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Ribozymes, a new therapeutic strategy?

Article  in  Ars Pharmaceutica · January 1997

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 Ribozimas, ¿una nueva estrategia
terapéutica?
...
Ribozymes, a new therapeutic strategy?

BERZAL-HERRANZ, A. Y BARROSO DEL JESÚS, A.

Instituto de Parasitología y Biomedicina "López Neyra" (CSIC). Ventanilla, n.o 11. 18001

Granada. España.

RESUMEN
Las ribozimas son moléculas de RNA con actividad catalítica, capaces de catalízar
reacciones químicas en el interior celular. En su contexto natural la gran mayoría de las
ribozimas descritas llevan a cabo el procesamiento de otras moléculas de RNA. A
diferencia de las ribonuc1easas proteicas, las ribozimas presentan una gran especificidad
de substrato, esta es la caracterlstica en la que se fundamenta la idea de que las
ribozimas puedan ser utilizadas como supresores génicos específicos y servir de base
para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos. La necesidad de disponer de nuevas
estrategias terapéuticas se hace más evidente cuando surgen enfermedades contra las
cuales los fármacos y terapias empleados no son eficientes. La repercusión social de
determinadas enfermedades de dificil o escasa probabilidad de curación (SIDA, Cáncer,
etc.), ha agudizado la necesidad de buscar tratamientos alternativos. La actnación directa
sobre la información genética responsable de la dolencia, es una de las aproximaciones
experimentales en desarrollo. En este sentido, la utilización de ácidos nucleicos como
agentes supresores constituye, desde hace algunos años, una línea de investigación
importante. Como resultado están surgiendo un conjunto de nuevas tecnologias en tomo
a conceptos tales como oligonuc1eótidos antisense, ribozimas y triples hélices. Las
ribozimas actnarían bloqueando la transmisión de información genética a nivel del RNA
mediante la destrucción de genomas RNA (virus RNA) o de mRNAs. El diseño y la
aplicación efectiva de ribozimas con nuevas especificidades requiere un profundo cono­
cimiento acerca de estas moléculas así como de sus mecanismos de reconocimiento e
interacción con los RNAs substrato. En este trabajo se describen los. RNAs cataliticos
mejor caracterizados, así como las diferentes estrategias desarrolladas hasta el momento
para la utilización de las ribozimas como inactivadores génicos.
Palabras clave: Ribozimas. RNA Catalítico. Terapia Génica.

ABSTRACT
Ribozymes are RNA molecules endowed with catalytic activíty, they are able to
catalyze chemícal reactions inside the cells. In their natural environment, most of the
described ribozymes carry out processing of other RNA molecule. In contrast to the
protein ribonucleases, ribozymes exhibít a high-substrate specíficity. This feature is the
base for the potential use of ribozymes as specific gene suppressors and therefore to

Ars Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190,1997

 . --===._-~~~,,~=~_. .~~~~--------------------

178 BERZAL-HERRANZ, A. Y BARROSO DEL JESÚS, A. RIBOZIMAS, ¿UNl

develop new therapeutic agents. The need of new therapeutic strategies is even more RNAs origim
significant with the rising of diseases against which the existent drugs and therapies do dose además
not show the desirable efficiency. The social repercussions of some diseases of difficult
or low probability of control (AIDS, Cancer, etc.), has made more acute the need of
tamente capa
looking for altemative treatments. Among the experimental approaches that are being cunstancias bI
carried out is the direct action on the genetic information responsible of such diseases. durante la el
On this line, several strategies have emerged in the past few years, mainly based on the múltiples sub
use ofnucleic acids as specific gene suppressors, e.g. antisense oligonucleotides, ribozymes Por lo ge
and triplex helix. The ribozymes would act blocking the transmission of genetic information
-." cimiento del :
at the RNA level, mediating destruction of RNA genomes (RNA virus) or mRNAs. A
deep understanding of the mechanisms used by these molecules for the recognition and de la reacciÓII
interaction with their RNA substrates as well as of these molecules themselves is cias con el o
necessary for the design and effective application of ribozymes with new specificity. In predeterminad
this work we describe the best characterized catalytic RNAs, as well as the different nos abre las J
strategies developed for their use as genetic suppressors. tratamiento el.
Key words: Ribozymes. Catalytic RNA. Gene therapy.
curación con 1
la investigaciC
Recibido: 15-01-97. génicos. En I
Aceptado: 21-02-97. catalíticos. A
BIBLID [0004-2927(1997) 38:2-3; 177-190]

