D ossier

thématique
Médecine De nouveaux marqueurs biologiques
translationnelle de la tolérance chez l’homme ?
Do we have new biomarkers of tolerance
Coordinateur : E. Thervet
in humans?
●●J. Ashton-Chess 1, R. Danger 1, J.P. Soulillou 1, 2, 3, S. Brouard 1

R é sum é  S u m m a ry

Obtenir une tolérance en transplantation est
­l’objectif ultime de bien des chercheurs et médecins
travaillant dans ce domaine. Détecter cette tolé-
rance en est un autre non moins important. C’est
ainsi que, depuis plusieurs années, des scientifiques
s’attachent à identifier des marqueurs biologiques
qui pourraient les aider à diagnostiquer un rejet,
voire prévoir le devenir à long terme du greffon chez
l’homme. De tels marqueurs sont en effet néces-
saires, non seulement pour reconnaître un état de
tolérance chez des patients prenant un traitement
immunosuppresseur à l’origine d’effets secondaires
importants, mais également pour estimer le degré
de réponse d’un patient à un traitement, prédire
la dégradation d’un transplant avant les premiers
signes fonctionnels, déjà trop tardifs, ou encore aider
à mieux comprendre les mécanismes du devenir à
long terme d’un greffon.
Tolerance is the ultimate goal of physicians and
researchers working in the field of transplantation.
Detecting such a tolerant state is another key issue
that needs to be resolved. For this reason, scientists
have, for many years, been focussing their efforts
on trying to identify biological markers that could
help to diagnose or even predict the outcome of
transplantation in humans. Such markers are neces-
sary, not only to identify a state of tolerance in
patients under immunosuppressive therapy, but
also to estimate the response of a given patient to
his/her immunosuppressive medication; to predict
future loss of graft function before the first clinical
symptoms appear. Finally, such markers could help
to better understand the mechanisms of long-term
graft survival.

Mots-clés : Biomarqueur – Transplantation – Keywords: Biomarker – Transplantation –

Tolérance. Tolerance.

La tolérance, un challenge De plus, s’ils sont incontournables, les

1 Inserm U643 et institut de transplantation et
de recherche en transplantation (ITERT), Nantes.
2 Service de néphrologie, CHU de Nantes.
3 Faculté de médecine, université de Nantes.
Remerciements
Ce travail a été rendu possible grâce à
­plusieurs financements de la fondation
­Progreffe.
en transplantation
Les traitements immunosuppresseurs ont
connu des progrès très importants ces
dernières années. Toutefois, la perte du
greffon au long cours reste un problème
majeur en transplantation, d’autant plus
que la greffe s’est aujourd’hui géné-
ralisée à un nombre plus important
de patients, entraînant irrémédiable-
ment l’utilisation de ­greffons prove-
nant de donneurs plus âgés, des temps
­d’ischémie acceptables plus longs, etc.
immunosuppresseurs, lorsqu’ils sont
administrés au long cours, augmen-
tent le risque de développer cancer(s)
ou infection(s) [1, 2] et sont même
pour certains (inhibiteurs de la calcineu-
rine) à l’origine d’une toxicité rénale
potentielle (3). Enfin, limiter l’utilisation
des immunosuppresseurs, même chez un
petit nombre de patients, pourrait avoir
un impact économique considérable en
réduisant les coûts de santé, et notam-
ment les dépenses en médicaments pour
ces patients (4).

