TEMA 1 Microbiologia Enológica

ISNU - 5 Saltos Microbiología Enológica - 2018
Tec. Superior en Viticultura y Enología Jorge Montano
TECNICATURA SUPERIOR EN VITICULTURA Y ENOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICA
UNIDAD 1 - INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICA
MICROBIOLOGIA: GENERALIDADES.
DEFINICIÓN DE MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICA.
IMPLICACIÓN DE LOS MICROORGANIMOS EN EL PROCESO ENOLÓGICO.
MICROBIOLOGÍA DE LA UVA.
CONCEPTO DE CONTROL MICROBIOLÓGICO.
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LA UVA.
MICROBIOLOGÍA: GENERALIDADES.................................................................... 2
¿Qué se estudia de los microorganismos en microbiología?.................2
¿Dónde se encuentran los microoganismos?........................................... 2
¿Cómo se clasifican los microorganismos?...............................................2
¿De dónde obtienen su alimento?............................................................. 3
Hablando de Bacterias................................................................................4
Nutrición y Crecimiento............................................................................. 6
Factores de orgánicos crecimientos.........................................................6
Requerimientos de Carbono...................................................................... 7
Requerimientos de Nitrógeno....................................................................7
Requerimientos de Azufre......................................................................... 7
Requerimientos de Oxígeno.......................................................................7
Crecimiento.................................................................................................. 8
El Agua.........................................................................................................11
DEFINICIÓN DE MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICA................................................12
IMPLICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL PROCESO ENOLÓGICO.. 12
MICROBIOLOGÍA DE LA UVA..............................................................................17
Origen de la levadura............................................................................... 18
Hongos Filamentosos.................................................................................18
Bacterias..................................................................................................... 19
CONTROL MICROBIOLÓGICO.............................................................................19
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LA UVA.........................................................19
Muestreo......................................................................................................19
Aislamiento de Microorganismos.............................................................20
Técnicas de identificación.......................................................................21
Control de Microorganismos.................................................................... 25
UNIDAD 1
1
MICROBIOLOGÍA: GENERALIDADES
Microorganismos. Los microorganismos o microbios son un variado grupo de
organismos microscópicos unicelulares o pluricelulares capaces de desarrollar
todas sus funciones vitales en forma independiente. En resumen, por
microorganismo entendemos cualquier organismo vivo que NO sea visible a
simple vista.
¿Qué pasa con las algas y los hongos que vemos a simple vista?
Aunque esta definición operativa no los incluiría, son considerados
microorganismos porque su organización es esencialmente unicelular. Lo que
vemos son colonias de hongos o algas, formadas por muchas células que
cumple cada una su función independiente de las demás.
También existe organismos pluricelulares que no vemos a simple vista y
entrarían “operativamente” dentro de esta definición, aunque son
estructuralmente tan complejos como cualquier animal superior.
Mención aparte merecen los virus, partículas inanimadas de material

genético, protegido por capas más o menos complejas de proteínas y
lípidos. Carecen de actividad metabólica cuando se encuentran libres.
Microbiología. Se puede definir como la ciencia que trata de los seres vivos
muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo tamaño se encuentra por
debajo del poder resolutivo del ojo humano. Etimológicmente, el vocablo
microbiología deriva del latín “microbio” y “logía” significa “estudio de los
microorganismos (o Microbios): Bacterias, hongos, algunos parásitos, etc.
Poder resolutivo del ojo: 0,1-0,2 mm.
Por ejemplo: tamaño de una bacteria esférica 0.2 y 2 m (micrómetros).
¿Qué se estudia de los microorganismos en microbiología?
 Actividades
 Forma y estructura
 Reproducción
 Fisiología y metabolismo
 Identificación
 Distribución en la naturaleza
 Relaciones con otros seres
 Efectos benéficos y perjudiciales que ejercen sobre los humanos
 Alteraciones físicas y químicas que ejercen en el medio
¿Dónde se encuentran los microoganismos?
Se encuentran en todas partes: en el aire que respiramos, en el suelo, en las
aguas naturales tales como los océanos, los lagos y los ríos, en los alimentos
que ingerimos diariamente, e incluso en inhóspitas fuentes hidrotermales,
en los hielos polares y a gran profundidad dentro de la corteza terrestre. A
esta caracterísitca se la denomina ubicuidad.
¿Cómo se clasifican los microorganismos?
Organismos Eucariotas. Son aquellos en cuyas células puede diferenciarse un
núcleo que contiene el material genético, separado de un citoplasma en el
UNIDAD 1
2
que se encuentran diferentes orgánulos celulares. Los más importantes en

Enología son los Hongos Unicelulares (levaduras)
Organismos Procariotas. Son aquellos en los que no existe la separación
entre núcleo y citoplasma. Dentro de este grupo se incluyen las bacterias.
¿De dónde obtienen su alimento?

