Biotecnología – Trabajos Prácticos

CINÉTICA ENZIMÁTICA
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica y estructural que catalizan reacciones químicas. Casi todos los
procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a velocidades significativas.
A las reacciones mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas. En éstas el sustrato se une
reversiblemente a la enzima, formando el complejo enzima-sustrato, luego la enzima cataliza la reacción y libera el producto.
Aquellas condiciones que desnaturalizan una proteína, como temperaturas elevadas, pH extremos o altas concentraciones de
sal, dificultan o impiden la actividad enzimática, mientras que elevadas concentraciones de sustrato tienden a incrementar la
actividad.
La ecuación de Michaelis-Menten relaciona la velocidad de una reacción con la concentración de sustrato.

Vmax . [S]
v=
Km + [S]

Dado que es difícil estimar los valores de Km y Vmax en gráficas no lineales, se recurre a la linealizacion de Michaelis-
Menten propuesta por Lineweaver-Burk.

1 Km 1 1
= +
v Vmax [S] Vmax

La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y Vmax; el punto de corte con el eje de
ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmáx, y el de abscisas es el valor de -1/Km.

Inhibición enzimática:

Los inhibidores enzimáticos reversibles pueden ser clasificados como competitivos, no competitivos y mixtos, según el
efecto que produzcan en las constantes cinéticas Km y Vmax. Este efecto dependerá de que el inhibidor se una a la enzima
E, al complejo enzima-sustrato ES o a ambos.
 Inhibición competitiva: el inhibidor compite con el sustrato por el sitio activo. El valor de Km aumenta en presencia
de inhibidor, por lo que la velocidad de formación de producto disminuirá. Sin embargo, Vmax no se ve afectada.
 Inhibición no competitiva: el inhibidor evita que la reacción se lleve a cabo. No compite por los sitios activos. Sólo se
verá afectada Vmax, la cual disminuye a mayor concentración de inhibidor.

EJERCITACIÓN

1) De acuerdo a los siguientes datos, representar las curvas de Michaelis-Menten.

Curva N° Km (mM) Vmax (µmol/seg)

1 1,0 50
2 2,0 50
3 5,0 50

a) Cuál de las enzimas llega más fácilmente a la saturación?

b) Cuál de las enzimas es más rápida a concentraciones saturantes?
c) Calcular el valor de v cuando [S] = 10 mM para cada una de las enzimas.

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2) Repetir el ejercicio anterior, con los siguientes valores.

Curva N° Km (mM) Vmax (µmol/seg)

1 1,0 10
2 1,0 8
3 1,0 6

3) Repetir el ejercicio anterior, con los siguientes valores.

Curva N° Km (mM) Vmax (µmol/seg)

1 1,5 20
2 2,8 14
3 3,3 14

4) La hidrólisis de N-glutaril-L-fenilalanina-p-nitroanilida (GPNA) para dar p-nitroanilina y N-glutaril-L-fenilalanina, está

catalizada por la enzima -quimotripsina. En determinadas condiciones de pH y temperatura, los datos cinéticos
obtenidos han sido los siguientes. Asumiendo una cinética de tipo Michaelis-Menten, calcular gráficamente el valor
de Vmax y Km.

[GPNA] (10-4 M) 2,5 5,0 10,0 15,0

v (mmol/L.min) 2,11 3,73 5,90 7,10

5) La fumarasa cataliza la reacción de hidratación que transforma el fumarato en L-malato. Cuando se utilizó como
sustrato el fumarato, una concentración de enzima de 2x106 M y se midió la velocidad inicial de la reacción de
hidratación a pH 5,7 y a 25 °C se obtuvieron los sig. datos. Calcular Km y Vmax mediante la representación grafica
de Lineweaver-Burk.

[fumarato] (mM) 2,0 3,3 5,0 10,0

v (mmol/L.min) 2,5 3,1 3,6 4,2

6) Teniendo en cuenta la reacción anterior, se midió la velocidad inicial de hidratación, expresada como milimoles por
litro de fumarato hidratados por minutos, en función del pH para distintas concentraciones de sustrato, y se
obtuvieron los siguientes datos:

Concentración de sustrato
pH
10 mM 5 mM 2,5 mM 1,25 mM
5 0,92 0,81 0,66 0,48
6 4,00 3,28 2,42 1,60
7 5,40 4,30 3,08 1,96
8 2,67 2,40 1,99 1,53
9 0,21 0,19 0,16 0,12

Por otra parte, la velocidad máxima inicial de la deshidratación del L-malato catalizada por la fumarasa tiene la
siguiente dependencia de pH:

pH 5 6 7 8 9
Vmax (mmol/L.min) 0,068 0,44 3,0 5,68 2,0

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a) Calcular el valor de Km y Vmax de la reacción de hidratación para cada valor de pH.

b) Los valores máximos de las velocidades de las reacciones directas e indirectas, alcanzan el mismo pH?

7) La penicilina es hidrolizada y con ello inactivada por la penicilasa, una enzima presente en algunas bacterias
resistentes a la penicilina. La cantidad de penicilina hidrolizada en un minuto en una disolución de 10 ml que
contiene 10-9 g de penicilasa purificada se midió como función de la concentración de penicilina. Suponiendo que la
concentración de penicilina no cambia apreciablemente durante el ensayo, representar 1/v frente a 1/S a partir de
los siguientes datos. ¿Sigue la penicilasa una cinética de Michaelis-Menten? Si es así, determine Vmax y Km.

[penicilina] 10-5 M 10-9 moles hidrolizados/min

0,1 0,11
0,3 0,25
0,5 0,34
1 0,45
3 0,58
5 0,61

8) Se obtuvieron los siguientes datos de velocidad para una reacción catalizada por un enzima en presencia y ausencia
de un inhibidor cuya concentración fue 2 mM. Determinar qué tipo de inhibición ajusta con los datos
experimentales, calcular Km, Vmax, Ki (constante de disociación para el complejo enzima-inhibidor) y representar
gráficamente los datos por Michaelis-Menten.

[sustrato] (mM) 2 4 8 12 16

v I = 0 mM 1,37 2,13 2,95 3,38 3,65

(µmol/min) I = 2 mM 1,18 1,89 2,72 3,18 3,47

9) Se estudia la cinética de una enzima en ausencia y presencia de un inhibidor A, a una concentración 10 mM. La
velocidad inicial viene dada en función de la concentración de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes.
Determine Vmax, Km y Ki. ¿Qué tipo de inhibición se produce?

[sustrato] (mM) 1,25 1,67 2,50 5,00 10,00

Sin inhibidor 1,72 2,04 2,63 3,33 4,17
v (µmol/min)
Con inhibidor 0,98 1,17 1,47 1,96 2,38

10) El salicilato inhibe la acción catalítica de la glutamato deshidrogenasa. Determinar el tipo de inhibición mediante
el análisis gráfico de los siguientes datos. Suponer que la concentración de salicilato se mantiene constante y es
de 40 mM. Calcule Vmax, Km y Ki.

[sustrato] (mM) 1,5 2,0 3,0 4,0 8,0 16,0

v Sin inhibidor 0,21 0,25 0,28 0,33 0,44 0,40

(mg/min) Con inhibidor 0,08 0,10 0,12 0,13 0,16 0,18

11) A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar el tipo de inhibición, Vmax, Km y Ki.

[sustrato] (mM) 2,0 3,0 4,0 10,0 15,0

I = 0 mM 139 179 213 313 370
v (g/h)
I = 6 mM 88 121 149 257 313