10 Le Courrier de la Transplantation - Volume IX - n o 1 - janvier-février-mars 2009

CT N°1-2009.indd 10 23/03/09 16:07:39

 D ossier
thématique
Induire un état de tolérance
en transplantation
La solution idéale recherchée par de
nombreux scientifiques dans le monde
est donc l’induction d’un état de tolé-
rance grâce auquel le greffon serait
accepté en l’absence de tout traitement
immunosuppresseur, sans compromettre
la santé du patient. Les expériences réali-
sées par R.E. Billingham, L. Brent et
al. dans les années 1950 ont permis de
montrer pour la première fois qu’un état
de tolérance à des antigènes étrangers
pouvait être obtenu chez le souriceau
nouveau-né (5). Depuis, la recherche
d’une tolérance à des antigènes allogé-
niques a été l’obsession de nombreux
scientifiques. La définition de la tolé-
rance, telle qu’elle a ainsi pu être mise en
évidence chez la souris, est fondée sur un
certain nombre d’éléments : un greffon
fonctionnel sans signe histologique de
rejet, en l’absence d’immunosuppres-
seurs, chez un hôte immunocompé-
tent. Enfin, cette tolérance doit être par
essence spécifique du donneur. Les diffé-
rents moyens d’induire une tolérance
entrent dans deux grandes catégories.
La première concerne les méthodes
visant à éliminer les cellules capables
de reconnaître les allo-antigènes direc-
tement dans le thymus, au moment des
processus de sélection centrale : on parle
alors de chimérisme (6). La seconde
regroupe l’ensemble des moyens en
périphérie à l’origine de l’élimination,
l’absence de réponse ou de l’anergie des
cellules circulantes alloréactives (7-10).
L’ensemble de ces phénomènes a été
très bien documenté dans des modèles
d’allogreffe chez le rongeur, pour lequel
il est possible d’induire une tolérance par
différentes stratégies : blocage des molé-
cules de la costimulation (11), trans-
fusion spécifique du sang du donneur
avant la greffe (12), injection de sérum
provenant d’animaux hyperimmunisés
contre leur donneur (13) ou utilisation
de différents immunosuppresseurs (14).
Un certain nombre de tentatives ont été
réalisées pour reproduire ces expé-
riences sur de plus grands modèles
proches de l’homme, notamment sur les
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primates (15), ou même, plus récem-
ment, en clinique chez l’homme (16, 17).
Les résultats de ces travaux montrent
avant tout que la tolérance est bien plus
difficile à atteindre chez l’homme que
chez le rongeur, et que le chemin est
encore long pour obtenir une tolérance
en clinique.
Un autre moyen – sûrement plus aisé et
réaliste – pour atteindre un jour “la” tolé-
rance en clinique – consiste à diminuer
progressivement les immunosuppres-
seurs chez des patients présentant des
constantes cliniques et fonctionnelles
“parfaites”. Il a en effet été montré qu’un
certain nombre de patients transplantés
hépatiques (18) ou rénaux (19-22), ayant
arrêté spontanément leur traitement,
pouvaient présenter un tel état de tolé-
rance des années après la transplantation.
Même si ces cas restent anecdotiques,
du moins en transplantation rénale, ils
montrent que l’obtention d’une tolé-
rance chez l’homme reste possible et
suscitent des questions importantes :
comment détecter ou prévoir cet état de
tolérance, comment diagnostiquer les
bons candidats à un arrêt des immuno­
suppresseurs, et comment assurer le suivi
de ces patients, voire contrôler un futur
rejet ?
Le besoin de marqueurs
biologiques en transplantation
Selon la définition donnée par le Biomar-
kers Definitions Working Group en 2001
(Clin Pharmacol Ther 2001;69(3):89-
95), un marqueur biologique est une
mesure objective permettant l’éva-
luation de processus physiologique et
pathologique ou permettant d’évaluer
la réponse d’un patient après une inter-
vention thérapeutique. Enfin, un bon
marqueur biologique doit permettre de
distinguer un état pathologique d’un état
physiologique de référence. Un certain
nombre de marqueurs biologiques sont
déjà utilisés en clinique : taux de glucose
indicateur de diabète, taux de choles-
térol indicateur de certaines pathologies
cardiaques, par exemple. Ces marqueurs
biologiques sont utiles pour diagnosti-
11 Le Courrier de la Transplantation - Volume IX - n o 1 - janvier-février-mars 2009
quer la maladie, mais ils doivent idéa-
lement être capables de la prévoir pour
intervenir de façon plus précoce auprès
du patient. De tels marqueurs biologi-
ques devraient nous permettre, un jour,
de mieux appréhender les mécanismes
responsables de la maladie, mais égale-
ment les mécanismes d’action de certains
médicaments. Enfin, idéalement, ces
marqueurs doivent être d’une utilisation
