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Abstrato
Objetivo
Investigar as bases biológicas da “depressão com estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do
baço ”.
Métodos
Um método de perfil de expressão gênica digital foi conduzido para explorar mudanças globais no
transcriptoma de mRNA em um modelo de rato com depressão com estagnação do qi do fígado e
síndrome de deficiência do baço. A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (q-PCR)
foi realizada para verificar os cinco genes mais interessantes com base na análise da Enciclopédia de
Genes e Genoma de Kyoto (KEGG). Sini San , que dispersa o qi estagnado do fígado e fortalece o baço, foi
administrado aos ratos modelo para observar se poderia reverter essas mudanças genéticas no fígado.
Resultados
Quarenta e seis genes diferencialmente expressos foram identificados. Três dos cinco genes de maior
interesse - Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 - com base na análise KEGG, foram confirmados por PCR em tempo
real. Sini San reduziu as alterações da expressão gênica de Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 no modelo de rato.
Conclusões
Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 estão envolvidos em “depressão com estagnação do qi do fígado e síndrome de
deficiência do baço”. Esses achados indicam que ratos deprimidos com estagnação do qi do fígado e
síndrome de deficiência do baço apresentam risco de doenças hepáticas. Além disso, nossos resultados
irão informar a exploração da etiologia da depressão e ajudar no desenvolvimento de estratégias
terapêuticas eficazes.
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Palavras-chave
Depressão; Estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço; Gene expresso
diferencialmente; Fígado; Base biológica
Introdução
A depressão é um transtorno psiquiátrico complexo , caracterizado por anedonia e sentimentos de
tristeza. 1 De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), espera-se que a depressão seja a
segunda causa de incapacidade após doença cardíaca até 2020. 2 Embora a depressão tenha sido
intensamente estudada, sua etiologia e estratégias terapêuticas eficazes ainda são ilusórias. Na China, a
Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento da depressão e
muitas vezes proporciona bom efeito terapêutico . De acordo com a teoria TCM, disfunção do fígado
Zangé a causa da depressão e a síndrome mais comum na depressão é “ estagnação do qi do fígado e
deficiência do baço ”. 3 Sini San , que dispersa o qi estagnado do fígado e fortalece o baço, é uma receita
que se provou benéfica para curar a depressão. 4 , 5 Portanto, o estudo da base biológica da síndrome de
“depressão com estagnação do qi do fígado e deficiência do baço” é necessário para entender a etiologia
da doença e desenvolver estratégias terapêuticas eficazes.
TCM postula que a resposta do organismo ao stress está associada com a função do fígado Zang . 6
Assim, o stress crónico imprevisível leve (Cums), que imita os níveis de stress por dia em seres humanos,
tem sido utilizada na investigação fígado Zang disfunção. Expostos ao estresse, diferentes tecidos e
órgãos têm que interagir extensivamente para se adaptar aos desafios ambientais. Entre esses órgãos, o
fígado, como definido por sua anatomia, é de particular interesse, dado seus papéis vitais na
manutenção da homeostase e da saúde, bem como na regulação da utilização de nutrientes e do
metabolismo geral. 7 Além disso, em teoria TCM, a função do fígado, conforme definido pela anatomia
moderna, é um componente importante do fígado Zang. 8 Portanto, especulamos que mudanças no
fígado devem ser uma parte importante da base biológica da “depressão com estagnação do qi do fígado
e síndrome de deficiência do baço”.
Com base na especulação acima, primeiro estabelecemos um modelo confiável de depressão em ratos
com estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço, de acordo com o método estabelecido
em nossos estudos anteriores. 9 Segundo, o perfil de expressão gênica digital (GDE), que pode analisar as
mudanças globais no transcriptoma de mRNA , foi conduzido para analisar as alterações genéticas no
fígado. Finalmente, a prescrição clássica, Sini San , composta de raiz chinesa da mandíbula ( Bupleurum
chinense DC), fruta laranja imatura ( Citrus aurantium L), raiz de peônia vermelha (Paeonia lactiflora Pall) e
alcaçuz ( Glycyrrhiza uralensis Fisch), foi administrada aos ratos modelo para observar se poderia reverter
as alterações genéticas no fígado.
materiais e métodos
Animais
Cento e dez ratos machos Sprague-Dawley (pesando aproximadamente 200 ± 20 g) (Licença Animal No:
SCXK Beijing 2012-0001) foram adquiridos do Centro de Pesquisa de Animais de Laboratório Beijing
Vitalriver, China. Todos os ratos foram criados em uma sala comum com temperatura entre 18 e 24 ° C e
umidade entre 40 e 60%. Os ratos receberam livre acesso a alimentos e água convencionais. Os
protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da
Universidade de Pequim de Beijing (número de ética: 2013BZHYLL1001B). Todos os esforços foram
feitos para minimizar o sofrimento dos animais.
