La deficiencia específica de gránulos (SGD) es un trastorno raro caracterizado por neutrófilos

anormales evidenciados por gránulos reducidos, ausencia de proteínas granulares y núcleos

bilobulados atípicos. El impacto de las mutaciones de CEBPE en la biología de los neutrófilos
sigue siendo difícil de alcanzar. Aquí, identificamos dos pacientes con SGD que tienen una
mutación heterocigótica descrita anteriormente en CEBPE. Aprovechamos esta rara
oportunidad para caracterizar los neutrófilos de la SGD en términos de distribución de
gránulos y contenido de proteínas. Los gránulos de los neutrófilos del paciente se agruparon y
polarizaron, lo que sugiere que no solo la ausencia de gránulos específicos, sino también los
defectos que afectan a otros gránulos contribuyen al fenotipo. Este análisis mostró que los
gránulos restantes mostraban un contenido de proteína mixta y carecían de varios
glicoepítopos. Esto sugiere que la ausencia de estas proteínas en individuos sanos podría ser
responsable de las formas segmentadas de los núcleos neutrofílicos. Ya que los granulocitos
neutrófilos son la primera línea de defensa que se recluta en los sitios de infección. Los
neutrófilos maduros contienen una serie de receptores preformados y péptidos microbicidas
almacenados en distintos orgánulos subcelulares. La fusión regulada de estos gránulos con su
membrana objetivo controla tanto la extravasación de células del torrente sanguíneo a los
sitios inflamatorios como la capacidad de las células para detectar, ingerir y destruir microbios.

Las deficiencias cuantitativas o cualitativas de neutrófilos se asocian con una vulnerabilidad a

menudo notable a las infecciones bacterianas y fúngicas. Entre estos defectos, la deficiencia
específica de gránulos (SGD) denota una inmunodeficiencia primaria particularmente rara con
un puñado de casos reportados hasta la fecha. Clínicamente, los pacientes sufren infecciones
recurrentes y abscesos en las vías respiratorias y en la piel. El diagnóstico se basa en el
aspecto característico de los neutrófilos de la sangre periférica, que no están completamente
diferenciados, sino que muestran núcleos bilobulados atípicamente y números y contenido
anormales de gránulos. La hipogranularidad, se asemeja al síndrome mielodisoplástico. En la
SGD, los neutrófilos carecen de la expresión de proteínas granulares localizadas en gránulos
específicos y de gelatinasa o localizados en gránulos azurófilos, pero expresados en la etapa
promielocítica tardía, como la proteína bactericida que aumenta la permeabilidad (BPI) y las
defensinas o los péptidos de neutrófilos humanos (HNPs). También se ha informado que los
eosinófilos contienen gránulos anormales. Los neutrófilos de pacientes con SGD están
alterados en la quimiotaxis y en la muerte in vitro de bacterias Staphylococcus aureus.

Curiosamente, se han identificado mutaciones homocigotas y heterocigotas en CEBPE en

pacientes con SGD. Dos mutaciones homocigotas son mutaciones de desplazamiento de
marco ubicadas en el exón 1 de CEBPE que conducen a la expresión de una proteína truncada
sin actividad transcripcional. Otra mutación homocigótica resulta en una eliminación en el
marco de dos aminoácidos dentro del dominio de cremallera leusina de la proteína.

Materiales y métodos

Pacientes y controles individuales.

Este estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de las juntas de revisión
institucional de la Universidad Médica de Viena con el consentimiento informado por escrito de
todos los sujetos. El paciente 1 tenía entre 3 y 9 años de edad cuando se tomaron muestras; El
paciente 2 tenía entre 35 y 41 años de edad mientras estaba inscrito en este estudio.

Manejo y enriquecimiento de neutrófilos.

