Sunteți pe pagina 1din 51

ANALIZA PROBELOR BIOLOGICE

ELECTROFOREZA
Curs 9-10
ELECTROFOREZA - Notiuni introductive
Electroforeza reprezintă o metodă de analiză și separare bazată pe migrarea particulelor solide încărcate electric (ioni,
macromolecule cu sarcină electrică, coloizi, unele celule, precum bacterii sau eritrocite) dispersate într-un lichid sub
acțiunea unui camp electric. Mediul în care se pot deplasa speciile încărcate electric pot fi:
1) mediu liber nelegat (pe o coloană de lichid);
2) mediu fixat (pe suport poros).

Astfel, daca se stabileste o diferenta de potential intre extremitatile unei solutii sau benzi de hartie (gel sau alte materiale),
impregnata cu un electrolit convenabil, pe care se depune o picatura de analit, constituientii ionici ai analitului se vor deplasa
sub actiunea campului electric cu viteza lor proprie. Aceasta viteza poate fi urmarita si masurata.

Prin electroforeza se pot determina marimea, forma si sarcina unei molecule, masa moleculara etc.
ELECTROFOREZA - Notiuni introductive

O specie chimica cu sarcina q , aflata intr-un camp electric de intensitatea E(volti/cm) va fi supus unei forte FE data de
relatia:

Deplasarea specie ionice se realizeaza intr-un fluid, acestei deplasari i se opune forta de frecare Stokes data de relatia :

în care η este vâscozitatea mediului lichid în care sarcina se deplasează, r este raza speciei ionice (considerata sferică),
iar ve este viteza de deplasare
Forţa de frecare creşte proporţional cu creşterea razei speciei ionice, viscozităţii mediului în care se deplaseaza şi viteza
de deplasare. La o deplasare cu viteza constanta cele doua forte sunt egale (FE=Ff). Viteza de deplasare va fi data de
relatia:

Daca se considera ca primul termen al relatiei de mai sus ca fiind mobilitatea electroforetica:

Atunci viteza de migrare a speciilor este data de relatia:

Viteza de migrare a ionilor depinde de mai multi factori si anume: sarcina electrica, marimea si forma particulelor, forta
ionica, vascozitatea si pH-ul electrolitului, tensiunea aplicata, temperatura, natura suportului solid (hartie
cromatografica, acetat de celuloza, gel, etc.).
ELECTROFOREZA - Notiuni introductive

Mobilitatea electroforetica a particulelor se defineste ca distanta parcursa in unitatea de timp (secunda) intr-un camp
electric de o forta electrica egala cu o unitate de potential si este determinata si de caracteristicile constructive ale celulei de
electroforeza si de caracteristicile componentelor analizate astfel:
𝑙 𝑙′
µe = d 𝑡 𝑉 ( 𝑙 )

unde : µe - mobilitatea electroforetica a ionului (cm2/Vs);

d - distanta parcursa de component pe hartie (cm);

l - lungimea benzii de hartie (cm);

t - durata electroforezei (s);

V - diferenta de potential (Volti);

l’/l - factor de corectie care caracterizeaza sinuozitatea fasciculelor capilare ale hartiei si depinde de tipul de hartie folosit
(pentru hartia cromatografica Schleicher-Schull 202, l’/l = 0,58 ± 0,06).
ELECTROFOREZA SISTEMELOR BIOLOGICE
• Multe molecule biologice sunt amfoliti care există ca anioni sau cationi in functie de pH:
• Soluţie cu pH < pI (punctul izoelectric - pH-ul la care amfolitul are suma sarcinilor electrice
zero), amfolitul are sarcina +ve,
• Soluţie cu pH > pI, amfolitul are sarcina –ve,
• In cazul in care se formeaza combinatii complexe, sensul migrarii este in functie de
incarcarea ionilor rezultati.
• Migrarea particulelor in campul electric se produce spre polul de semn opus incarcarii
particulelor:
- Cationii migreaza spre catod (-) - (cataforeza)
- Anionii migreaza spre anod (+) - (anaforeza).
- La punctul izoelectric, nu are loc migrarea electroforetica
Componenta echipamentului de electroforeza

Echipamentul de electroforeza consta in:


• Camera de electroforeza cu doua compartimente care contin
solutia sistemul electroforetic si in care se gasesc electrozii
• Electrozi de carbon sau platina
• Sursa de curent electric continuu cu tensiune variabila
• Capac care minimalizează evaporarea
Sistemul electroforetic consta din:
- o faza lichida (un electrolit in solutie, solutie tampon)
- o faza solida ce este in contact cu faza lichida (hartia
cromatografica, foi de acetat de celuloza, geluri de agaroza
1%, agar-agar 1,5%, amidon)
- in cazul in care corpul solid este poros, poate fi prezenta si
o a treia faza, o faza gazoasa ce este in echilibru cu cea lichida.
Rolul si caracteristicile elementelor componente ale celulei de electroforeza
Solutiile de electroliti - Soluţii Tampon
• Solutia de electrolit (sau sistemul tampon) trebuie sa fie in asa fel aleasa incat sa permita
separarea neta a compusilor probei de analizat, fara sa reactioneze cu acestia.
-Ca electroliti se utilizeaza solutii tampon (aminoacizi), solutii diluate de electroliti tari (KCI,
KNO3, etc.), solutii ale acizilor slabi (acid tartric, acid citric, acid acetic) sau a sarurilor lor cu
baze tari, etc
• Forta ionica a electrolitului μ - este o mărime care determină potenţialul câmpului electric
existent în soluţie, importanta in alegerea diferentei de potential care i se va aplica celulei


1
2

2 2 2 2 1 n

c1z1  c 2 z 2  c3z 3    c n z n   ci z i2
2 i 1

unde c1, c2, ..., cn sunt concentraţiile molare ale diverşilor ioni în soluţie şi z1, z2, ..., zn sarcinile lor

-Forta ionica trebuie sa fie bine corelata cu tensiunea aplicata precum si cu timpul de electroforeza.
-pentru solutii tampon cu o forta ionica μ = 0,05 - 0,1 trebuie sa se aplice o tensiune mica pe o
durata de timp mai lunga.
-pentru solutii tampon cu forta ionice (μ = 0,05 sau mai mica) se reduce durata de migrare si se
creste tensiunea.
Rolul si caracteristicile elementelor componente ale celulei de electroforeza

Surse de alimentare
• Sursă de alimentare: curent continuu intre 2 electrozi
• Fluxul de curent produce căldura care incalzeste proba si
determina:
- Creşterea vitezei de migraţie si extinderea tipurilor de probe
- Formarea de curenti de convectie care determina amestecarea
probelor
- Instabilitate termică a probelor sensibile la căldură
• Evaporarea apei determina concentrarea ionilor, creşterea
vascozitatii soluţiei tampon si scade rezistenţa electrica
• Pentru a minimiza problemele: se utilizeză surse de alimentare cu
putere constantă si mare
Rolul si caracteristicile elementelor componente ale celulei de electroforeza

Detecţia şi cuantificarea
• Rapida ca:
-% din fiecare fracţiune prezentă
- concentraţia absolută
• Prin densitometrie:
- benzile electroforetice se trec printr-un sistem optic de masurare
- absorbanţa fiecărei fracţiuni afisată pe o diagramă

Electroforegrama
 Detectoarele sunt plasate la catod/anod, in conditii comune, toate speciile
sunt conduse in aceasta directie de catre forta electromotoare.
 Detectoare de tip spectrometre cu absorbtie UV, de fluorescenta si MS etc.
 Detectoare sensibile sunt necesare pentru concentratii mici.
TIPURI DE ELECTROFOREZA

