PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA ENTEROBACTERIAS

IDENTIFICACIÓN MICROBIANA Se entiende por identificación microbiana al

conjunto de técnicas y procedimientos que se aplican para establecer la
identidad de un microorganismo.
MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA
Los métodos más utilizados para la identificación microbiana, los podemos
clasificar en:
 Métodos basados en criterios morfológicos
 Métodos basados en tinción diferencial
 Métodos basados en pruebas bioquímicas
 Métodos basados en tipificación con fagos
 Métodos basados en pruebas serológicas
 Métodos basados en detección molecular
MÉTODOS BASADOS EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS
 Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar
bacterias.
 Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es
capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación
de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc.
Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies
diferentes con base a pruebas bioquímicas.
Por ejemplo, las bacterias entéricas gram negativas, forman un grupo muy
grande y heterogéneo cuyo hábitat natural es el tracto gastrointestinal de
humanos y otros animales. Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios
patógenos que causan síndromes diarreicos.
 Existen flujogramas, para la identificación bacteriana, mediante pruebas
bioquímicas de microorganismos. Por ejemplo, la presencia de un coco
bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa, oxidasa negativo,
nos indica la presencia de una enterobacteria, para determinar su género
podemos seguir el siguiente esquema.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
 Citrato
 Ureasa
 Voges-Proskauer
 Rojo de metilo
 Sulfuro Indol Movilidad (SIM)
 Movilida, Indol, Ornitina (MIO)
 Triple azúcar Herro (TSI)
 Agar Lisina Hierro (LIA)
 Citrato
 COLOR: VERDE INDICADOR: AZUL DE BROMOCRESOL SUSTRATO
PRINCIPAL: CITRATO DE SODIO
PRINCIPIO Es una sal del ácido cítrico. Algunas bacterias pueden obtener
energía de fuentes distintas de la fermentación de los hidratos de carbono, con
el citrato como única fuente de carbono.
 La medición de esta característica es importante para identificar muchos
miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para
detectar la utilización del citrato por las bacterias que se van a probar debe
carecer de proteínas e hidratos de carbono como fuente de carbono.
 La utilización del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el
medio de citrato por la producción de subproductos alcalinos.
 El medio contiene citrato de sodio, que es un anión, como única fuente de
carbono, y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias
que pueden utilizar el citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de
amonio, con producción de amoniaco (NH+), lo que produce la
alcalinización del medio por conversión del NH a hidróxido de amonio
(NH4OH).
 El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y
azul por encima de pH 7,6.
MEDIO DE CULTIVO
El medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la fórmula de Simmons.
El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de flauta).
La fórmula del medio de citrato de Simmons es la siguiente:
 Fosfato de amonio dihidrogenado 1 g
 Fosfato dipotasico 1 g
 Cloruro de sodio 5 g
 Citrato de sodio 2 g
 Sulfato de magnesio 0 ,20 g
 Agar 15 g
 Azul de bromotimol 0 ,08 g
 Agua destilada 1 L
 pH final = 6,9
PROCEDIMIENTO Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio
de aislamiento primario y se siembra en forma de estría única en el pico de flauta
(agar inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 °C durante 24 a
48 horas.
RESULTADOS La prueba positiva está representada por la producción de color
azul oscuro en el término de 24 a 48 horas, que indica que el microorganismo en
prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formación
de productos alcalinos.
  La prueba también puede considerarse positiva sin que haya color azul, si
hay desarrollo visible en la estría de siembra. Esto es válido porque para
que el desarrollo sea visible, el microorganismo debió haber ingresado en
la fase logarítmica de crecimiento, lo que solo es posible si ha asimilado
carbono y nitrógeno.
Microorganismos Positivos Microorganismos Negativos
Salmonella Edwarsiella
Arizona Yersinia enterocolítica
Citrobacter Escherichia coli
Enterobacter Shigella
Klebsiella Yersinia pseudotuberculosis
Serratia licuefaciensis Otras especies de Moraxella
Pseudomonas cepacia Proteus morganii