Heterótrofos. Son los seres vivos que obtienen sus elementos alimenticios y
estructurales de otros organismos, de donde también obtienen su energía.
Por ejemplo, obtienen Carbono y Nitrógeno de la materia orgánica (glúcidos,
lípidos, proteínas, ácidos nucleicos, ácidos orgánicos, etc.) – Animales, Hongo,
Bacterias.
Autótrofos. Son aquellos que pueden sintetizar todas las sustancias
esenciales para su metabolismo a partir de sustancias inorgánicas, de manera
que para su nutrición no necesitan de otros seres vivos, Utilizan el CO2 como
fuente única de Carbono.
 Fotosintéticos. Utilizan la luz como fuente de energía.
 Quimiosintéticos. Utilizan como fuente de energía, la oxidación de
compuestos inorgánicos, como el anhídrido sulfuroso o compuestos
ferrosos.
UNIDAD 1
3
Microorganismos
Procariotas Eucariotas
Bacterias Ciano Algas Hongos Protozoos

Bacterias
Autótrofos Autótrofos Heterótrofos

Quimiosintéticos Fotosintéticos
Hablando de Bacterias
Tinción de Gram: es un sistema de dos tinciones simples sucesivas, separadas
por una fase de decoloración selectiva. Permite diferenciar las bacterias que
retienen el primer color (Gram-positivas) de las que no lo retienen
(Gram-negativas). Esta diferencia en comportamiento refleja diferencias
estructurales y fisiológicas entre ambos grupos de bacterias.
Gram-Positivas Gram-Negativas
UNIDAD 1
4
UNIDAD 1
5
Nutrición y Crecimiento
Los microorganismos para crecer y desarrollar sus actividades, deben
disponer en el ambiente de los nutrientes que le provean energía y materiales
para la biosíntesis. Los microorganismos presentan una gran diversidad
fisiológica específica y por lo tanto requerimientos nutricionales específicos.
No es casual, que las células de todos los seres vivos, independientemente de
su grado de organización, presenten una composición química constante de
aquellos materiales necesarios para la vida.
Composición elemental aproximada en Escherichia coli (% del peso seco):
Carbono 50%, Oxígeno 20%, Nitrógeno 14%, Hidrógeno 8%, Fósforo 3%, Azufre
1%, Potasio 1%, Sodio 1%, Calcio 0,5%, Magnesio 0,5%, Cloro 0,5%, Hierro 0,2%,
Todos los demás 0,3%. (Stanier, Dourofoff, Adelberg, Microbiología, 1977).
Se puede observar que carbono, oxígeno y nitrógeno representan entre un 80
a 90% del peso total de este microorganismo. El 95 % del peso seco de la
célula, contiene carbono, nitrógeno, fósforo y azufre, así como hidrógeno y
oxígeno (que pueden derivarse metabólicamente del agua). El porcentaje
restante incluye una gran variedad de elementos. La gran mayoría de los
seres vivos requieren además, calcio, cinc, cobre, cobalto, hierro,
manganeso, magnesio, molibdeno y potasio, entre otros micronutrientes.
Factores de orgánicos crecimientos
Los compuestos orgánicos que un organismo no pueda sintetizar a partir de
fuentes primarias de carbono, necesariamente deben ser administrados como
nutrientes. Estos nutrientes son conocidos como factores de crecimiento y de
acuerdo a su estructura química y función metabólica se pueden clasificar en
tres clases:
 Aminoácidos, necesarios como constituyentes de las proteínas.
UNIDAD 1
6
 Purinas y pirimidinas Las dos últimas son requeridas como integrantes

de los ácidos nucleicos.
 Vitaminas, forman parte de grupos prostéticos o centros activos de
ciertas enzimas.
Los factores de crecimiento son requeridos en pequeñas cantidades ya que
cubren plenamente las necesidades específicas de las biosíntesis.
Requerimientos de Carbono
Los organismos fotosintéticos, y las bacterias que oxidan compuestos
inorgánicos, utilizan como o fuente de carbono su forma más oxidada (CO2).
Los otros organismos, obtienen el carbono fundamentalmente de materiales
orgánicos. Gran parte del carbono de los materiales orgánicos, es utilizado
como fuente de energía y es excretado de la célula como CO2, que es el
principal producto de la respiración.
Cuando el mecanismo productor de energía es la fermentación, parte del

carbono es excretado como CO2 y compuestos orgánicos.
Las sustancias orgánicas cumplen un doble papel nutricional, son fuente de
carbono y fuente de energía. No existe en la naturaleza, ningún compuesto
orgánico que no pueda ser utilizado como fuente de carbono y energía por
algún microorganismo.
Requerimientos de Nitrógeno
El nitrógeno en los compuestos orgánicos de las células se presenta en estado
reducido como grupo amino. La gran mayoría de los organismos fotosintéticos
asimilan el nitrógeno en estado inorgánico como nitratos, que posteriormente
son reducidos. Muchos organismos no fotosintéticos como bacterias y hongos
también pueden asimilar el nitrógeno como nitrato, otros microorganismos
son incapaces de llevar a cabo esta reducción y utilizan como fuente de
nitrógeno formas reducidas de este. Las necesidades de nitrógeno se cubren
frecuentemente con materiales orgánicos que contienen nitrógeno en estado
reducido.
Requerimientos de Azufre
El azufre en los compuestos orgánicos de las células se presenta en estado
reducido como grupo sulfhidrilo. La mayoría de los organismos fotosintéticos
asimilan el azufre en estado inorgánico como sulfatos que posteriormente son
reducidos. Bacterias y hongos también pueden asimilar el azufre como sulfato.
Las necesidades de azufre, se cubren frecuentemente con materiales
orgánicos que contienen azufre en estado reducido.
Requerimientos de Oxígeno
En los organismos superiores, el oxígeno es un componente universal de las
células y gran parte de este elemento lo proporciona el agua. No obstante,
los organismos superiores y muchos microorganismos necesitan además
oxígeno molecular, ya que dependen de la respiración aerobia como
mecanismo generador de energía, donde el oxígeno actúa como oxidante
terminal. A estos organismos que requieren oxígeno molecular se les
denomina aerobios obligados. Dentro de esta categoría, hay algunos grupos
UNIDAD 1
7
que crecen mejor a presiones parciales de oxígeno más bajas (0,2 atmósferas)
que las del aire y se les denomina microaerófilos.
Otros microorganismos, obtienen energía por la vía fermentativa o por
respiración anaerobia, que no implica la necesidad de oxígeno como oxidante
terminal. En muchos casos el oxígeno puede actuar como una sustancia tóxica
o bien inhibir el crecimiento. A estos microorganismos se les denomina
anaerobios obligados.
Otros microorganismos pueden crecer tanto en ausencia como en presencia
de oxígeno molecular, alternando la respiración con la fermentación, a estos
se les denomina anaerobios facultativos. Un caso particular son las bacterias
del ácido láctico, que no son sensibles al oxígeno molecular y en presencia de
éste, continúan la fermentación.
SINTROFÍA. En materiales orgánicos en degradación, participan diferentes

