Alice Sakuma (Instituto Adolfo Lutz) - Validação de Métodos Analíticos

Instituto Adolfo Lutz
METROALIMENTOS
Validação de Métodos Analíticos
São Paulo, 25 de setembro de 2008
1 ALICE M. SAKUMA
Validação (NBR ISO IEC 17025 item 5.4.5.1)
“É a confirmação por fornecimento de evidência

objetiva, que os requisitos específicos do método
para um determinado uso foram satisfeitos para o
uso pretendido”
2 ALICE M. SAKUMA
NORMAS/GUIAS/MANUAIS PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
INMETRO
ANVISA
AOAC
FDA
IUPAC
EURACHEM
CODEX
NATA
EUROPEAN COMMUNITIES
PERIÓDICOS EM GERAL
3 ALICE M. SAKUMA
Validação de um método analítico
Características de desempenho
Limitações de um método
Identificação das influências que podem alterar
essas características e qual extensão
4 ALICE M. SAKUMA
Quando deve ser validado:
Modificações no método normalizado

Novo método desenvolvido para um problema
específico
Método estabelecido utilizado em laboratórios
diferentes, equipamentos diferentes ou equipes
distintas
Situações fora do controle interno da qualidade
Desempenho insatisfatório em PEP
Demonstração de equivalência entre dois
métodos (ex: um método novo rápido x método
normalizado)
5 ALICE M. SAKUMA
Verificação de um método analítico
É a confirmação, por fornecimento de evidência

objetiva, que os dados das características analíticas
fornecidos por um produtor, um laboratório ou instituição
de referência foram alcançados
As ferramentas são as mesmas da validação

O laboratório só precisa verificar se as características
de desempenho documentadas podem ser cumpridas
(ex: acurácia)
6 ALICE M. SAKUMA
Critérios de decisão para a extensão de uma validação
Condições técnicas e pessoal capacitado

Ponto de vista
Complexidade do método
analítico
Nível de concentração
Risco potencial para o cliente/empresa

Ponto de vista Objetivo real da validação
político Considerações sobre legislação ou
outros requisitos
7 ALICE M. SAKUMA
Classificação de um método
Análise de contaminantes (resíduos de

pesticidas, metais pesados)
Análise de composição dos alimentos
Medidas físicas (pH, condutividade)
Determinações qualitativas
Métodos microbiológicos
8 ALICE M. SAKUMA
Parâmetros da validação para cada tipo de método

Parâmetro Análise de Análise de Métodos Métodos Métodos Métodos Métodos
contaminan Constituin- convencio- sem Físicos Qualita- Bacterio-
-tes tes nais calibra- tivos lógicos
ção
Descrição X X X X X X X
do método
Calibração X X X X
Faixa de X X X X X X X
trabalho
Limite de X X X X
Detecção
Limite de X X
Quantificação
X X X
Recuperação
Repetitividade X X X X X X
Acurácia X X X X
Epecificidade X X X X X
Reprodutibilid Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível

ade
9 ALICE M. SAKUMA
Necessidades comuns de validação para métodos

conhecidos
Método Acurácia Precisão Seletividade Linearidade Limites Detecção e Robustez
Quantificação
AAS,AES,ICP, x X X X X X
UV-VIS
Polarografia X X X X X
Titulação X X X
Umidade X X X X
Comatografia X X X X X X
Espectroscopi X X X X X X
a
TOC X X X X
Eletroforese X X X X X X
Capilar
Imuno ensaio X X X X X X
10 ALICE M. SAKUMA
Determinação das características do método
Calibração Faixa de Trabalho Acurácia
Limite de detecção Veracidade

Linearidade Limite de Precisão
Sensibilidade quantificação Repetitividade
Reprodutibilidade
Robustez Seletividade
11 ALICE M. SAKUMA
Limite de detecção
Precisão
Linearidade Limite de
Repetitividade
Sensibilidade quantificação
Reprodutibilidade
12 ALICE M. SAKUMA
Características da
calibração: Coeficiente de Correlação
Linearidade R2>0,99
Sensibilidade
Linearidade é determinada pelo

coeficiente de correlação da curva
Sensibilidade é determinada pelo

coeficiente da curva de calibração
13 ALICE M. SAKUMA
Linearidade
Detrminada com o uso de padrões com diferentes

concentrações e cálculo da regressão
Cinco concentrações de padrão, se a linearidade é

satisfeita; caso contrário, usar mais padrões
14 ALICE M. SAKUMA
Calibração
Valores de calibração devem ser aplicados dentro da

faixa de trabalho
Menor concentração da curva deve ser o limite de
quantificação
Usar soluções padrão, ou curva de adição de padrão
Usar pelo menos cinco concentrações do padrão
Sensibilidade (resolução)
Pode ser determinada:
A meio da curva de calibração

