Sunteți pe pagina 1din 21

Subiecte examen TE

1. Definirea ingineriei tisulare cu cunoașterea elementelor componente (C1, slide 2-11)


Ingineria tisulara a fost inițial un subdomeniu al științei biomaterialelor, dar în prezent este un
domeniu de sine stătător al ingineriei biomedicale datorită accentuării scopului si importantei
sale.
Definiția 1: TE este un domeniu interdisciplinar care aplică principiile științelor inginerești și
științelor vieții pentru dezvoltarea de substituenți biologici care restabilesc, mențin sau
îmbunătățesc funcția unui țesut sau a unui organ.
Definiția 2: Dezvoltarea de țesuturi sau organe în laborator prin manipularea de molecule, celule
și structuri scaffold (de susținere a celulelor) cu scopul de a înlocui sau îmbunătăți funcția unor
părți ale corpului imperfecte sau vătămate.
Definiția 3: Regenerarea de țesuturi și/sau restaurarea funcției unor organe prin implantarea în
organism de celule crescute ex vivo pe suporturi speciale astfel încât să se asigure organizarea lor
în țesuturi specifice.
Definiția 4: TE este un domeniu interdisciplinar cu un potențial enorm pentru medicina
regenerativă deoarece el se bazează pe folosirea de materiale și tehnologii pentru a restabili sau
îmbunătăți funcția țesuturilor și organelor afectate de boală, vătămări sau deformări.
Elemente componente:
a) Celule: pot fi izolate din țesuturi/organe, propagate (multiplicate prin pasaj) in vitro și
însămânțate într-un carrier sau scaffold înainte de implantare
b) Structura scaffold: un analog artificial al matricei extracelulare (MEC), ce este capabil de a
găzdui un număr suficient de mare de celule, menține viabilitatea lor și dirijează creșterea
celulară și regenerarea tisulară tridimensională (3D). Sunt structuri solide și poroase sau structuri
de tip hidrogel care asigură un micromediu 3D pentru celule.
c) Molecule de semnalizare celulară (factori de creștere/diferențiere)
Proceduri de TE: recoltare țesut și izolare celule/recoltare celule, cultivarea celulelor
(multiplicare), însămânțarea pe scaffold, obținerea constructului tisular în bioreactoare,
implantarea constructului tisular.

2. Ingineria tisulara versus medicina regenerativă (slide 12)

Ingineria tisulară Medicina regenerativă


Regenerarea in vitro Regenerarea in vivo
Generarea in vitro a unui țesut/organ complet Implantarea în organism a scaffold-ului
prin însămânțarea și creșterea celulelor într-un (biomaterialului), pentru a facilita un proces de
scaffold, urmată de implantarea în organism a regenerare in vivo prin popularea sa cu celule!
constructului TE obținut. Ar putea include: terapii celulare, TE, terapia
genică, tratamente tradiționale ce presupun
dispozitive medicale și compuși
Avantaje: permite evaluarea țesutului de Avantaje: formarea țesutului de regenerare
regenerare înainte de implantare sub influența factorilor reglatori din organism
(inclusiv solicitare mecanică)
Dezavantaje: pentru o integrare adecvată, Dezavantaje: deplasarea sau distrugerea
țesutul nou format trebuie să sufere un proces biomaterialului de către factori de stres
de remodelare in vivo (mecanic) generați in vivo
3. Rolul celulelor drept componente ale implanturilor tisulare (construcților de TE) (slide 20)
Drept componente ale implanturilor tisulare celulele au 2 roluri:
1) Înzestrarea constructului cu o componentă “vie” ce-i permite acestuia să răspundă traumelor
suferite în timpul uzurii normale și să se repare de la sine, dându-i posibilitatea să dureze mai
mult decât implanturile sintetice. (= componenta vie a construcților TE)
2) Înzestrarea țesuturilor supuse regenerării cu funcții tisular-specifice (= asigură expresia
funcțiilor tisular specifice).
ex: în cartilaj proteinele și PG pe care celulele le produc înzestrează țesutului cartilaginos cu
proprietățile sale mecanice; în pancreas celulele implantate produc insulină înzestrând pancreasul
cu funcția sa endocrină.
Concluzii: celulele îndeplinesc un rol vital în realizarea unui construct tisular cu proprietățile
dorite.

4. Caracteristici si rolul structurilor “scaffold” (slide 30-33)


Scaffold (scheletul constructului de TE) = structura în care celulele se pot fixa și prolifera.
 Asigură susținerea celulelor
 Menține forma țesutului
 Contribuie la reglarea funcției celulare prin compoziția lor chimică, proprietățile de
suprafață, structura poroasă și arhitectura porilor
Caracteristici:
1) Să imite MEC naturală
2) Să fie biodegradabile, astfel încât MEC sintetizată de novo de către celulele încorporate să-l
înlocuiască. Aceasta a condus la dezvoltarea de metode pentru producerea de structuri scaffold
cu compoziție chimică și arhitectură atent selecționate.
3) Compoziția chimică, afectează:
 adeziunea celulară
 comportamentul celular prin căile de semnalizare mediate de MEC prin intermediul
integrinelor
 viteza sa de degradare și proprietățile mecanice ale țesutului format
4) Arhitectura porilor
Structura poroasă a structurilor scaffold este esențială pentru:
 distribuția uniformă a celulelor în timpul însămânțării
 difuzia substanțelor nutritive la celule
 îndepărtarea eficientă a deșeurilor metabolice
Gradul de porozitate afectează:
 Numărul de celule conținute
 Rezistența materialului
Diametrul porilor influențează:
 Aria suprafeței de contact celule-suport
 Numărul de celule aderate
 Capacitatea celulelor de se infiltra prin pori
Orientarea porilor poate direcționa creșterea celulelor
5) Viteza de degradare
Pe măsură ce se formează țesutul funcțional, structura scaffold trebuie să fie degradată.
Timpul de degradare este dependent de compoziția scaffold-ului și moleculele produse de țesutul
gazdă ce au potențial de degradare a scaffold-ului. Este de dorit să rezulte produși de degradare
cu o toxicitate minimă, fiind evitate complicațiile pe termen lung induse de un corp străin.
În mod ideal, viteza de degradare a scaffold-ului trebuie să fie identică cu viteza de regenerare
tisulară. Dacă viteza de degradare este < decât viteza de regenerare a țesutului atunci scaffold-ul
va pierde funcția de suport pentru celule. Dacă viteza de degradare este > decât viteza de
regenerare atunci remodelarea tisulară va fi împiedicată.
6) Proprietăți mecanice
 Rezistența mecanică trebuie să fie destul de mare pentru a rezista distrugerii înainte ca
celulele sa sintetizeze propria MEC.
 Modulul de elasticitate trebuie să fie suficient de mare pentru a rezista forțelor de
compresie care ar putea determina colapsul porilor
Roluri:
a) Matrice pentru adeziunea celulară, înainte de a fi resorbite. Reglează anumite procese
celulare (ex: proliferarea, migrare, diferențiere, procese biosintetice)
b) Promovează polarizarea celulară normală
c) Cresc aria de interacție celule-matrice și celulă-celulă
d) Consolidează dpdv structural defectul tisular pentru a menține forma țesutului supus
regenerării
e) Servesc ca o barieră față de pătrunderea țesutului înconjurător care poate împiedica procesul
de regenerare
f) Servesc ca un vehicul de furnizare de celule, factori de creștere și eventual gene