RIBOZIMAE
RIBOZIMAS
El domini
Las ribozimas son moléculas de RNA con actividad catalítica. Desde su ridad negatiw
descubrimiento en 1981, la catálisis biológica mediada por RNA se ha encon­ [(-)sTRSV] se
trado subyacente a diversos procesos biológicos: procesamiento de intrones, mental en el I
mecanismos de replicación de genomas RNA, maduración de tRNAs, incluso vez en 1989,
se ha propuesto que el RNA ribosómÍco sea el auténtico catalizador de la otros grupos
formación del enlace peptídico durante el proceso de la traducción. La prác­ original capa:l
tica totalidad de ribozimas de origen natural descritas hasta la fecha catalizan, nucleótidos (:
independientemente del proceso biológico en el que participen, el procesa­ mecanismo ti
miento del esqueleto fosfodiester de otros RNAs. Pueden ser consideradas transesterifica
pues como ribonucleasas que, a diferencia de sus análogas proteicas, presen­
tan una elevada especificidad de reacción. Esta especificidad viene determi­
nada, en todos los casos, por interacciones tipo RNA-RNA entre la ribozima
y el substrato, siendo la misma molécula de RNA responsable tanto del
reconocimiento e interacción con el substrato, como de la acción catalítica
- cíclico. Esta 1
puesto que SI
como los deDIl
hairpin osteal
ligazón de _
propiamente dicha (etapa química de la reacción). Tras nIUD
En su contexto natural, la mayoría de las ribozimas (salvo la RNase P) ribozima fue I
catalizan reacciones intramoleculares. Como consecuencia, no pueden ser trato con el ji
consideradas como verdaderas enzimas dado que se ven modificadas en el estructura sec:I
curso de la reacción y además no pueden procesar más de una molécula, elección para
aquella de la que forman parte. Sin embargo, tras un exhaustivo estudio de los dirigida, sin 1
Ars Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190, 1997
 RIBOZIMAS, ¿UNA NUEVA ESTRATEGIA TERAPÉUTICA? 179

RNAs originales se ha conseguido aislar los dominios catalíticos, demostrán­

dose además que conservan intacta su actividad y que por tanto son perfec­
tamente capaces de procesar substratos aportados en transo Bajo estas cir­
cunstancias las ribozimas se comportan como auténticos enzimas, no se alteran
durante la catálisis, y además, una única molécula es capaz de procesar
múltiples substratos.
Por lo general en las rioozimas, las secuencias responsables del recono­
cimiento del substrato no están directamente implicadas en la etapa química
de la reacción. Esto posibilita el hecho de que podamos alterar dichas secuen­
cias con el objeto de dirigir selectivamente la ribozima frente a substratos
predeterminados. La capacidad de generar ribozimas con nuevas especificidades
nos abre las puertas de su futura utilización como agentes supresores en el
tratamiento de enfermedades actualmente de dificil o escasa probabilidad de
curación con los fármacos de los que se dispone. De hecho, ya se ha iniciado
la investigación con el fin de optimizar el uso de ribozimas como inactivadores
génicos. En estos estudios se están utilizando diferentes tipos de RNAs
catalíticos. A continuación se describen brevemente los más representativos.

RIBOZIMA HAIRPIN

El dominio catalítico responsable del procesamiento de la hebra de pola­

ridad negativa del RNA satélite del virus de las manchas en anillo del tabaco
[(-)sTRSV] se conoce como ribozima Hairpin. In vivo juega un papel funda­
mental en el proceso de replicación de este RNA. Fue descrita por primera
vez en 1989 por Hampel y Tritz (1). Los trabajos llevados a cabo por este y
otros grupos permitieron delimitar la mínima porción del RNA catalítico
original capaz de conservar la actividad. El dominio catalítico consta de 50
nucleótidos (50 nt) y utiliza como substrato una molécula de 14 nt. El
mecanismo de reacción es dependiente de iones Mg2+ y consiste en una
transesterificación que origina productos con extremos 5' OH y 2' 3' fosfato

