2º Trimestre: Técnicas Generales de Laboratorio

TEMA 5. LIMPIEZA, DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN

El material que usamos en el laboratorio se ensucia y se contamina, si la suciedad y
los microorganismos no se eliminan adecuadamente, podemos:

● obtener resultados erróneos (los restos pueden reaccionar con los productos).
● obtener lecturas inexactas (la suciedad ocupa volumen en el material).
● contaminar con gérmenes.

Para evitar estos riesgos, tenemos dos opciones:

1. Utilizar material desechable.

2. Lavar el material utilizado, desinfectarlo o si fuese necesario, esterilizarlo.

Conceptos:

● La asepsia: es la ausencia de contaminación o suciedad

● La antisepsia: es la técnica utilizada para combatir la suciedad
● Antiséptico: Sustancia química empleada para prevenir o inhibir el crecimiento
de los microorganismos.
● Desinfección: es la destrucción, inactivación de aquellos microorganismos que
pueden causar infección u ocasionar otros efectos indeseables. La desinfección
no implica necesariamente esterilización.
● Descontaminación: proceso para lograr que una persona, objeto o entorno esté
libre de microorganismo, radioactividad u otros contaminantes.
● Esterilización: es la destrucción o eliminación total de microorganismos
incluyendo las esporas.

1. LIMPIEZA

Es el procedimiento mediante el cual se retira la suciedad de microorganismos.

1.1 Limpieza manual

Es realizada a mano con guantes.

o Lavar con agua (o agua jabonosa) ayudándonos de cepillos si fuese

necesario para facilitar el arrastre.
o Aclarar varias veces con agua del grifo.
o Realizar el último aclarado con agua destilada.
o Dejar secar el material (escurrir o utilizar estufa de secado).
 1.2 Limpieza automática

Se realiza con maquinas añadiendo detergentes.

1.3 Limpieza de material de vidrio

Según la suciedad se realizará de distintos modos:

▪ Poco sucio:
➢ Lavar con agua y jabón, y con ayuda de esponjas y escobillas que no
rallen.
➢ Aclarar con abundante agua del grifo (varias veces).
➢ Enjuagar con arrastre mínimo tres veces, se puede utilizar agua caliente o
tibia (excepto con material volumétrico, éste está calibrado a 20ºC, y a
mayor temperatura y con restos de sangre, ésta se coagula y se adhiere al
material.
➢ Para comprobar que está sucio, en el enjuague final de agua destilada, no
deben quedar gotas adheridas.
▪ Muy sucio​, entre otros encontramos:
➢ Jabones específicos​: Se sumerge el material durante varias horas en una
disolución con este tipo de jabón, enjuagar con agua del grifo y finalmente
con agua destilada. Este es adecuado para la limpieza de vidrio en
general.

➢ Potasa alcohólica​: Solución de hidróxido potásico al 20% en alcohol etílico,

empleada para retirar residuos de grasa. El material se llena un tercio con
esta disolución, se agita y se deja actuar durante unos minutos, se enjuaga
varias veces con agua destilada y se deja secar.

Ejemplos de limpieza:

▪ Pipeta​: se introducen en un recipiente con agua jabonosa durante un

tiempo, se aclara con agua del grifo hasta retirar el jabón y por último se
realiza el ​curado*​ de la pipeta.
Otro modo es utilizando el pipetero, consta de dos recipientes y un cestillo
perforado donde se colocan las pipetas, un recipiente contiene la solución
agua jabonosa, y el otro sirve para aclarar (éste consta de dos tabuladoras,
una va conectada al grifo y otra para que salga el agua). Tras su uso, se
sacan las pipetas y se enjuagan tres veces con agua destilada. Para
secarlas, se colocan en el porta pipetas en posición invertidas.