5. Biomateriale: definiție si clasificare in funcție de răspunsul organismului gazda (slide 58-60)


Biomaterial = orice material, natural sau sintetic, care interacționează cu un sistem biologic și
poate fi utilizat într-o aplicație medicală, realizând, ameliorând sau înlocuind o funcție tisulară.
Materialele din care se obțin implanturile trebuie să fie:
 Biocompatibile
 Biofuncționale
 Accesibile dpdv al costurilor
În funcție de răspunsul organismului gazdă, biomaterialele pot fi:
 Bio-inerte
 Bio-active
 Bio-resorbabile
1) Bioinerte – acele materiale care odată plasate în organismul uman nu generează un răspuns
celular sau nu interacționează cu țesutul gazdă. În jurul unui implant bioinert se formează o
capsulă fibroasă care îl izolează de țesutul gazdă, ca rezultat al răspunsului la corp străin
(Foreign Body Response – FBR).
Exemple: oțelul inoxidabil, titanul, alumina, dioxidul de zirconiu
Aceste materiale au fost folosite inițial pentru chirurgia vasculară datorită necesității unei
suprafețe care nu determină coagularea sângelui (hemocompatibile).
2) Bioactive – acel material care odată plasat în organismul uman interacționează cu țesutul
gazdă (ex: se formează țesut osos între os și implant)
Exemplu: hidroxiapatita, în cazul căreia poate avea loc chiar un schimb ionic între implantul
bioactiv și fluidele corporale înconjurătoare, făcând posibilă formarea unui strat biologic activ de
carbonat de hidroxiapatită, ce este cristalografic echivalent cu faza minerală a țesutului osos.
3) Bioresorbabile – acele materiale care odată plasate în organism sunt supuse dizolvării
(resorbției) și pot fi înlocuite de un țesut similar țesutului gazdă.
Exemple: fosfatul tricalcic, PGA, PLA, copolimerii acid poli-lactic/acid poli-glicolic, colageni

6. Teste in vitro de evaluare a biocompatibilității (slide 76-95)


Constituie prima etapă în cadrul unui proces complex de evaluare biologică a biocompatibilității,
fiind urmate de teste pe animale și studii clinice. Pot stabili dacă unele materiale sunt
biocompatibile pentru a fi incluse în constituția unor implanturi sau dispozitive medicale (ex: de
eliberare a medicamentelor, a unor substanțe chimice). Au ca obiectiv major reducerea studiilor
in vivo care durează ani și necesită sacrificarea unui număr mare de animale. În prezent, se fac
eforturi pentru validarea unor teste in vitro ca alternative experimentale la studiile pe animale,
dar o înlocuire totală a studiilor in vivo nu va fi posibilă.
a) Teste in vitro incluse în standardele ISO 10993:
Teste de citotoxicitate:
Se evaluează efectele biologice:
 Indirecte ale substanțelor ce se extrag din dispozitivul medical (scaffold)
 Directe ale produsului de testat (biomaterial, scaffold) asupra celulelor crescute în
monostrat
Testul eluției
Constă în obținerea în condiții standard (3 cm2 sau 0.2 g produs/ml mediu cultură, timp de 24h,
la 37oC) a unor extracte din probele de testat în mediul de cultură. Aceste extracte se aplică peste
cultura celulară în sistem 2D și se mențin la 37oC, timp de < 3 zile, realizându-se:
 Examinarea microscopică periodică a celulelor
 Evaluarea gradului de inhibiție/stimulare a creșterii celulelor
Liniile celulare recomandate pentru acest test sunt Vero sau L929. În paralel, se realizează un
control pozitiv de citotoxicitate (cultură în prezența DMSO – 5%) și unul negativ (cultura
standard).
Testul contactului direct (Testul difuziei în agar)
Piese din materialul de testat pot fi aplicate pe monostratul celular ce este acoperit fie cu mediu
de cultură, fie cu un strat fin semisolid de agar/agaroză care protejează celulele de un contact
direct cu probele de testat. În cursul perioadei de incubare, substanțele solubilizate din piese vor
migra în mediul de cultură sau prin stratul de agar până la celule. După incubare, monostratul
celular este investigat pentru a determina dacă materialul le-a afectat (a manifestat efecte
citotoxice). Dacă materialul testat eliberează substanțe toxice, acestea pot inhiba viteza de
creștere a celulelor și pot să producă leziuni celulare în diferite moduri. Liza celulară este
indicată de coloranții vitali (ex: roșu neutru) incorporați în stratul de agar.

