INFORME FINAL

EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DE GLUCOGENO HEPATICO

Y NITRÓGENO RETENIDO EN EL ORGANISMO DE LA RATA

I. INTRODUCCIÓN

La vida es sostenida por los alimentos, y las sustancias contenidas en ellas de las cuales depende la
vida son los nutrientes .Estos proporcionan energía y materiales de construcción para las
innumerables sustancias que son esenciales para el crecimiento y la supervivencia de los seres
vivos. La manera en que los nutrientes llegan a ser partes integrales del cuerpo y contribuyen a su
función depende de los procesos fisiológicos y bioquímicos que gobiernan sus acciones. Los
procesos de digestión, absorción, transporte, y excreción determinan el destino de los alimentos
después que ingresan a nuestro cuerpo. En efecto, una vez dentro del tubo digestivo, debido al
proceso de digestión, lo reduce a los mismos denominadores comunes y hace disponibles en tamaño
y forma (glucosa, aminoácidos, etc.) con el fin de hacerlos capaces de ser absorbidos y trasportados
a las células individuales.

Sin embargo, uno de los principales factores que modifican la concentración de glucosa sanguínea
es el ayuno, el cual se define como el cese total o parcial de la ingesta calórica. Durante esta etapa
se presentan eventos metabólicos regulados por hormonas, liberadas para el mantenimiento de la
homeostasis de la glucosa, evitando así daño a los diferentes tejidos, sobre todo a aquellos que de
forma normal la utilizan como único sustrato. El ayuno es uno de los principales factores que
modifican la concentración de glucosa sanguínea; la cual comienza a elevarse 10 min después de la
ingesta del primer bocado, como resultado de la absorción de los nutrientes de la dieta a nivel
intestinal (carbohidratos). La concentración de glicemia posprandial está regulada por varios
factores: el aporte y tipo de carbohidratos de la dieta, la duración de la ingesta y el tiempo que
tardan en absorberse, así como la secreción de insulina y glucagón y sus efectos coordinados en el
metabolismo de la glucosa en el hígado y tejidos periféricos.

En situación de inanición, el glucógeno es la primera reserva que se moviliza para mantener la

glucemia, al menos durante las primeras horas. El metabolismo del glucógeno está asociado al
nivel de la glucosa sanguínea, durante una buena alimentación se presenta su síntesis o
glucogenogénesis, en condiciones de ayuno ocurre su degradación o glucogenólisis. La extracción y
cuantificación del glucógeno hepático se realiza mediante un proceso de homogenización y ruptura
celular, así como la extracción y la eliminación de las proteínas para evitar interferencias en el
análisis posterior del polisacárido. El glucógeno se libera de los tejidos que lo contienen por
calentamiento con una base fuerte (KOH) hasta la destrucción total del tejido. La separación del
glucógeno del tejido se consigue mediante la adición de etanol (precipita polisacáridos y elimina los
monosacáridos solubles) y sulfato de sodio (coprecipitante). Así, se produce un precipitado que
contiene una mezcla de glucógeno, proteínas y ácidos nucleicos, que han resistido el calentamiento
anterior.
El tratamiento con antrona que contiene (H2SO4) es un método rápido para la determinación de
hexosas y alopentosas constituyentes de un polisacárido. Mediante este método, el glucógeno es
hidrolizado por un ácido (H2SO4) hasta sus unidades elementales (monosacáridos), que pueden ser
luego deshidratadas dando furfural, y éste último, reacciona con la antrona y se forma un producto
coloreado (azul-verdoso) con un máximo de absorbancia a 620 nm. El valor resultante se compara
con los obtenidos al preparar una recta estándar con glucosa pura, usando el mismo método.

Por otro lado, siguiendo con la idea central, el ayuno puede clasificarse según su duración en breve
y prolongado, aunque no exista una delimitación temporal clara. Si el ayuno es prolongado y el
suministro de glucosa vía glucogenolisis se ha agotado, la actividad gluconeogenica se incrementa
empezando a sintetizar continuamente glucosa a partir de sustancias distintas a los carbohidratos,
tales como aminoácidos, lactato y glicerol.

Por ello, si se desea conocer el porcentaje de proteína, se debe determinar el contenido de nitrógeno
total en la muestra a objeto del estudio, luego se precipita la fracción de proteínas y se cuantifica el
nitrógeno no proteico del sobrenadante. La diferencia con el contenido de nitrógeno total permite
establecer el contenido de nitrógeno proteico. Para calcular el contenido de proteína cruda en
función al contenido de nitrógeno total, se recurre al factor de conversión, definido en función del
tipo de alimento. El factor representa el contenido de nitrógeno por 100 g de proteínas en ese
sistema. El factor 6,25 es el más comúnmente usado. La proteína cruda es una de las
determinaciones que integra la “composición proximal” de los alimentos. Sin embargo, el contenido
de nitrógeno en el organismo está influenciado por la eliminación de los compuestos nitrogenados
no proteicos a través de la orina. Siendo la urea el principal producto de degradación de las
proteínas (80% - 90%) en tal sentido, la excreción urinaria del nitrógeno ureico se convierte en un
indicador valioso del estado de la vertiente catabólica del metabolismo celular y tisular. Se debe
hacer notar que el amonio (7.4%), la creatinina (6.4%), y el ácido úrico (2.0%) también contribuyen
al nitrógeno urinario.

Para cuantificar el nitrógeno total en los alimentos y en la materia orgánica en general se requiere la
conversión completa del nitrógeno en su forma nativa a nitrógeno gaseoso o a una sal inorgánica de
amonio (estado totalmente reducido del nitrógeno). La siguiente etapa del análisis es la
determinación precisa y exacta de alguna de las conversiones antes señaladas. Se han descrito y
desarrollado tres métodos, cada uno de ellos lleva el nombre de su creador: Dumas, Kjeldahl y Ter
Meulen.