▪ Buretas​: lavar con agua del grifo o agua jabonosa, y con ayuda de una
escobilla o fregona. Aclarar con agua del grifo hasta retirar el jabón y
realizar el ​curado* de la bureta (si la suciedad es resistente, utilizar
 productos especiales). Una vez limpia se sujeta al soporte con las pinzas
en posición invertidas y con la llave abierta, para que seque a temperatura
ambiente. Si no se realiza bien la limpieza, puede ocurrir que:
➢ Pueden que aparezcan burbujas de aire en su interior, es muestra que
no está limpia, por tanto no transferirá la cantidad exacta de líquido.
➢ Que la solución no fluya suavemente con el extremo es señal que el
paso esté obstruido por un trozo de un material sólido o por un poco
de grasa.
➢ Por último, la bureta hay que desmontarla periódicamente, y retirar la
llave para limpiarla.

*Curado​: llenar la tercera parte de la pipeta o bureta con la solución o liquido que se
vaya a medir, inclinarla y girarla para hacer pasar dicha solución para todo su interior,
esta operación debe efectuarse tres veces, así se consigue sustituir algún posible
resto de agua destilada por la solución a medir y se evitan interferencias.

2. DESINFECCIÓN

Es un proceso que elimina la mayoría de microorganismos patógenos y no patógenos

de los objetos inanimados con la excepción de virus y esporas bacterianas. Se
distinguen tres niveles de desinfección:

1. Intensidad baja​: pude destruir muchas de las bacterias, algunos virus y

hongos.
2. Intensidad media​: inactiva las bacterias y la mayoría de virus y hongos, pero
no asegura la destrucción de esporas bacterianas.
3. Intensidad alta​: destruye todos los microorganismos, excepto algunas esporas
bacterianas.

2.1 La desinfección se lleva a cabo mediante los siguientes métodos:

● Métodos físicos​: utilizan el calor.

- Pasteurización​: proceso que expone el material a agua caliente, a unos
77ºC aproximadamente y durante unos 20-30 minutos (esto puede variar),
su objetivo es destruir todos los microorganismos patógenos.
- Ebullición​: proceso en el cual el objeto se sumerge en agua hirviendo
(100ºC), con el se consigue una desinfección de nivel más elevado.

*los virus y las esporas bacterianas son microorganismos pero no pueden ser
destruidos con el método de desinfección.

● Métodos químicos​: utilizan desinfectantes, que son sustancias químicas que

pueden usarse sobre material inerte (paredes, suelos, mobiliario, material de
laboratorio, etc.) sin alterarlo de forma apreciable. Pueden aplicarse de la
siguiente forma:
- Inmersión​: sumergir el objeto en una solución durante 10 minutos
(desinfección nivel bajo).
 - Loción​: empapar el objeto (suele usarse en objetos grandes) frotándolo con
bayeta o esponja mojada en desinfectante.
- Pulverización​: el desinféctate se proyecta uniformemente en pequeñas
gotas sobre la superficie del objeto.

Los desinfectantes más usados son:

● Hipoclorito sódico (lejía​): es de acción rápida y transitoria (su agente activo

se evapora), es el desinfectante ambiental más común, pero ​no sirve para
desinfectar el instrumental porque corroe los metales, algunos plásticos y el
caucho.

La lejía de uso doméstico contiene una concentración entre el 3% y 5%. Se

diluye al 2% para utilizar como desinfectante del material de laboratorio. Si se
diluye al 10% se considera desinfectante de nivel alto.

● Alcohol etílico​: aplicado al 70% es el más utilizado debido a que posee mayor
poder desinfectante que el de 96º porque penetra mejor en el protoplasma
bacteriano (interior de la bacteria), aun así se consigue una escasa
desinfección por lo que su uso se limita a los materiales ​no críticos como por
ejemplo termómetro de baño, para desengrasar portaobjetos o cubreobjetos,
etc.

Características de los desinfectantes:

● Ser solubles en agua o alcohol.

● No ser corrosivo.
● Precio comercial bajo.
● Ser inodoro o tener olor agradable.
● Ser incoloro.