Metode folosite mai rar:


Metoda inhibiției creșterii celulelor în suspensie
Extracte ale materialului de testat sunt adăugate peste celulele ce cresc în suspensie. După o
perioadă standard de incubare se evaluează posibilele efecte inhibitorii prin determinarea masei
celulare (ex: conținutul de ADN) în comparație cu o cultură obișnuită.
Metoda cuantificării numărului de colonii
Un număr determinat (foarte mic) de celule aderente este expus la un extract al materialului de
evaluat și mediul de creștere (proba control), iar după incubare (test de clonare) se numără
coloniile celulare în ambele probe. Formarea unui număr mai mic de colonii celulare comparativ
cu controlul este un indiciu că materialul testat are un potențial citotoxic.
b) Evaluare in vitro a comportamentului celular și interacțiilor celulă-biomaterial
Metode clasice:
 Teste de citomorfologie
 Teste de citotoxicitate și viabilitate celulară
Evaluarea microscopică a morfologiei celulare
Morfologia celulelor aderate de suprafața materialelor testate se poate evalua în microscopia de
fluorescență prin marcarea filamentelor de actină cu faloidină-FITC (fluorescein izotiocianat-
verde) sau TRITC (tetrametilrodamina – roșu)
Studiul potențialului citotoxic manifestat de biomateriale prin determinarea activității lactat
dehidrogenazei extracelulare (testul LDH)
Citotoxicitatea materialului este evaluată în funcție de cantitatea de LDH eliberată în mediul de
cultură de către celulele care au pierdut integritatea membranară. Cu câr este detectată mai multă
LDH în mediul de cultură cu atât materialul este mai citotoxic. Test realizat prin metode
spectrofotometrice în UV și VIS.
Metoda colorimetrică permite determinarea gradului de reducere a unei sări de tetrazoliu la
formazan (absoarbe la 490 nm) de către produsul de reacție al LDH (NADH, H+).
Cuplarea reducerii NAD+ de către LDH cu conversia unei sări de tetrazoliu la formazan.
Evaluarea viabilității/citotoxicității/proliferării celulare prin testul MTT
Celulele sunt tratate cu o sare de tetrazoliu (MTT: bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-
difeniltetrazoliu) pentru a evalua metabolismul celular oxidativ (mitocondrial) și răspunsul unei
populații celulare la factori externi, ce pot avea efect pozitiv sau negativ asupra viabilității
celulelor în cultură. La baza acestei metode colorimetrice cantitative este reducerea de către
enzimele mitocondriale (în special succinat dehidrogenaza) din celulele vii metabolic active, a
compusului MTT (culoare galbenă) la cristale de fomazan (albastru închis-violet), cristale care
sunt apoi solubilizate cu DMSO sau izopropanol.
Pe același principiu se bazează și testele XTT, MTS sau WST-1 care permit detectarea în mediul
de cultură a produsului de reacție (solubil în apă). Sensibilitatea reacției de reducere a sării de
tetrazoliu este crescută în cazul testului CCK-8 (Cell Counting Kit- 8) care folosește ca substrat
WST-8, ce este transformat într-un formazan solubil în prezența unui donor de electroni (1-
metoxi PMS).
Evaluarea calitativă a viabilității celulare (testul Live/Dead)
Acest test permite diferențierea celulelor vii (verde fluorescent) de celulele moarte (roșu
fluorescent). Se bazează pe transformarea calceinei-AM de către esterazele din celulele vii în
calceină (verde) și colorarea nucleilor celulelor moarte (ce au pierdut integritatea membranei
plasmatice) cu etidiu homodimer-1 (roșu) .

7. Substituenți ai pielii obținuți prin inginerie tisulara (C2, slide 31-54)


a) Substituenți epidermali
Autogrefe epiteliale
În 1988 s-a realizat primul produs epidermal comercial, pentru uz clinic, numit EPICEL
(keratinocite autologe atașate de un tifon care se îndepărtează la aproximativ o săptămână după
grefare).
LASERSKIN (dezvoltat de Fidia Advanced Biopolymers)
Este compus din keratinocite autologe cultivate pe o membrană pe bază de acid hialuronic.
Membrana prezintă micro-interstiții circulare (tăiate cu laserul) de 40 μmetri în diametru ce
penetrează 20 μmetri în adâncimea materialului. Transplantul se realizează când keratinocitele au
atins subconfluența. Poate fi folosit în combinație cu substituentul dermal Integra.
Avantajele substituenților epidermali:
- pot fi obținute suprafețe importante într-un timp relativ scurt, din eșantioane de
dimensiuni reduse (câțiva cm2)
- funcționează ca modalitate de acoperire permanentă a plăgilor
- nu determină reacția de respingere
Dezavantajele substituenților epidermali:
- prezinta instabilitate mecanică (fragilitate) prin structura de tip monostrat (lipsită de
suportul dermic)
- flictenizează cu ușurință
- rezultatul estetic este defectuos
- au un cost ridicat
Produse alogene
Avantaje: costuri de fabricație reduse în comparație cu produsele autologe

Atât substituenții epidermali autologi cât și alogeni au un defect semnificativ, și anume au o rată
de fixare scăzută care poate conduce la formarea de pustule pe piele.

b) Substituenți dermali
Au fost dezvoltați pentru a rezolva neajunsurile prezentate de substituenții epidermali.
Echivalenții dermali și epidermali trebuie aplicați secvențial pe rană, deoarece buna
vascularizație a rănii trebuie să fie realizată înainte de aplicarea stratului epidermal.

INTEGRA
Dezvoltat în 1980, este un produs comercial, constituit dintr-o membrană bistratificată:
 Stratul dermic (intern) – grosime de apx. 2 mm, conține colagen bovin și
glicozaminoglicani (condroitin 6-sulfat) cu porozitate și capacitate de biodegradare
controlate (pori de apx. 70-200 μm). Servește ca suport pentru infiltrarea în patul rănii a
fibroblastelor și celulelelor endoteliale din țestului dermic adiacent, precum și a
macrofagelor și limfocitelor. Este degradat pe măsură ce vindecarea progresează și
înlocuit cu o matrice predominant colagenică nou sintetizată de fibroblaste.
 Stratul epidermic (extern) – este un substituent temporar constituit dintr-un polimer de
polisiloxan (silicon) cu grosime de 0,23 mm. Este înlocuit după apx. 2-3 săpt. (când s-a
format neoderma vascularizată) cu o autogrefă epidermală fină. Prin proliferare și
migrare peste patul dermic, celulele din autogrefa epidermală formează un strat confluent
închizând rana.

