Neutrophil Granulocytes in Ovarian Cancer –

Induction of Epithelial-To-Mesenchymal-
Transition and Tumor Cell Migration
Christine Mayer, Silvia Darb-Esfahani, Anne-Sophie Meyer, Katrin Hübner, Joachim Rom,
Christof Sohn, Ioana Braicu, Jalid Sehouli, G. Maria Hänsch, Matthias M. Gaida

Journal of Cancer 2016, 7(5):546-554

doi: 10.7150/jca.14169
 Introducere

 Cancerul reprezintă una dintre principale cauze

ale mortalităţii, cancerul ovarian fiind a şaptea
cauză a deceselor prin cancer în rândul femeilor
şi totodată cea mai agresivă formă de cancer din
sfera ginecologică.
 Simptomele bolii apar de obicei foarte târziu,
boala fiind în cele mai multe cazuri descoperită
Fig.1. Carcinom ovarian
accidental la un examen de rutină sau în stadii http://www.aboutcancer.com/wh1c4001.jpg

deja avansate.
Se observă frecvent infiltrarea leucocitelor
polimorfonucleare (PMN), ridicându-se problema
impactului acestora asupra dezvoltării tumorilor.
Se pune problema dacă proteazele produse de PMN
sunt responsabile pentru inducerea tranziției EMT
E-caderina este o moleculă situată pe suprafața
membranelor celulare cu rol în adeziunea celulelor
învecinate, sunt prezente în toate celulele epiteliale. Fig.2. PMN
Tranziția EMT se caracterizează prin pierderea
https://i.ytimg.com/vi/d351j52UzCA/hqdefault.jpg

moleculelor de E-caderină și scăderea

citokeratinelor
 Materiale și metode

Probe de țesut
 Probele de țesut au fost obținute de la 334 paciente cu carcinom
ovarian care au suferit o intervenție chirurgicală radicală.
 Aceste probe au fost fixate în formol și impregnate în parafină lichidă
pentru examenul histologic.
 Colorație uzuală – hematoxilină-eozină
Imunohistochimia
 Ac primari anti-CD15 (reacționează cu celule PMN), anti-E-caderină
și ZEB1  Ac secundari (Histofine, Simple Stain universal polymer)
 Colorare
 Numărul de neutrofile infiltrate a fost
evaluat folosind un sistem de calcul
semicantitativ (negativ: 0, moderat: 1-19,
mare 20 PMN/ 1 mm câmp microscopic)
 Cantitatea de E-caderină a fost exprimată
procentual calculând intesnsitatea
colorației și distribuția celulelor/câmp

Linii celulare de cancer ovarian

Fig.1: Celule canceroase SKOV-3
Celulele canceroase SKOV-3 au fost cultivate în https://encryptedtbn0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcQn9x_0bD
9oohH6SLgEQ1skCkiviiDK10MJVTsvxfFcOUz4O1TNAw

mediu McCoys cu 10% SFB și 1% PEN-STR la

37°C, iar celulele OVCAR-3 au fost cultivate în
mediu RPMI (10% SFB, 1% PEN-STR și 0.01
mg/ml insulinlă la 37°C).
Izolare PMN și obținerea de lizate PMN
 Sângele a fost recoltat de la donatori
sănătoși, iar PMN au fost izolate prin
centrifugare și ulterior resuspendate în
mediu McCoys.
 Lizatul de PMN a fost obținut prin tehnica
nitrogen cavitation - Celulele sunt
plasate într-un vas sub presiune, cantități
mari de azot sunt dizolvate în celule sub
presiune înaltă. Atunci când presiunea este
eliberată, azotul iese din soluție, rupe Fig.2: Vas sub presiune
celulară și eliberează
https://www.parrinst.com/wp-
membrana content/uploads/2011/09/4636-4639_Cell-w-spout.jpg

conținutul celular (Simpson, 2010).

Incubarea celulelor canceroase cu: PMN, lizat de
PMN, elastază produsă de neutrofile
Celulele SKOV-3 au fost transferate în dispozitive
specifice Lab-TEK, incubate 20 h, după care PMN
izolate, lizatul de PMN și elastaza au fost adăugate
la celule și s-au înregistrat modificările morfologice
ale SKOV-3 (time-lapse video microscopy).
In vitro wound-healing assay Fig.2: Lab-TEK chambered
Celulele SKOV-3 tratate cu elastază au fost cultivate slide
https://www.google.com/search?q=TEK+chambered+slides&source=lnms&t
bm=isch&sa=X&ved=0ahUKEwir1LaNgsDfAhUGXCwKHYdeAMMQ_A
în dispozitive cu 6 godeuri. Folosind vârful pipetei UIDigB&biw=1343&bih=625#imgrc=_tNCxg8psbMDjM:

s-au creat zone libere de celule și a fost evaluată

migrarea celulară față de control (celule netratate).
Izolarea proteinelor, SDS-Page și Western Blot
 Proteinele din celulele SKOV-3 au fost izolate
 Lizatul total a fost folosit pentru analiza citokeratinelor prin
metoda Western Blot, folosind Ac monoclonali de șoarece
 Pentru detectarea degradării E-caderinei celula a fost fracționată
utilizând kitul ProteoExtract subcellular proteome extraction
 S-au folosit Ac monoclonali de iepure pentru E-caderină
 Lizatele și proteinele au fost separate prin SDS-PAGE - proteinele
au fost transferate pe membrane de nitroceluloză
 Membranele au fost incubate cu anticorpii respectivi, iar anticorpii
legați au fost detectați utilizând anticorpi secundari conjugați
(POX)
 control - β-actină
Citometrie în flux
Incubarea celulelor SKOV-3 cu elastază, cu lizat PMN timp de
5h-24h, degradarea E-caderinei se poate evidenția utilizând un
anticorp care se leagă la capătul N-terminal al E-caderinei
Analize statistice
Analiza statistică a fost efectuată folosind GraphPad prism software.
 Rezultate și discuții
Infiltrarea neutrofilelor și tranziția epitelio-mezenchimală la pacientele cu
carcinom ovarian
 Infiltrarea de PMN a fost detectată în toate subtipurile histologice, identificând
morfologia lor, expresia de CD15 și de elastază.
 Molecula de adeziune (E-caderină) este puternic exprimată în celule epiteliale, astfel
în 78 de cazuri s-a observat exprimarea E-caderinei, în timp ce în cazul 153 de probe
s-a observat o colorație slabă sau intermediară, iar în 85 de cazuri colorația a fost
absentă.

Fig.3. Examples of tissue specimens

derived from patients with epithelial
ovarian cancer: On the left panel, tissue
with dense expression of PMN, on the
right panel with low expression of PMN
are shown
 Ca marker pentru tranziția epitelio-mezenchimală, a fost evaluată
expresia ZEB1 în celulele canceroase. ZEB1 inhibă promotorul pentru
E-caderină și induce tranziția EMT.
 Ac primari anti-CD15 reacționează cu celule PMN

Fig.4. Examples of tissue

specimens derived from patients
with epithelial ovarian cancer: On
the left panel, tissue with dense
expression of PMN, on the right
panel with low expression of PMN
are shown
 Elastaza produsă de neutrofile produce
detașarea celulelor și schimabare fenotipică
 A fost observată o detașare progresivă și o
dispersie a celulelor tumorale, însoțită de o
schimbare fenotipică drastică, dar fără apoptoză.
 Au fost obținute imagini după 0h, 1h, 3h și 6h.
Date similare au fost obținute în cazul liniei
OVCAR-3.
 Lizatele PMN au provocat detașarea celulelor,
sugerând astfel rolul proteazelor produse de
PMN în acest proces. Astfel, elastaza purificată
Fig. Elastaza produsă de
induce detașarea celulelor canceroase, însoțită de neutrofile
o schimbare fenotipică. https://en.wikipedia.org/wiki/Neutrophil_elastase#/media/File:Prote
in_ELA2_PDB_1b0f.png
Fig.4. Effect of PMN on
SKOV-3 monolayers:
Tumor cells were grown to
near confluence and PMN,
PMN elastase, or PMN
lysate were added and the
interaction was observed by
time-lapse video
microscopy. Images were
selected from the video clip
after 0 h, 1 h, 3 h, and 6 h,
respectively. The data are
representative for three
experiments performed with
PMN derived from different
individuals.
 Degradarea E-caderinei
 O țintă potențială pentru elastaza neutrofilelor este molecula de adeziune (E-
caderina), care menține legătura între celule.
 Citometria în flux arată o scădere a expresiei E-caderinei atunci când celulele sunt
tratate cu elastază – scăderea fluorescenței cu 70%. De asemenea, lizatele PMN au
redus expresia E-caderinei cu aprox. 30%

netratate
netratate
Tratate cu lizat de
Tratate cu elastază PMN

Fig.4. Effect of elastase or PMN lysate on E-cadherin surface expression

 Degradarea E-caderinei a fost confirmată prin Western blot
 Exprimarea E-caderinei în membrană a fost redusă, în timp ce E-
caderina citosolică nu a fost afectată, astfel se poate afirma faptul că
elastaza țintește doar E-caderina de suprafață.

Fig.4. Western blot

analysis revealed a
significant reduction
of E-cadherin in the
cell membrane but
not in the cytoplasm
Elastaza induce tranziția EMT (epithelial-
to-mesenchymal) în cazul celulelor SKOV-
3
 Detașarea și modificările fenotipice ale
SKOV-3 sunt asociate cu inducerea de
EMT ?
 În acest scop, a fost evaluată expresia
citokeratinelor ca marker pentru celulele
epiteliale
 Prin Western blotting, o scădere de Fig.4. Induction of EMT in SKOV-3 by elastase or
citokeratine a fost observată în cazul PMN lysate

celulelor tratate cu lizat PMN, elastază

 Consecințele funcționale ale EMT în SKOV-3
 mobilitatea celulelor a fost testată utilizând in vitro wound-healing assay
 Celulele tratate cu elastază au ocupat 27% din suprafața goală față de 13%
în cazul celulelor netratate

Fig.3: Migration of SKOV-3 cells: A Cells were grown to

confluence. Then a defined area was scratched (time 0 h) and the
repopulation after 24h was determined by untreated cells or cells
that had been pretreated with elastase
 Concluzii
 Infiltrarea neutrofilelor în tumori a fost observată în majoritatea
cazurilor
 Elastaza este una dintre principalele enzime efectoare în neutrofile,
astfel se observă pierderea E-caderinei în cazul infiltrării neutrofilelor.
 Pierderea E-caderinei de suprafață este datorată scindării de către
elastază produsă de neutrofile, fapt confirmat în acest studiu.
 Pierderea E-caderinei duce la pierderea polarității celulare, fiind un pas
crucial în tranziția EMT, fapt dovedit prin pierderea de citokeratine.
Astfel, induce o detașare progresivă și o dispersie a celulelor tumorale,
În plus, a fost observat un potențial crescut de migrare.