Precauciones ante los desinfectantes:

● Manipularlos con guantes.

● No mezclarlos salvo que los fabricantes lo aconsejen.
● Conservar en recipientes tapados, proteger de la luz y del calor.

CASO PRÁCTICO

María va a preparar a partir de lejía domestica (5%) las siguientes disoluciones e

Indica cómo tiene que proceder para preparar dichas disoluciones:

a) 100ml al 10%

No se puede hacer.

b) 200ml al 2%
 C​1​ · V​1 ​= C​2​ · V​2
5 · V​1 ​ = 2% · 200
V​1​= 80ml

Tenemos en el laboratorio alcohol absoluto de 100º (concentración madre), quiero 500

ml de alcohol al 70º, pero lo quiero hacer a partir de alcohol de 96º (1000 ml).

C​1​= 100%

C​2​=96%

V​2​= 1000ml

C​2​=70% C​1​= 96 V​1​= (70 · 500): 96= 364´58ml C= 96%

V​2​= 500ml V​1​= 364´58ml 500-364´58= 135,42ml

Se echa 135,42ml de agua hasta llegar a los 500ml C= 70%

3. ESTERILIZACIÓN

Es el procedimiento para la destrucción de toda forma de vida microbiana, incluyendo

los virus (hepatitis y SIDA) y las esporas bacterianas. Este proceso se puede llevar a
cabo mediante métodos físicos y químicos.

Métodos físicos

Son los que se basan en propiedades físicas para conseguir eliminar por completo los
microorganismos de un determinado material, superficie, equipo o solución. A
continuación hablaremos de los más utilizados en el laboratorio clínico, estos son:

● Calor​: es uno de los agentes físicos que más se utiliza para la esterilización.
Este desnaturaliza estructuras y macromoléculas (membranas celulares,
proteínas, etc.) por lo que todos los microorganismos son susceptibles en
mayor o menor grado. La eficacia del calor como agente esterilizante depende
de dos factores: la temperatura y el tiempo de exposición.

*​todo el material volumétrico reutilizable de buena calidad se puede calentar en

la estufa de secado o de esterilización hasta 180ºC, sin que haya que temer
una variación de volumen. Sin embargo debe tenerse siempre en cuenta que
un calentamiento irregular o un cambio brusco de temperatura provocan
tensiones térmicas que pueden conducir a la rotura de vidrio.
 ✓ Calor húmedo​: provoca la desnaturalización y la coagulación de las
proteínas. Este método se basa en que los materiales húmedos conducen
mejor el calor que los materiales secos, por ello, el vapor de agua, es más
eficaz a la hora de matar microorganismos y se requiere menor temperatura
y tiempo que la esterilización por calor seco. El aparato más usado es la
autoclave (estufa de vapor). Este, básicamente, aplica vapor de agua a una
presión establecida (normalmente una atmósfera). Estas condiciones
pueden variar en función del tipo de material a esterilizar. Se utiliza
principalmente para medios de cultivo, soluciones, ropa de laboratorio, etc.
Sus ​principales ventajas es que es un método muy rápido, no deja
residuos tóxicos, no deteriora en exceso el material expuesto y es
económico (sólo utiliza agua). ​En contra tenemos que no permite esterilizar
soluciones que formen emulsiones con el agua y que es un método
corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.

Funcionamiento de autoclave (test):

1. Abrir la tapa, girando el volante de cierre y desplazándola.

2. Llenar el depósito con agua destilada hasta la señal por debajo de la rejilla
perforada.
3. Poner el material encima de la rejilla o en un cestillo para que quede espacio
entre los materiales así puede circular el vapor de agua.
4. No taponar el orificio superior del depósito por donde sale el vapor de agua.
5. Desplazar la tapa girando el volante y cerrarlo bien.
6. Conectar el autoclave a la corriente eléctrica y accionar el interruptor
7. La autoclave aumentará la temperatura y empezara a producir vapor de
agua.
8. Una vez purgado el aire, se cierra la llave de purga y la temperatura llega a
100ºC aproximadamente, momento en el que se llega a una atmósfera,
indicado en el manómetro.
9. Cuando se alcanza la temperatura y la atmosfera desea, comienza el tiempo
de esterilización 20-30 min.
10. Cuando termina la esterilización se desconecta, pero no se abre hasta que
el manómetro índice 0 de presión y se haya enfriado. Abrir la llave de purga
ayuda a que el vapor salga más rápido.
11. Todo el proceso suele durar 1 hora u hora y media.