El método más comúnmente utilizado para la determinación de nitrógeno orgánico es el llamado

método Kjeldahl, que se basa en una volumetría ácido-base. El procedimiento es directo, el material
necesario es muy simple (aparato de destilación Kjeldahl), y es fácilmente adaptable al análisis
rutinario de un gran número de muestras. Es el método estándar para la determinación del contenido
proteico en grano, harinas, carnes, y en general, en materiales biológicos.

Finalmente, uno de los biomodelos ampliamente usados en la experimentación es la rata de

laboratorio debido a que tiene características que favorecen su manipulación y reproducción: rápido
crecimiento y desarrollo, fácil manejo, gran número de crías, y reproducibilidad de algunas de las
enfermedades que aquejan a los humanos.
II. OBJETIVO

2.1 Objetivo general

 Evaluar efecto del ayuno sobre el contenido de glucógeno hepático y nitrógeno retenido en
el organismo de la rata

2.2 Objetivos específicos

 Determinar la cantidad de glucógeno almacenado en el hígado en diferentes condiciones

metabólicas.
 Determinar la cantidad de nitrógeno retenido en la carcasa de ratas Holtzman en diferentes
condiciones metabólicas.
 Determinar el nivel de nitrógeno excretado en la orina de ratas Holtzman sometidas a
diferentes condiciones metabólicas.

III. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

3.1 GLUCÓGENO HEPÁTICO

3.1.1 GLUCÓGENO
Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como materiales
de reserva. En los vegetales superiores se acumulan principalmente como almidón, en los
animales se presentan en forma de glucógeno. El glucógeno es una biomolécula que está
conformada por unidades de glucosa unidas por enlaces glucosídicos α(1-4) con
ramificaciones mediante enlaces α(1-6).
 El glucógeno es la reserva principal de carbohidratos en los organismos animales. El
depósito principal de glucógeno son el hígado (de 2 a 10%) y los músculos (de 0.5 a 2%),
en los cuales esta acumulado hasta en un 60% de su contenido en el organismo. En
situación de inanición, el glucógeno es la primera reserva que se moviliza para mantener la
glucemia, al menos durante las primeras horas. El metabolismo del glucógeno está
asociado al nivel de la glucosa sanguínea, durante una buena alimentación se presenta su
síntesis o glucogenogénesis, en condiciones de ayuno ocurre su degradación o
glucogenólisis

El glucógeno del músculo esquelético tiene como finalidad suministrar glucosa para que sea
degradada oxidativamente y se pueda obtener ATP para la actividad muscular. En
contraste, el glucógeno hepático sirve como fuente de glucosa para los tejidos
extrahepáticos, incluido el músculo esquelético, ante un descenso de la glucemia.

3.1.2 GENERALIDADES SOBRE EL METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS

Todos los procesos que llevan a cabo los organismos biológicos requieren energía, esta
energía se utiliza para producir y transformar los diversos compuestos bioquímicos que
resultan importantes para la vida de las células. El ser humano extrae la energía de su medio
ambiente a partir de los nutrientes que consume en los alimentos (carbohidratos, lípidos y
proteínas principalmente). Tanto la captura, transformación y uso de energía por los
organismos vivos involucran miles de reacciones químicas conocidas como metabolismo,
estos procesos enzimáticos están encaminados a la síntesis (anabolismo) o degradación
(catabolismo) de biomoléculas. Todo este conjunto de reacciones químicas que ocurren en
las células pueden ser agrupadas en un número sorprendentemente pequeño de rutas o vías
metabólicas, de esta manera la célula ha diseñado para la glucosa un proceso metabólico
específico, el metabolismo de carbohidratos.

Los carbohidratos son compuestos formados por átomos de carbono, hidrogeno y oxígeno,
que proporcionan aproximadamente un 60% del requerimiento diario de energía del cuerpo
y representan uno de los principales componentes de la dieta diaria recomendada
(Despopoulos 2003). Durante la ingesta, en el proceso de la digestión, los carbohidratos son
llevados hasta el estado de monosacáridos (azúcares simples) de los cuales la glucosa
predomina netamente. Estos son absorbidos por la mucosa intestinal y transportados hacia
el hígado por la vena porta. En el hígado la galactosa y la fructuosa son transformadas en
metabolitos, de tal manera que los tres monosacáridos tienen un destino metabólico común,
la glucosa.

El conjunto de procesos fisiológicos por el cual el cuerpo mantiene en equilibrio la

concentración de la glucosa, es conocido como: homeostasis de la glucosa. Este proceso de
regulación se lleva a cabo principalmente debido al control hormonal, siendo las hormonas
pancreáticas: insulina y glucagón, las principales responsables. Por simplicidad, la
homeostasis de la glucosa puede ser estudiada en tres estados distintos: el estado
postprandial, estado postabsortivo o de ayuno y de inanición (Beyon y Roach 2003).

El estado posprandial corresponde al periodo comprendido dentro de las 4 primeras horas

después del consumo de alimentos. La elevación de la glucemia por encima de los rangos
fisiológicos normales (hiperglucemia) tras el aporte de los alimentos, causa un aumento en
la secreción pancreática de insulina y la inhibición de la secreción de glucagón. La insulina
regula la homeostasis de la glucosa ejerciendo su función en el tejido del hígado, el
músculo y la grasa, principalmente. Es una hormona favorecedora del almacenamiento de la
energía, que actúa estimulando la captación de la glucosa a través de los transportadores de
glucosa (GLUT) e inhibiendo su producción por el hígado.