la plus simple possible et applicables
au plus grand nombre de patients. Les
liquides biologiques tels que les urines,
le sang, la salive, de par leur possible
promiscuité avec le site de la maladie,
mais également du fait du caractère non
invasif de leur recueil, sont des éléments
privilégiés qui font l’objet d’un grand
nombre de recherches.
Jusqu’à présent, la biopsie était consi-
dérée comme le seul acte capable d’ap-
porter un diagnostic fiable quant au statut
clinique du greffon, notamment en cas de
rejet identifié selon les critères de la clas-
sification de Banff (23), celui-ci n’étant
en effet pas toujours accompagné d’une
dégradation de la fonction et donc d’une
modification des paramètres fonctionnels
sanguins créatinine/protéinurie (24, 25).
Si elle apporte ainsi une information
capitale pour le suivi des greffons, la
biopsie n’en demeure pas moins un acte
invasif qui entraîne un risque pour le
transplant et le patient (26). De plus, cet
acte a un coût économique non négli-
geable et, de par son caractère invasif,
est à l’origine de nombreux refus de
la part des malades. Pour ces raisons,
les recherches se tournent actuelle-
ment vers d’autres sites privilégiés ou
liquides biologiques. Du fait de leur
étroite relation avec le greffon rénal, du
caractère non invasif et du faible coût de
leur recueil, les urines ont retenu l’atten-
tion de plusieurs équipes de recherche.
Notamment, il a été rapporté que les taux
d’ARNm pour le granzyme B et FOXP3
étaient de bons marqueurs biologiques
diagnostiques et prédictifs du rejet cellu-
laire aigu et de son devenir (27-29). Le
sang est un autre liquide biologique inté-
ressant. Déjà largement utilisé pour les
paramètres fonctionnels, mais également
pour la recherche d’anticorps circulants,
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thématique
qui apparaissent comme un facteur de
risque pour le greffon (30, 31), il offre
également la possibilité d’un nombre
important d’explorations (cellules,
sérum, plasma…), la prise de sang
restant par ailleurs un acte peu invasif
et relativement bon marché.
Actuellement, les marqueurs biologiques
en transplantation sont recherchés à la
fois pour permettre de diagnostiquer ou
de prédire l’état du greffon, mais égale-
ment pour évaluer le suivi thérapeutique
d’un patient (32). Compte tenu de la
rareté des cas de tolérance, la plupart des
marqueurs biologiques identifiés sont à
ce jour majoritairement des marqueurs
du rejet, rejet humoral avec la présence
de C4d dans le greffon (33), rejet aigu
(34, 35) ou rejet chronique (35-41).
Évidemment, de tels marqueurs de la
tolérance seraient également très utiles
pour diagnostiquer un état de tolérance,
dans le cas notamment des protocoles
de minimisation du traitement immuno­
suppresseur, mais aussi en permettant
un meilleur suivi du patient, particuliè-
rement dans le cas des sujets à risque,
polytransfusés, multipares ou présen-
tant des infections multiples, autant de
facteurs qui semblent être une barrière
à l’induction d’un état de tolérance (42).
Ils devraient également permettre de
prévoir une éventuelle perte de la tolé-
rance de ces patients après diminution ou
arrêt du traitement. Ce dernier point est
fondamental puisque, aujourd’hui, le peu
de recul que nous avons concernant les
sujets tolérants ne permet pas de dire si
l’état de tolérance est un état stable (43),
et les exemples de rupture de tolérance
décrits dans la littérature, même des
années après la greffe, nous inclinent
à penser le contraire (22, 44, 45). Ces
marqueurs biologiques, s’ils s’avèrent
assez sensibles, permettraient donc une
intervention plus précoce et la possible
réintroduction d’un traitement immu-
nosuppresseur chez certains patients
avant l’apparition de lésions histologi-
ques irréversibles au niveau du greffon.
Enfin, ils permettraient également, en
s’appuyant sur l’observation faite qu’un
certain nombre de patients sont sponta-
nément tolérants (18, 22, 46), de repérer
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des “candidats” pour de futurs protocoles
de minimisation de traitement parmi les
patients stables sous immunosuppres-
seurs. Actuellement, de tels marqueurs
n’existent pas, et il n’est pas possible
de sélectionner ces patients sur des
bases scientifiques et rationnelles. En
effet, plusieurs obstacles empêchent ou
retardent à ce jour l’identification de ces
marqueurs biologiques chez l’homme :
les cas de tolérance sont rares, limitant
ainsi leur étude ; les mécanismes, tout
comme la stabilité, d’un tel processus
sont encore inconnus et l’absence de
“profil de référence” entraîne donc
toujours un doute potentiel lorsqu’un