.. cíclico. Esta reacción química no es exclusiva de la ribozima tipo hairpin

puesto que su mecanismo es coincidente con el de otros RNAs catalíticos
como los denominados pequeños (Hammerehead, HDV). Además, la ribozima
hairpin ostenta la capacidad de catalizar la reacción inversa, es decir, la
ligazón de sus propios productos de corte (2).
Tras numerosas tentativas fallidas para modificar la especificidad de la
ribozima fue necesario un análisis sistemático del complejo Ribozima-Subs­
trato con el fin de obtener más información acerca de nucleótidos esenciales,
estructura secundaria, y en 10 posible, contactos terciarios. La estrategia de
elección para estudios de esta naturaleza es comúnmente la mutagénesis
dirigida, sin embargo, ésta por 10 general se basa en estudios filogenéticos
Ars Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190, 1997
180 BERZAL-HERRANZ. A. Y BARROSO DEL JESÚS. A. amo

preliminares que suelen revelar secuencias conservadas y por tanto particular­

mente interesantes. La carencia de secuencias análogas en el caso de la
ribozima tipo hairpin (únicamente tres motivos similares en la naturaleza)
hace muy laborioso el análisis indiscriminado de la molécula mediante mutagénesis
. Por este motivo se desarrolló una nueva herramienta para el estudio simul­
táneo de miles de variantes basada en el concepto de la selección in vitro (2).
La aplicación en este campo de la selección molecular in vitro es factible
gracias a la naturaleza de los RNAs catalíticos. Dado que son ácidos nucleicos, .. ,~

~I
su secuencia de bases nitrogenadas tiene la capacidad de codificar informa­
ción genética (genotipo), pero además, las ribozimas expresan de forma direc­
ta su propio fenotipo a través de la catálisis de una reacción química. La
posesión simultánea de ambas características las hace susceptibles de sufrir ~
procesos de evolución y selección, aunque, a diferencia de lo que ocurre para Si .~
los seres vivos, estos procesos operan en un sistema totalmente extracelular. "'lII1
Para el estudio sistemático de una molécula predeterminada con una función
ya establecida es más frecuente la utilización de técnicas de selección, mien­
tras que la evolución in vitro (que implica la introducción de nueva variabi­
-S¿
fiir;';

..J
lidad genética en cada ronda de selección) es preferentemente empleada r.1
cuando se persigue la obtención de moléculas con nuevas actividades (3). La :z:
pauta a seguir en el desarrollo de estrategias de esta naturaleza es general­
mente similar: Se introducen aleatoriamente mutaciones en las regiones obje­ 1
to de estudio y se somete a la población de variantes resultante a la presión 1
selectiva de ser recuperadas únicamente aquellas moléculas que mantengan la .~
actividad y que por tanto catalicen la reacción deseada. Estudiando las molé­ ..J
culas no recuperadas se determinan las mutaciones que bien de forma aislada, .Dl
bien en combinación con otras, no son toleradas. Del conjunto de moléculas
recuperadas se puede obtener información acerca de posiciones esenciales,
regiones que no presentan requerimientos de secuencia estrictos e incluso
acerca de aspectos estructurales (estructura secundaria fundamentalmente).
Los datos obtenidos mediante el uso de técnicas de esta naturaleza, en
combinación con los estudios más tradicionales de mutagénesis, han permi­ Ji
tido establecer los modelos estructurales y requerimientos de secuencia de -~

algunos RNAs catalíticos (fig. 1).

En 10 que respecta a la ribozima hairpin, se han identificado 15 nucleótidos
en la ribozima y uno en el substrato esenciales para la actividad catalítica, así
como cuatro regiones de doble banda necesarias para la catálisis (4, 5).
El gran volumen de información estructural y de secuencia obtenida a lo
largo de los últimos años, ha permitido sentar las bases para el diseño de
ribozimas tipo hairpin con nuevas especificidades. Estas ribozimas han sido
empleadas como supresores génicos en numerosos ensayos, tanto in vitro
-
as

como en cultivos celulares. El RNA del HN ha sido una de las dianas más
frecuentemente utilizadas en ensayos de inactivación por RNAs catalíticos.
Ara Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190, 1997
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~ Fig. l.-Requerimientos estructurales y de secuencia de los complejos ribozima-substrato para los dominios catalíticos tipo hammerhead (a)
15 y tipo hairpin (b). Estos requerimientos han sido determinados mediante técnicas de selección in vitro y análisis mutacional. Las flechas
t.O indican los sitios de procesamiento de las moléculas substrato. Las secuencias correspondientes a las ribozimas están representadas con letras ..­
:s mayúsculas y las correspondientes a los substratos con minúsculas. 00
182 BERZAL-HERRANZ, A. Y BARROSO DEL JESÚS, A.