grupos fisiológicos de microorganismos. Algunos grupos actúan
simultáneamente y otros se suceden en el tiempo. Las actividades
metabólicas combinadas pueden diferir cuantitativa y cualitativamente
de la suma de los efectos de estos grupos en forma separada. Este
fenómeno, es el resultado de interacciones nutricionales y se denomina
efecto sintrófico o sinergético.
Crecimiento
Para cualquier ser vivo, el crecimiento puede definirse como un incremento
ordenado de todos los constituyentes químicos del organismo. Es normal que
el crecimiento determine la multiplicación celular. En los organismos
pluricelulares, la multiplicación celular tiene como consecuencia un aumento
en el tamaño del individuo. En los unicelulares conduce a un incremento en el
número de individuos.
Una población de bacterias en un medio favorable no comienza
inmediatamente a aumentar el número de células, sino que presenta una fase
inicial, llamada fase de latencia, de retraso o fase “lag”, es el tiempo en el
que las células comienzan a prepararse para la división (duplicación del
material genético, etc).
En estas condiciones, la población de bacterias, se dobla a intervalos
regulares de tiempo. Cada célula hija, proveniente de una misma división,
tiene el mismo potencial de crecimiento que la célula madre. Si la población
se inicia a partir de una única célula, la población se incrementa por cierto
tiempo en forma escalonada, no obstante debido a las diferencias
individuales de crecimiento, el tiempo de división es asincrónico y el número
de células crece en forma continua, doblándose la población a intervalos fijos.
Este tipo de crecimiento se denomina crecimiento exponencial o logarítmico.
El crecimiento exponencial raramente se mantiene durante mucho tiempo.
Como consecuencia de los cambios ambientales generados por los propios
microorganismos, el crecimiento se autolimita.
Normalmente los factores que limitan el crecimiento son:
 el agotamiento de nutrientes
 la acumulación de productos metabólicos tóxicos.
UNIDAD 1
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En un cultivo donde no se aportan nuevos nutrientes, estos factores

determinan una curva característica de crecimiento. Condiciones
desfavorables son
 la humedad, temperatura
 falta de nutrientes
 presencia de sustancias inhibidoras del crecimiento
 un inóculo procedente de un cultivo anterior.
Esta fase (Exponencial) cuando se presenta tiene una duración muy variable.
La fase de crecimiento exponencial se inicia cuando la velocidad de
crecimiento alcanza su valor máximo y el número de células aumenta.
La concentración y naturaleza de los nutrientes, la temperatura y el pH, son
algunos de los factores que afectan la velocidad de crecimiento. Por el
agotamiento de nutrientes o por la concentración de metabolitos tóxicos la
velocidad de crecimiento comienza a decrecer paulatinamente.
Ejemplo: un cultivo bacteriano en fase de crecimiento exponencial (sin fase
de retraso) en el que el número de células inicial del cultivo es de 1 bacteria
viable por mililitro. Este cultivo duplicará el número de células cada hora
durante un periodo de estudio de 10 horas. Por tanto, a lo largo del
experimento tendríamos el número de células indicadas en la siguiente tabla
y representada en la gráfica:
UNIDAD 1
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Normalmente, luego de la fase exponencial, viene la fase estacionaria. La fase

máxima se verifica por el agotamiento de nutrientes o por la concentración de
metabolitos tóxicos, la velocidad de crecimiento comienza a decrecer
paulatinamente hasta velocidad de crecimiento cero.
La última fase es la fase de muerte, donde la población viable disminuye. La
cinética de la muerte de las poblaciones bacterianas es exponencial.
Algunas veces, cuando el número de células comienza a decrecer debido al
agotamiento de nutrientes, hay una nueva “pequeña” fase de crecimiento,
donde las células muertas hacen de nutrientes para las que aún están viables, es
de corta duración, luego recomienza la fase de muerte.
La concentración de nutrientes en la velocidad de crecimiento:

Para concentraciones de nutrientes bajas la velocidad de crecimiento es
proporcional a la concentración. En concentraciones altas, la velocidad de
crecimiento alcanza rápidamente su valor máximo, que se mantiene hasta que el
incremento en la concentración de nutrientes actúa como inhibidor.
La Temperatura y la velocidad de crecimiento
El intervalo de temperatura en que crecen los organismos se presenta entre
los –5ºC y +80ºC. Los organismos procariotas (bacterias y algas verdeazuladas)
presentan diferencias muy marcadas respecto a la zona de temperatura donde
pueden crecer, siendo este un factor limitante para su crecimiento. En función a
su relación con la temperatura se clasifican en termófilos, mesófilos y
psicrófilos.
Principales categorías fisiológicas de las bacterias según su relación con la
temperatura (ºC).
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TERMOFILOS: Algas verdeazuladas, Bacterias formadoras de endosporas

