INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

EFECTO DEL pH Y LA CONCENTRACIÓN DE LA

INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA DE LA RIBOFLAVINA

MÉTODOS DE ANÁLISIS
PROFESOR:
Q.B.P. ROSA MARTHA CABRERA MARTÍNEZ

4IM2
SECCIÓN 2

HERNÁNDEZ SOTO ARTEMISA DALA

O
OBJETIVOS
 Comprender el efecto que tiene el pH del medio y la concentración de la
Riboflavina en su intensidad de fluorescencia.
 Compenetrarse en el fenómeno de la fluorescencia.
 Determinar el por qué la Riboflavina fluoresce.

FUNDAMENTO DEL MÉTODO

La espectroscopía de filtros se fundamenta en utilizar un haz de luz ultravioleta, el cual
excita a los electrones de nuestro analito desde su estado basal hasta un estado excitado
y permite que estos emitan luz a una menor longitud de onda.
A diferencia del espectrofluorómetro, el fluorómetro no usa monocromadores para aislar
la luz incidente y la fluorescente, sino, hace uso de filtros para aislar la luz incidente y
fluorescente. La radiación emitida por la muestra es en todas direcciones pero se elige
la que forma un ángulo de 90° con el haz de excitación.

DATOS EXPERIMENTALES E INFORME

Con los datos obtenidos, complete la tabla 5. En un mismo gráfico, construya las rectas
ajustadas por regresión lineal, colocando en el eje de las abscisas la concentración, y en
el eje de las ordenadas la intensidad de emisión, de acuerdo a las condiciones
empleadas.
TABLA 5. RESULTADOS DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN DE RIBOFLAVINA EN
DIFERENTES MEDIOS.
Intensidad de
Intensidad de Intensidad de fluorescencia Intensidad de
Riboflavina fluorescencia fluorescencia en CH3COOH fluorescencia
(ppm) en H2O en HCl 0.1M 0.9M en NaOH 0.1M
0 4.89 4.87 4.87 4.85
1 5.79 5.05 5.73 4.86
2 6.67 5.21 6.28 4.87
3 7.45 5.37 7.27 4.88
4 8.18 5.5 8.03 4.89
5 8.82 5.61 8.58 4.89
10 11.67 6.04 10.93 4.92
50 16.14 6.11 13 4.96
pH 5 1 4 13
Gráfica 1.

RFU en función de las ppm de Riboflavina

18
16
14
12
10
RFU

8
6
4
2
0
0 10 20 30 40 50 60
Riboflavina (ppm)

H2O HCl 0.1M CH3COOH 0.9M NaOH 0.1M

Gráfica 2.

RFU en función de las ppm de Riboflavina

10
9
8
7
6
RFU

5
4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6
Riboflavina (ppm)

H2O HCl CH3COOH NaOH

Linear (H2O) Linear (HCl) Linear (CH3COOH) Linear (NaOH)
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos reflejan que el pH del medio en el que se encuentra la
riboflavina juega un papel muy importante en la cantidad de fluorescencia que emite. En
las gráficas anteriores se puede observar que a pH=1 la fluorescencia emitida por la
riboflavina es baja, esto es debido a que cuando el anillo de isoaloxicina es protonado,
se pierde la conjugación de la estructura y la florescencia se vuelve mínima.
En ácido acético, la riboflavina se encuentra menos protonada que cuando se encuentra
en HCl, así mismo está cerca del pH en el cual su estructura molecular es más estable;
por esta razón sus URF fueron similares a las obtenidas con H2O pH=5.
Cuando el analito se disolvió en agua destilada con pH=5, presentó la mayor cantidad
de unidades relativas de fluorescencia ya que a este valor de pH se alcanza la mayor
estabilidad de la riboflavina, lo cual puede ser traducido como una mayor conjugación en
la estructura de la molécula, y, por ende mayor fluorescencia.
En solventes alcalinos, la riboflavina tiende a romperse por lo que es muy inestable y su
nivel de RFU se considera prácticamente cero. En la práctica se observó cómo en NaOH
la riboflavina se solubilizó rápidamente, lo cual está relacionado con su tendencia a
hidrolizarse en ácido oxocarbónico y urea en medios alcalinos.
La gráfica 1 presenta un comportamiento lineal en concentraciones iguales o menores a
5ppm de analito, mayores a este valor, su comportamiento ya no es lineal. Por lo que
podemos deducir que este método presentará una mayor sensibilidad cuando se trabaja
con concentraciones menores o iguales a 5ppm.
A altas concentraciones el comportamiento lineal se pierde, lo cual puede ser explicado
por una autoabsorción, en la cual la energía fluorescente emitida por las moléculas es
consumida por moléculas adyacentes disminuyendo así el rendimiento cuántico. El
autoamortiguamiento es un factor que también afecta al fenómeno de fluorescencia
cuando el analito se encuentra en altas concentraciones, en este fenómeno las colisiones
entre moléculas aumenta, lo cual genera que la energía absorbida no se pierda en forma
radiante, sino en forma de calor, por ejemplo.