Especialmente cuando la comida ha sido muy rica en glúcidos en los tejidos como el
hígado, considerado el órgano central de los procesos metabólicos, y el tejido musculo-
esquelético, se capta la mayor parte de la glucosa y es almacenada como material de reserva
(glucógeno) para los periodos de inanición, el proceso por el cual se transforma la glucosa
en glucógeno es conocido como glucogénesis. La glucosa restante pasa a formar parte de la
circulación general, por lo que todos los tejidos reciben un aporte continuo de glucosa, la
cual es oxidada con la finalidad de obtener energía para realizar sus funciones este proceso
es conocido como glucólisis.

De esta manera debido a la síntesis de glucógeno y a la glucólisis, la concentración de

glucosa durante este periodo, varía entre un rango de 120 a 140 mg/dl en la primera hora
después de una comida (aunque puede variar debido al tipo de alimento y la cantidad), y
retorna a sus valores normales, aproximadamente a las 2 horas de la ingesta (Guyton 2006).

Se reconoce como un estado postabsortivo o de ayuno al periodo comprendido entre 4 a 12

horas después de una comida. Durante este periodo la sustentación del nivel estándar de
glucemia, con valores de concentración de entre 80 a 100 mg/dl (Guyton 2006), se debe
principalmente a la producción hepática de glucosa. Cuando la concentración de glucosa
seguida de la ingesta de alimento comienza a bajar, se desencadena una serie de
mecanismos pancreáticos opuestos que conllevan una inhibición significativa de la
secreción de insulina y un aumento en la secreción del glucagón. El glucagón cuya acción
es antagónica a la de la insulina, actúa movilizando las reservas endógenas de glucosa. Una
de sus principales acciones es estimular la degradación de glucógeno hepático para dar
glucosa a la circulación general, proceso conocido como glucogenólisis. Estos depósitos
solo puede satisfacer las necesidades de glucosa de 12 a 24 horas en ausencia de ingesta
dietética de carbohidratos.
Cuando la producción de glucosa hepática se ve rebasada por los requerimientos de glucosa
por los tejidos, se presenta una disminución de la glucemia por debajo del rango fisiológico
normal (<70 mg/dl), estado conocido como hipoglucemia. Generalmente durante el ayuno
nocturno, la hipoglucemia se resuelve por medio de las llamadas hormonas
contrarreguladoras, como son la adrenalina, glucagón, cortisol y la hormona de crecimiento
(Racotta – Roulieff 2002).
En estado basal, la toma de glucosa por el cerebro es independiente de la concentración de
insulina y representa cerca de la mitad de la producción de glucosa de ayuno. Del restante,
aproximadamente el 7% es utilizado por el estómago, el 20% por el tejido muscular, 7%
por el corazón y del 2 al 3% por tejido adiposo (Racotta – Roulieff 2002). En condiciones
postabsortivas, los riñones y las células sanguíneas no muestran una captación neta de
glucosa.

La constancia del suministro de glucosa en los tejidos durante estos periodos resulta vital,
especialmente para el sistema nervioso central, ya que su funcionamiento depende casi
exclusivamente de la glucosa sanguínea como fuente de energía. El glucógeno almacenado
en el músculo sólo puede ser utilizado como fuente de energía para él mismo, dando
piruvato y lactato como productos finales.

Después de las primeras 12 horas de una comida se entra en el estado de inanición. Durante
este ayuno prolongado se agotan las reservas hepáticas de glucógeno y se forma glucosa a
partir de precursores como piruvato, lactato (producido por glucólisis anaeróbica en los
músculos y las células rojas), glicerol (derivados de los triglicéridos a través del proceso de
lipólisis) y cetoácidos (derivados de los aminoácidos glucogénicos). La vía de síntesis de
glucosa a partir de estos compuestos se denomina gluconeogénesis y tiene lugar únicamente
en el hígado, este proceso es promovido por el glucagón.

A las 24 horas de ayuno, el contenido de glucógeno hepático llega a sólo cerca de un 14%
del inicial, porque la producción hepática de glucosa queda a cargo principalmente de la
gluconeogénesis, representando cerca de un 93% de la producción total de glucosa, de la
cual, la mayor cantidad es sólo para sustentar los requerimientos del cerebro (Racotta –
Roulieff 2002).

Figura 1. Resumen general del metabolismo de los carbohidratos

 3.2 NITROGENO RETENIDO

3.2.1 PROTEINAS

Las proteínas son los principales constituyentes del cuerpo animal y esencial para la recuperación
celular y procesos de síntesis. La deficiencia proteica en la dieta conlleva aun agotamiento de las
reservas en la sangre, hígado y musculo, predisponiendo al animal a una variedad de cuadros
muchos de ellos fatales (Fernandes, 1991).

3.2.2 NITROGENO

Es el componente principal de la proteína total, al determinar el porcentaje de nitrógeno de un

forraje - alimento y multiplicado por el factor 6.25 (100/16 = 6.25, indica que cada 100 g de
proteína contiene 16 % de nitrógeno, estos valores varían en diferentes forrajes o alimentos; de esta
manera se obtiene el valor de la proteína total (Maynard et al., 1992).