(B.Stearothernophilus) Actinomicetos (Thermoactinomices).
MESOFILOS: Gran mayoría de microorganismos. Euactinomicetos
(Streptomyces, Micromonospora) Bacterias Metanogénicas (Metanobacterium,
Methanococus, Metanosarcina), Bacterias del ácido láctico, Esporulantes
anaeróbicos (Clostridium).
PSICOTRÓFICOS: Microorganismos que crecen a temperatura ambiente pero
causan contaminación en condiciones de refrigeración.
El Agua
Las bacterias necesitan grandes cantidades de agua. De hecho, salvo
excepciones, se pueden considerar como organismos acuáticos. Requieren
cierto grado de humedad para crecer. Desde el punto de vista de sus posibles
papeles, el agua es:
 el principal constituyente del protoplasto bacteriano;
 el medio universal donde ocurren las reacciones biológicas;
 un reactante en exceso (es decir, un producto resultante de algunas
reacciones bioquímicas).
Las fuentes de agua pueden ser:
 endógena: procedente de procesos de oxido-reducción;
 exógena (la más importante): procedente del medio, y que difunde a
través de las membranas.
Ahora bien, no toda el agua de un ambiente está disponible para la bacteria:
 Existen determinadas sustancias que absorben y superficies que
adsorben de modo más o menos intenso moléculas de agua, dejándolas
inasequibles para la bacteria.
 Los solutos disueltos en agua (p. ej., sales, azúcares) tienen afinidad
por las moléculas de H2O que los rodean, por lo que éstas tampoco
estarán a disposición del microorganismo.
La disponibilidad de agua se mide por un parámetro llamado actividad de
agua o potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como:
aW= PS/PW
Donde PS es la presión parcial de vapor de agua en la solución problema y PW
es la presión parcial de vapor del agua destilada.
¿Cómo medir el potencial de agua de un medio líquido determinado? Se
mide la humedad relativa del aire que hay encima del medio (en frascos), y
este valor se refiere al valor de 100, que es la humedad del aire encima del
agua destilada. O sea, la aW = humedad relativa/100).
Las bacterias tienen valores de aW normalmente entre 0.90 y 0.99.
Bacterias de hábitats oligotróficos (como Caulobacter, Spirillum) tienen aW
cercanos a 1.
 Bacterias como Escherichia y Streptococcus, que viven en sangre y
fluidos corporales, tienen aW de alrededor de 0.995.
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 Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran

valores de 0.980.
 Ciertos bacilos Gram-positivos que resisten mejor la sequedad poseen
valores de 0.950.
 En el extremo de resistencia encontramos ciertas bacterias xerófilas,
capaces de vivir a aW muy bajos (en torno a 0.75). Muchas de estas
bacterias viven de hecho en medios acuosos, pero donde gran parte del
agua no está disponible por las razones arriba citadas:
 procariotas halófilos extremos, como la arquea Halobacterium, que
habita en lagunas hipersalinas;
 bacterias (y sobre todo, ciertos microrganismos eucarióticos como
levaduras) sacarófilos, que viven en jugos y zumos con altas
concentraciones de azúcares.
DEFINICIÓN DE MICROBIOLOGÍA ENOLÓGICA.
Enología. Conocimiento o estudio de todos los productos derivados de la uva
y productos no vínicos, que estudia la composición, propiedades y
elaboración de ellos.
Conjunto de conocimientos y técnicas relativos a los procesos de elaboración
y crianza de vinos.
Etimológicamente, la palabra "enología" deriva del griego oinos (vino) y logos
(conocimiento, estudio, discurso)
Microbiología enológica: Ciencia que estudia todos los microorganismos
presenten en la uva y en vino tanto en ambientes naturales como en
condiciones impuestos por la tecnología (Levaduras, bacterias lácticas/
acéticas, mohos/hongos filamentosos).
IMPLICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL PROCESO ENOLÓGICO.
Los microorganismos en la elaboración de un vino se encuentran en todas las
etapas de éste, así como en el ambiente de las bodegas. No obstante, hay
etapas en las que hay que tener un control microbiológico importante.
Vino Blanco
En la elaboración de un vino blanco es importante controlar la población de
microorganismos en varias etapas. No solo hay que controlar los
microorganismos que consideramos negativos para el vino sino también los
positivos.
1. Antes de la selección del racimo.
2. Antes de comenzar la fermentación siempre se usa el SO2 como
antibacteriano haciendo que la población de bacterias disminuya
considerablemente y por tanto las levaduras puedan iniciar la
fermentación. Al tener mayor población de bacterias inicial que de
levaduras el efecto es negativo ya que las bacterias consumen el azúcar y
pueden producir el picado láctico. En concreto no matamos las bacterias,
sino que reducimos la población con el fin de favorecer el crecimiento de
las levaduras.
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SO2
UNIDAD 1
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3. En caso de no usar sulfuroso tenemos que buscar alternativas:

a. Temperatura: si bajamos la temperatura las bacterias se pueden
controlar y por tanto las levaduras crecen mejor.
b. pH
4. En los procesos no tenemos en cuenta los hongos filamentosos ya que en
el proceso de fermentación debido al pH del mosto y ausencia de oxígeno
mueren. En las lías podremos encontrar bacterias lácticas y levaduras.
Las lías son la materia sólida que queda