Utilizando una ribozima tipo hairpin dirigida contra la región 5' no codifican­
te del RNA de este virus, se han logrado porcentajes de inhibición de la
replicación de hasta un 80% en cultivos celulares (6, 7).

RIBOZIMA HAMMERHEAD

Se denomina genéricamente ribozimas tipo hammerhead a un conjunto de

dominios catalíticos, estructuralmente análogos, presentes en numerosos RNAs
generalmente patógenos de plantas, especialmente en los llamados virusoides.
Catalizan una reacción intramolecular de corte en una posición perfectamente
determinada dentro de su genoma de RNA. La reacción depende de la presen­
cia de iones magnesio y consiste en una transesterificación que genera pro­
ductos 5' OH Y 2' 3' fosfato cíclico (8). El avance en el conocimiento de este
RNA catalítico ha progresado de forma paralela al de la ribozima hairpin por
lo que muchos de los argumentos expuestos anteriormente son también apli­
cables en este caso: Se ha delimitado el dominio catalítico, se ha demostrado
que puede catalizar el corte en trans de otro RNA (substrato) y se ha logrado
modificar la especificidad de la ribozima.

Es el motivo catalítico más ampliamente utilizado en experimentos de

inactivación génica debido a su pequeño tamaño (aprox. 35 nt) y a su elevada
eficiencia catalítica. Las estrategias utilizadas con este dominio son semejan­
tes a las de la ribozima tipo hairpin, conseguiéndose inactivación de RNAs in
vi/ro, en cultivos celulares (9-11) e incluso en organismos superiores (12, 13).

RIBOZIMAS GRUPO 1
~
<4
La información genética no se encuentra codificada de manera continua
en el genoma. Existen interrupciones del mensaje ocupadas por secuencias no
codificantes. Cuando estas secuencias se disponen en el interior de un marco
abierto de lectura reciben el nombre de intrones. Aunque los intrones se
transcriben de forma primaria, son posteriormente eliminados del RNA men­
sajero durante su maduración.
Las ribozimas Grupo 1 son un tipo particular de intrones que, en ausencia
total de proteinas catalizan su propio procesamiento, 10 cual implica no solo
su escisión sino también la ligazón de los exones flanqueantes.
El mecanismo de reacción es dependiente de guanosina e iones magnesio
y consiste en dos transesterificaciones consecutivas que liberan, como pro­
ductos finales de la reacción, el intrón unido covalentemente por su extremo
5' a la guanosina y los dos exones ligados (14).
Ara Pharmaceutica. 38:2-3; 177-190, 1997
ús.. A. RIBOZIMAS, ¿UNA NUEVA ESTRATEGIA TERAPÉUTICA? 183

i:an­ En la primera etapa del proceso, la molécula de guanosina unida previa­

le la mente al centro activo del intrón, inicia, por mediación de su grupo 3'
hidroxilo, el ataque al enlace fosfodiester existente entre el último nucleótido
del exón 1 y el primer nucleótido del propio intrón. A pesar de la destrucción
del enlace, el exón 1 permanece asociado al intrón por apareamiento de bases,
es decir, por una interacción no covalente. Durante el curso de la reacción la
guanosina es adicionada al extremo 5' del intrón. En la segunda etapa es
ID de atacado el lugar de procesamiento en 3', es decir, el punto de unión entre el
lMAs intrón y el exón 2. La reacción es prácticamente idéntica a la catalizada en el
iIes. primer corte, aunque en esta ocasión el grupo químicamente activo es el 3'
~ OH del exón 1, que queda libre después de la primera reacción. Tras esta
ÍIIcn­ segunda transesterificación se liberan los dos exones ligados y el intróncon
lpro- la guanosina en su extremo 5' (fig.2). La reacción descrita es, en su totalidad
~cste

...,..,
reversible por lo que el intrón es capaz de integrarse específicamente entre los
Ilpor dos exones (15).
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RNA PREC'lJRSOR

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RNA PROCESAl)()
Resio I y 2 I.IGMXJS)
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pro­ Fig. 2.-Principales etapas en el procesamiento de los ¡ntrones grupo l. En cursiva se indican
remo las secuencias correspondientes a los exones l y 2. La guanosina de origen ex6geno, impres­
cindible para la catálisis, se representa incluida en un circulo.
Ars Pharmaceutica,38:2-3; 117-190,1997

....