Agrupamento
Após alimentação adaptativa por 2 semanas, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos de
acordo com o peso corporal : grupo CUMS (n = 89) e grupo controle (n = 21). Os ratos do grupo CUMS
foram alojados em isolamento, enquanto os outros ratos foram alojados em grupos de quatro a cinco.
Após 6 semanas, os ratos CUMS foram considerados o modelo de depressão com estenose do qi do
fígado e síndrome de deficiência do baço e divididos aleatoriamente em três grupos de acordo com
testes comportamentais: (1) grupo modelo (grupo M) - 21 ratos recebendo água destilada e submetidos
para o procedimento CUMS; (2) Grupo Sini San + CUMS (grupo S) - 14 ratos que recebem Sini
Sandissolvido em água destilada e depois submetido ao procedimento CUMS; (3) fluoxetina + grupo
CUMS (grupo F) - 18 ratos que receberam fluoxetina em água destilada e depois submetidos ao
procedimento CUMS. Ratos no grupo controle (grupo C) permaneceram os mesmos.
Métodos para identificar o modelo de rato com depressão com estagnação do qi do fígado e
síndrome de deficiência do baço
De acordo com os métodos estabelecidos em nosso estudo anterior, 9 atribuímos sintomas, que são
usados para discriminar a doença e a síndrome na clínica, 11 para características macroscópicas visíveis
nos ratos. As atribuições específicas foram as seguintes:
Ratos exibindo três características visíveis macroscópicas principais, ou os dois primeiros principais
com a característica visível macroscópica secundária foram diagnosticados como ratos deprimidos com
estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço.
Amostragem
Antes do meio dia do segundo dia após o término do experimento de 8 semanas, os ratos foram
sacrificados por decapitação . Seus fígados foram imediatamente removidos e congelados em nitrogênio
líquido , em seguida, armazenados a -80 ° C até o uso.
onde N é o número de todos os genes com anotação KEGG, n é o número de genes diferencialmente
expressos (DEGs) com anotação KEGG, M é o número de todos os genes anotados em vias específicas e
m é o número de DEGs anotados em vias específicas . Os valores de P foram calculados pelo teste exato
de Fisher e corrigidos pelo método de Bonferroni para obtenção dos valores de Q.
Testes comportamentais
Como mostrado na Tabela 1 , Tabela 2 , Tabela 3 , em comparação com ratos no grupo C, os ratos nos
grupos M e S têm diferenças significativas no OFT, SPT e FST após 6 semanas de exposição ao CUMS.
No entanto, não houve diferenças significativas entre os grupos M, S e F nos três testes
comportamentais antes da administração do medicamento . Após um tratamento de 2 semanas, em
comparação com o grupo S, tanto a administração de Sini San como a de fluoxetina aumentaram
significativamente o número de elevações ( Tabela 1 , M vs. S: P = 0,012; M vs. F P = 0,005). No OFT e
SPT, Sini Sane a administração de fluoxetina tendeu a aumentar a distância total de movimento ( Tabela
1 ) e a preferência por sacarose ( Tabela 2 ), embora essas diferenças não tenham sido significativas em
comparação com o grupo M. No FST ( Tabela 3 ), a administração de Sini San tendeu a aumentar o tempo
de imobilidade , enquanto a administração de fluoxetina não teve um efeito significativo em comparação
com o grupo M.
∗P ≤ 0,05 em comparação ao grupo C, # P ≤ 0,05 em comparação ao grupo M; valores são médias (SD) (unidade: s) (N =
21, 17, 13,18).
Tabela 4 . Enriquecimento KEGG de DEGs (as seis vias mais marcadamente enriquecidas).
Hnf4α Hnf4γ
* P ≤ 0,05 em comparação ao grupo C, # P ≤ 0,05 em comparação ao grupo M; valores são médias (SD).