Ureasa
 COLOR: ROSADO
 INDICADOR: ROJO FENOL
 SUSTRATO PRINCIPAL: UREA
PRINCIPIO
 Es una diamida del ácido carbónico
 Todas las amidas se hidrolizan fácilmente, con liberación de amoniaco y
dióxido de carbono.
 El amoniaco reacciona en solución para formar carbonato de amonio, lo que
produce alcalinización y aumento de pH del medio.
MEDIOS DE CULTIVO
Los dos medios utilizados con mayor frecuencia son el caldo urea de Stuart y el
agar urea de Christensen.
PROCEDIMIENTO El medio liquido se siembra con un ansa de cultivo puro del
microorganismo por probar. La superficie inclinada del agar (pico de flauta) se
siembra en estría con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban
a 35 °C durante 18 a 24 horas.
RESULTADOS Los microorganismos que hidrolizan la urea rápidamente pueden
producir reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos activas pueden
requerir 3 días o más. Las reacciones son las siguientes:
 Caldo de Stuart: Un color rojo en todo el medio indica alcalinización e
hidrolisis de la urea.
 Agar de Christensen: Degradadores rápidos de la urea (especies de
Proteus): color rojo en todo el medio. Degradadores lentos de la urea
(especies de Klebsiella): inicialmente color rojo solo en el pico de flauta,
que gradualmente se extiende a todo el tubo.
  Ausencia de hidrolisis de la urea: el medio conserva su color amarillo
original.

Microorganismos positivos Microorganismos negativos

Klebsiella Escherichia coli
Proteus (rápido) Providencia

Voges- Proskauer
 El acido pirúvico, se metaboliza da como resultado la producción de
acetoina (acetil metil carbinol)
 Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-Hafnia-Serratia
producen acetoina como producto metabólico final principal del
metabolismo de la glucosa y forman cantidades pequeñas de ácidos mixtos.
 En presencia de oxigeno atmosférico e hidróxido de potasio al 40%, la
acetoina se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para
producir un complejo de color rojo.
MEDIOS DE CULTIVO A. Caldo VP/RM El medio utilizado con mayor frecuencia
es el caldo de rojo de metilo- Voges-Proskauer (MR/VP) según la fórmula de
Clark y Lubs.
PROCEDIMIENTO Sembrar un tubo de caldo MR/VP con un cultivo puro del
microorganismo por probar.
 Incubar 24 horas a 35 °C.
 Finalizada la incubación, transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio.
 Agregar 0,6 ml de a-naftol al 5%, seguidos de 0,2 ml de KOH al 40%.
 Es esencial que los reactivos sean agregados en ese orden.
 Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosférico y
dejar el tubo en reposo durante 10 a 15 minutos.
RESULTADOS
 Positivo: desarrollo de color rojo 15 minutos o más después del agregado de
los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidación
de la acetoina. La prueba no debe leerse más allá de una hora después de
dejar los tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos
pueden producir un color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo
falso.

Microorganismos positivos Microorganismos negativos

Klebsiella pneuminiae Escherichia coli
Yersinia enterocolítica K. ozaenae
Rojo de Metilo
PRINCIPIO
 El rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4
(rojo).
 El pH al cual el rojo de metilo detecta los ácidos es mucho más bajo que el
pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo
bacteriológicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el
microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de ácido del
sustrato de hidratos de carbono que se utilice.
 La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la producción de
ácido, que requiere que los microorganismos positivos produzcan ácidos
fuertes (lactico, acetico, formico) de la glucosa.
MEDIOS DE CULTIVO A. Caldo VP/RM El medio utilizado con mayor frecuencia
es el caldo de rojo de metilo- Voges-Proskauer (MR/VP) según la fórmula de
Clark y Lubs.
PROCEDIMIENTO
 Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio.
 Incubar el caldo a 35 °C durante 48 a 72 horas (no menos de 48 horas).
 Finalizada la incubación, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de metilo
directamente al caldo.
RESULTADOS
 Positivo: El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica
la suficiente producción de ácido como para disminuir el pH a 4,4.
 Negativo: Como otros microorganismos pueden producir pequeñas
cantidades de ácido del sustrato probado, puede observarse un color naranja,
intermedio entre amarillo y rojo. Esto no indica una prueba positiva.