184 BERZAL-HERRANZ, A. Y BARROSO DEL JESÚS, A.

El primer RNA catalítico que se describió fue un intrón grupo 1 presente

en el precursor del RNA ribosómico de la subunidad grande de los ribo somas
de Tetrahymena thermophila (16). Análisis filogenéticos y mutacionales han
permitido definir un modelo de estructura secundaria en el que destacan
elementos estructurales (PI, P2 hasta P10) y de secuencia (P, Q, R Y S)
altamente conservados y necesarios para la catálisis (fig.3a). La especificidad
de secuencia del ribozima viene dada por las interacciones establecidas entre
la región 5' del intrón y cada uno de los exones (fig.3b). La reacción en 5' está
bien caracterizada y el corte se produce, salvo raras excepciones, inmediata­
mente después de un par G-U muy conservado. Del procesamiento en 3' se
tienen menos datos aunque lo que si se conoce es la necesidad de una
guanosina en el extremo 3' del intrón.
La mayoría de los ensayos encaminados a la utilización de los intrones
grupo 1 como inactivadores o modificadores génicos se han llevado a cabo
empleando como modelo experimental la ribozima grupo 1 de Tetrahymena
thermophila.. En términos generales, se han establecido tres estrategias dife­
renciadas para el diseño y aplicación de ribozimas grupo 1 con nuevas
especificidades. A continuación se describe brevemente cada una de estas
aproximaciones:

a) Inactivación de RNAs utilizando la reacción de procesamiento en 5'.

En su contexto natural el intrón cata liza, durante la primera etapa de su
procesamiento, una reacción intramolecular de corte que libera el exón 1. Sin
embargo, un estudio exhaustivo con este RNA catalítico ha permitido definir
y aislar, al igual que para el resto de las ribozimas descritas, el centro activo
capaz de procesar en trans otro RNA. Para ello, este RNA substrato debe
presentar en su interior una región análoga al sitio de procesamiento en 5" o
lo que es lo mismo, un uracilo inmediatamente en 3' respecto al punto de
corte. Modificando adecuadamente la región del intrón implicada en la inte­
racción con lo que en una situación natural sería el exón 1, se posibilita un
apareamiento de bases estable entre el intrón y el RNA diana. En esta situa­
ción la ribozima reconoce el punto de corte como el sitio de unión entre el
exón I y ella misma, catalizando el procesamiento del RNA substrato en dos
productos de corte sin resultar modificada (17).

b) Inactivación de RNAs utilizando la reacción de procesamiento en 3'.

Como se ha apuntado anteriormente, la reacción catalizada por los intrones
grupo 1 es totalmente reversible. El intrón es capaz de integrarse específica­
mente en el mismo punto del que fue escindido dado que las zonas de
interacción PI y PIO le permiten reconocer el sitio de unión entre el exón 1
yel exón 2. En primer lugar el extremo 3' del intrón ataca la unión existente
Ars Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190, 1997
 RIBOZIMAS, ¿UNA NUEVA ESTRATEGIA TERAPÉUTICA? 185

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5' exon - e u e u e u A A AU ~
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I I I I 1 1 I PIO
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P9.0 l i S
,--AG-G CUGAUAUAGAA ~
I I I I I I P7
L..----U e A e A G A e U A - - - - - - . . J
I[I1II_ en dos
R

Fig. 3.-Estructura secundaria consenso de los intrones grupo I según (21). a) Representación
bidimensional de la estructura secundaria consenso de los intrones grupo L PI-P9: elementos
estructurales de doble cadena conservados. Los elementos de secuencia conservados P, Q, R
Y S se representan con las secuencias nucleotídicas más comunes. Las flechas indican los sitios
de procesamiento en 3' y 5'. b) En esta figura se muestran más detalladamente las interacciones
de la región 5' del intron grupo 1 con ambos exones. Interacción PI con el exón 5' e interacción
PIO con el exón 3'. La interacción P9.0 posibilita el acercamiento de la zona de procesamiento
en 3' al centro activo del intrón. P7, R Y S como anteriormente.
Ara Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190, 1997
186 BERZAL-HERRANZ, A. Y BARROSO DEL JESÚS, A.