La sangre completa de los pacientes se superpuso en un gradiente de Ficoll diluido (Ficoll en

PBS, 5: 1) como se describe (17). Los controles sanos (HC) (envío y controles locales) se
procesaron con Ficoll [polimorfonuclear (PMN) -undil) diluido (HC) y sin diluir y siempre se
ejecutaron en paralelo. Se recogió la parte inferior del gradiente y los glóbulos rojos (RBC) se
lisaron en una solución de cloruro de amonio tamponada (tampón de lisis de RBC,
eBioscience). Las células PMN se utilizaron directamente para el análisis funcional o la
extracción de ARN, se fijaron para el análisis de microscopía electrónica o se congelaron en
nitrógeno líquido para el análisis proteómico. Es importante destacar que la tinción con FACS
en gránulos de neutrófilos de HC confirmó un fuerte enriquecimiento de los neutrófilos (Figuras
S1A, B en Material suplementario).

análisis genético

El ADN se extrajo de la sangre completa y, posteriormente, el gen CEBPE se analizó mediante

secuenciación capilar como se describió anteriormente (22). Se utilizaron los siguientes
cebadores: Exon 1.1: 5′-CAGGCCCAGGTCAGGAG delantero, 5′-GGGCTGCTGTAG
ATGCCAG inverso; exón 1.2: para la sala 5′-CTCT T TGCCGTGAAGCCAG, inversa 5′-
CTCAGCAGCATGAGCCG; exón 2: adelante 5′-GA CGCATCAAGTGTGCCC, inverso 5′-
TCCATGGTCTATGTCT CAGGG.

Análisis proteómicos

Se obtuvieron gránulos de neutrófilos como se describió anteriormente. Dos gránulos de

neutrófilos de cada individuo analizado se separaron sometido a lisis en tampón Frackleton
(Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; NaCl 50 mM; NaPPi 30 mM; NaF 50 mM, Triton X-100 al 1%)
complementado con un cóctel inhibidor de proteasa que contiene AEBSF, aprotinina, Bestatin,
E-64, leupeptina y pepstatina A (Sigma-Aldrich, Austria) durante 20 minutos en hielo. Se
cargaron 30 μg de proteína en un gel SDS-PAGE (Novex® NuPAGE® 4–12% Bis-Tris Gel,
Thermo Fisher) que posteriormente se tiñó con Coomassie después de la separación de
proteínas. Cada carril se cortó en 10 partes (Figura S1C en Material suplementario). Las
proteínas de cada rebanada se alquilaron y se digirieron in situ con tripsina (Promega, EE. UU.)
Durante la noche. Los péptidos se purificaron con discos de extracción C18 (3 M, St. Paul,
MN, EE. UU.) Y se eluyeron con ácido fórmico al 5% para su posterior análisis en un sistema
de nano-HPLC (Agilent Technologies) acoplado a un Orbitrap Velos LTQ (Thermo Fisher).

inmunotransferencias

Las inmunotransferencias se realizaron como se describe en la ref. (23) con modificaciones

mínimas. Los anticuerpos utilizados se dirigieron contra CEACAM1 (clon tsg101, donación de
Peter Draber, Instituto de Genética Molecular del ASCR, Praga, República Checa), pan-
CEACAMs (clon AG11) (24), lactoferrina [anticuerpo policlonal (pAb) A0186, DAKO ,
Dinamarca], MPO (pAb, A0398, DAKO, Dinamarca) y actina (pAb, A2066, Sigma-Aldrich,
Alemania), CD13 (clon BF-10, Santa Cruz, CA, EE. UU.). Para gp91phox, p22phox, LCN2 y
GAPDH, se obtuvieron los sedimentos de neutrófilos de inmunotransferencia como se
describe en el manejo y enriquecimiento de los neutrófilos y luego se lisaron en tampón
Frackleton durante 15 minutos en hielo complementado con un cóctel inhibidor de proteasa
(Sigma-Aldrich). Los anticuerpos utilizados se dirigieron contra gp91phox (ab129068, Abcam),
p22phox (CS9, Santa Cruz Biotechnology), LCN2 (D4M8L, Cell Signaling Technology) y
GAPDH (6C5, Santa Cruz Biotechnology). La inmunodetección se realizó con anticuerpos
secundarios de cabra anti-ratón acoplados a peroxidasa de rábano picante (554002, BD
Biosciences) o anticuerpos secundarios de cabra anti-conejo (172–1019, BioRad) con ECL
Prime (Amersham).

microscopio de electrones

Las muestras fueron procesadas y analizadas esencialmente como se describe en la Ref. (24).
Para immunoEM, se analizaron 9-13 secciones por individuo.