CONCLUSIONES
 Cuanto más estable es una molécula, su emisión de fluorescencia será mayor.
 La fluorescencia de la riboflavina es menor cuando su estructura se encuentra
protonada.
 La riboflavina se descompone a pH fuertemente alcalinos.
 La riboflavina presenta un comportamiento lineal en cuanto a sus RFU en función
de su concentración, en límites menores a 5ppm.
PREGUNTAS ADICIONALES
1. ¿Por qué se deben conocer las longitudes de onda de máxima excitación y de
máxima emisión?
Porque la longitud de onda de absorción o excitación es menor que la longitud de onda
de emisión, por ello se deben de generar 2 espectros, uno de absorción en el que se
modifique la longitud de onda del filtro de excitación y se mantenga constante la longitud
de onda del filtro de emisión, de igual manera se debe construir un espectro de emisión
en el que la variable sea la longitud de onda del filtro de excitación. Realizado esto, se
eligen las longitudes de onda de trabajo adecuadas.

2. Diga cuáles son las formas coenzimáticas de la riboflavina y cuál es su papel en

el metabolismo celular.
La riboflavina en forma de FAD es parte de la cadena de
transporte de electrones, que es fundamental en la producción de
energía. La glutatión reductasa utiliza al FAD para generar las dos
moléculas que perdió al oxidarse, el papel del FAD en este
proceso es de suma importancia para proteger al organismo
contra las especies reactivas del oxígeno.
El FAD es usado por la hipoxantina y xantina para producir ácido
úrico, el cual es un antioxidante presente en el torrente
sanguíneo.

El flavin mononucleótido FMN es un agente oxidante

más fuerte que el NAD+ y es útil debido a que puede
transferiri uno o dos electrones, pero es más
costoso de producir.
 3. Estructura resonante de la Riboflavina a pH ácido, neutro y alcalino

4. Diferencias entre la fluorescencia y fosforescencia.

 En la fosforescencia la transición electrónica implica un cambio en el spin
electrónico, lo cual implica que en el estado triplete excitado se encuentran dos
electrones con espines paralelos y que al momento de regresar al estado
fundamental, el electrón con spin invertido deberá invertir nuevamente su spin.
 En la fluorescencia la luz absorbida es emitida en forma de radiación de menor
longitud de onda en un intervalo de tiempo de aproximadamente 10-8 s, si el tiempo
es mayor, hablamos de fosforescencia.
 A diferencia de la fosforescencia, la fluorescencia tiene lugar únicamente mientras
dure el estímulo que la produce.

BIBLIOGRAFÍA
- Hu, C.; Sun, W.; Cao, J.; Gao, P.; Wang, J.; Fan, J.; Song, F.; Sun, S.; Peng, X.
A. (2013) Ratiometric Near-Infrared Fluorescent Probe for Hydrazine and Its in
Vivo Applications. Org. Lett., pag. 110-112
- D. Freifelder. (2003). Physical Biochemistry. 2° edición. USA: Ed. W. H. Freeman
and Company. Pp 201-202