În 1996 FDA a aprobat utilizarea Integra pentru tratarea arsurilor. De atunci 20.000 de pacienți
au fost tratați cu succes.
Avantaje:
 este superior substituenților tegumentari monostratificati
 rezultatul estetic în timp este mult mai bun
 este disponibil imediat și in orice cantități
 permite amânarea autogrefei epiteliale până în momentul în care se pot obține autogrefele
 funcționează ca un suport bioresorbabil, potențând creșterea neo-dermului (asemănător cu
cel normal)
 poate rămâne la nivelul plăgii până la apx. 2luni, fără a forța astfel aplicarea imediată a
autogrefelor
 ridicarea stratului siliconic (extern) este atraumatică, neimplicând excizia chirurgicală
 nu generează probleme imunologice (de respingere) ale produsului
 este un substituent al pielii acelular indicat în tratamentul plăgilor post-excizionale și al
arsurilor de gradul III

BIOBRANE
Este constituit dintr-un film subțire extern de silicon (analog epidermal) și unul intern 3D
filamentos din nailon (analog dermal) pe care sunt legate peptide colagenice. Este folosit ca
pansament temporar și îndepărtat când rana se vindecă sau autogrefa epidermală este disponibilă.
Este indicat în tratamentul arsurilor complete excizate.

DERMAGRAFT
Este un substituent al pielii (SP) celular constituit dintr-o plasă (meșă) de Vicryl (poliglactin
910), adică dintr-un copolimer sintetic, bioresorbabil de poliactidă și poliglicolidă derivate din
acizii polilactic și poliglicolic. Această meșă este impregnată cu fibroblaste neonatale umane,
care secretă proteine ale MEC (ex: colagen) și factori de creștere mitogenici și chemotactici. Este
non-antigenic și non-pirogenic.
Studiile clinice au pus în evidență reacții imunologice împotriva fibroblastelor.
Este depozitat la -70oC și comercializat pe gheață uscată. După decongelare, înainte de
implantare, materialul este testat dpdv al activității metabolice a celulelor. Este utilizat în arsuri,
ulcere cronice (picior diabetic), plăgi tăiate.

TRANSCYTE = SP bistratificat, celular, cu compoziție similară Biobrane


Analogul epidermal extern: un film de silicon neporos
Analogul dermal intern: o meșă de nailon acoperită cu colagen (COL) dermal porcin, populată cu
fibroblaste (FB) izolate din prepuț (de la nou-născuți) care produc: COL I, fibronectină, GAG și
factori de creștere.
Prin crioconservare (-70oC) FB sunt distruse, reducând răspunsul imun al gazdei, iar produșii de
sinteză ai FB sunt păstrați și stimulează procesul de vindecare.
Produsul se aplică cu analogul dermal pe rană. Meșa de nailon asigură flexibilitate și aderență
excelente. Se folosește pentru închiderea arsurilor superficiale și dermale medii (la copii) –
aprobat FDA, și pentru închiderea temporară a rănilor tăiate înainte de aplicarea grefei
epidermale autologe.
Avantaje:
 Analog bi-stratificat
 Aderență excelentă
 Reduce durerea
 Furnizează componente dermale bioactive
 Menține flexibilitatea țesutului
 Acționează ca o barieră externă
Dezavantaje:
 Necesită congelare înainte de folosire
 Este relativ scump

c) Substituenți dermo-epidermali
Conțin atât componentele celulare ale epidermei cât și ale dermei.
Toleranța imunologică a gazdei față de FB alogene este discutată controversat. Se pare că o
grefare pe termen lung a acestor celule (până la 2 luni) este posibilă. Totuși, keratinocitele
autologe sunt cele mai potrivite pentru generarea unui substituent dermo-epidermal permanent.

SISTEMUL TissueTech Autograft (proiectat de Fidia Advanced Biopolymers)


Este un produs disponibil în comerț care permite închiderea permanentă a rănilor.
Componente:
a) celule = FB și keratinocite autologe, cultivate pe
b) substrate pe bază de acid hialuronic = Hyalograft (înlocuitor dermic) și Laserskin (înlocuitor
epidermic)
Așadar, combină 2 biomateriale independente și nu poate fi considerat un adevărat substituent
dermo-epidermal al pielii.

PERMADERM = grefă de piele 3D


Este construit dintr-un analog dermic reprezentat de burete de colagen însămânțat cu FB
autologe pe care se însămânțează keratinocite autologe. Asigură închiderea permanentă a rănilor,
poate fi descris ca un adevărat substituent dermo-epidermal.

APLIGRAF
Are o structură bistratificată:
a) Gel de colagen bovin de tip I, în care se însămânțează
b) FB și keratinocite alogene umane izolate din pielea de prepuț
Este utilizat la acoperirea plăgilor post-excizionale de dimensiuni relativ mici și în ulcerele
venoase.

Avantaje:
 primul SP bi-stratificat (conține neoderma și neoepiderma) disponibil comercial
 o soluție de vindecare permanentă a rănilor pielii
 aprobat de FDA (1999)
 permite realizarea unei intervenții terapeutice rapide (vindecare completă în apx. 60 zile)
în comparație cu alte terapii (bandajele de compresie, apx 180 zile).
 cicatrizare de bună calitate
 rezultate cosmetice superioare
 nu au fost semnalate fenomene de rejecție a grefei
Dezavantaje:
 trebuie menținut în mediu nutritiv până la transplant
 este împachetat individual și livrat cât mai repede posibil
 celulele obținute prin necropsie necesită un screening foarte minuțios
 nivelul de supraviețuire a grefei: până la 30 zile
 aplicațiile tehnice sunt complicate
 costuri ridicate, este un produs greu accesibil pe piața medicală românească

ORCEL
Similar Apligraf deoarece conține atât FB cât și keratinocite din prepuțul neonatal dar prezintă
un matrix poros de colagen ce permite migrarea celulelor din țesutul gazdă.
S-a dovedit că prezintă viteze de vindecare mai rapide decât substituentul dermal Biobrane.

8. Implantul de condrocite (C3, slide 13-24)

a) Tehnica implantului de condrocite autologe (ACI)


A fost realizată prima dată în 1987 de către Peterson și colab. A constat în:
 Recoltarea de piese de cartilaj prin artroscopie
 Izolarea și multiplicarea în monostrat a condrocitelor (CH) autologe
 Injectare CH în defectul condral sub un fragment de periost
A fost realizat cu succes pe modele animale (în special iepuri și câini), de aceea s-a dezvoltat un
procedeu ACI la oameni.