entre los exones, rompiendo el enlace y uniéndose covalentemente al extremo

S' del exón 2. En una segunda etapa el extremo libre del intrón (S') queda
ligado al exón 1 liberándose durante el curso de la reacción la guanosina
existente en esta posición del RNA catalítico. La modificación de las secuen­
cias en S' del intrón encargadas del reconocimiento del substrato permiten
dirigir la ribozima contra cualquier región o molécula de RNA. A efectos
prácticos no es necesaria la integración completa del intrón para conseguir la
inactivación del RNA de interés, bastará tan solo con que se culmine la #;...

primera etapa del proceso que conduce por si misma a la rotura de la molé­
cula substrato en dos fragmentos y como consecuencia a su inactivación.

c) Utilización de ribozimas tipo 1 para la corrección de mensajes.

Hasta el momento nos hemos referido a las ribozimas como potenciales
inactivadores génicos. Sin embargo, esta aproximación considera la posibili­
dad de su utilización no para la destrucción sino para la corrección de
mensajes erróneos. Esta estrategia sería útil en el tratamiento de enfermeda­
des causadas por la alteración en la secuencia de un gen.

El extremo S' de la ribozima se diseña para permitir la interacción con la

región del RNA diana inmediatamente anterior a la mutación. En el extremo
3' se dispone una secuencia de RNA que se comportará durante la reacción
como el exón 2. Este exón se correspondería con la secuencia correcta aná­
loga a la de la región a reparar en el substrato. Establecida la interacción, el
intrón cataliza en trans el primer paso de su procesamiento, como consecuen­
cia se escinde el fragmento portador de la mutación. En un segundo paso la
ribozima une covalentemente los dos exones, es decir, el fragmento S' del
RNA substrato (exón 1) Y la secuencia correcta que él mismo portaba en su
extremo 3' (exón 2). Como resultado se produce la sustitución de la región
mutada reparándose el mensaje genético (fig. 4).
Este mecanismo no es un mero planteamiento teórico, sino que ha sido

­
llevado a la práctica con éxito en un sistema simple eubacteriano. En este
trabajo se consigue la reparación del RNA mensajero mutado del péptido a de
la 6-galactosidasa recuperándose la actividad de la proteína en las bacterias
defectivas mutantes (18).

RIBONUCLEASA P

La RNase P es una ribonucleoproteina esencial para el crecimiento celu­

lar dado que participa activamente en la biosíntesis de los RNAs transferentes.
Está ampliamente distribuida a lo largo de la escala filogenética, habiéndose
Ars Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190, 1997
 JESÚS, A. R1BOZIMAS, ¿UNA NUEVA ESTRATEGIA TERAPÉUTICA? 187

~xtremo Rihozima con exón 3" no mutante

) queda Tllln:>erito Mutante

anosina
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ción.

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mciales
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:ión de .. Corte y ligación catalizados por la ribozína
~rmeda-

Tninscr1to f\."pHrado
l con la
:xtremo
Fig. 4.-Mecanismo de escisión y reparación de mRNAs mediado por ribozimas grupo 1.
eacción Figura modificada a partir de (18).
:ta aná­
ción, el
~ecuen-
encontrado en todos aquellos organismos en los que se la ha buscado. Es por
paso la consiguiente operativa tanto en células procariotas como eucariotas.
I S' del