Electroforeză in gel de agaroză


Electroforeză in acetat de celuloză
Electroforeză in gel de poliacrilamidă
Concentrare izoelectrică
Electroforeză bidimensională
Electroforeza capilara
Electroforeza zonala (ZE)
ZE utilizeaza un mediu stabilizant (hartie) care este impregnat cu o solutie de electrolit, ce
prezinta o anumita conductibilitate specifica (un mediu - gel- fixat pe un suport poros). Ca
medii se pot utiliza agaroza, acetat de celuloza si poliacrilamidă.
Concentrarea (Focusing) izoelectrica (IEF)
- Concentrarea izoelectrica (IEF) permite moleculele de amfoteri, cum ar fi proteinele, care
urmeaza sa fie separate prin electroforeza in gradient de pH-ul generat intre catod si
anod. Aceasta tehnica este frecvent folosita la caracterizarea proteinelor pentru a
determina punctul izoelectric al acestora.
Izotacoforeza (ITP)
- Isotacoforeza este o tehnica de concentrare (focusing) componentii probei sunt separati
in zone distincte, cuprinse intre doua solutii de electroliti, prima continind un ion
conducator si cealalta un ion terminal. Ionul conducator are o mobilitate mai mare, iar cel
terminal mai mica. Substantele ce constituie amestecul sunt separate in functie de
mobilitatile lor efective. Izotacoforeza se aplica pentru analiza calitativa si cantitativa a
unor zaharuri, peptide.
Electroforeza în mediu stabilizant Focalizarea izoelectrica (IEF) Izotacoforeza (ITP)
(zonală) (ZE)
Electroforeză Zonală

Caracteristici
• Migraţia moleculelor incărcate
• Mediu de migrare depus pe un suport
-Medii poroase de gel de tip: agaroză, acetat de celuloza, poliacrilamidă
- Pot fi uscate şi reutilizate
• Acelaşi pH şi domeniu de rezistenţă electrica
• Separare bazată pe mobilitate electroforetică
• Separă coloizi macromoleculari de exemplu: proteine in ser, urină, LCR,
eritrocite, acizi nucleici
Electroforeza in gel de agaroza
-Cea mai comuna metoda de separare in laboratorul biomedical
-Separarea este bazata pe diferenta de mobilitate a moleculelor incarcate sub infuenta campului electric.
Se cunosc mai multe tipuri de electroforeza in gel de agaroza:
-tehnica standard,
-electroforeza in gel de SDS-agaroza (la care adaugarea SDS - sodium dodecil sulfat in compozitia suportului
electroforetic permite separarea fractiunilor pe baza masei moleculare)
•Avantaje:
-gradul mare de rezolutie, specificitate si sensibilitate
-rapiditatea, conferita de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca urmare a independentei totale a
celor doua module (de migrare si colorare)
-gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minima a factorului uman la metodele manual;
-diversificarea parametrilor investigati (proteine, lipoproteine, izoenzime, hemoglobine normale si patologice)
-aplicabilitatea in cazul mai multor lichide biologice (ser dar si urina, LCR si altele), precum si faptul ca pentru aceste
lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind astfel inlaturat un neajuns important.
Aplicatii ale electroforezei in gel de agaroză (EGA)

-Electroforeza în geluri de agaroza reprezinta metoda standard de analiza a


acizilor nucleici.
Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru electroforeza în geluri de agaroză
sunt:
- TAE (Tris- acetat 40 mM, EDTA 1 mM),
- TBE (Tris –borat 45 mM, 1 mM EDTA),
-TPE (Tris -fosfat 90 mM, EDTA 2 mM).
Tamponul de încărcare are în componenţă un colorant (albastru de bromfenol sau
roşu de crezol 0,25%) care permite vizualizarea frontului de migrare şi zaharoză (40%)
sau glicerină (30%) pentru a asigura o vâscozitate corespunzătoare la aplicarea probei.
Benzile sunt vizualizate cu compuşi fluorescenţi (bromura de etidiu sau
SYBR Green) prin iradiere cu lumină UV.

Mobilitatea electroforetica este influenţata de următorii factori:


-concentraţia de agaroză,
-conformaţia moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau superrăsucit),
-prezenţa compusului fluorescent în gel,
Gel din aragoză si
-tamponul utilizat, poliacrilamidă
-tipul de agaroza şi Proteine = 30-200 kDa
-voltajul aplicat ADN = >200 kDa
Electroforeză in acetat de celuloză (EAC)

Electroforeza in acetat de celuloză (EAC) se caracterizeaza prin


faptul ca:
• Utilizeaza anhidridă acetică + celuloză => AC
• Are 80% spaţiu interstitial => se umple cu lichid atunci cand este
scufundat in tampon
• Pot fi făcute transparente pentru densitometrie

Avantaje:
- Viteza de separare ridicata
- Posibilitatea de a stoca membrane transparente

