INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE METODOS DE ANALISIS

PRACTICA: SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE
AZUL DE METILENO Y FLUORESCENCIA
EMPLEANDO CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

ALUMNO: SALVADOR HERNANDEZ JUAN

GRUPO: 4IM2 SECCION: 3

PROFESOR: ACUÑA GONZÁLEZ CAROLINA

OBJETIVOS
 Separar dos colorantes aplicando una técnica cromatográfica por adsorción.
 Realizar un perfil de elución para poder comprobar la separación.
FUNDAMENTO
Es un método de separación que depende de los equilibrios de adsorción- desorción
de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria sólida y la fase móvil
líquida o gaseosa. La fuerza con que es adorbido un componente depende de la
polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase móvil.
En general cuanto más polar es un compuesto más fácilmente es adsorbido.
RESULTADOS
Tabla 1.
Volumen de A493 A468 Volumen de A493 A468
elución elución
3 0.016 0.018 45 0.005 0.099
6 0.000 0.000 48 0.000 0.097
9 0.035 0.152 51 0.002 0.094
12 0.047 0.154 54 0.005 0.061
15 0.037 0.141 57 0.000 0.008
18 0.087 0.171 60 0.225 0.000
21 0.042 0.138 63 0.990 0.028
24 0.003 0.115 66 0.937 0.105
27 0.010 0.111 69 0.515 0.112
30 0.001 0.105 72 0.933 0.105
33 0.011 0.116 75 0.070 0.084
36 0.020 0.120 78 0.020 0.065
39 0.056 0.146 81 0.017 0.049
42 0.002 0.100
 Perfil de elucion
Absorbancia
1.2

0.8

0.6

0.4

0.2

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Volumen de elucion (mL)

A493 A668

PREGUNTAS EXTRAS
1. Especifique y defina los elementos del sistema cromatográfico para
esta separación.
Fase estacionaria: Alúmina ácida (pH 5) actúa como el adsorbente.
Fase móvil: Agua y NaOH (0.1) permite la elución de los solutos a través de la
columna de acuerdo con su afinidad por éstos.
Soporte: Columna, lugar donde se lleva a cabo la separación de los compuestos.
Mezcla: Fluoresceína y azul de metileno, actúan como adsorbato.

2. Defina el término adsorción y empleando fórmulas, esquematice qué

fuerzas intermoleculares participan en el proceso de separación de
solutos.
La adsorción es un fenómeno por el cual átomos, iones o moléculas de gases,
líquidos o sólidos disueltos son atrapados o retenidos en una superficie a través de
interacciones covalentes (adsorción química) o interacciones débiles: puentes de
hidrógeno y fuerzas de Van Der Waals.
Puentes de hidrógeno: La fuerza por puente de hidrógeno o enlace de hidrógeno
es la fuerza eminentemente electrostática atractiva entre un átomo electronegativo
y un átomo de hidrógeno unido covalentemente a otro átomo electronegativo.
Ión- dipolo: los iones de una sustancia pueden interactuar con los polos de las
moléculas covalentes polares.

Dipolo- dipolo: La interacción dipolo-dipolo consiste en la atracción electrostática

entre el extremo positivo de una molécula polar y el negativo de otra.

Dipolo- dipolo inducido: Tienen lugar entre un ión y una molécula apolar. La
proximidad del ión provoca una distorsión en la nube electrónica de la molécula
apolar que convierte (de modo transitorio) en una molécula polarizada. En este
momento se produce una atracción entre el ión y la molécula polarizada.
 3. Considerando las propiedades de solubilidad de los colorantes, indique
qué modificaciones haría para invertir el orden de elución.
Se utilizaría alúmina básica y un regulador ácido, de manera que el compuesto
retenido sería el azul de metileno por su carga positiva, mientras que la fluoresceína
sería el primer compuesto en eluír.
DISCUSIÓN
Para poder llevar a cabo la separación fue necesario cuidar de varios factores, como
mantener la altura de la fase móvil para que de esta manera la presión se mantenga
y la velocidad sea constante, así como cuidar el aforo en los tubos donde se recogía
la muestra. De esta manera se puede construir un perfil de elución más confiable.
De acuerdo con el perfil de elución podemos apreciar que la separación de la mezcla
de colorantes no se llevo a cabo porque no existen fracciones con valores de 0 de
absorbancia entre los dos picos máximos. Aunque en el perfil de elución se puede
notar una fracción con absorbancia 0 a las 2 longitudes de onda, al observar las
fracciones se notaba que no estaban separados los colorantes.
Teoricamente de acuerdo con el perfil de elución hay dos picos máximos de
absorbancia. El primero corresponde al azul de metileno y se pudo apreciar
visualmente mientras se recogían en los tubos. Este compuesto al presentar una
carga positiva no interactúa con la fase estacionaria por presentar la misma carga
de manera que eluye junto con el agua por la formación de puentes de hidrógeno
entre ellos. La fluoresceína por presentar carga negativa queda retenida en la fase
estacionara hasta que cambiamos la fase móvil, al agregar el hidróxido comienza
una competencia por la fase estacionaria entre la fluoresceína y el hidróxido. Al
existir mayor interacción con el NaOH la fluoresceína sale del sistema,
representando el segundo pico máximo del perfil de elución.
El perfil de elución también nos indica que el azul de metileno muestra señal
instrumental en dos longitudes de onda, una máxima en 468 y una en 493, que si
bien no es grande, existe señal de absorbancia. Mientras la fluoresceína solo
muestra señal a una longitud de 493 nm. Además hay diferencia en lo ancho de las
bandas para ambas muestras. La banda del azul de metileno es más estrecha que
la de la fluoresceína debido a que eluyó con mayor velocidad.
CONCLUSIÓN
 El azul de metileno muestra señal instrumental en más de una longitud de
onda.
 El ancho de banda, es decir la resolución, depende de la velocidad de
elución.
BIBLIOGRAFÍA
 Skoog, D. A., Holler, J. H., Nieman, T. A. “Principios de Análisis Instrumental”,
5a Edición. McGraw Hill. Madrid, España. 2001. (p.p 662-663).
 Harris, D. (1992) Análisis químico cuantitativo. España: Reverte (p. 105-107).