A pesar de que uno de sus componentes es proteico, la actividad catalítica

a en su
reside en el RNA (RNA MI) o al menos así se ha demostrado in vitro para
región
ciertos sistemas eubacterianos (19). Es la única ribozima bien caracterizada
cuyo comportamiento natural es la catálisis de una reacción en transo
na sido El reconocimiento del substrato se basa en aspectos estructurales más
En este que de secuencia, aunque resulta imprescindible la presencia de un triplete
do ade
lcterias
... CCA en el extremo 3' del RNA substrato. Además es necesario que la región
inmediatamente anterior a este triplete se halle implicada en la formación de
una estructura de doble hélice. Dicha secuencia recibe el nombre de External
Guide Sequence (EGS) (fig. 5). El conjunto de la estructura reconocida por la
RNase P se corresponde con la del brazo aceptor de los tRNAs.
La reacción catalizada consiste en una transesterificación que origina
productos S'-P y 3' OH Y que tiene como consecuencia la escisión del frag­
o celu­ mento S' del tRNA inmaduro para generar de esta manera la molécula
~rentes. biológicamente activa.
léndose Dado que la RNase P está presente de forma natural en todos los tipos
Ars Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190, 1997
188 BERZAL-HERRANZ. A. Y BARROSO DEL JESÚS. A.

5'

...
t;lCCAJ 3' ."

EGS

5'

3'

Fig. 5.-Reconocimiento de substrato por la Rnase P. La

flecha indica el sitio de corte del RNA diana. EGS: External
Guide Sequence. Figura tomada de (22).

celulares, coexistiría con los posibles RNAs diana y no sería necesaria su

administración en caso de utilizarse como agente terapéutico. Sin embargo, •
para que la RNase P pueda reconocer el RNA a inactivar debe generarse en
este último una estructura análoga a la que presentan los RNAs transferentes
en su brazo aceptor. Es necesario pues, diseñar e introducir en las células a
tratar una molécula de RNA (EGS) de secuencia complementaria a la región
diana del RNA substrato y portadora del triplete CCA en su extremo 3', Tras
la interacción de ambas moléculas la estructura generada podría "confundir"
a la RNase P, de manera que ésta catalizara el corte de la molécula como si
de un pre-tRNA se tratara. Desafortunadamente, esta aproximación no elude
la problemática subyacente a la introducción y localización de un ácido
Ars Pharmaceutica, 38:2-3; 177-190, 1997
1lúS.A. RIBOZIMAS, ¿UNA NUEVA ESTRATEGIA TERAPÉUTICA? 189

nucleico exógeno en las células diana. Sin embargo, cuenta con una enorme
ventaja, dado que el interior celular es el contexto natural de la RNase P, será
en este ambiente donde desarrolle su máxima actividad catalítica. Existen ya
algunos trabajos en los que se ha utilizado con éxito la RNase P para la
inactivación in vitro de RNAs modelo (20).
Como se ha podido comprobar existe una amplia variedad de RNAs
catalíticos y aproximaciones sobre los que poder trabajar e investigar con el
fin de lograr el desarrollo de protocolos terapéuticos eficaces. Sin embargo,
todavía son muchos los obstáculos a salvar por lo que el camino se prevee
largo aunque esperanzador. Entre los principales problemas a solventar se
pueden destacar:

- Diseñar y optimizar estrategias de búsqueda y selección que permitan

~ determinar de una forma rápida y eficaz la mejor ribozima y la mejor diana
~ para la inactivación de un RNA dado.
~ - Desarrollar la metodología adecuada para la introducción de ácidos nucIeicos
~ exógenos en las células eucariotas. Dichas técnicas deberían proporcionar,
en el compartimento celular en el que se requiera, una concentración de
catalizador suficiente para conseguir el efecto deseado.
p - Conseguir preparaciones de ribozimas que mejoren la estabilidad de estas
¡

sustancias en el interior celular, ya sea mediante la utilización de nucIeótidos

químicamente modificados, la formación de complejos RNA-proteínas, etc ...
- Determinar las dosis terapéuticas eficaces, así como la posible toxicidad
f
b
que se pueda derivar de una elevada concentración intracelular de la ribozima.
Ampliar el espectro de substratos frente a los que las ribozimas muestren

~i
actividad catalítica. Este requisito impuesto por la variabilidad genética es
particularmente importante en el caso de los genomas virales de RNA.

~ Todos y cada uno de estos problemas están siendo abordados en la

actualidad, y los resultados obtenidos, aunque no definitivos son esperanzadores.
Por todo ello se piensa que en un futuro no muy lejano la tecnología de
. . SU las ribozimas podrá dar respuesta a algunas de las enfermedades para las
'-80, • cuales los fármacos y terapias actuales no se consideran suficientemente

_a
i.een
_tes

!legión
eficaces.

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