Dezavantaje:
- Presare inainte de utilizare
- Curăţare pentru efectuarea densitometriei
Electroforeză in gel de poliacrilamidă (PAGE)
Separarea se realizeaza in functie de greutatea moleculara a proteinelor si dimensiunea componentelor
probelor

• Celula electroforetica in formă tubulară


Se toarnă gel de separare cu pori mici
Se adaugă gel cu pori mari in partea de sus
Soluţie de monomer cu pori mari + proba deasupra celui de-al doilea gel
• Principiul metodei de separarea prin electroforeza
Toţi ionii proteinelor migreaza prin gelurile cu pori mari
Se concentrează in gelul de separare
Se separă dupa denaturarea unor proteine
• Dimensiunea medie a porilor in 7,7% din gelul de separarea PAGE este de aproximativ 5 nm
Permite proteinelor serice să migreze
 Impiedică migrarea proteinelor mari de exemplu: fibrinogen, 1-lipoproteine, 2-macroglobuline
Electroforeza proteinelor
• Molecule mari, extrem de incarcate (proteinele) pot migra
intre electrozii incarcati (polarizati) diferit

Metode de separare a proteinelor


a) Denaturarea
• Se fierbe o proba timp de 5 minute in soluţia tampon ce conţin b-
mercaptoethanol & sodium dodecil sulfat (SDS)
• b-mercaptoethanol: reducere puntile disulfitice (S-S)
• SDS: se leaga puternic de proteinele şi le denaturează
• Proteine denaturate -> se rup structurile in formă de tijă =>”ghem” sunt
separate in funcţie de dimensiunea lor

• Utilizare:
Pentru a evalua puritatea proteinei
Pentru a determina MW proteinelor

b) Metode non-denaturare
• Separarea proteinelor se bazează pe:
- Mobilităţile electroforetice diferite
- Efectul de “cernere” moleculara a gelului
• Utilizare
- Pentru a obţine proteine native/enzime
- Pentru a studia activitatea biologica
Concentrarea izoelectrică (isoelectrofocusing)
Caracteristici:
• Se utilizeaza pentru a separa amfoteri (de exemplu: proteine)
• Proteinele se deplaseaza in zona in care: pH-ul mediu = pI => sarcina = 0
• pI este limitat intr-un domeniul de pH ingust =>zone ascuţite pentru proteine

Metoda de lucru :
- Folosirea gelurilor orizontale pe sticlă / folii de plastic
- Să introduc amfoliţii in gel => se crează gradientul de pH
- Se aplică o diferenţă de potenţial in gel
- Anod => zona cu pH-ului cel mai mic
- Catod => zona cu pH-ului cel mai mare
- Proteinele migrează pană cand se ajunge la pH = pI
Se spală cu soluţie de fixare pentru eliminarea amfoliţilor
- Colorare, decolorare, vizualizare
Electroforeza bidimensinală (2D)
Reprezinta tehnica de separare care consta in combinarea a doua tehnici electroforetice:
-separarea izoelectrica prin care proteinele se separa pe baza sarcinii electrice, folosing geluri cu gradient de pH urmata de
separarea SDS-PAGE prin care proteinele se separa pe baza greutatii lor moleculare
• prima dimensiune utilizand IEF (concentrarea izoelectrica)
- intr-un mediu cu pori mari
- amfoliţii formează gradientul de pH
• a doua dimensiune utilizand EG, dependentă de greutatea
moleculară
- in poliacrilamidă
- liniar sau gradient
• Metoda O'Farrell:
- Denaturare prin utilizarea β-mercaptoethanol (prima D)
şi SDS (a doua D)
• Detectează proteine folosind coloranţi (Coomassie), radiografie, fluorografie
• Separă 1100 de culori (autoradiografie)
Optimizarea proceselor electroforetice

Optimizarea electroforezei

• Separarile electroforetice optimizate trebuie sa fie o echilibrare

intre valorile vitezei si rezolutiei

– Voltajul ridicat mareste viteza, dar temperatura cauzeaza evaporarea si

poate denatura proteinele

– Rezistenta ionica ridicata mareste conductivitatea, dar imbunatateste

efectele endo-osmotice.
Aplicatii: Separarea proteinelor plasmatice

Permite separarea proteinelor serice in 5 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la
pH 9.2 sau in 6 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la pH 8.5.
Utilizarea amidoschwarz-ului drept colorant confera rezolutie, specificitate si sensibilitate
metodei, putand fi detectate, chiar si benzi monoclonale slab reprezentate.

