrococi (M. varians), streptomicii
(Streptomyces griseus).
În literatura de specialitate sunt menţionate următoarele culturi starter
concentrate de bacterii singulare sau în amestec:
 S. carnosus
 S. carnosus + P. pentosaceus;
 S. xylosus + P. pentosaceus;
 M. varians;
 M. varians + P. pentosaceus + P. acidilacti;
 M. varians + P. pentosaceus;
 S. carnosus + Streptomyces griseus.
Culturile starter de micrococi sau stafilococi sunt recomandate la maturarea
lentă a salamurilor crude unde se realizează o scădere lentă a pH-ului şi deci
consistenţa produsului se realizează în timp. Gustul acestor produse este puţin
acrişor (pH 5,6-6,1).
Culturile starter mixte (micrococi/stafilococi/lactobacili) se utilizează la
maturarea rapidă a salamurilor crude în care caz realizarea consistenţei merge
paralel cu acidifierea.
Culturile starter concentrate de utilizare în industria cărnii pot fi livrate în stare
lichidă subrăcită sau uscată. Adaosul în compoziţie trebuie să asigure o concentraţie
de cel puţin 106-107/g pastă. Modul de folosire al culturilor starter concentrate este în
funcţie de modul lor de conservare. Cele congelate în antigel se utilizează ca atare;
cele liofilizate se suspend în apă pentru o distribuţie mai uniformă în compoziţie.
Culturile starter concentrate de bacterii lactice pentru industria cărnii nu se
amestecă cu sare, condimente, acid ascorbic, acizi alimentari şi nici nu se păstrează
în amestec cu substanţele menţionate deoarece se inactivează rapid.
De asemenea trebuie să se aibă în vedere două situaţii particulare:
 Folosirea culturilor starter concentrate în pasta cu adaos de GDL (glucono delta
lactona). În condiţiile folosirii GDL pH-ul pastei scade rapid, proteinele sunt aduse la
pH izolelectric şi pierd apa de hidratare, azotitul de reduce bine la NO, se
favorizează dezvoltarea bacteriilor lactice care produc şi H 2O2. Acidifierea rapidă
împiedică însă dezvoltarea micrococilor care sunt necesari dacă se lucrează cu
NaNO3. La folosirea GDL este deci recomandat să se folosească culturi starter
concentrate de stafilococi care produc catalază, reduc azotatul la azotit şi se pot
dezvolta la pH 4,7 fiind şi un bun producător de aromă;
 Folosirea culturilor starter în pasta cu adaos de uleiuri eterice. Aceste uleiuri eterice
au acţiune bacteriostatică, mai ales dacă solventul lor este şi alcoolul etilic şi, deci,
inhibă culturile starter. În acest caz se recomandă să se folosească o cantitate mult
mai mare de cultură starter, pe de altă parte uleiurile eterice să fie încapsulate.
Culturile starter concentrate folosite în industria cărnii trebuie să
îndeplinească următoarele condiţii:
- să fie tolerante la NaCl (concentraţie 2,5-3%);
- să se dezvolte bine în saramura de concentraţie 6%;
- să se dezvolte bine în prezenţă de 80-100 mg NaNO 2/kg compoziţie dar să
acţioneze şi la temperatură mai scăzută (14-24C);
- să producă numai acid lactic (culturile starter concentrate de bacterii lactice să
cuprindă numai specii homofermentative);
- să fie puţin lipolitice şi proteolitice;
- să nu producă mirosuri şi gusturi nedorite din cauza produşilor secundari de
metabolism;
- să fie nepatogene (să nu producă infecţii şi să nu producă toxine);
- să se adapteze compoziţiei de carne utilizată şi condiţiilor de fermentare a
produselor, respectiv la creşterea concentraţiei de NaCl, la temperatura de afumare
rece şi de uscare, de activitate a apei care scade progresiv pe măsura uscării
produsului;
- să producă catalază şi nitratreductază (cele cu micrococi, streptomicii, stafilococi);
- să fie inactivate la 57-60C.
Folosirea culturilor starter concentrate de bacterii (în special lactice şi
pediococi) prezintă următoarele avantaje:
- se micşorează durata de maturare a produselor carnate;
- se îmbunătăţesc proprietăţile senzoriale (gust, miros, consistenţă);
- se asigură un grad înalt de inocuitate produsului carnat (salamurile şi cârnaţi cruzi)
prin controlul dezvoltării microorganismelor patogene şi de alterare şi prin limitarea
folosirii unor substanţe cu caracter toxic (amine şi nitrozamine).
Lactobacilii din culturile starter concentrate produc în compoziţia salamurilor
crude următoarele efecte:
 acidifierea pastei cu următoarele consecinţe:
- scăderea pH-ului şi deci aducerea proteinelor la punctul izoelectric deci şi la starea
de hidratare minimă, favorizându-se în acest fel uscarea;
- reducerea mai rapidă şi mai completă a NaNO2;
- inhibarea microorganismelor patogene: Staphilococcus aureus, Salmonella, Cl.
botulinum;
 producerea de substanţe de aromă;
 controlul producţiei de amine biogene prin inhibarea bacteriilor cu activitate
decarboxilazică (inhibare prin competiţie faţă de nutrienţi şi, respectiv, prin
acidifiere);
 controlul producţiei de nitrozamine (aciditate formată, respectiv pH-ul scăzut
favorizează transformarea NaNO2 în NO şi deci rămâne în produs o cantitate mai
mică de NaNO2 care ar putea intra în combinaţie cu aminele secundare pentru a
forma nitrozaminele;
 controlul microflorei de alterare şi patogene prin producţia de H 2O2, bacteriocine.
Pediococii din culturile starter concentrate produc în compoziţia salamurilor
crude următoarele efecte:
 acidifierea mai redusă a pastei la temperaturi mai ridicate fără formarea de produşi
care să afecteze negativ gustul şi mirosul;
 producerea de H2O2, bacteriocine cu acţiune inhibitoare faţă de microorganismele
patogene.

Culturi starter concentrate de spori de mucegai


Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii:
 prepararea mediului de cultură, sterilizarea acestuia şi repartizarea în eprubete
(agar înclinat);
 însămânţarea mediului în eprubete cu spori de mucegai ce se doreşte a se cultiva;
 termostatare pentru germinare spori cu organe purtătoare de spori şi sporulare;
 preluare spori cu 2 ml ser fiziologic 0,8% şi însămânţare medii de cultură Czapek
cu 2% agar aflate în vase Roux;
 recoltare spori din vase Roux cu ser fiziologic 0,8% astfel ca să se asigure în
suspensie 108-1010 spori/ml;
 păstrare suspensie la 0-4C.
Cultura cu spori de mucegai concentrată poate fi livrată şi sub formă de
emulsie liofilizată, emulgatorul fiind polietilsorbitanul .
Se pot realiza culturi starter concentrate de spori cu mucegaiurile utilizate în
industria laptelui şi cărnii, utilizarea lor fiind în funcţie de produsul alimentar în care
se foloseşte cultura respectivă de spori de mucegai.
Pentru industria cărnii, la utilizare suspensia de spori de mucegai concentrată
se diluează cu apă fiartă şi răcită în raport de 1/3.