Transplant de condrocite autologe (ACI) la oameni


Constă în 2 intervenții chirurgicale:
1) Recoltare piese de cartilaj din condilul femural medial sau lateral superior
Pacientului aflat sub anestezie i se recoltează piese de cartilaj cu ajutorul unui artroscop dintr-o
zonă de susținere minoră a greutății corporale (de pe condilul femural medial sau lateral
superior). Sunt izolate CH prin digestie enzimatică, suspendate în mediu de cultură suplimentat
cu ser autolog și însămânțate la densități între 5x103 și 104 celule/cm2.
Implantul se poate realiza când cultura celulară deține o populație de celule de 2,6 milioane până
la 5 milioane. O fracție din celulele obținute în cultură poate fi inclusă în agaroză (sistem 3D)
timp de 3 săpt pentru a evalua fenotipul condrocitic.
2) Transplantul propriu-zis
Se efectuează la 14-21 de zile de la operația inițială. Se debridează leziunea condrală fără a
penetra osul subcondral, pentru a preveni contaminarea situsului leziunii cu celule din măduva
osoasă, respectiv riscul formării de fibrocartilaj. Defectul este acoperit cu un fragment de periost
recoltat de pe tibia medială proximală, cusut de cartilajul sănătos sau de țesuturile din vecinătate.
Fragmentul de periost este așezat cu cambiul (celulele sale au efecte umorale și paracrine asupra
regenerării cartilajului) orientat spre interiorul leziunii și fixat etanș cu fibrină obținută din
sângele pacientului. Sub fragmentul de periost sunt injectate condrocite autologe multiplicate în
cultură.

Două organizații (SUA și Germania) oferă servicii comerciale de cultivare a condrocitelor


autologe pentru folosirea lor în terapia leziunilor articulare. Produsul se numește Carticel.
Obținerea lui implică recoltarea țesutului cartilaginos de la pacient și trimiterea acestuia la
laboratoarele companiei pentru a fi izolate și multiplicate celulele constituente. Produsul biologic
obținut este trimis înapoi la centrul de tratament unde CH vor fi implantate la locul leziunii.

b) Implantul de condrocite autologe acoperit cu colagen (AICI-C)


Această tehnică a fost încurajată de complicațiile generate de folosirea periostului în tehnica
ACI, și anume: delaminarea grefei, calcifierea ectopică a fragmentului de periost, hipertrofia
grefei care poate conduce la blocarea articulației. În loc de periost se folosește o membrană de
colagen II/III.
c) MACI (Matrix-induced Autologous Chondrocyte Implantation)
O adaptare a tehnicii ACI. Este o tehnică de reparare a cartilajului, ce presupune însămânțarea de
condrocite autologe pe o matrice bistratificată de colagen de tip I și III pentru a evita utilizarea
periostului. Materialul biologic (membrană +CH) obținut după o perioadă de menținere în
cultură (în prezența serului autolog) este implantat direct la locul leziunii și fixat cu fibrină de
țesutul adiacent. Remodelarea MEC cartilaginoase se produce prin procesul de resorbție a
membranei și activitatea biosintetică a CH.
După această intervenție, activitatea genunchiului este suspendată 2-3 zile, apoi este reluată
gradual până la folosirea integrală a articulației, cu o gimnastică adecvată.
Avantaje:
 Lipsa inciziei pe tibie pentru procurarea periostului
 Evitarea complicațiilor asociate cu utilizarea periostului
 Cartilajul se regenerează și e similar cu cel nativ
 Aprobată de FDA în 2016 (Vericell Corp.)
Dezavantaje:
 Recuperarea este prelungită deoarece țesutul nou format este vulnerabil la deteriorări
mecanice în perioada imediat postoperatorie
Un produs similar este furnizat de elvețieni, cu denumirea comercială Chondro-Gide. Produsul
poate fi folosit și în conjuncție cu microfractura într-o singură etapă, procedeu cunoscut ca
Autologous Matrix-Induced Chondrogenesis (AMIC), în care Chondro-Gide este suturat pe
leziune după microfractură pentru a servi ca scaffold pentru celulele stem mezenchimale (MSC).

9. Tipuri celulare utilizate in TE cartilajului (slide 25-32)


Potențiale surse de celule pentru TE a cartilajului:
a) condrocite diferențiate
Izolate din cartilajul uman matur. Își schimbă fenotipul în timpul culturilor seriale în monostrat,
dediferențiază către un fenotip fibroblastic. Începând cu primul pasaj, celulele crescute în
monostrat dobândesc treptat o morfologie și funcții tipice fibroblastelor:
 Potențial proliferativ crescut
 Scăderea producției de agrecan (PG majoritar din cartilaj)
 Reducerea până la încetarea expresiei colagenului de tip II
 Creșterea sintezei de versican și colagen I, III și V
Condrocitele pot rediferenția la fenotipul specific după transferul celulelor (cultivate în
monostrat până la cel mult pasaj IV) într-un sistem de cultivare în suspensie la densitate celulară
mare sau sistem 3D (agaroză, alginat, colagen, etc.) Rediferențierea CH se caracterizează prin:
 Recăpătarea formei celulare apx rotunde
 Supresia sintezei tipurilor de colagen I/III și a versicanului
 Inducerea sintezei de colagen de tip II și a agrecanului
Un rol important în evoluția acestor evenimente celulare îl au interacțiile matrice extracelulară-
celulă, prin intermediul joncțiunilor de adeziune focală via un complex supramolecular de
proteine transmembranare (integrine) și citoplasmatice (proteine ale citoscheletului și molecule
de semnalizare), interacții care determină adaptarea răspunsului celular la modificările dinamice
ale mediului extracelular.
Avantajele utilizării condrocitelor autologe:
 Elimină riscul respingerii imune a implantului
 Reduce șansa transmiterii bolilor infecțioase
b) fibroblaste
c) MSC derivate din măduva osoasă, țesut adipos, periost, membrana sinovială, țesut muscular
MSC derivate din măduva osoasă și membrana sinovială posedă cel mai înalt potențial
condrogenic in vivo. Totuși, cea mai eficientă schemă de purificare a celulelor cu potențial
condrogenic o reprezintă MSC izolate din măduva osoasă.
Caracteristici:
 Proliferează rapid în monostrat
 Pot fi pasate serial fără a suferi modificări fenotipice
În 1998, în prezența factorului creștere transformant TGF-β1, MSC izolate din măduva osoasă au
diferențiat în condrocite. Sunt încă în curs de dezvoltare cercetări în scopul optimizării
condițiilor de diferențiere în condrocite mature a celulelor stem transplantate, care să promoveze
formarea cartilajului hialin.