Metode:
–Electroforeza in: amidon gel, agar gel, acetat celuloza, PAGE, EC

-Se obtin: Spoturile de proteine

-Se vizualizeaza / localizeaza fracţiunile separate de proteine

Coloranţi: intensitatea colorarii depinde de:


-Tipul proteinei
-Gradul de denaturare a proteinelor prin agenţii de fixare
Principiul metodei

O proteina in solutie care are un pH inferior punctului sau izoelectric se va comporta ca o baza si
va accepta protoni de hidrogen. Proteina va deveni astfel incarcata pozitiv. In mediu acid:

O proteina in solutie care are un pH superior punctului sau izoelectric se va comporta ca un acid
si va ceda protoni de hidrogen. Proteina va deveni astfel incarcata negativ.
In mediu bazic:

Prin electroforeza serului uman se obtin astfel sase fractii proteice: albumina, alfa1, alfa 2, beta
1 si 2 si gama globuline.
Se realizeaza astfel o migrare reprezentata grafic (electroforegrama).
Interpretarea principalelor modificari pe electroforeza proteinelor serice
Modificari la nivelul albuminelor Alfa-1 globulinele si Alfa-2 globulinele
•bisalbuminemii tranzitorii sau permanente Cresc in: sindrom nefrotic, diabet zaharat, miocardoscleroza,
•analbuminemie congenitala endocardite bacteriene, arsuri, boli infectioase, rheumatism, reactii
•hipoalbuminemia apare in: inflamatorii
-insuficienta aportului albuminelor in alimentatie (malnutritie cronica In reactii de faza acuta se intesifica atat banda alfa-1 cat si alfa-2.
severa) Cresterea exclusiva a componentelor alfa-1 poate fi observata in:
-diminuarea sintezei: insuficienta hepatica (ciroze, hepatite) si inflamatii hepatita cronica, reactii de faza acuta insotite de hemoliza, terapie
-pierderea lor accentuata pe cale urinara (sindrom nefrotic), digestiva cu estrogeni, sarcina
(gastroenteropatie exudativa) sau cutanata(arsuri) Cresterea predominanta a componentelor alfa-2 se intalneste in:
-hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse poliartrita reumatoida, boli cu complexe imune circulante
(tireotoxicoza, sindrom Cushing) Scaderea alfa-1 globulinelor apare:
•hiperalbuminemia fara semnificatie patologica importanta apare frecvent •in urma unei insuficiente hepatocelulare, malnutritiei sau pierderii
la pacientii cu hemoconcentratie locala sau sistemica sau in urma de proteine
perfuziilor cu albumina •in cazul deficitului congenital de alfa-1 antitripsina

Gama globulinele cresc in: infectii bacteriene, parazitoze, colagenoze,


Beta globulinele cresc in: anemia feripriva, dislipidemii, boala Cushing,
poliartrita reumatoida, obstructie biliara
gamapatii monoclonale(Ig A, Ig G, lanturi usoare Kappa sau Lambda),
•hepatita acuta sau cronica
hepatite toxice, ciroze, inclusiv alcoolice, sindrom nefrotic
•ciroza hepatica
Scaderi ale beta globulinelor pot apare in:
•leucemii
•insuficienta hepatica, malnutritie, pierderi proteice corelate cu
•mielom multiplu
diminuarea valorii transferinei in mobilitatea electroforetica in zona
•boli inflamatorii
beta-1
Estomparea sau absenta benzii gama sugereaza un deficit imun
•scaderea fractiunii C3 a complementului, asociata cu o scadere a
(agamaglobulinemie
fractiunii beta-2
Masurarea distantei de migrare a proteinei necunoscute
Determinarea marimei din grafic
Masa Molecular medie
Electroforeza standardelor
de masa moleculara