3.2.3 COMPUESTOS NITROGENADOS NO PROTEICOS

Los compuestos nitrogenados no proteicos se encuentran dentro de las sustancias de desecho que se
excretan por los riñones, estos se forman en el organismo como resultado del catabolismo de los
ácidos nucleicos, aminoácidos y proteínas; en el plasma existen más de 15 diferentes compuestos
nitrogenados no proteicos dentro de estos los de mayor estudio son: la Creatinina, Nitrógeno
Ureico, Ácido Úrico, Creatina y Amoníaco. El contenido de estos compuestos nitrogenados no
proteicos en la sangre completa es aproximadamente un 75% superior al del plasma sanguíneo,
principalmente debido al alto contenido de Glutatión en los eritrocitos. El compuesto que contiene
mayor cantidad de nitrógeno no proteico en el plasma es el nitrógeno ureico al cual también se le
conoce como urea. De tal manera que es considerado el principal compuesto nitrogenado no
proteico del plasma, en donde representa aproximadamente un 45% del total de nitrógeno en el
organismo humano; otros constituyentes en orden decreciente de contribución de nitrógeno son el
ácido úrico y la creatinina. Estos compuestos de desecho por su alto grado de toxicidad se
consideran los de mayor importancia clínica; de ahí el interés de su determinación para el
diagnóstico de diferentes enfermedades tanto renales como hepáticas. Los métodos utilizados en el
área de química sanguínea para la determinación de estos compuestos son: los métodos
colorimétricos, cinéticos y enzimáticos. Los métodos colorimétricos forman parte del análisis
químico fotométrico, que se basan en la medición de la cantidad de luz absorbida por una solución
coloreada o en la cantidad de luz difundida por una suspensión química; otro método utilizado para
estas determinaciones es el método cinético que consiste en mezclas de especies similares de
sustancias que reaccionan con un mismo reactivo, estos aprovechan las diferencias mínimas entre
los productos de reacción para la resolución de las muestras sin que haya separación física delas
mismas.

A diferencia de los métodos colorimétricos y cinéticos; los métodos enzimáticos son métodos de
ensayo químico que se utilizan para medir la actividad de las enzimas, estos métodos actualmente
han venido a reemplazar a otros métodos de determinación química como los antes mencionados,
esto se debe a la sensibilidad y especificidad de las enzimas utilizadas para las diferentes
determinaciones.

3.2.4 NITROGENO ENDOGENO URINARIO

Existe un catabolismo nitrogenado esencial mínimo debido al mantenimiento de los procesos vitales
del organismo, como es el caso de la energía. Este catabolismo se mide como la excreción urinaria
mínima bajo la dieta libre de nitrógeno y con una energía adecuada, llamándose nitrógeno endógeno
urinario (NEU). Una vez instaurado un régimen libre de nitrógeno, el nitrógeno urinario disminuye
gradualmente. Cuando se ha llegado a post-absorción respecto a la proteína existen aún “depósitos
proteicos” que se deben eliminar, al menos en parte, antes de alcanzar el valor endógeno mínimo.
Por lo tanto, mientras mayor haya sido el nivel nutricional previo, más grande será la reserva
proteica, y más prolongado el tiempo para alcanzar el nivel mínimo. En la rata este estado puede
alcanzar en una semana si inicialmente se había alimentado con una dieta previa era elevada en
proteínas. El NEU mínimo es el menor desperdicio nitrogenado que produce el organismo
(Maynard et al., 1992).

Para poder llegar al verdadero del NEU, es necesario que el animal reciba una dieta adecuada en
energía, pues de otra manera el NEU excretado puede incluir alguna proteína corporal que fue
degradada para promover energía, y sería mayor del valor representativo del catabolismo
nitrogenado esencial mínimo. Aun cuando en teoría la medición del metabolismo del NEU mínimo
parece sencillo, en la práctica es difícil obtener valores dignos de confianza, en particular con
ciertas especies. Con frecuencia no solo es variable sino que también insume mucho tiempo llegar a
lo que puede ser considerado como un valor mínimo constante, y, a menudo es imposible conseguir
que los animales consuman lo suficiente de una dieta libre de nitrógeno durante periodos
prolongados. Cualquier variación apreciable en la ingesta de una dieta de este tipo anula la validez
de los resultados. Brody et al. (1934) confirmaron que el nitrógeno endógeno urinario en animales
adultos está relacionado con el peso corporal metabólico por la misma potencia que el metabolismo
basal, tal como se indica en la formula siguiente:

NEU mg/d = 146 Wkg0.75

3.2.5 DIGESTIÓN ABSORCIÓN Y METABOLISMO DE LAS PROTEÍNAS

Las proteínas necesitan ser reducidas a dipéptidos o tripéptidos y aminoácidos para ser absorbidas
por las células de la mucosa intestinal. Este proceso se lleva a cabo fundamentalmente en el
intestino (duodeno y yeyuno), ya que la parte correspondiente a la acción de las enzimas
proteolíticas en el estómago (pepsina) es escasa. Una vez en la luz intestinal, la acción de las
enzimas pancreáticas (tripsina, quimiotripsina y elastasa) sobre los polipéptidos los degrada a
oligopéptidos, que aún han de ser reducidos por las enzimas del borde luminal del enterocito
(aminopeptidasas, dipeptidasas y tripeptidasas, dipeptidil aminopeptidasas) a aminoácidos y
dipéptidos o tripéptidos. Una vez en el interior de la célula, las peptidasas citoplasmáticas
completan el proceso digestivo y los aminoácidos obtenidos pueden seguir varios caminos:
participar en el anabolismo del propio enterocito (hasta en un 10 % de los aminoácidos absorbidos
se utilizan por el enterocito y por este motivo durante la nutrición parenteral se produce atrofia del
epitelio intestinal), ser metabolizados o bien ser vertidos intactos al torrente circulatorio. El
transporte al exterior celular se realiza mediante distintos sistemas, activos y pasivo, específicos
para los distintos tipos de aminoácidos. El metabolismo de los aminoácidos, además de realizarse en
el propio enterocito, también lo hace a nivel hepático y muscular. En el hígado los aminoácidos se
liberan indemnes, o transformados en derivados nitrogenados o péptidos, a la circulación sanguínea.
En caso de una ingesta excesiva de proteínas, los aminoácidos se emplean para obtener energía
directa o glucosa (mediado por sistemas hormonales catabólicos) y originan amoníaco, que al ser
tóxico para el organismo, ha de ser transformado en urea, que se aclara a través del riñón (fig. 4).
En la musculatura, el metabolismo se regula por la acción de las hormonas, cuyo efecto puede ser
anabólico (como la insulina) y determina la utilización de los aminoácidos en la síntesis proteica, o
catabólico (glucocorticoides), lo que favorece la síntesis de glucosa a partir de éstos, siendo la
alanina el principal aminoácido neoglucogénico. Globalmente es característico que se mantenga un
equilibrio constante en el metabolismo proteico del organismo entre la síntesis y destrucción de
proteínas. Este recambio proteico diario se estima en un 2 % y se le denomina proteína corporal
lábil. La mayor parte de ella se recicla, pero hay una pérdida porcentual, en torno al 15-20 %, que
ha de ser repuesta con el aporte dietético, en el cual se basan las recomendaciones nutricionales para
el requerimiento proteico diario de un adulto sano.