microscopia de inmunofluorescencia

Después de la lisis de RBC, los sedimentos celulares se resuspendieron en PBS frío a 1,5
millones de células / ml y se dejaron adherir a portaobjetos de adhesión (Marienfeld, Alemania)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante o con cubreobjetos recubiertos con poli-l-
lisina. Las células adheridas a los portaobjetos de adhesión se fijaron 10 min a 4ºC, seguido de
5 min a temperatura ambiente en PFA al 3,5% en PBS. El bloqueo se realizó durante 30
minutos, en el Bloque del receptor de Fc (Innovex Biosciences, EE. UU.) Y durante 30 minutos,
en suero de cabra al 10% en PBS. Los anticuerpos se incubaron en suero de cabra al 1% en
PBS. Antes de la tinción con lectinas, los portaobjetos se bloquearon adicionalmente con
estreptavidina / kit de bloqueo de biotina (Vector Laboratories, EE. UU.). Las células adheridas
a cubreobjetos recubiertos con poli-l-lisina se fijaron durante 20 minutos en una solución de
PFA / PBS al 4%, se permeabilizaron con Triton X-100 al 1% y se bloquearon en BSA al 1% en
PBS suplementado con Triton X-100 al 0,1%. Los anticuerpos dirigidos contra C / EBPε se
incubaron durante la noche a la 1:50 (sc-515192, ratón monoclonal, Santa Cruz) o 1:35
(HPA002928, dilución policlonal de conejo, Sigma-Aldrich); contra p22phox (CS9, Santa Cruz
Biotechnology) a dilución 1: 200. Se utilizaron anticuerpos secundarios específicos de especie
acoplados a Alexa Fluor 488. Las células se tiñeron con DAPI. Otros anticuerpos y lectinas
utilizados para inmunofluorescencia y microscopía inmunoelectrónica fueron los siguientes:
anticuerpos dirigidos contra la lactoferrina (pAb, A0186, DAKO, Dinamarca), MPO (pAb, A0398,
DAKO, Dinamarca), CD15 (clon 4D1 / VIMD5, regalo de Johannes Stöckl , Instituto de
Inmunología, Universidad de Medicina de Viena, Austria), CD15 (clon 2H5, BD Biosciences, EE.
UU.), Lisozima (clon LZ-2, An Der Grub Bioresearch, Austria) y lectinas aglutininas de
cacahuete (PNA; de Arachis hypogea) y se compraron Ulex europaeus agglutinin I (UEA-I)
(Vector Laboratories, EE. UU.). Se usaron estreptavidina o IgG anti-conejo de cabra, IgG anti-
ratón de cabra y anticuerpos IgM anti-ratón de cabra directamente vinculados a Alexa488 o
Alexa546 (ThermoScientific, EE. UU.) Según sea necesario. Las imágenes fueron analizadas
con Fiji.

Citometría de flujo

La sangre completa se mezcló con N-Formil-Met-Leu-Phe (fMLF) (Glycotope, Alemania) a una

concentración final de 5 nM y se incubó durante el tiempo indicado a 37 ° C. La estimulación
se detuvo sumergiendo las células en un tampón de lisis de RBC enfriado en hielo en un
exceso de 20x y centrifugación posterior. Después de completar la lisis de RBC, las células se
fijaron o no, en PFA frío al 3.5% y se permeabilizaron en Reactivo B (kit Fix & Perm, An Der
Grub Bioresearch, Austria). Las muestras se analizaron como se describe (25). El
inmunofenotipo de diagnóstico se evaluó como se publicó anteriormente (26, 27).

Las células polimorfonucleares sometidas a tinción de la superficie CD14 y CD15 se derivaron

como se describe en el manejo y enriquecimiento de neutrófilos y se recogieron en medio
RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero bovino fetal al 10%, filtrado estéril (Sigma-
Aldrich). Las células se tiñeron con anticuerpo anti CD14-PC7 (RMO52, Beckman Coulter) y
anti-CD15 (SSEA-1) -FITC (HI98, BioLegend) a temperatura ambiente durante media hora. Las
células se lavaron una vez con PBS analizado inmediatamente mediante citometría de flujo.