Se traseaza graficul semilogaritmic al distantei de migrare


(mm) vs.marimea (kDa)
Electroforeza capilara
– bazele instrumentatiei –

• Electroforeza are loc in tuburi capilare ce contin un electrolit


• Fiecare tub capilar are un diametru interior de circa 25-75 μm
• Cand se aplica o tensiune electrica solutiei, moleculele migreaza
catre electrodul de sarcina opusa
• In functie de sarcina acestora, moleculele pot migra cu viteze
diferite
– In final are loc separarea componentilor
Teoria Electroforezei capilare EC
Electroforeza capilara permite separarea moleculelor incarcate electric
functie de mobilitatea proprie intr-un tampon cu un pH dat si functie de
fluxul electro-osmotic. Sectiunea transversala a unui capilar
Electro-osmoza: miscarea relativa a masei de lichid catre
electrozi datorita campului electric creat.
Fluxul electro-osmotic (EOF): se produce din cauza sarcinilor
de pe capilar la un pH peste 3 sub actiunea campului electric.
Cand se aplică curent sistemului
- sarcinile - răman fixate pe suport
- norul de ioni din soluţie se muta la electrozi, foarte hidrataţi
- odată cu mişcarea norului ionic, solventul se mişcă si el
• Mişcarea relativă a solventului de pe suportul fix => endosmoză
• Mişcarea apei intr-o singură direcţie
• Macromolecule se deplasează in direcţia opusă fluxului de ioni
+ hidrataţi
- pot rămane imobile sau să fie atrase la polul opus

Tubul este de lungime variabila, in general intre 25-60 cm, diametrul


interior al tubului si grosimea silicei joaca un rol important in separare.
Folosind tuburi cu diametre mici si pereti grosi se previne aparitia incalzirii
de tip Joule, datorate voltajului.
EC este o metoda cu o eficienta extrem de ridicata.
“Curgerea” electro-osmotica

• O caracteristica importanta a EC este reprezentata


de curgerea lichidului prin tuburile capilare.
• Acest fenomen poarta numele de electro-osmoza
Potentialul Zeta
Peretele interior al capilarului este acoperit de grupari silanol (SiOH) care sunt deprotonate
(SiO-) la pH> 3.

Reprezinta faza mobila “impinsa” catre zona capilara a electroforezei (CZE).


Fluxul electroosmotic (EOF):
- fluxul net creste la pH mai mare;
- factorii cheie care afecteaza mobilitatea electroosmotica sunt reprezentati de constanta
dielectrica si vâscozitatea solutiei tampon;
- EOF poate fi “stins” de protectia silanolui sau a pH-ului scazut.
Controlul fluxului electro-osmotic (EOF)
Migrarea diferitelor specii (ionizate sau neionizate) de analiţi sub influenţa fluxului electro-osmotic
Profilul de curgere al electro-osmozei
• O alta caracteristica importanta a “curgerii”
electro-osmotice este profilul plan de curgere al
acesteia, spre deosebire de cel parabolic, realizat
de o pompa peristaltica.
• Profilul acestei curgeri este plan datorita fortei
uniform distribuite de-a lungul tubului capilar, ce
pune in miscare particulele, ceea ce inseamna ca
nu vom avea caderi de presiune, iar viteza de
curgere va fi aceeasi pe toata lungimea tubului.
• Profilul plan al EOF (electro-osmosis flow) este
important deoarece permite separari foarte
eficiente.
Electroforeza capilara: Detectoare

 LIF (cu fluorescenta indusa de laser) este un detector foarte popular de EC


 Absorbanta directa (UV-Viz), pot fi folosite pentru substante organice
 Pentru anorganice, metodele indirecte sunt utilizate in locul absorbantei, in cazul in care un
tampon absorbant (de exemplu, cromat) este inlocuit de catre ionii de analit
 Limitele de detectie sunt in intervalul 50-500 ppb

Metode alternative care implica detectarea potentiometrica sau conductometrica sunt, de asemenea,
utilizate
 Detectare potentiometrica: un ISE cu spectru larg
 Detectarea conductometrica: cum ar fi IC

Incalzirea prin efectul Joule


Caldura prin efectul Joule este o consecinta a rezistentei solutiei la fluxul de curent
 Disiparea caldurii este esentiala pentru functionarea EC
 Rezultatul final: potentiale mari pot fi aplicate pentru separatii extreme de rapide (>30kV)
Electroforeza capilara:
Aplicatii

Aplicatii (in cadrul bioanalizei) sunt largi:


Exemplu: EC este puternic aplicata in cadrul
industriei farmaceutice, ca o alternativa la LC in
diferite situatii.