Un protocol larg utilizat pentru a promova diferențierea condrogenică a MSC este cultura de
pelet. MSC sunt centrifugate pentru a forma un pelet, care mai apoi este cultivat în prezența
TGF-β1. Acest pelet dezvoltă o structură multistratificată, cu o morfologie bogată în MEC,
reprezentată de un conținut abundent de colagen tip II și glicozaminoglicani (GAG) tipici
cartilajului articular.
d) celule stem embrionare (probleme etice)
10. Cerințe pe care trebuie sa le îndeplinească structurile scaffold utilizate in ingineria
tisulara a cartilajului (slide 34)
În mod ideal, aceste structuri trebuie să îndeplinească următoarele cerințe:
1) Să fie capabile de degradare direcționată și controlată (hidrolitic sau enzimatic)
2) Să susțină viabilitatea, proliferarea și diferențierea celulară (cu producerea de MEC specifică)
3) Să permită difuzia nutrienților și a produșilor de catabolism
4) Să adere și să se integreze în țesutul nativ înconjurător
5) Să se potrivească formei defectului
6) Să furnizeze integritate mecanică in funcție de poziția defectului
11. Strategiile pentru TE vasculara (C4, slide 6-12)
Conceptul de bază al TE are la bază 3 componente esențiale:
a) celulele (fie însămânțate in vitro, fie imobilizate in vivo)
b) scaffold (pe care este organizată MEC in procesul de formare a noului țesut)
c) semnalele: umorale (citokine, chemokine, factori de creștere) și mecanice (stres de forfecare).
Toți cei 3 factori sunt interdependenți si indispensabili pentru formarea unui țesut vascular înalt
organizat.
Strategiile pentru TE vasculară pot fi clasificate în 3 categorii:
a) grefe ghidate de scaffold (matrici sintetice, naturale sau decelularizate)
b) strategii de auto-asamblare bazate pe cell sheet technology
c) grefe produse prin endotelializarea in situ

(1) Diferite tipuri celulare pot reprezenta componenta celulară a TE vasculară (TEVG), acestea
pot fi autologe sau alogenice:
- celule diferențiate specifice: celule endoteliale (EC), celule musculare netede (SMC),
fibroblaste (FB)
- celule stem
(2) Celulele multiplicate în cultură sunt însămânțate pentru obținerea TEVG

(3) Vasele sunt recoltate din surse alogenice sau xenogenice și decelularizate. Matricea rezultată
este recelularizată cu celulele izolate din țesut.
(4) Polimeri naturali și sintetici sunt folosiți pentru construcția de structuri scaffold pentru
însămânțarea celulară ulterioară.
(5) Este folosită tehnologia cell sheet pentru a forma TEVG “scaffold-free”
(6) După însămânțare, construcții pot suferi etape de maturare opționale inclusive cultivarea
prelungită, folosirea de bioreactoare, etc.
(7) TEVG complet funcționali sunt implantați la pacienți
(8) Alternativ, structuri scaffold acelulare dar funcționalizate biologic pot fi implantate pentru a
induce endotelializarea in situ

a) Grefe ghidate de scaffold


Celulele recoltate de la pacient sunt multiplicate și apoi însămânțate în materiale formatoare de
scaffold (COL, fibrină), modelate în structuri tubulare sau însămânțate pe un scaffold poros.
Constructul este apoi cultivat în bioreactor.
exemplu: primul TEVG era compus din matrice de colagen cu celule musculare netede,
fibroblaste și celule endoteliale bovine (1986), dar nu era suficient de stabil. A necesitat o meșă
de Dacron (polietilen tereftalat).
Pot fi folosite matrici decelularizate: țesutul recoltat dintr-o sursă animală este decelularizat cu
agenți chimici (acizi și baze, soluții hipo-/hipertonice, detergenți și solvenți), biologici (enzime și
agenți de chelare) sau prin metode fizice (agitare, abraziune). Matricile decelularizate pot fi vase
de sânge, submucoasa intestinului subțire și membrane amniotice, ce pot fi modelate într-o
construcție tubulară. Celulele recoltate de la pacient sunt apoi însămânțate pe scaffoldul
decelularizat generând un TEVG după mature.
Exemplu de grefe acelulare disponibile comercial: Artegraft, Solcograft și ProCol (bazate pe
vase de sânge bovine decelularizate) și SynerGraft Model 100 (bazat pe ureter bovin
decelularizat)

b) strategii de auto-asamblare bazate pe cell sheet technology


(a) Un înveliș celular 2D este obținut în cultură și rulat în jurul unui “fus”, formând o structură
tubulară care este maturată în TEVG
(b) Agregate celulare plasate într-o matriță și combinate pentru a forma TEVG
(c) Bioimprimare 3D: celulele și matricea suport sunt depozitate într-o manieră ”layer by layer”
pentru a realiza un construct 3D
Pentru a produce un echivalent vascular prin tehnologia cell sheet trebuie reconstituite toate cele
3 tunici ale peretelui vascular (adventicea, media și endoteliul)