nouveau marqueur est mis en évidence ;
l’extrapolation des résultats obtenus dans
les modèles animaux est très difficile et
discutée (cf. supra).
Les méthodes utilisées
aujourd’hui pour identifier
ces nouveaux marqueurs
biologiques
La liste est longue, allant des techniques
les plus classiques, telles que la cyto-
métrie en flux ou la PCR quantitative
en temps réel, aux techniques les plus
innovantes de génomique ou de protéo-
mique. Les premiers essais se fondent
sur la “spécificité du donneur”. Ainsi,
les deux méthodes les plus utilisées sont
les techniques Luminex et ELISA. La
technique Luminex permet de mesurer le
taux d’anticorps circulants dirigés contre
le donneur (30, 31). Leur suivi aide, en
tout cas chez le primate, à prévoir le
devenir d’une greffe de rein (47). Toute-
fois, ces anticorps peuvent persister des
années après la transplantation sans qu’il
y ait détérioration de la fonction de ce
greffon (48), et leur présence a même
été montrée chez des patients tolé-
rants (22). La technique ELISA, quant
à elle, est utilisée pour mesurer le taux
de CD30 soluble (sCD30) circulant
chez les patients transplantés rénaux.
Un niveau élevé de sCD30, seul ou en
association avec de forts taux d’anticorps
anti-HLA anti-classe II, est associé à une
augmentation du risque de rejet (31).
12 Le Courrier de la Transplantation - Volume IX - n o 1 - janvier-février-mars 2009
Deux autres expériences sont également
utilisées pour mesurer la réponse spéci-
fique du receveur contre son donneur.
La première consiste à mesurer l’ac-
tivité des lymphocytes T cytotoxiques
de type CD8 (CTL). Elle a ainsi permis
de mettre en évidence une diminution
de la réponse spécifique antidonneur
chez un patient (49). La deuxième
méthode consiste à mesurer la réponse
de ces lymphocytes T après injections
simultanées d’antigènes du donneur et
de lymphocytes T du receveur dans la
voûte plantaire d’une souris immunodé-
ficiente (réaction inflammatoire locale) :
on parle alors du test d’hypersensibilité
retardée (DTH assay). Cette technique
permet de distinguer des singes accep-
tant ou rejetant leur greffon rénal (45).
Elle a également permis de montrer une
diminution de la réponse spécifique chez
3 patients transplantés rénaux devenus
tolérants après arrêt de leur traitement
immunosuppresseur (44) ou encore,
dans une étude plus récente, de mettre
en évidence l’existence d’une popu-
lation régulatrice T CD4+ CD25low
chez 2 patients tolérants (50). Ces deux
techniques reposent ainsi sur la diminu-
tion de la réponse du receveur comme
marqueur biologique du devenir à long
terme du greffon. Bien que séduisantes,
elles ne sont encore utilisées que dans
un nombre limité de cas et nécessitent
donc d’être confirmées à plus grande
échelle.
Parmi les autres tests qui ne se fondent
pas sur la spécificité du donneur, le
plus utilisé est la cytométrie en flux.
Cette technique informe sur le nombre
et le phénotype des différentes popu-
lations cellulaires présentes chez le
receveur. Elle a permis de mettre
en évidence différentes populations
régulatrices chez des rongeurs rece-
veurs présentant des survies prolon-
gées de leur greffe, certaines d’entre
elles permettant même de transférer
un état de tolérance lorsqu’elles sont
injectées à un animal naïf venant juste
d’être greffé : lymphocytes T CD4+
CD25high (51-53), lymphocytes T
CD4+ CD25– (54), lymphocytes T
CD8CD45RC (55), cellules non-T
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thématique
B7+ (11), CD103+ (13) ou certaines
populations de cellules dendriti-
ques (56). Toutefois, il est difficile de
considérer ces populations cellulaires
comme de bons marqueurs biologiques
de la tolérance en tant que tels. En effet,
elles coexistent – dans la majeure partie
des cas rapportés – avec des lésions
de rejet chronique (12, 55, 57, 58) et
sont généralement détectées dans la
rate des animaux testés, mais rarement
dans le sang, ce qui rend leur approche
délicate et difficilement extrapolable
à l’homme (12). En clinique, la cyto-
métrie en flux a permis de mettre en
évidence l’existence d’un certain
nombre de molécules spécifiques de ces
populations régulatrices : FOXP3 (59),
GITR (60), CD103 (61), CCR5 (62),
CTLA-4 (63) ou encore CD25 (64).
Une augmentation du nombre de
cellules CD4+ CD25+ a ainsi été
mise en évidence chez des enfants
transplantés hépatiques (64) et chez
des adultes ayant subi avec succès un
arrêt de leur traitement immunosup-
presseur (65). Ce résultat a également
été retrouvé en transplantation rénale,
où les patients tolérants présentent plus
de lymphocytes T CD4+ CD25+ régula-
teurs que ceux en rejet chronique (21).
