UNIVERSIDAD DEL VALLE

FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
CURSO DE LABORATORIO DE
BIOLOGÍA CELULAR Y BIOQUÍMICA II
Prof. Enrique Bravo M.
TRANSAMINACIÓN

La transaminación es una de las reacciones celulares más importantes del catabolismo y de la

biosíntesis de los aminoácidos.
Durante la reacción de transaminación se transfiere el grupo -amino de un aminoácido al
carbono alfa de un -cetoácido, dando como productos, un nuevo aminoácido y un nuevo -
cetoácido.
La transaminación es una de las primeras reacciones en las rutas catabólicas que permiten la
utilización de los aminoácidos para la producción de energía metabólica y es una de las reacciones
principales en la síntesis de aminoácidos a partir de otros aminoácidos.
La reacción de transaminación es catalizada por las enzimas denominadas transaminasas, o más
apropiadamente, aminotransferasas, que utilizan el piridoxal fosfato como coenzima.
Estas enzimas se encuentran en la matriz citoplasmática y en las mitocondrias de las células de
diversos tejidos. Por ejemplo, en los mamíferos las aminotransferasas son abundantes en hígado,
corazón y riñón, principalmente. En algunos casos, el nivel sanguíneo de las aminotransferasas
puede utilizarse para ayudar en el diagnóstico del estado funcional de estos órganos.
En esta práctica se pretende examinar la reacción de transaminación utilizando como catalizador
un extracto enzimático crudo obtenido a partir de tejido cardiaco de res.

OBJETIVOS:

1. Obtener un extracto enzimático crudo a partir de corazón de res.

2. Utilizar el extracto enzimático para catalizar la reacción de transaminación entre el
aminoácido L-alanina y el -cetoácido -cetoglutarato.
3. Analizar las características de la reacción efectuada, mediante la utilización de
cromatografía de papel.
4. Deducir la importancia de las reacciones de transaminación en el metabolismo de las
células y organismos.

MATERIALES Y REACTIVOS:

10 tubos de ensayo 1 Erlenmeyer de 500 ml con tapón

1 gradilla papel de filtro
2 tubos plásticos de centrífuga, de 50 ml secador de pelo
1 probeta de 100 ml 2 tubos capilares
1 “beaker” de 250 ml rociador para la ninhidrina
4 pipetas de 5 ml estufa a 110ºC
1 pipeta de 1 ml centrífuga
1 embudo Amortiguador fosfatos 0.01M pH 7.4
licuadora Ácido acético al 4%
balanza Amortiguador de fosfatos M/15 pH 7.4
1 cuchilla nueva
Guía práctica Transaminación 2

Solvente: etanol:agua:amoniaco Mezcla patrón de alanina y ácido glutámico

(80:10:10 por volumen) Mezcla de sustratos: alanina--ceto glutarato
baño de agua a 37ºC Ninhidrina 0.2% en acetona
baño de agua en ebullición ganchos “clips”
1 papel Whatman #1 de 10x12 cm Corazón de res

PROCEDIMIENTOS:

1. Preparación del extracto enzimático.

Pese aproximadamente 30 g de corazón de ternera fresco, córtelo en pedazos pequeños y

colóquelos en una licuadora con 60 ml de amortiguador de fosfatos 0.01 M, pH 7.4. Licue durante
3 minutos y luego reparta el volumen en dos tubos de centrífuga.
Centrifugue a 3000 rpm por 15 minutos.
Decante el sobrenadante en un tubo de ensayo. Este será el extracto enzimático crudo.
Descarte los sedimentos.

2. Reacción de transaminación.

Prepare tres tubos de ensayo con las siguientes mezclas:

Contenido Tubo No. 1 2 3

Sustratos: mezcla alanina--cetoglutarato 1 ml 1 ml 1 ml
Amortiguador de fosfatos M/15, pH 7.4 2 ml 2 ml 2 ml
Agua destilada - - 1 ml
Extracto enzimático crudo 1 ml 1 ml -

Atención! Tan pronto como haya agregado todos los ingredientes (el extracto enzimático de
último) del tubo No. 1 (control a tiempo 0) añádale inmediatamente 0.2 ml de ácido acético al 4%,
mezcle bien y coloque el tubo en el baño de agua en ebullición durante 3 minutos. Deje enfriar y
filtre en un tubo de ensayo. Descarte el residuo. Este será el filtrado libre de proteínas del tubo No.
1. Guárdelo para la cromatografía.