c) grefe produse prin endotelializarea in situ


= strategie ce se bazează pe incorporarea de molecule biofuncționale (factori de creștere,
chemokine, molecule de adeziune celulară) în grefa vasculară pentru a mobiliza celulele
endoteliale progenitoare (EPCs) sau ECs din vasul gazdă după implantare.
Acest proces presupune mobilizarea celulară, migrarea, popularea grefei cu celule endoteliale
(prin procese de adeziune, proliferare și diferențiere).
În 2010, Zeng și colab. au imobilizat factorul de creștere neurală (NGF– promovează migrarea și
proliferarea ECs) într-o matrice de colagen cross-lincată celulară. Grefa rezultată a fost
transplantată în artera carotidă la șobolani. La 1 lună post-implantare numai 1 din 10 grefe au
suferit tromboză.
În 2012, Zheng și colab. au fabricat grefe tubulare prin electrofilarea PCL, le-a funcționalizat cu
secvența RGD și implantat în artera carotidă la iepuri. Procesul de vindecare a fost evaluat la 2 și
4 săptămâni post-implantare. La ambii timpi toate cele 10 grefe PCL modificate cu RGD au fost
deschise; 4 din grefele de PCL nemodificat s-au trombozat. La 4 săptămâni post-implantare
∼65% din suprafața grefei PCL-RGD a fost acoperită de un strat de SMC (cu 23% mai mult
decât în cazul grefei PCL).
12. Strategii în contextul ingineriei tisulare cardiace (C5, slide 9-17)
a. TE bazată pe utilizarea de structuri scaffold
Tehnologie (cea mai populară) ce presupune însămânțarea de celule în structuri scaffold 3D
biodegradabile pre-fabricate care sunt constituite din polimeri sintetici și materiale biologice.
Au fost dezvoltate matrici cu proprietăți similare MEC din miocard, ca de exemplu: alginat,
colagen (COL), acid polilactic (PLA) sau acid poliglicolic (PGA). Principalul avantaj este că
aceste materiale sunt înalt maleabile, ceea ce le permite să fie proiectate sub diferite forme și
mărimi în funcție de necesitățile țesutului (organului) gazdă.
Studii in vivo:
1) Studiul clinic MAGNUM (Myocardial Assistance by Grafting a New Bioartificial Upgraded
Myocardium) a folosit o matrice suficient de mare de COL I pentru acoperirea completă a
cicatricei (2007). Tehnologia MAGNUM presupune utilizarea unui scaffold de COL populat cu
celule mononucleare autologe din măduva osoasă. Oferă rezultate mai bune în comparație cu
cardiomioplastia, însă nu substituie complet MEC cardiacă, iar celulele implantate colonizează
țesutul superficial sau pe o adâncime de doar câțiva micrometri.
2) Un consorțiu (RECATABI, REgeneration of Cardiac Tissue Assisted by Bioactive Implants) a
fost creat în cadrul programului cadru european FP7 pentru a dezvolta o platformă de
bioinginerie cardiacă prin combinarea unor biomateriale inovative:
- un schelet elastomeric (poli-etilen acrilat–PEA) și
- un hidrogel peptidic – PuraMatrixTM care a îmbunătățit livrarea, supraviețuirea și proliferarea
celulelor implantate (celule stem derivate din țesutul adipos).
Rezultatele obținute in vivo (pe rozătoare și oi) au demonstrat:
- un anumit grad de diferențiere cardiomiogenică a celulelor implantate și
- conexiuni vasculare între construcți și miocardul adiacent

b. TE bazată pe includerea de celule în hidrogeluri


Celulele sunt combinate cu forma lichidă a unui biomaterial urmată de solidificarea sa pentru a
crea un hidrogel 3D. Această strategie a fost dezvoltată de către Eschenhagen și colab. (1997),
care au cultivat cardiomiocite într-o matrice de colagen tip I pentru a produce un țesut cardiac
contractil.
Există două abordări de utilizare a celulelor încorporate în hidrogel pentru regenerarea cardiacă:
a) injectarea intramiocardială a celulelor incluse în hidrogel
b) implantarea de construcți de TE bazați pe hidrogel formați ex-vivo

a) Injectarea intramiocardială a celulelor înglobate în hidrogel


Polimeri naturali de tipul:
Matrigel TM (laminină, colagen tip IV și heparansulfat), colagen, acid hialuronic, gelatină,
fibrină sau chitozan au fost folosiți pentru încorporarea de celule și injecția intramiocardială
ulterioară.
Dezavantaje:
 deși efectul hidrogelului asupra retenției celulare a fost pozitiv, presiunea de injectare
necesară pentru livrarea celulară este prea mare și determină moartea celulară crescută
diminuând astfel efectul terapeutic al procedurii
 hidrogelurile obținute din materiale naturale sunt dificil de controlat în ceea ce privește
proprietățile lor fizico-chimice și de degradare
 hidrogelurile sunt dificil de purificat și sterilizat
Hidrogelurile sintetice:
Au fost dezvoltate ca o alternativă la cele naturale. Din această categorie fac parte:
 Polietilenglicol (PEG)
 Acid polilactic (PLA)
 Acid polilactic co-glicolic (PLGA)
 Policaprolactona (PCL)
 Poliacrilamida (PAA)
 Poliuretan
care evită dezavantajele prezentate de polimerii naturali. Totuși, potențialul lor citotoxic este încă
studiat. FDA a aprobat doar PEG, PLA și PLGA pentru aplicații clinice.

Hidrogelurile hibride (naturale/sintetice)


Prezintă avantajele ambelor tipuri de polimeri.

b) Formarea ex vivo de construcți de TE bazați pe hidrogel


Permite crearea ex vivo de țesut nou din celule cu potențial cardiomiogenic ce au fost anterior
încorporate în hidrogeluri. Există studii ce au raportat obținerea de construcți TE cardiacă cu
capacitate contractilă pe bază de:
- cardiomiocite embrionare depui încorporate în colagen
- cardiomiocite neonatale de șobolan incluse în Matrigel
Această strategie crează un mediu 3D ce favorizează comunicarea intercelulară, prevenirea
morții celulare ce se poate produce în absența acestei comunicări și permite construcților celulari
să formeze o MEC. Totuși, pentru o dezvoltare tisulară optimă, acești construcți noi trebuie să fie
supuși electromecano-stimulării deoarece, altfel, cardiomiocitele pot prezenta tendința să moară.
Un aspect critic al TE cardiace este riscul inducerii aritmiilor cardiace, cel mai probabil datorită
eșecului cuplării electrice a celulelor implantate cu cardiomiocitele din țesutul gazdă. De aceea,
se fac eforturi de a se asigura integritatea electrică a funcției cardiace prin îmbunătățirea
conductivității electrice. Aceasta se poate realiza prin:
- creșterea tăriei ionice sau
- adăugarea de materiale electro-conductive inclusiv:
Nanorods
Nanofire
Nanotuburi de carbon
Polimeri
Introducerea materialelor electroconductive în construcții TE este o provocare datorită
biocompatibilității limitate și proastei dispersabilități a materialelor electroconductive. Candidați
promițători sunt polimerii datorită faptului că sunt miscibili cu un domeniu larg de materiale și
manifestă contracție prin stimulare electrică. Prin urmare, hidrogelurile biohibride
electroconductive dezvoltate pot fi folosite la obținerea de construcți de TE cardiacă, având
potențialul de a se matura și contracta fără stimulare mecanică sau electrică. Astfel, ele pot fi
utilizate pentru tratamentul bolilor inimii și posibil al altor țesuturi ce sunt sensibile electric.