Tabela 7 . Níveis de expressão de Cyp1a1 , Cyp1a2 e Cyp7b1 em cada grupo.
Discussão
Na teoria da MTC, uma síndrome é o resumo patológico da localização, causa, natureza e condição de
uma doença em um determinado estágio, e esse é o núcleo do tratamento da MTC. Estudos para
entender a base biológica de uma síndrome são imperativos para a popularização e aplicação da teoria
da MTC na medicina moderna.
Há um crescente corpo de evidências sugerindo que o estresse pode modificar os citocromos P450 ( Cyps
) no fígado. 31 , 32 , 33 , 34 Dois efetores primários do sistema de resposta ao estresse, chamados
glicocorticóides e vias adrenérgicas , são os principais responsáveis pelas alterações das cits no fígado,
por meio de várias vias de sinalização. 35 , 36 , 37 No presente estudo, confirmamos que o citocromo
P4501A1 ( Cyp1a1) expressão no fígado foi supra-regulada na depressão induzida por estresse com
estagnação do qi do fígado e modelo de síndrome de deficiência do baço. Cyp1a1 é uma enzima chave na
biotransformação de agentes tóxicos e carcinogênicos ambientais, tais como aminas aromáticas e
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos . A indução e a atividade elevada de Cyp1a1 têm sido associadas
à toxicidade e ao aumento do risco de câncer em indivíduos expostos à fumaça do tabaco ou outros
poluentes ambientais, incluindo esses compostos. 32 Cyp1a2 , que compartilha as principais funções do
Cyp1a1 , 35também demonstrou aumento dos níveis de expressão. Assim, combinado com os resultados
do Hnf4α , o modelo de depressão com estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço
também pode estar em risco de câncer. Além da subfamília Cyp1a , o presente estudo demonstrou uma
tendência de aumento da expressão de Cyp7b1 . Como o Cyp7b1 tem uma relação estreita com a síntese
do ácido biliar, 38 ele pode ser responsável pela síndrome da deficiência do baço.
Além de investigar alterações no fígado no modelo de rato, também avaliamos o efeito do tratamento
com Sini San e fluoxetina . Tanto o Sini San quanto o tratamento com fluoxetina podem melhorar os
comportamentos relacionados à depressão, embora o efeito não tenha sido notável. Este resultado pode
ser devido ao fato de que a terapia medicamentosa de 2 semanas foi relativamente curta. Os fenótipos do
comportamento depressivo podem melhorar significativamente com um tempo de tratamento
prolongado. Notavelmente, a administração de Sini San reduziu significativamente as alterações na
expressão do subtipo Hnf4 e teve uma tendência a reduzir as alterações na expressão do Cyp1a1 . Na
teoria do TCM, Sini Sané uma prescrição clássica que tem a função de dispersar o qi estagnado do fígado
e fortalecer o baço. Estes resultados confirmaram ainda que Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 estão envolvidos na
base biológica da estagnação do qi do fígado e da síndrome de deficiência do baço.
Em conclusão, usando a tecnologia DEG para investigar mudanças globais no transcriptoma de mRNA e
q-PCR para verificar os maiores DEGs, e avaliando o efeito de Sini San nestes DEGs, nós demonstramos
três genes no fígado que estão envolvidos na depressão com qi do fígadoestagnação e síndrome de
deficiência do baço. Esses achados sugerem um alto risco de doença hepática nesse modelo. No entanto,
existem algumas limitações em nosso estudo. Primeiro, apenas verificamos cinco DEGs com base na
análise do KEGG. Mais estudos para verificar os outros DEGs são garantidos. Em segundo lugar, poucos
estudos foram realizados para investigar alterações no fígado em modelos de depressão; portanto, mais
pesquisas são necessárias para investigar o mecanismo dessas mudanças na expressão gênica. Isso
ajudará no desenvolvimento de remédios mais direcionados para a depressão. Apesar dessas limitações,
acreditamos que nosso estudo demonstrou um grupo de genes que estão envolvidos na depressão
combinada com a estagnação do qi do fígado e com a síndrome de deficiência do baço, o que é
importante para a exploração futura da doença.etiologia da depressão e desenvolver estratégias
terapêuticas eficazes.
Conflito de interesses
Os autores declaram não haver conflitos de interesses.
Reconhecimento
Este trabalho foi apoiado por uma doação do Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (973
Programa No. 2011CB505106 ).
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