Figura 2. Metabolismo hepático y muscular de las proteinas

3.2.6 DETERMINACIÓN DE NITROGENO

En 1883, el investigador Danés, Johan Kjeldahl desarrolló el proceso básico del conocido método
actual de análisis de proteína por el método kjeldahl, más propiamente, para analizar nitrógeno
orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos
en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total es
convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila
posteriormente en una solución de ácido bórico. Los aniones del borato así formados se titulan con
HCL estandarizado, lo cual se convierte en el nitrógeno de la muestra.

El resultado del análisis representa el contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno
también proviene de componentes no proteicos. Este método ha sufrido varias modificaciones. Así,
kjeldahl usó originalmente permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación, sin
embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó., en 1885
Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión con el ácido sulfúrico añadiendo algunos
catalizadores. Gunning en 1889 sugirió la adición de sulfato de potasio para elevar el punto de
ebullición de la mezcla de la digestión para acortar la reacción. Por lo tanto, el procedimiento de
esta técnica es más correctamente conocida como el método Kjeldahl, Wlforth, Gunning (A.O.A.C.
1996).
 Gasto mL H2SO4 * Normalidad H2SO4 * mEq N
% N = ---------------------------------------------------------------------------* 100
Muestra, g
%Proteína total = %N * 6.25

3.3 INVESTIGACIONES REALIZADAS EN RATAS

Según León et al. (2011) los valores referenciales de parámetros bioquímicos en suero de ratas
SpragueDawley de 5 a 8 semanas de edad fueron: Glucosa 60 – 160 mg/dl, colesterol total 49.7 – 91
mg/dl y triglicéridos 24.5 – 91.3 mg/dl.

En una investigación realizado en la Universidad de Colima, determinaron las concentraciones de

glucógeno hepático, reportando como valores normales en ratas de 3.6 +/- 0.33 g /100 (Álvarez
2014). En otro estudio en donde se determinaron glucógeno en hígado de ratas sometidas a dos
tipos de tratamientos: Dieta Normal y Ayunas tratadas con glucagón, obteniendo los siguientes
resultados: 45.5 ± 8 y 0.3 ± 0.2 mg/g de hígado en la dieta normal y en ayunas respectivamente
(Asins 1989). Sin embargo, los resultados de una investigación en ratas tratadas con una dieta
normal y la otra en ayunas fueron: 0.003 y -0.004 de absorbancia respectivamente a 535nm,
concluyendo que el ayuno promueve la disminución de los niveles de glucógeno, así como también
disminuye las concentraciones de otros metabolitos que son usados como combustibles
(Trigliceridos y aminoacidos), por consiguiente, el hígado de rata que estaba en un ayuno
prolongado formo menos precipitado, ya que poseía menos concentración celular de glucógeno, ya
que estos eran usados para obtener glucosa y así brindar energía a las células durante este estado
(Salazar 2018).

Por otro lado, los resultados de la glucemia demostraron que algunos de los grupos manejados con
dieta alta en grasa presentaron hiperglucemia y que en el último día de administración de los
péptidos miméticos de leptina, los valores de la glucosa sanguínea disminuyeron en la totalidad de
los grupos de tratamiento excluidos los que recibieron el péptido en las cuatro dosis; en estos grupos
se aumentaron las concentraciones de glucosa. La hiperglucemia observada en algunos grupos es
concordante con otros estudios que indican que una dieta alta en grasa puede causar alteración de la
función pancreática para la secreción de insulina y no hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa,
disminución en el consumo de glucosa en el músculo y tejido adiposo e incremento en otras células
no dependientes de la insulina (Huang 2004).
CAPITULO IV:

MATERIALES Y MÉTODOS

Los animales fueron distribuidos aleatoriamente en los tratamientos, siendo como quedaron:

N1 A1 H1

N2 A2 H2
 DETERMINACION DE NITRÓGENO EN ORINA

(método semi Microkjeldahl)

MATERIALES

 Vaso para muestra de orina

 01 buretra
 02 balón de digestión
 02 erlenmeyer 150 ml
 02 beacker 100 ml
 02 embudos
 02 fiolas 50 ml

EQUIPOS

 Balanza analítica
 Estufa
 Digestor
 Destilador

REACTIVOS
  Agua destilada caliente
 Sulfato de aluminio y potasio
 2.5 a 5 ml H2SO4
 Catalizador (sulfato de potasio 15 gr + sulfato de cobre 1 gr)
 5 ml NaOH al 50%
 10 ml H3BO3 con indicadores
 HCL de N conocida