✓ Calor seco​: se utiliza casi exclusivamente para la esterilización de material

de vidrio y algún metal. El material de vidrio se debe envolver en papel
secante e introducirse en hornos (horno Pasteur), donde el material se
expone a temperaturas entorno a los 170ºC durante al menos 90 minutos.
Un ejemplo de material de metal puede ser un asa de siembra, con ella se
realiza un flameado, es decir, se coloca el asa sobre un mechero bunsen
unos minutos hasta que este al rojo vivo.
 ● Radiaciones

✓ Radiaciones UV​: estas son absorbidas por los ácidos nucleicos y los
aminoácidos que forman el material genético de los seres vivos, de esta
manera provocan errores en la duplicación de los microorganismos
ocasionando la pérdida de viabilidad y su muerte. Además estas radiaciones
tienen un bajo poder de penetración, por lo que, solo se utilizara para la
esterilización de superficies de trabajo, campanas de flujo, quirófano, etc.

✓ Radiaciones ionizantes​: tienen mayor poder de penetración. Producen iones

y radicales libres que alteran los ácidos nucleicos, las proteínas y otros
componentes celulares ocasionando la muerte de los microorganismos. Se
suelen utilizar para la esterilización de materiales termosensibles como
jeringas, sondas… por su elevado coste solo suelen utilizar a nivel industrial
aunque es interesante su conocimiento, ya que gran parte del material que
llega al laboratorio clínico ha sufrido una esterilización de este tipo en su
proceso industrial de elaboración ​(test)​.

● Filtración​: consiste en hacer pasar una disolución que se desea esterilizar por
una serie de filtros con distintos tamaños de poros, los cuales son capaces de
retener los diferentes microorganismos que pueda haber presentes en una
disolución. Solo se consigue una esterilización parcial, ya que los virus no
quedan retenidos por ningún tipo de filtro. Esta técnica solo suele emplearse
para la esterilización de disoluciones de materiales termolábiles (que se altera
con facilidad por la acción del calor).

Métodos químicos

Se basan en la utilización de sustancias químicas para esterilizar el material de

laboratorio. (Test) Un buen agente esterilizante químico es aquel que además de
tóxico sea volátil (puede ser fácilmente eliminado del objeto cuando haya finalizado el
proceso). La efectividad de estos agentes químicos va a depender de:

● La concentración del agente.

● El tiempo de acción.
● El ph del medio.

Los más utilizados son:

● Óxido de etileno​: esterilización basada en el uso de gas de oxido de etileno

muy recomendado cuando los materiales o instrumentos no pueden ser
esterilizados mediante técnicas de calor húmedo y/o seco.
 ● Glutaraldehído​: sustancia irritante de mucosas utilizada en la esterilización de
material clínico delicado, como por ejemplo material de endoscopia,
colonoscopia, etc.