c. TE bazată pe înveliș celular


Shimizu și colab. (2002) au dezvoltat construcți musculari cardiaci prin asamblarea de mono-
straturi de cardiomiocite. Monostraturile de cardiomiocite au fost inițial formate prin cultivarea
de celule cardiace pe suprafața plăcilor de cultură grefate cu polimerul sensibil la temperatură
poli (N-izopropilacrilamidă) (PNIPAAm).

Generarea de bio-construcți multi-stratificați prin intermediul tehnologiei termo-sensibile:


celulele crescute în monostrat în plăci acoperite cu PNIPAAm termo-sensibilă pot fi desprinse
prin scăderea temperaturii sub 32°C. La 37°C suprafața este puternic hidrofobă și permite
adeziunea celulară. Când temperatura este redusă, PNIPAAm devine hidrofilă, stratul celular se
desprinde și MEC este păstrată. Învelișul celular multi-stratificat poate fi obținut prin
suprapunerea serială a învelișurilor mono-stratificate obținute.

13. Abordări ale echivalenților hepatici vascularizați (C6, slide 12-15)


a) Strategia ce implică Sistemele MicroElectroMecanice (MEMS)
Grupul lui Vacanti a reuşit să formeze un echivalent hepatic constituit din 23 de unităţi similare
lobulilor hepatici cu o reţea de microvasculatură 2D cu dimensiuni similare sinusoidelor
hepatice. Presupune realizarea a doua compartimente polimerice similare, semi-închise cu
structura 2D:
- unul conține hepatocite
- cel de-al doilea este căptușit pe peretele interior cu celule endoteliale ce sunt separate printr-o
membrana semipermeabila de primul compartiment

Se comporta ca un sistem vascular pentru a transporta nutrienți și oxigen la celulele din celălalt
compartiment.
Astfel de microstructuri 2D pot fi fabricate folosind polimeri biodegradabili polimerizabili
termic sau fotopolimerizabili. Este dificil sa se obțină țesuturi mari: se impune realizarea in
prealabil a mai multor culturi 2D si suprapunerea compartimentelor, separându-le printr-o
membrană semipermeabilă.

b) Asamblarea modulară – împachetarea elementelor tisulare și perfuzarea spațiilor interstițiale


ca o vasculatură la scară macro.
Abordare dezvoltata de McGuigan şi Sefton (2006). Promovează o arhitectură 3D:
a) hepatocitele sunt înglobate într-un hidrogel de formă tubulară (al cărui diametru este de
ordinul sutelor de μm)
b) acoperirea suprafeței cu celule endoteliale
c) în final: asamblarea elementelor (modulelor) într-un bioreactor

Modulele obținute sunt asamblate într-o


incintă mai mare, pentru a forma construcți
cu canale interconectate prin care poate fi
perfuzat sânge sau mediu
Mediul de cultură (sângele) este perfuzat prin spatiile interstițiale rămase între elemente,
constituindu-se o rețea vasculară cu suprafața interioară căptușită de celule endoteliale
(împiedică coagularea sângelui la perfuzarea cu sânge integral).
Dezavantaj:
 nu se asigură o perfuzare uniformă
 celulele pot suferi datorită manifestării unui stres de forfecare

c) Fabricarea de scaffold-uri macroporoase 3D ce conțin o structură de tip vascular la


scară macro.
Aceasta strategie se bazează pe metodologia convenţională a TE de a utiliza scaffold-uri 3D
biodegradabile ce au structură macroporoasă pentru imobilizarea celulelor. In plus este prezenta
o structură “flow channel-like” pentru a asigura aportul de oxigen şi nutrienți către celule. Pentru
conectarea la circulaţia sanguină a organismului gazdă, Sakai și col. (2004) au propus un design
3D special a reţelei canalelor de flux “tree-like” cu ramificații si conexiuni astfel organizate încât
reţeaua are o intrare şi o evacuare si întregul scafold poate fi uniform alimentat cu mediu de
cultură sau sânge prin perfuzare.

Scaffolds macroporoase pe bază de PCL ce posedă o reţea 3D de canale de flux ramificate/unitate (V=13 cm3)
d) Bioimprimarea (Bioprinting-ul)
= printing-ul 3D simultan al celulelor şi scaffold-urilor
= cea mai noua abordare tehnologica aflata încă într-un stadiu incipient
Presupune incorporarea de celule sau agregate celulare în materiale de tip hidrogel care sunt apoi
solidificate împreună într-o manieră 3D.
Unul dintre punctele cheie ale acestei tehnologii este reprezentat de selectarea unor matrici de
hidrogel netoxice care pot fi uşor solidificate. Hidrogelurile termoreversibile constituie unele
dintre cele mai promiţătoare materiale potrivite pentru această tehnică.
Tsang și colab. (2007) au dezvoltat un hidrogel din polietilenglicol (PEG) fotopolimerizabil
dopat cu peptida RGD, care s-a dovedit potrivit pentru entraparea de hepatocite. Ei au realizat o
structură complicată reprezentata de tuburi de hidrogel (cu diametrul de ~500 μm) în care au fost
încorporate celulele. Spațiile libere dintre tuburi au fost perfuzate cu mediu de cultură, iar
oxigenul a fost furnizat celulelor entrapate prin difuzie. Densitatea inițială a celulelor a fost de
7,5 milioane celule/ml de hidrogel. Celulele si-au recuperat parţial contactele celulă-celulă într-o
manieră 3D şi au prezentat funcţii adecvate în condiţiile de perfuzare.