PROCEDIMIENTO

a) Tomar la densidad de la orina a evaluar

b) Tomar 3 ml de orina aproximadamente y colocarlo en balón de digestión
c) Luego adicionar 2.5 – 3.5 ml de H2SO4 concentrado, según su contenido de materia seca
tal como se detalla: 2 ml para MS no mayor a 0.1g y añadir 0.1 ml de H2SO4 por cada 0.01g
de MS que exceda al 0.1g.
d) Llevar a dirigir en forma gradual para evitar la formación de espuma y hasta obtener un
producto cristalino. El tiempo total de la digestión es de aprox. media a una hora.
e) El producto digerido debe enfriar y diluido con agua destilada (usar fiola de 50 ml), enrasar
en frio y tomar una alícuota (10 ml) que se llevara a destilación
f) Destilar la muestra digerida adicionando 5 ml de NaOH y recepcionando la muestra en
erlenmeyer conteniendo 10 ml de ácido bórico con indicadores hasta tener un volumen no
menor a 20 ml. Cuidar de que el agua del destilador no llegue a estar muy caliente que
invalida el ensayo.
g) Titular con HCL de N conocido y determinar el % de N y de proteína total

SOLUCION DE ACIDO BORICO CON INDICADOR DE Ph:

Ácido bórico al 4% :

a) Pesar 40 gr de Ácido Bórico y colocarlo en una fiola de 1 lt, y diluir con 800 ml de agua
destilada.
b) Agregar 20 ml de verde de bromocresol al 1%.
c) Añadir 8 ml de rojo de metilo al 0.1%.
d) Enrasar la fiola con agua destilada a volumen de 1 litro.

 CALCULOS

La cantidad de nitrógeno de las muestras se obtiene por la siguiente formula:

% de nitrógeno = ml de HCL X Normalidad X meq del N2 X 100

Gramos de muestra
 EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DEL GLUCOGENO HEPATICO

(Método antrona y estándar)

MATERIALES Y REACTIVOS

Animales de experimentación: 2 ratas de similares características (1 y 2).

Condiciones experimentales:

 Tratamiento “N”: en condiciones normales de alimento

 Tratamiento “A”: condiciones de ayuno por 48 horas
 Tratamiento “H”: alimento altamente energético

General:

 Centrifuga
 Balanza analítica
 6 vasos de precipitado de 50 ml
 Espectrofotómetro
 6 pipetas 1 ml
 2 pipetas 10 ml
  2 pipetas 5 ml
 1 fiola 25 ml

Para las muestras de hígado:

 6 tubos de centrifuga, de 15 ml de capacidad

 6 bolillas de vidrio
 6 fiolas de 100 ml
 10 ml de KOH 30%
 30 ml de etanol 95% V/V
 Solución de antrona al 0.2% en ácido sulfúrico q.p
 Solución estándar de glucosa 5 mg

PROCEDIMIENTO

a. Aislamiento
b. Hidrolisis alcalina
c. Cuantificación

PARTE A: AISLAMIENTO DEL GLUCOGENO

1. Sacrificar las ratas con golpe en la cabeza, extraer rápidamente los hígados, pesarlos y
colocarlos en vasos de precipitado en baño de hielo.

PARTE B: HIDROLISIS

1. Tomar 0.5 g de hígado y trasladarlas a tubo de centrifuga graduados de 15 ml conteniendo

1 ml de KOH al 30 % y homogenizar.
2. Observar el aspecto del hígado
3. Colocar el tubo tapado con una bolilla de vidrio en baño María por 30 minutos, agitando el
contenido cada cinco minutos. Se puede colocar embudo y sobre el la bolilla de vidrio.
4. Enfriar con agua de caño y añadir 3 ml de agua destilada y 5 ml de etanol al 95%, se agita
fuertemente y se verá el precipitado de glucosa.
5. Centrifugar por 5 minutos a 2500 r.p.m y decantar el sobrenadante.
6. Disolver el residuo (glucosa), lavando con agua destilada y trasvasar a fiola de 100 ml.
Enrasar
7. Rotular la muestra y se puede dejar en refrigeración hasta la siguiente sesión de prácticas.

PARTE C: DETERMINAR EL GLUCOGENO COMO GLUCOSA

1. Tomar 1 ml de la muestra de un tubo de ensayo sumergido en agua helada y agregar gota

a gota 6 ml de reactivo de antrona.
2. Poner en baño María hirviente por 15 minutos y enfriar con agua helada.
 3. Leer la absorbancia en espectrofotómetro a 620 nm. Si la lectura fuera mayor a 0.8, diluir
la muestra obtenida del paso 7 y repetir la reacción de antrona.
4. Preparar los siguientes tubos.
5. Tomar resultados de transmitancia y absorvancia.

TUBO blanco estándar H1 H2 H3 H4 H5 H6

ml de glucosa estándar
a 5 mg/ml 0 1 0 0 0 0 0 0
ml agua destilada 1 0 0 0 0 0 0 0
ml de muestra problema 0 0 1 1 1 1 1 1
ml de antrona 6 6 6 6 6 6 6 6
Colocar los tubos en baño maría con hielo por 5 minutos y añadir gota a gota 6 ml de antrona en agua
helada.
colocar los tubos en baño maría caliente por 15 minutos y luego enfriar

6. De cada muestra se tomó 2 ml y se agregó 2 ml de agua destilada, para su posterior

lectura a 640 nm.
7. Calcular el contenido de glucosa en hígado; como % en el contenido del hígado y gramos
total
8. Transformar la glucosa a glucógeno; multiplicando por el factor 0.9

(Glucosa) mg/% = Cst X 100 X A mg

Ast peso

CAPÍTULO V

RESULTADOS

Tabla 01: Datos de los parámetros productivos en ratas sometidas a tres tratamientos con
diferentes tipos de dietas.