Controles de esterilización

Después de cualquier proceso de esterilización, es necesario realizar un control de la

misma, así se asegura que el proceso se ha desarrollado consiguiendo una eficacia
del 100%, es decir, eliminar cualquier forma de vida que hubiera en el material o
instrumento. Existen diferentes métodos:

● Controles físicos​: ​el objetivo es vigilar y revisar el funcionamiento mecánico

de los dispositivos de esterilización, estos van incorporados en los propios
dispositivos (termómetros, manómetros, etc.). Es muy importante revisar las
gráficas de registros que se producen en cada proceso así se verifica que no
ha habido errores.
● Controles químicos​: ​se realiza utilizando una serie de indicadores
colorimétricos o también conocidos como termopromos. Son sustancias
formadas por sales de diferentes metales que reaccionan de distinta manera
ante la presencia o no de microorganismos.
● Controles biológicos​: ​consisten en preparados de esporas de
microorganismos no patógenos los cuales se exponen al agente esterilizante y
a continuación se evalúa la supervivencia de los mismos. Se incuban a la
temperatura óptima de su crecimiento (40-52ºC) durante 24-48 horas. Si se
observa crecimiento o cambio de color (medio de cultivo) es que no se ha
logrado la esterilización.

Actividades

1. Dibuja un autoclave y señala las distintas partes ​(examen)​.

2. Cita ventajas del sistema de esterilización por calor húmedo (autoclave).
- Es un método muy rápido
- No deja residuos tóxicos
- No deteriora en exceso el material expuesto
- Es económico

3. Cita posibles errores al utilizar el autoclave.

- No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua.
- Es un método corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos.
4. Define:
● Desnaturalización​: es un cambio estructural de las proteínas o ácidos
nucléicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su
óptimo funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades
físico-químicas.
● Flameado: destruir con la llama los gérmenes nocivos que puede haber
en un objeto.
● Manómetro: es un instrumento de medida de la precisión en fluidos en
circuitos cerrados. Miden la diferencia entre la presión real o absoluta y
la presión atmosférica, llamándose a este valor, presión manométrica.
● Termopromo
● Volátil: que cambia o varía con facilidad y de forma poco previsible.

Material Método de esterilización parámetros

Líquidos autoclave 135ºC aprox
 vidrios Autoclave 135ºC
Estufa calor seco 160ºC a 180ºC
madera autoclave 135ºC
Algodones y gasas autoclave 135ºC
plástico Óxido de etileno 37ºC- 55ºC

Deterioro más comunes de materiales sometidos a esterilización y posibles causas:

● Manchas blancas en artículos metálicos​: la causa puede ser uso de agua

dura o por falta de secado.
● Decoloración​: causa es por agua dura.
● Oxidación o picaduras en artículos metálicos​: puede ser por uso de agua
dura, por presencia de materia orgánica, presencia de polvo.

Accidentes debido a un mal uso:

● Autoclave​: quemaduras, vapores, aerosoles.

● Luz uv​: quemaduras en la cornea, en la piel.
● Oxido de etileno​: irritación en la piel, ojos, mucosas.
● Cloro​: es tóxico, irrita, alergia.
● Glutaraldeido​: dermatitis de contacto.

Agua para el laboratorio. Tipos de aguas.

Un suministro de agua pura limpia puede ser vital para el trabajo del laboratorio. El agua se
utiliza a menudo como un disolvente, reactivo o un agente de limpieza en las reacciones y
pruebas. Al ser pura evitará problemas con la contaminación que puede conducir a
experimentos o resultados falsos. Tanto el agua destilada como desionizada son opciones
comunes para el agua del laboratorio.

·​ ​Agua
dura: contiene gran cantidad de minerales (calcio y magnesio) , que se le conoce
como calcáreas.

·​ ​Agua blanda: agua suave y poseen mínimas cantidades de sales.

Hay varias maneras de purificar el agua destilación y desionización son dos de los métodos más
comunes.

·​ ​Agua destilada: el agua se calienta hasta su punto de ebullición, se convierte en un vapor

gaseoso y se condensa de nuevo en un líquido. Teóricamente esa agua que se recoge es

pura, ya que los minerales no se convierten en vapor en el punto de ebullición del agua.

·​ ​Agua desionizada: se realiza un proceso de intercambio de iones, y el agua pasa a ser

eléctricamente neutra (se eliminan iones contaminantes). Esta agua se conoce como “DI”.

La destilación produce típicamente agua de mayor pureza en comparación con la

desionización.