Los tubos Nos. 2 y 3 deben incubarse por 30 minutos en el baño de agua a 37ºC.
Terminada la incubación, agregue a cada tubo 0.2 ml de ácido acético al 4%. Mezcle bien y
colóquelos por 3 minutos en el baño de agua en ebullición.
Deje enfriar y filtre el contenido del tubo No. 2 (el tubo No. 3 no requiere filtración).
Guarde el filtrado del tubo No. 2 y el contenido del tubo No. 3 para la cromatografía.

3. Cromatografía de papel.

Coloque la tira de papel para cromatografía sobre una hoja limpia. Maneje el papel agarrándolo
sólo por las puntas.
Trace una línea fina con un lápiz de grafito, a 2 cm del borde inferior. Marque cuatro puntos sobre
la línea, con 2 cm de separación entre ellos.
Guía práctica Transaminación 3

Utilizando cuatro tubitos capilares, realice tres aplicaciones sobre cada uno de los puntos, secando
la muestra antes de volver a aplicar sobre el mismo punto, así (use un capilar diferente para cada
muestra):

a) filtrado libre de proteínas del tubo No. 1

b) filtrado libre de proteínas del tubo No. 2
c) contenido del tubo No. 3
d) mezcla patrón de alanina y ácido glutámico

 Terminadas las aplicaciones, enrolle la tira de papel teniendo el cuidado de que las
muestras queden hacia afuera y manejando el papel sólo por el borde superior.
 Sujete el borde superior con un “clip” tratando de formar un cilindro (aunque el
enrollamiento final debe quedar como un cono truncado. Evite superponer las áreas del
papel que tienen las aplicaciones.
 Coloque 35 ml del solvente (etanol:agua:amoniaco) en el Erlenmeyer de 500 ml, evitando
que se impregnen con la mezcla las paredes del recipiente.
 Introduzca el papel enrollado dentro del Erlenmeyer, con el borde que contiene las
muestras, hacia abajo. Colóquelo con suavidad en el centro del recipiente, evitando
salpicaduras del solvente y que quede en contacto con las paredes del vaso.
 Tape el Erlenmeyer con el tapón. Deje desarrollar el cromatograma hasta que el frente del
solvente haya llegado a 2 cm del borde superior del papel.
 Cuando esto ocurra, saque el papel cuidadosamente, quítele el “clip” y cuélguelo en un
sitio ventilado para que se seque.
 Una vez seco, solicite que sea rociado con el reactivo de ninhidrina (evite respirar estos
vapores!) y colóquelo en una estufa a 110ºC hasta que aparezca el revelado de la posición
de los aminoácidos. (El revelado también puede hacerse con el aire caliente del secador de
pelo). Observe las manchas de color púrpura que aparecen en el papel. ¿En qué consisten?
 Trace el perímetro de las manchas con un lápiz y establezca los Rfs. Identifique las
manchas. ¿En cuál o cuáles tubos ocurrió la transaminación? ¿En cuál o cuáles no se llevó a
cabo la reacción? ¿por qué sucedió esto?

Escriba la reacción de transaminación efectuada y la reacción con ninhidrina.

Consultar sobre la importancia de las reacciones de transaminación en el metabolismo celular?

Guía práctica Transaminación 4

REPORTE DE TRANSAMINACIÓN

ASISTENTES A LA PRÁCTICA: FECHA:_________________

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1. Describa la apariencia del extracto enzimático crudo obtenido por la homogenización del
tejido cardiaco, antes y después de la centrifugación:
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2. Describa la apariencia del contenido de los tubos después del tratamiento con ácido
acético al 4% y de la incubación por tres minutos en el baño de agua hirviendo:
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3. En el cuadro, pegue el cromatograma tal como quedó después del revelado con ninhidrina:
Guía práctica Transaminación 5

Duración de la cromatografía: ________________________

Identifique las manchas observadas : ______________________________________________

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Calcule el Rf de cada aminoácido: ______________________________________________

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¿En cuál o en cuáles de los tubos ocurrió la reacción de transaminación?

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Escriba dos conclusiones preliminares, con base en los resultados de la práctica:

Conclusión 1:
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Conclusión 2:
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