en un depósito o barrica después de la
fermentación, formadas por las
levaduras muertas y otra serie de
sustancias procedentes de la uva. La
crianza sobre lías forma parte de la
clásica elaboración con el método
‘champenoise’ en los vinos espumosos
naturales. Tras el embotellado, el vino
realiza una segunda fermentación en la
botella y los restos (las lías) se acumulan
en el cuello de la botella. El ‘degüelle’
en este tipo de vino, no es otra cosa que
quitar el cuello de la botella para
eliminar ésas lías.
Hay un mayor riesgo de aparición de
Brettanomyces, levaduras que crecen en
las barricas viejas de roble y que
producen la aparición de la molécula
etil-4-fenol, que da el olor característico
a cuero y sudor de caballo.
5. Para eliminar la bacterias y levaduras se realizará mediante la etapa de

filtración y estabilización. Aun así siempre antes de embotellar habrá que
realizar un análisis para evitar problemas.
6. En etapa de crianza también es importante el control debido a la
presencia de oxígeno.
Vino Tinto
En el proceso de elaboración de un vino tinto, el control es igual que en vinos
blanco a excepción de que aquí encontramos dos fermentaciones:
fermentación alcohólica y fermentación maloláctica.
En la fermentación maloláctica hay que favorecer a las bacterias sabiendo
antes que tipo de fermentación queremos realizar ya que luego tendremos
que favorecer a las levaduras.
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SO2
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Vino Rosado
La elaboración de rosados tiene características de la elaboración de tintos,
como la maceración, aunque esta es más corta porque no necesitamos una
extracción de color tan importante; y otras de los blancos, como la
fermentación alcohólica a temperaturas bajas.
SO2
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MICROBIOLOGÍA DE LA UVA
Microorganismos
de la uva
Levaduras Mohos Bacterias
Especies Inocentes Deseables

(Areobasidium) (Lácticas)
Especies Fermenativas Indeseables
(Saccharomyces) (Lácticas, acéticas,
Especies Alterantes Enfermedades de la vid)
(Brettanomyces,
Zygosaccharomyces)
Levaduras
La población de levaduras en la uva depende de muchos parámetros:
 Situación geográfica.
 Pluviosidad.
 Temperatura.
 Maduración de la uva (↑maduración ↑ [ Azúcar] ↑ levadura)
 Empleo de sustancias antifúngicas (Puede dar efector perjudiciales en
la uva o potenciadores de levaduras que no nos interesan)
 Tipo de suelo: proporciona distintas características.
 Edad del viñedo (a más edad mayor susceptibilidad a infecciones y
menos población de levaduras)
 Daños físicos debido a:
▪ Pájaros.
▪ Insectos: proporciona más o menos cantidad de levaduras ya que
al haber más ruptura hace que salga la pulpa y crezca o que
favorezca a los hongos.
 Varidad de la uva
 Muestreo: ETAPA PRIMORDIAL O MÁS IMPORTANTE PARA VERIFICAR LA
FLORA QUE TENGO. ES IMPORTANTE QUE LA MUESTRA SEA
REPRESENTATIVA.
 Ataque de Hongos
Levaduras en la uva. Es importante el control ya que inicialmente
encontramos:
 Mayoritarias: No-Saccharomyces.
 Minoritarias: Saccharomyces cerevisiae.
Y durante la fermentación encontramos el caso contrario ya que la mayoría a
4º de alcohol no tienen actividad.
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Origen de la levadura
Para explicar el origen de las levaduras existen tres teorías:
1. Insectos: mayor cantidad de levaduras se encuentran en los panales de las
abejas. Así mismo, la mosquita pica la uva y provoca mayor cantidad de
acético aunque también puede ser un transmisor de levadura.
2. Paredes de bodega: no hay esterilización por tanto las levaduras se
encuentran en las paredes de los fermentadores.
3. Actividad humana: tocar la vid mientras se poda.
Las barricas a veces necesitan una esterilización debido a una contaminación,
para ello se utilizan mechas de azufre.
Hongos Filamentosos
Los hongos no son un gran problema si la uva está en buen estado pero cuando
la uva está en mal estado sanitario afectan considerablemente el mosto.
Botrytis (glucónico) ; Mildiu; Oídio; Penicillium
Botrytis no produce la quiebra oxidásica, sino que produce la enzima lacasa,
ésta será la que producirá la oxidación en el vino.
Aspergillus y Penicillium producen toxinas ocratoxinas que no afectan al vino
sino al consumidor.
Características
▪ No tienen capacidad fermentativa.

▪ Las toxinas, consumo de nutrientes y la podredumbre (polvo) infectan a
la uva.
▪ Da compuestos que afectan a las características organolépticas del vino.
▪ No podemos eliminarlos pero si controlarlo.
Consecuencias
▪ Reducción de la cosecha (calidad y cantidad)