Exemplu: detectarea contaminarii rapide


bacteriene / microbiene folosind EC:

-un tampon cationic radioactiv diluat este


folosit pentru a marca microorganisme din
proba si un "agent de blocare" – dopul care
anuleaza mobilitatea celulelor si induce
agregarea.

-metoda detecteaza celule bacteriene intregi.


Electroforegramele arata detectarea unei
singure varietati de bacterii, cu un bun raport S
/ Z.
Se utilizeaza un fotoreceptor pentru a masura absorbanta
moleculelor in timp ce acestea migreaza in solutie

Semnalul analitic este analizat de catre


un computer si reprezentat grafic
Instrumente pentru realizarea electroforezei capilare
Electroforegrama
Datele furnizate de EC sunt prezentate sub
forma unei electroforegrame aceasta fiind
similara cu cromatograma.
• Electroforegrama reprezinta un grafic al
timpului de migrare in functie de valorile
raspunsului detectorului.
• Raspunsul detectorului depinde de obicei
de concentratie, cum ar fi aborbanta UV-Viz
sau fluorescenta.
Avantaje ale EC
Selectivitate buna si previzibila 1. EC are la baza principiile separarii electroforetice.
Eficienta separarii ridicata 2. Viteza de migrare a speciilor este determinata de
Dimensiuni mici (1-10 esantioane) sarcina acestora dar si de dimensiunile lor.
Separatii rapide (1 la 45 min.) 3. Particulele mici cu sarcina ridicata vor migra mai
Pot fi automatizate repede decat cele mari si cu sarcina scazuta.
Cantitativa (liniar) 4. Curgerea fluidului este cauzata de EOF.
Cuplare usoara a unui detector MS 5. Viteza EOF poate fi ajustata prin modificarea pHului
“Moduri“ variate de lucru in practica solutiei.
Dezavantaje ale EC 6. Profilul de curgere al EOF este plan, ceea ce
Nu se pot face separarii preparative reprezinta eficiente ridicate de separare sau
Concentratii mici si volume mari (dificultate) identificare.
Compusi “lipiciosi" (polihazaride) 7. Rezultatul este reprezentat grafic sub forma unei
Specii care sunt dificil de dizolvat electroforegrame.
Probleme de reproductibilitate
Aplicatii
• Analiza carbohidratilor Avantaje Dezavantaje
• Analiza anionilor anorganici • Metoda rapida • Nu se pot identifica specii neutre
• Identificarea de ADN • Probe mici • Aparitia efectului Joule
• Identificarea proteinelor • Metoda relativ ieftina
• ETC. • Aparatura automatizata
EC proteinelor si polipeptidelor
Electroforeza capilara in gel (ECG)
 Capilar umplut cu electrolit de transport (tamponat),
intr-un gel (geluri de poliacrilamida)
 Separare in functie de marimea/dimensiunea
moleculelor
 Geluri reticulate
 Geluri liniare (capilarele pot fi spalate si reumplute)
 Aplicarea ECG: SDS + proteina

Acrilamida
CH2=CH-CO-NH2

Random Retea
EC proteinelor si peptidelor
EC carbohidratiilor cu detectie indirecta UV

 acid asorbic 6mM,


0,001% HDB, -10 kV
1 acid manuronic
2 acid glucuronic
3 acid galacturonic
4 acid gluconic
5 acid N-acetilneuramic
6 fructoza
7 ramnoza
8 glucoza
9 galactoza
10 dezoxiriboza
11 zaharoza
EC carbohidratilor
cu detector ESI-MS

 300 mM dietilamina
(DEA), + 20 kV
 Debit scazut: DEA 0,25%
in 2 propanol/apa 80:20,
4 mL/ min.
 17 analiti in 5 minute
EC a aminoacizilor cu detector UV

Separare:
- dupa derivatizare
 Fara derivatizare
- cationic
- anionic
Separarea aminoacizilor prin EC cu detector MS