Análisis de la explosión oxidativa

El estallido oxidativo se evaluó como se describió anteriormente (28). Para el análisis, las
células no estimuladas se utilizaron para establecer la puerta para la positividad de AlexaFluor
488.

análisis de expresión de ARN

El ARN de los neutrófilos enriquecidos se extrajo con el kit RNeasy® (Qiagen). La conversión
del cDNA se realizó con la transcriptasa inversa M-MLV (Promega) de acuerdo con el protocolo
del fabricante con 500 ng de ARN como material de partida. El análisis cuantitativo se realizó
con la polimerasa KAPA SYBR® FAST ABI PRISM® en un sistema de PCR en tiempo real
StepOnePlusTM de Applied Biosystems. Los cebadores se diseñaron de modo que solo
amplificaran el ADNc y se probaron en el ADNc de HC para productos no específicos. Se
utilizaron los siguientes cebadores: LTF-forward 5'-AGGAAAAGTGAGGAGGAAGTGG-3 ', LTF-
r e v e r s e 5 ′ - T G G C AT C A G C T T C T C C T T T T C A - 3 ' ; L C N 2 - a d e l a n t e 5 ' -
CACCCTCTACGGGAGAACCA-3 ', LCN2-reverso 5'-GGTCGAT TGGGACAGGGAAG-3';
ALOX15-para la sala 5′-AC AGACGTGGCTGTGAAAGA-3 ', ALOX15-reverse 5′-AAAGA

GACAGGAAACCCTCGG-3 '; OLFM4-forward 5′-GGAGGTG GAGATAAGAAATATGAC-3

'OLFM4-reverse 5′- GACGGTTT GCTGATGTTCAC-3'; VIM-forward 5′-GTGGACCAGCTAAC
CAACGA-3 ', VIM-reverse 5′-CCTGGATTTCCTCTTCGT GGA-3'; SYNE2-for ward 5′-
GAATGAAACCTCTGCCTGTG-3 '; SYNE2-reverse 5′-CGATTTCTCCCTGTAGTTGTG-3 '; MYO
18A-forward 5′-CTTCACCAAGAAACGGCTCC-3 ': MYO18A- reverse 5′-
CTCACTGTCAAACCTCCTCTG-3'; CEACAM1- adelante 5′-
GATCATAGTCACTGAGCTAAGTC-3 '; CEACAM1-reverso 5′-TTTACGTTCAGCATGATGGG-3 ';
H P RT 1 - f o r w a rd 5 ′ - C C C T G G C G T C G T G AT TA G T G - 3 ' ; H P RT 1 - re v e r s e 5 ′ - T C G
AGCAAGACGTTCAGTCC-3 '.

ensayo de quimiotaxis

La quimiotaxis de los neutrófilos se evaluó utilizando el soporte permeable Transwell-96 HTS

con una membrana de policarbonato de poro de 5,0 µm (Corning). Por medición, se colocaron
50,000 neutrófilos en la cámara superior y se incubaron durante 20 minutos a 37 ° C. La
cantidad de neutrófilos migrados hacia el fMLF 5 nM (Glycotope, Alemania) colocado en la
cámara inferior se evaluó mediante citometría de flujo.

etiquetado de S. aureus

Philipp Starkl, PhD (laboratorio de Sylvia Knapp, Centro de Investigación de Medicina

Molecular de la Academia de Ciencias de Austria) proporcionó Staphylococcus aureus (cepa
USA300) cultivada en medio de caldo de soja tríptico. Después de lavar en PBS, las bacterias
se inactivaron por calor a 65 ° C durante 45 min. Las bacterias inactivadas por calor se
recogieron en pH Rojo, SE (Invitrogen) disuelto en NaHCO3 0,1 M y luego se incubaron
durante 1 hora a 37 ° C. Etiquetado

las bacterias se resuspendieron en el volumen apropiado de PBS para una CFU final de 1 ×
1010 / ml, según lo determinaron las diluciones secuenciales de S. aureus antes de la
inactivación por calor.

Ensayo de fagocitosis

Fagocitosis previa inactivada por calor, pH rodeo marcado S. aureus se opsonizó en medio
RPMI 1640 (Gibco) suplementado con suero autólogo al 15% durante 1 hora a 37 ° C. El suero
autólogo se aisló recientemente de la sangre completa usando S-Monovette Z-Gel (Sarstedt)
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las bacterias opsonizadas se incubaron con
neutrófilos a una MOI de 50 a 37 ° C en el baño de agua durante 0, 30 y 60 min. La fagocitosis
posterior a la incubación se detuvo lavando las células en PBS helado. Inmediatamente antes
de la medición, se añadió azul de tripano a la suspensión celular y se evaluó la fagocitosis
mediante citometría de flujo.