▪ Afectan el contenido de nitrógeno (Los hongos son más exigentes con el
N2)
▪ Presencia de enzimas como la lacasa (oxidasa) produce quiebra
oxidásica (oxidación del vino)
▪ Afecta la estabilidad físico-química del vino.
▪ Olor y sabor a moho.
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Bacterias
Las bacterias lácticas pueden ser tanto deseables como indeseables
dependiendo de cuándo y cómo se desarrolle.
Las bacterias acéticas siempre son indeseables en la elaboración de vino,
aunque son las principales en la elaboración de vinagre.
CONTROL MICROBIOLÓGICO
Controlar las bacterias “buenas y malas” de manera que sepamos: qué hacen,
como afectan, que podemos hacer con ellas, la cantidad que hay. Es decir, un
seguimiento y estudio de los microorganismos.
Estudio de microorganismos a muchos niveles:
 ¿Quién es?
 ¿Qué hacen?
 ¿Qué pueden conseguir?
 ¿Qué provoca?
Identificación, control, implicación de las características organolépticas.
Características de los microorganismos.
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LA UVA
El control se realiza en tres etapas:
1. Muestreo.
2. Aislamiento
3. Identificación (caracterización de los microorganismos).
Muestreo
El muestreo consiste en tomar una muestra que sea representativa, es decir,
debe reunir todas las cualidades del conjunto que se desea estudiar. Para ello
basamos un parámetro microbiológico.
Característica de la muestra
 Ser representativa.
 Etiquetarse adecuadamente de manera que contenga la información
que permita saber dónde y cuándo se tomó la muestra.
 Evitar contaminaciones tomando precauciones de asepsia. (Conservar
las condiciones adecuada de temperatura y humedad).
 Envío al laboratorio: realizar en poco tiempo, en contenedores,
neveras o recipientes adecuados (tardar el menor tiempo desde que
tomamos la muestra hasta que se analiza)
 Evitar la exposición de la muestra al aire, luz y manipulación.
 Nunca poner en contacto directo con hielo. (El hielo no está estéril)
Etiqueta
 Peso y volumen de muestra que se toma. (Anotar en muestra y
cuaderno).
 Fecha, lugar y hora de muestreo.
Conservación
Temperatura de almacenamiento.
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 Producto estable, temperatura ambiente: 18°C -27°C.

 Producto inestable, temperatura de refrigeración: 3-2 °C.
 Producto ultra congelado: -15°C y -18°C.
▪ Uso anticongelante: glicerol (20% - 50%) proteger la célula y evita
que se congele el agua de la célula. (↓Temperatura ↑[glicerol])
▪ Si se puede restituir en el volumen a la muestra que he tomado es
mejor.
Pretratamiento de la muestra
 Sólida.
▪ Pesar.
▪ Superficie: Lavar con solución estéril. (Microbiota en superficie)
▪ Obtener mosto. (Obtener microbiota fuera y dentro)
 Líquida → centrifugación.
▪ Pelet (microorganismo de superficie y dentro de superficie).
▪ Mosto se elimina y se recupera.
▪ Resuspender en agua estéril o solución salina (para mantener la
presión osmótica y evitar que estalle)
▪ Agua +cloruro sódico 0,9%
Toma de Muestra
 Racimos elegidos al azar: racimos completos, según horas de sol.
 Transporte en neveras.
 En función:
▪ Tamaño de parcela.
▪ Cantidad de luz y humedad.
▪ Número de vides.
Aislamiento de Microorganismos
 Método de disolución sucesiva.
▪ Aislamos lo mayoritario, lo minoritario se va perdiendo.
▪ Siembra por extensión (Extendido en placa).
Para realizar en
conteo de las
colonias se debe
seleccionar la
dilución en que
se formen entre
30-300 colonias y
afectarlo por el
volumen de
siembra y la
dilución que se
ha realizado.
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Extendido en placa Colonias

superficiales
Incubación
La muestra es vertida La muestra es esparcida

sobre la superficie de la sobre toda la superficie de Resultado típico de
placa de agar (0.1 ml o agar utilizando una varilla un Extendido en
menos) de vidrio. placa
Siembra en profundidad Colonias

bajo la
Colonias
superficiales
superficie
Incubación
La muestra es vertida Se agrega medio esteril y se Resultado típico de una

en la placa esteril mezcla bien con el inóculo. siembra en profundidad
Medio de cultivo (tipos)

 Selectivo: selecciono lo que quiero aislar.
 Complejo: todos los componentes sin saber la exactitud que hay en
ellos.
 MRS: Bacterias lácticas (crecen muy bien las levaduras)
 GYC: Bacterias acéticas (crecen las levaduras)
 Selectivos/suplementados: Inhibir el crecimiento de grupos
microbiano.
Crecimiento en placa es un método de recuento por el cual se determina la
microbiota viva de la muestra como UFC/ml (Unidades formadores de colonia
por militro)
1 1
UFC / ml  nColonias  
dilusión vol. sembrado (ml )
Se habla de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) y no de células, porque
no tenemos la certeza de si cada colonia que contamos fue formada a partir
de una, dos o más células microbianas.
Técnicas de identificación
Técnicas de microbiología clásica:
 Características morfológicas. Son basicamente la observación
microscópica en fresco, las técnicas de tinción, que pueden hacerse
sobre un frotis desde la muestra tal cual o desde colonias que han
resultado del cultivo (inoculación e incubación) en algún medio
nutritivo específico para el crecimiento de un grupo determinado de
microorganismos o genérico. También es de ayuda la morfología de las
colonias, cada bacteria crece formando colonias de diferente altura,
color, textura, brillo, olor, etc., algunas incluso generan pigmentos
que tiñen el medio; si bien la morfología de las colonias no es
definitiva, orienta hacia hacia un grupo más o menos amplio de
microorganismos.
UNIDAD 1
21
 Bioquímicas y fisiológicas. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente

utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales,
generalmente determinan la actividad de una vía metabólica
(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma
o no. Son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en
forma clara una determinada característica bioquímica como
presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo
de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una
determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores,
etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del
metabolismo bacteriano. En todos los casos se debe tener un cultivo
fresco (18-24 hrs. de incubación) en un medio en que el
microorganismo se desarrolla en forma óptima, a pH, fuerza iónica,
atmósfera y temperatura adecuados. Si bien existen una gran variedad
de pruebas bioquímicas empleadas con fines de identificación, las que
se utilizan más frecuentemente, agrupadas según el tipo de ensayo y
se denominan según su nombre corriente son:
▪ Enzimas vinculadas con la respiración: oxidasa y catalasa.
▪ Descomposición de azúcares simples, ácidos orgánicos y otros
Requerimientos de oxígeno: Prueba de oxido fermentación (OF),
crecimiento en caldo tioglicolato.
▪ Producción de ácido, o ácido y gas: Fermentación de
carbohidratos.
▪ Detección de enzimas y vías metabólicas: Prueba del gluconato,
ONPG (orto nitro B-D galactopiranósido, esculína, hipuráto rojo de
metilo Voges-Proskauer).
▪ IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato)
▪ Descomposición de carbohidratos aminoácidos y otros: Prueba del
indol, fenialanina, lisina, arginina, ornitina, urea.
▪ Ensayos combinados: TSI (Triple azúcar hierro), bilis esculina.
Detección de exoenzimas: lecitinasa, proteasa, coagulasa,
amilasa, celulasa, desoxirribonucleasa.
 Medios selectivos. son medios sólidos en los que la selectividad se
consigue alterando las condiciones físicas del medio o añadiendo o
suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de inhibir el
crecimiento de especies químicas cuyo crecimiento no interesa. Este
tipo de medio sólo permite el crecimiento de un grupo de
microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y
aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo
Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos
estafilococos). Entre los factores selectivos que alteran las condiciones
del medio tenemos:
▪ Cambio de pH: por ejemplo agregando ácido acético para
favorecer el crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es
hostil par la mayoría de las especies que crecen entre 6,5 y 7,2).
Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S. faecalis a pH 9,6.
UNIDAD 1
22
▪
Cambio de temperatura: la mayoría de las bacterias crece
óptimamente entre 20º C y 40º C. Los cultivos típicos de S.
Faecalis requieren 60º C de temperatura y los de Listeria son
capaces de desarrollarse y crecer a 4º C.
▪ Alteraciones osmóticas: se acrecientan las propiedades osmóticas
un medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos medios
intensifican la selección de bacterias halófilas como
Staphylococcus spp. (7,5%).
▪ Ajuste en la tensión de oxígeno: es importante en la selección de
aerobios y anaerobios.
▪ Ajuste en la tensión de anhídrido carbónico: muchos patógenos
importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensión
más allá de la atmosférica.
Entre los factores que inhiben el crecimiento de bacterias indeseables
tenemos:
▪ Antisépticos: sustancias antibacterianas inespecíficas que pueden
actuar como inhibidores.
▪ Antibióticos: sustancias antibacterianas específicas que impiden
el crecimiento de aquellos microorganismos que no nos interesa
que crezcan en ese medio.
 Kits comerciales. Una enterobacteria necesita de unos 15 ensayos
para determinar su especie, por eso es uqe existen baterías
comerciales de pruebas agrupadas para cada tipo de microorganismo;
sus ventajas son que proponen un mejor conjunto de pruebas
bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, simplifican
la interpretación de resultados utilizando valores numéricos, proveen
reactivos listos para su uso y algunas son totalmente automatizadas.
Antes de aplicar cualquiera de ellas es necesario realizar una tinción
de Gram y las características de aislaiento para poder aplicar la
batería adecuada. Los sistemas comerciales más comunes son:
▪ ENTEROTUBE II®. Es un sistema de identificacón de
enterobacterias que consiste en un tubo con 12 medios de cultivo
contenidos en compartimentos individuales que se inoculan
simultáneamente en una etapa y permiten detectar 15
características bioquímicas y cuenta con una plantilla que permite
la interpretación.
UNIDAD 1
23
▪ API 20 E®. Es un sistema estandarizado para la identificación de

bacterias Gram negativas que consiste en una plantilla con medios
de cultivo deshidratados a los que se agrega una suspencsión
bacteriana. Permite la realización de 23 pruebas biouímicas a
partir de una única colonia bacteriana. También existe API 10®,
con menos pruebas y pantillas específicas.
▪ PETRIFILM®. 1980 se creo la primer placa para la identificación de

aerobios, posteriormente salio al mercado distintos tipos tales
como coliformes, E. coli, mohos y levaduras, coliformes
rápidos/Enterobacterias, St aureus, Estafilococos Express, Listeria
ambiental. incrementa la eficiencia de los análisis bacteriológicos
ya que es rápido y sencillo de usar además de ser específico para
cada grupo bacteriano optimiza el número de los análisis
bacteriológicos, entre sus ventajas en el laboratorio es el ahorro
de espacio, trabajo, tiempo y costos. Las placas existentes en el
mercado son:
 Aerobios (AC).
 Bacterias acido lácticas (AC).
 Psicrófilos (AC).
 Mohos y levaduras (YM).
 Coliformes totales y fecales (CC).
 Coliformes rápidos (RCC).
 E. Coli
 Enterobacterias (EB).
 Estafilococos aureus (RSA).
 Estafilococos express (SRX).
Levaduras Bacterias Ácido-Lácticas
UNIDAD 1
24
Técnicas de biología molecular