TRATAMIENTO NORMAL AYUNO HIPERCALÓRICA

Animal 1 2 1 2 1 2
Ganancia de peso (g)
Semana 1 26 27 19.5 30 27 23
Semana 2 27 30 0 -7 25 38
Total 53 57 19.5 23 52 61
Consumo de alimento (g)
Semana 1 77.88 75.47 83.8 97.8 91.6 87.4
Semana 2 97.2 103.6 70.5 63.6 89.5 104.2
Total 175.08 179.07 154.3 161.4 181.1 191.6
Consumo de agua (ml)
Semana 1 178 158 145 117 126 130
Semana 2 165 155 135 122 151 207
Total 343 313 280 239 277 337
Conversión Alimenticia
Semana 1 3.00 2.80 4.30 3.26 3.39 3.80
Semana 2 3.60 3.45 error error 3.58 2.74
Final 3.30 3.14 7.91 7.02 3.48 3.14

Tabla 02: Resumen de parámetros productivos obtenidos por cada tratamiento de diferente tipo
de dieta en ratas.

NORMAL AYUNO HIPERCALÓRICO

TRATAMIENTO
PARAMETRO
Ganancia de peso 55 21.25 56.5
Consumo de alimento 177.08 157.85 186.35
Consumo de agua 328 259.5 307
Conversión Alimenticia 3.22 7.43 3.30

Se observa que, en la ganancia de peso, hay una caída abrupta en el tratamiento de ayuno en la segunda
semana, esto es porque en el ayuno que se realizó 48 horas antes del sacrificio, los animales perdieron
gran cantidad de peso en vez de subir, debido a esto arroja un valor negativo. La mayor ganancia de peso
final se observó para el tratamiento con dieta hipercalórica, sin embargo no muestra mucha diferencia
con el tratamiento normal mientras que si con el tratamiento de ayuno, lo mismo ocurre para el consumo
de alimento.
Fig. 01: Ganancia de peso de los diferentes Fig. 02: Consumo de alimento de los diferentes
tratamientos por semana. tratamientos por semana.

En cuanto al consumo de agua se observa un mayor consumo para la dieta normal, seguida por la dieta
hipercalórica y la dieta ayuno con menor consumo. El índice de C.A. es mejor para la dieta normal, aunque
no difiere mucho con la dieta hipercalórica, mientras que si para la dieta ayuno debido al peso que perdió.

Fig. 03: Consumo de agua de los diferentes Fig. 04: índice de conversión alimenticia de los
tratamientos por semana. diferentes tratamientos por semana.
Tabla 03: Parámetros biológicos en ratas sometidas a tres tratamientos con diferentes tipos de
dietas.

TRATAMIENTO Normal Ayuno Hipercalórica

PARAMETRO 1 2 1 2 1 2
ORINA
Volumen (ml) 18.3 14.6 4.9 6.9 6.6 16.4
Densidad (g/ml) 1.032 1.040 1.059 1.044 1.093 1.030
% Nitrogeno 1.23 1.42 2.05 1.85 1.13 0.70
Nitrogeno total/24 h (g) 0.23 0.22 0.11 0.13 0.08 0.12
SANGRE
Glucosa (mg/dL) 103 97 72 57 85 87
Colesterol (mg/dL) < 100 < 100 < 100
HDL (mg/dL) 57 20 15
Trigliceridos (mg/dL) < 45 < 45 < 45
HÍGADO
Peso (g) 7 6 4 3 7 8
[glucosa] (mg/%) 205.8 536.9 432.8 197.8 125.8 955.6
CARCASA
Peso vivo al sacrificio (g) 163 167 125 122 170 173
Peso carcasa (g) 120 127 100 96 128 132
Peso visceras 43 40 25 26 42 41
% Rendimiento 73.6 76.0 80.0 78.7 75.3 76.3
% Proteina total 61.56 58.97 69.5 70.86 64.23 57.26

Tabla 04: Resumen de parámetros biológicos obtenidos por cada tratamiento de diferente tipo de
dieta en ratas.

TRATAMIENTO NORMAL AYUNO HIPERCALÓRICA

ORINA
% Nitrogeno 1.33 1.95 0.91
Nitrogeno total/24 h (g) 0.22 0.12 0.10
SANGRE
Glucosa (mg/dL) 100.00 64.50 86.00
Colesterol (mg/dL) < 100 < 100 < 100
HDL (mg/dL) 57 20 15
Triglicéridos (mg/dL) < 45 < 45 < 45
HÍGADO
Peso (g) 6.5 3.5 7.5
[glucosa] (mg/%) 371.3 315.3 540.7
CARCASA
Peso carcasa (g) 123.5 98.0 130.0
% Rendimiento 74.8 79.3 75.8
% Proteína total 60.3 70.2 60.7

CAPÍTULO VI

DISCUSIONES
Un estudio realizado por el Instituto de Ciencia Metabólica en Cambrigde sugiere que las dietas
cargadas de alimentos muy calóricos, aumentan el riesgo de desarrollar diabetes, siendo el riesgo
de desarrollarla un 60% mayor en los que reportaban una ingesta de calorías más grande. Los
alimentos con mucha carga calórica suelen estar relacionados con el aumento de peso y el
incremento de los niveles de azúcar en la sangre. Estas afirmaciones se expresan parcialmente en
nuestros resultados, ya que la dieta hipercalórico tuvo la mayor ganancia de peso con 56.5 gramos
comparado con la dieta ayuno que obtuvo una ganancia de peso de 21.25 gramos.

60.0 GANANCIA DE PESO

50.0
peso ganado (g)

40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
-10.0
SEMANA 1 SEMANA 2 TOTAL
Normal 26.5 28.5 55.0
Ayuno 24.8 -3.5 21.3
Hipercalórica 25.0 31.5 56.5

Grafica 01: Ganancia de peso obtenido en los diferentes tratamientos por semana.