Mais ces lymphocytes T présentent le
même phénotype et n’ont pas d’acti-
vité suppressive accrue in vitro (66).
De la même façon, une augmentation
du nombre de lymphocytes B périphé-
riques, particulièrement des popula-
tions mémoires et activées, a été mise
en évidence chez les patients tolérant
leur greffon rénal par rapport à ceux en
rejet chronique (21, 67-69). En trans-
plantation hépatique, ce même résultat
a été mis en évidence chez des enfants
tolérant leur greffe (64), mais il n’a
pas été rapporté chez l’adulte (70). Il
a également été montré que les patients
qui tolèrent leur greffe rénale ont moins
de lymphocytes T périphériques de type
CD8 et présentant un profil cytotoxique
que les patients en rejet chronique (20).
Enfin, ces mêmes patients tolérant
CT N°1-2009.indd 13
leur greffon rénal présentent un déficit
périphérique en TLR4 par rapport aux
patients en rejet chronique (40).
Une autre technique utilisée pour tenter
de trouver de nouveaux marqueurs biolo-
giques est celle du TcLandscape®, qui
consiste à analyser le répertoire du
récepteur des lymphocytes T (TCR) et
à en donner une vue tridimensionnelle
(67, 71, 72). Cette technique a fait ses
preuves dans différents modèles d’al-
logreffe chez le rongeur et a montré
que, selon la phase d’induction (73) ou
de maintenance de la tolérance (12), le
répertoire du TCR présentait des varia-
tions spécifiques. Chez l’homme, il a
également été montré que les patients
tolérant leur greffon rénal présentaient
un répertoire différent et identifiable
par rapport aux patients en rejet chro-
nique (19, 74), ce qui suggère que cette
technique pourrait permettre d’identifier
de nouveaux patients potentiellement
tolérants parmi une cohorte présentant
une fonction stable des greffons sous
traitement immunosuppresseur.
La PCR quantitative a aussi largement
été utilisée dans ce but, mais, à ce jour,
de tels marqueurs n’ont été rapportés que
dans le rejet aigu (28) et le rejet chro-
nique (39, 41), et aucun n’a été identifié
de cette façon pour la tolérance.
La technique de screening vers laquelle
se sont tournées la plupart des équipes
travaillant dans ce domaine est sans
aucun doute la technique des puces à
ADN. Elle permet en effet de mesurer
simultanément des milliers de gènes,
et ce avec une grande sensibilité et une
grande spécificité. Par ce moyen, les
chercheurs espèrent identifier des “signa-
tures” moléculaires de la tolérance. Chez
l’homme, le groupe d’Alberto Sanchez-
Fueyo a mis en évidence une signature
chez des patients transplantés hépatiques
ayant subi avec succès un arrêt de leur
traitement immunosuppresseur (70, 75).
En transplantation rénale, les exemples
sont nombreux pour identifier des signa-
tures du rejet (34-36, 38, 76). Dans le
contexte de la tolérance, nous avons iden-
13 Le Courrier de la Transplantation - Volume IX - n o 1 - janvier-février-mars 2009
tifié une liste de 49 gènes spécifiquement
régulés dans le sang des patients opéra-
tionnellement tolérants par rapport aux
patients présentant des signes de rejet
chronique (77). Nous avons également
mis en évidence des voies de signalisa-
tion spécifiquement impliquées dans cet
état de tolérance (78, 79).
Les dernières techniques les plus récem-
ment utilisées sont issues du domaine
de la protéomique. Certains marqueurs
biologiques tels que des peptides (beta-
defensin-1, alpha-1-antichymotrypsin)
permettent en effet de diagnostiquer
le rejet aigu du transplant rénal chez
l’homme (80). Cependant, à l’heure
actuelle, aucun marqueur de la tolé-
rance n’a été identifié par ces techniques
protéomiques.
Conclusion
Au regard des études antérieures, il
apparaît clairement que des résultats
très prometteurs ont été obtenus, mais
seulement à partir de petites cohortes de
patients, ou de cohortes limitées à des
modèles animaux, voire à une espèce
expérimentale précise, ce qui rend
l’extra­polation à l’homme difficile. Des
efforts de concertation internationale sont
donc réalisés dans le cadre de réseaux en
Europe (Indices of Tolerance, RISET)
et aux États-Unis (Immune Tolerance
Network) pour regrouper le maximum
de renseignements sur un maximum de
patients opérationnellement tolérants.
Cette démarche est fondamentale pour
que des marqueurs biologiques fiables
soient validés et rendent ainsi posssible
une avancée dans le domaine de la trans-
plantation, en permettant notamment à
un nombre de plus en plus important de
patients de bénéficier d’une réduction de
leur traitement immunosuppresseur. ■
Retrouvez l’intégralité des
références bibliographiques sur
www.edimark.fr
23/03/09 16:07:40
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