Pelo uso de amostras com diferentes concentrações
15 ALICE M. SAKUMA

Reprodutibilidade
16 ALICE M. SAKUMA
Faixa de trabalho
Faixa de concentração do analito no qual o

método pode ser aplicado com acurácia e precisão
Determinação do intervalo de trabalho:

– Diferentes matrizes
– Variando as concentrações
17 ALICE M. SAKUMA
Características da Faixa
Limite de detecção
XLOD=3.sL/b ( Método do Branco)
XLOD=3.sxo (Método da Curva de Calibração)

LOD
XLOD : limite de detecção
sL : Desvio padrão do branco
Sxo : Desvio padrão da curva de calibração
b: coeficiente angular da curva de calibração
Convenção XLOD = média branco + 3.sL
18 ALICE M. SAKUMA
Características da Faixa
Limite de quantificação
XLOQ=9.sL/b ( Método do Branco)
XLOQ=11.sxo (Método da Curva de Calibração)
LOQ
XLOQ : limite de quantificação
sL : Desvio padrão do branco
Sxo : Desvio padrão da curva de calibração
b: coeficiente angular da curva de calibração
Várias
XLOD = 5 ou 6 ou 10.sL
convenções
19 ALICE M. SAKUMA
Técnicas X Limite de Quantificação X Legislação
Técnica Limite de Limite para água

quantificação mgL-1 de diálise mgL-1
Alumínio Alumínio
AAS Chama 1,1
AAS Forno 0,002

0,01
ICP OES 0,040
ICP MS 0,001
20

Reprodutibilidade
21 ALICE M. SAKUMA
Acurácia = Precisão + veracidade Instituto Adolfo Lutz
Acurácia
Grau de concordância dos resultados experimentais com o valor

de referência aceito ou valor verdadeiro convencional = exatidão
do método analítico
a) Precisão
Grau de concordância entre resultados de ensaios independentes

obtidos sob condições específicas
Recuperação/
Repetitividade Reprodutibilidade Incerteza
Bias
b) Veracidade
Erro sistemático/Valor correto

22 ALICE M. SAKUMA
Desvios aleatórios e sistemáticos
Preciso e Correto Impreciso mas correto
Preciso mas incorreto Impreciso e errado
23 ALICE M. SAKUMA
Características da Acurácia
Medida da veracidade, incluindo erros

a) Veracidade sistemáticos e aleatórios (uso de MRC,
comparação com método de referência)
Medida do grau de repetitividade, incluindo

b) Precisão
erros sistemáticos
Repetitividade:
um laboratório Reprodutibilidade
ou : mais que um
Reprodutibilidade laboratório
interna
24 ALICE M. SAKUMA
Veracidade
Utiliza um dos seguintes métodos para assegurar

veracidade:
Análise de MRC
Participação em PI
Comparação com método de refer6encia
Se não disponível:
Documente qualquer dado que prove veracidade
Providencie MRC
Use um método similar em paralelo
25 ALICE M. SAKUMA
Precisão
Grau de concordância entre resultados de ensaios

independentes obtidos sob condições específicas
Geralmente expressa como desvio-padrão ou desvio-padrão
relativo;
As medições mais comuns de precisão são: repetitividade,
precisão intermediária e reprodutibilidade
Depende da concentração do analito

Repetitividade:
Mesma amostra
Mesmo método
Mesmo analista
Mesmo laboratório
Curto espaço de tempo
26 ALICE M. SAKUMA
Recuperação
Determinada com a adição do analito à matriz

Matriz deve ser homogenea, livre do analito ou em
concentração abaixo do LOQ, ou preparar uma matriz
de composição similar
Recuperação só poderá ser feita se o analito estiver
disponível na forma pura e na mesma forma que
ocorre na natureza
27 ALICE M. SAKUMA
Concentração analito versus RSD e recuperação
Conc. analito Razão analito% Unidade RSD % Recuperação
%
100 1 100% 1,3 98-102
10 10-1 10% 2,8 98-102
1 10-2 1% 2,7 97-103

0,1 10-3 0,1% 3,7 95-105
0,01 10-4 100 ppm 5,3 90-107
0,001 10-5 10 ppm 7,3 80-110
0,0001 10-6 1 ppm 11 80-110
0,00001 10-7 100 ppb 15 80-110
0,000001 10-8 10 ppb 21 60-115
0,0000001 10-9 1 ppb 30 40-120
28 Fonte: Huber, L, 1998