Microorganismos positivos Microorganismos negativos

Escherichia coli Enterobacter aerógenes
Especies de Yersinia Enterobacter cloacae
----------- Klebsiella

TSI: Triple azúcar Hierro

MEDIO DE CULTIVO Agar hierro de klinger (AHK)
 Composición: Extracto de carne, Extracto de levadura Peptona Proteasa
Lactosa Dextrosa Sulfato ferroso Cloruro de Na Tiosulfato de Na Agar Agua
destilada Indicador: Rojo fenol Ácido: amarillo Alcalino: Rojo Medio no
inoculado: naranja rojizo, pH 7.4
PRINCIPIO
 Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono
específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción
o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico.
La fermentación es un proceso que se lleva a cabo en condiciones aeróbicas
(pico de flauta) y anaeróbicamente (capa inferior)
 El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y concentración 10
veces mayor de lactosa. Las enterobacterias y los fermentadores de glucosa
comienzan metabolizando este azúcar. Una vez que se ha reducido toda la
glucosa piruvato, este se metaboliza por el ciclo de Krebs formando
productos finales ácidos.
 El ácido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol. A
6 horas de la incubación, la zona de la estría y el fondo del tubo tendrán
un color amarillo (fermentador de glucosa)
 Si el fondo permanece rojo, no hay variación de pH (no fermentador de
glucosa) Si el color rojo es mas intenso que el original, hay alcalinización
(no es miembro de la familia enterobacteriaceae)
 Al agotar la glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa. Después de 18-
24 hrs, el medio permanece amarillo, reacción ácido sobre ácido (A/A).
Fermentador de lactosa. La producción de gas romperá el agar o lo
empujara hacia arriba. Reacción A/A más gas.
 Si no utiliza la lactosa, hará uso de proteínas o aminoácidos. El metabolismo
proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el oxígeno
es abundante. 18-24 hrs de incubación: zona inclinada roja fondo del agar
amarillo (metabolismo anaerobio de glucosa inicial). Reacción alcalina
sobre ácido K/A.
PROCEDIMIENTO
 Inoculación: picadura y estría en pico de flauta. Tiempo: 18-24 hrs
Temperatura:35-37°C
RESULTADOS
 K/A: fermentación de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad
ácida). Característico de bacterias no fermentadores de lactosa como
Shigella.
 A/A: fermentación de glucosa y lactosa (Pico de flauta ácido/ profundidad
ácida).Característicos de E. coli y grupo Klebsiella-Enterobacter.
 K/K: No fermentación de glucosa y lactosa (pico de flauta
alcalino/profundidad alcalina). Característico de bacterias no fermentadoras
como Pseudomas aeruginosa

LIA: Agar Lisina Hierro

 COLOR: LILA
 INDICADOR: PÚRPURA DE BROMOCRESOL
 SUSTRATOS PRINCIPALES: LISINA Y HLUCOSA
MEDIO DE CULTIVO Base de descarboxilasa de Moller
Composición:
 Peptona
 Extracto de carne
 Piridoxal L-lisina
 Citrato de amonio
 Tiosulfato de sodio
 Glucosa
 Agua destilada
 Agar
 Indicador de pH: Purpura de bromocresol
Ácido: Amarillo pH 5.2
Alcalino: Púrpura pH 6.8
Medio no inoculado: Purpura intenso brillante pH 6.0
PRINCIPIO Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar
un aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina con la consiguiente
alcalinidad.
PROCEDIMIENTO
 Inoculación: por picadura y estría, inóculo liviano. Temperatura: 35-37°C
Tiempo 18-24 hrs
RESULTADOS
 A: ácido
 K: alcalino
 N: neutra
 R: Rojo (desaminación oxidativa)

Agar sangre
El agar sangre es una combinación de un agar base (agar nutritivo) con fuente
proteica (digeridos trípticos, digeridos proteicos de soja) el cual tiene un
agregado de 5 % de sangre ovina, (también puede usarse sangre humana, para
cultivos en una placa de Agar) con una pequeña cantidad de hidratos de carbono
naturales y cloruro sódico.
 Se usa para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos
(que es un factor de virulencia). Observando los halos hemolíticos alrededor
de las colonias se determina el tipo de hemólisis que posee:
Alfa: halos verdosos Beta: halos incoloros Gamma: inexistencia de halos.

 Hemólisis alfa: la hemolisis alfa se reduce a partir de una zona parda o

verdosa alrededor de las colonias
 Hemólisis beta: en la hemolisis beta, las bacterias sintetizan una hemolisina
que origina una zona de lisis transparente alrededor de las mismas
 Hemólisis Gamma