Sin embargo, los niveles de glucosa en sangre fueron mayor en la dieta normal, cuando
teóricamente la dieta Hipercalórica debería haber tenido los mayores niveles de glucosa en sangre
debido a que las dietas hipercalóricas causan resistencia a la insulina y por consiguiente la glucosa
sanguínea debería ser mayor; el glucógeno hepático si fue mayor en la dieta hipercalórica con
540.7 mg, mientras que en la dieta de ayuno apenas y llego a los 315.3 mg, esto se debe a que el
hígado es el órgano donde se almacena el glucógeno y en déficit de energía se realiza
glucogenólisis produciendo de esta manera glucosa a partir de glucógeno. Mientras los niveles de
glucógeno hepático y glucosa sanguínea en las dietas de ayuno son menores en relación a las otras
dietas, esto se debe a que el organismo al estar en condiciones de ayuno requiere de energía y
debe degradar glucosa para formar ATP, la glucosa sanguínea se agota primero en condiciones de
ayuno y gradualmente la glucosa hepática al agotar las reservas de glucógeno, es justamente por
eso que el glucógeno hepático en la dieta ayuno es menor ya que está en constante degradación, y
el glucógeno en la dieta hipercalórica es más elevado.
 Glucosa en sangre (mg/dL)

Normal,
100 Hipercaló
rica, 86
Ayuno,
64.5

NORMAL AYUNO HIPERCALÓRICA

Glucosa

Grafica 02: Glucosa en sangre promedio obtenido

en los diferentes tratamientos.

Por otro lado, cuando se habla de nitrógeno es un indicador del metabolismo proteico, y se puede
reconocer los estados de hipercatabolia, las principales causas de encontrar nitrógeno proteico
elevado en la orina es cuando la dieta es rica en proteína, y debido a que el exceso de proteína no
puede ser almacenado y se excreta; otra causa es en estado de ayuno o inanición, ya que el
individuo no tienes fuentes para generar energía, el organismo empieza a catabolizar las
proteínas, destinando su esqueleto carbonado para la producción de energía y el grupo amino
para su excreción y/o formación endógena de proteínas. En estado de ayuno las proteínas se
catabolizan para producir energía. El grupo amino y el grupo carboxilo se separan, el grupo
carboxilo ingresa al ciclo de Krebs para proporcionar energía, mientras que el grupo amino debe
ser expulsado por transaminacion y luego por desaminacion, por lo que la presencia de cuerpos
nitrogenados debe ser mayor en la orina. Esta condición si se cumplió en el ensayo, ya que el
nitrógeno en orina fue mayor en la dieta ayuno con 1.95% con respecto a la dieta normal e
hipercalorica con 1.33% y 0.91% respectivamente, lo que evidencia que hubo degradación
proteica en el metabolismo de los animales con la dieta ayuno para mantener sus niveles
energéticos.
CAPÍTULO VII

CONCLUSIONES

 Las ratas con la dieta hipercalórica tuvieron una mayor ganancia de peso al final de la prueba
con 56.5 gramos en promedio, siendo la dieta normal la segunda mejor con 55 gramos y la
dieta ayuno tuvo la menor ganancia de peso con 21.25 gramos.

 Las ratas con la dieta hipercalórica tuvieron un mayor consumo con 186.35 gramos durante las
dos semanas de prueba, siendo la dieta normal la segunda con mayor consumo con 177.08
gramos de alimento ingerido, y la dieta de ayuno lógicamente obtuvo el menor consumo con
157.85 gramos.

 Los niveles más alto de glucosa en sangre se obtuvieron de la dieta normal con 100 mg/dL, la
hipercalórica con 86 mg/dL y la dieta ayuno obtuvo los niveles más bajos de glucosa en sangre
con 64.5 mg/dL, estando estos valores muy debajo del mínimo recomendado, lo que puede ser
un indicador de principios de glicemia. Por otro lado, la glucosa hepática fue mayor en la dieta
hipercalórica y menor en la dieta de ayuno, demostrando la capacidad de almacenamiento de
reservas con este tipo de dietas hipercalóricas y la degradación inmediata del glucógeno en el
caso de ayuno.

 Por otro lado los niveles de porcentaje de proteína en carcasa no tienen relación alguno con lo
esperado en las pruebas, ya que se esperaba que en las dietas con ayuno se presenten
menores niveles de proteína en carcasa por el catabolismo proteico que sufre el cuerpo para
cubrir sus necesidades energéticas.

RECOMENDACIONES

 Realizar una prueba experimental con mayor número de repeticiones para asegurar que
haya diferencia estadística significativa y variabilidad.
 Alargar el periodo de experimentación por mayor tiempo para poder observar si existe un
mayor efecto y descartar posibles errores.
 Evaluar otros métodos posibles para realizar los análisis propuestos en el experimento.
CAPÍTULO VIII

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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Asins, G. 1989. Purificación de una actividad HMG-CoA reductasa fosfatasa tipo 1 de la fracción
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Elsevier.

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protein. J. Nutrition, 9: 403-433.

Despopoulos, A. 2003. Color Atlas of physiology. Quinta edición. Alemania. Thieme.

Fernandes, S. 1991. Avances y perspectivas de los camélidos sudamericanos. Organización de las

naciones unidad para la Agricultura y la alimentación, oficina regional de la FAO para América
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Guyton, C.G., Hall, J.E. 2006. Tratado de Fisiología Médica. Onceava Edición. Elsevier.

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Mancebo, A. 2011. Valores hematológicos y bioquímicos de las ratas Sprague Dawley producidas
en CENPALAB, Cenp: SPRD. Revista electrónica de Veterinaria. Volumen 12:11

Maynard, L. A.; J. K. Loosli; H.F. Hintz y R. G. Warner. 1992. Nutrición animal. Cuarta Edición.
McGraw-Hill. México.

Salazar, J. 2018. Efecto del ayuno sobre el contenido de glucógeno hepático. Facultad de Ciencias
de la Salud Escuela de Medicina Humana. Universidad Cientifica del Sur – Lima.
CAPÍTULO IX

ANEXOS