Correção pela Recuperação
Análise de uma amostra X

% Recuperação do método=70%
Limite da legislação: 5 µg/kg
Laboratório Resultado Recuperação Conclusão

(µg/kg)
A 4,0 Sem correção Satisfatório
B 6,8 Corrigido Insatisfatório
29
Reprodutibilidade
Comparação de Desvio padrão

Interna
Desvio padrão de replicatas
Participação em PEP
Externa
Participação em PI
30 ALICE M. SAKUMA
CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO DE REPETITIVIDADE E

REPRODUTIBILIDADE
Conc. Repetitividade CV Reprodutibilidade CV
C > 1 ppm < 14% < 19%
100 ppb < C ≤ 1ppm < 18% < 25%
10 ppb < C ≤ 100 ppb < 22% < 34%
1 ppb < C ≤ 10 ppb < 32% < 46%
C ≤ 1ppb < 36% < 54%
Fonte: FAO
31
Participação em PEP ou Estudos colaborativos
PEP - Método mais aceito para a validação
Estudos Colaborativos - Vários problemas

práticos para quem organiza
Custo, tempo
Coordenação
Remessa de amostras
Análise estatística e interpretação de
resultados.
32 ALICE M. SAKUMA
Análise de Materiais de Referência
Geralmente aceito na validação de método

Materiais fornecidos com certificados
O analista deve demonstrar que o método é exato e preciso
33 ALICE M. SAKUMA

Reprodutibilidade
34 ALICE M. SAKUMA
Seletividade e Especificidade
Extensão no qual um analito pode ser

determinado em uma mistura complexa
Seletividade/
Especificidade
Demonstra interferentes e restrição ao uso do

método
Codex recomenda o uso do termo seletividade

35 ALICE M. SAKUMA

Reprodutibilidade
36 ALICE M. SAKUMA
Robustez
Mede a sensibilidade que um método apresenta, face a

pequenas variações:
Tempo
Temperatura
Marca de reagente
Tamanho da amostra
Concentração de ácido
Agitação
É determinada pelo teste de Youden
37 ALICE M. SAKUMA
Validação é sempre o equilíbrio entre custos, riscos e

possibilidades técnicas
38 ALICE M. SAKUMA
Muito Obrigada!
Alice M. Sakuma
Fone: 11 3068 2915
Alice@ial.sp.gov.br
39 ALICE M. SAKUMA

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Validação (NBR ISO IEC 17025 item 5.4.5.1)

“É a confirmação por fornecimento de evidência

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Validação de um método analítico

Quando deve ser validado:

Modificações no método normalizado

Verificação de um método analítico

É a confirmação, por fornecimento de evidência

As ferramentas são as mesmas da validação

Critérios de decisão para a extensão de uma validação

Condições técnicas e pessoal capacitado

Risco potencial para o cliente/empresa

Análise de contaminantes (resíduos de

Parâmetros da validação para cada tipo de método

Reprodutibilid Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível Se possível

Necessidades comuns de validação para métodos

Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção Veracidade

Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Determinação das características do método

Linearidade é determinada pelo

Sensibilidade é determinada pelo

Detrminada com o uso de padrões com diferentes

Cinco concentrações de padrão, se a linearidade é

Valores de calibração devem ser aplicados dentro da

Pode ser determinada:

A meio da curva de calibração

Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção Veracidade

Faixa de concentração do analito no qual o

Determinação do intervalo de trabalho:

XLOD=3.sL/b ( Método do Branco)

XLOD=3.sxo (Método da Curva de Calibração)

Convenção XLOD = média branco + 3.sL

XLOQ=9.sL/b ( Método do Branco)

XLOQ=11.sxo (Método da Curva de Calibração)

Técnicas X Limite de Quantificação X Legislação

Técnica Limite de Limite para água

AAS Forno 0,002

Determinação das características do método

Calibração Faixa de Trabalho Acurácia

Limite de detecção Veracidade

Grau de concordância dos resultados experimentais com o valor

Grau de concordância entre resultados de ensaios independentes

Erro sistemático/Valor correto

Desvios aleatórios e sistemáticos

Preciso e Correto Impreciso mas correto

Preciso mas incorreto Impreciso e errado

Medida da veracidade, incluindo erros

Medida do grau de repetitividade, incluindo

Utiliza um dos seguintes métodos para assegurar

Grau de concordância entre resultados de ensaios

Depende da concentração do analito

Determinada com a adição do analito à matriz

100 1 100% 1,3 98-102

10 10-1 10% 2,8 98-102

1 10-2 1% 2,7 97-103