 PFGE (Electroforesis en Gel de Campo Pulsado - Estudio de ácidos
nucleicos). La técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en
disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de
una técnica fundamentalmente analítica, aunque también se puede
realizar con fines preparativos. Características:
▪ Permite conocer el número y tamaño de los cromosomas.
▪ Protocolo específico en función del microorganismo que
tengamos.
▪ Se puede usar en bodegas para diferenciar cepas (elegir según la
característica organoléptica que queramos.
 RFLP (Fragmentos de restricción de longitud polimórfica - Estudio de
ADN). Los fragmentos de restricción de longitud polimorfica (RFLPs)
son un tipo de polimorfismo que resulta de la variación en la secuencia
de ADN reconocida por las enzimas de restricción. Estas son enzimas
bacterianas que utilizan los científicos para cortar moléculas de ADN
en lugares conocidos. Los RFLPs (se pronuncia "rif lips") se utilizan
como marcadores en los mapas genéticos. Por lo general, para
visualizar los RFLPs se utiliza la electroforesis en gel. Consideraciones:
▪ Se utilizan enzimas de restricción.
▪ Corta por secuencias.
▪ Se aplica a cualquier microrganismo, pero no sabemos que es.
 PCR (Reacción en cadena de la polimerasa - Estudio de ADN). Su
objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN
particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única
copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para
amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la
amplificación resulta mucho más fácil de identificar. Características:
▪ Permite amplificar el número de copias de un determinado gen o
secuencia.
▪ Para identificar género y especie de levaduras, NO de cepas.
 PROTEÓMICA (Estudio de proteínas). Es el estudio a gran escala de las
proteínas, en particular de su estructura y función. Da conocimiento
básico, pero no tiene aplicación real.
 CHIPS ADN (Estudio de genes). Consiste en colocar miles de secuencias
génicas en lugares determinados sobre un portaobjetos de vidrio
llamado chip. Una muestra que contiene ADN o ARN se pone en
contacto con el chip. El apareamiento de las bases complementarias
entre la muestra y las secuencias de genes en el chip produce una
cantidad de luz que se puede medir. Las áreas del chip que producen
luz identifican los genes que se expresan en esa muestra.
Control de Microorganismos
Minimizar la microbiota acompañante de la uva → ELIMINAR PROBLEMAS.
Implica control desde la brotación hasta la recolección y transporte.
Etapa de maduración:
UNIDAD 1
25
 Minimizar la manipulación. Esto es debido a que nosotros tenemos

microrganismos sobre nuestra piel; también resulta necesario reducir
las heridas de la baya y así evitar la proliferación de microorganismos
indeseables.
La Botrytis o Moho Gris tiene la

particularidad de atacar a los frutos incluso
si estos no han sufrido heridas. Es el
responsable de la “Podredumbre Noble”
cuando se retrasa la vendimia, si el
ambiente es húmedo y cálido; no sólo
cambia el aspecto externo de las uvas,
pareciéndose a pasas enmohecidas, sino que
además se altera la composición del mosto,
con un aumento en la concentración de los
azúcares y de la acidez. Gracias a ello los
vinos elaborados con estos mostos no
resultan empalagosos, pues la acidez
equilibra el gran contenido de azúcares.
 Mantener las Condiciones higiénico-sanitarias adecuadas. Tanto en la

recogida, limpiando los camiones como en las instalaciones de la
bodega, tolvas, prensas, depósitos. Como última fase es necesaria la
esterilización de la línea de embotellado con agua caliente o vapor de
agua.
UNIDAD 1
26

TEMA 1 Microbiologia Enológica

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ISNU - 5 Saltos Microbiología Enológica - 2018

Tec. Superior en Viticultura y Enología Jorge Montano

TECNICATURA SUPERIOR EN VITICULTURA Y ENOLOGÍA

Mención aparte merecen los virus, partículas inanimadas de material

que se encuentran diferentes orgánulos celulares. Los más importantes en

¿De dónde obtienen su alimento?

Bacterias Ciano Algas Hongos Protozoos

Autótrofos Autótrofos Heterótrofos

 Purinas y pirimidinas Las dos últimas son requeridas como integrantes

Cuando el mecanismo productor de energía es la fermentación, parte del

SINTROFÍA. En materiales orgánicos en degradación, participan diferentes

En un cultivo donde no se aportan nuevos nutrientes, estos factores

Normalmente, luego de la fase exponencial, viene la fase estacionaria. La fase

La concentración de nutrientes en la velocidad de crecimiento:

TERMOFILOS: Algas verdeazuladas, Bacterias formadoras de endosporas

 Bacterias marinas como ciertos Vibrio y Pseudomonas encuentran

3. En caso de no usar sulfuroso tenemos que buscar alternativas:

Las lías son la materia sólida que queda

5. Para eliminar la bacterias y levaduras se realizará mediante la etapa de

Levaduras Mohos Bacterias

Especies Inocentes Deseables

▪ No tienen capacidad fermentativa.

▪ Reducción de la cosecha (calidad y cantidad)

 Producto estable, temperatura ambiente: 18°C -27°C.

Extendido en placa Colonias

La muestra es vertida La muestra es esparcida

Siembra en profundidad Colonias

La muestra es vertida Se agrega medio esteril y se Resultado típico de una

Medio de cultivo (tipos)

 Bioquímicas y fisiológicas. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente

▪ API 20 E®. Es un sistema estandarizado para la identificación de

▪ PETRIFILM®. 1980 se creo la primer placa para la identificación de

Levaduras Bacterias Ácido-Lácticas

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