1.

Biosinteza de novo a nucleotidelor piri-midinice

Experimente cu markeri radioactivi au aratat ca atomii N(1), C(4), C(5) si C(6) ai ciclului
pirimidinic provin din scheletul acidului aspartic, atomul (C) provine din CO 2 si atomul N(3) este
preluat de la glutamina.

1.1. Mecanismul chimic

1. Sinteza carbamoil fosfatului este prima reactie a

biosintezei pirimidinelor, enzima fiind carba-moil fosfat
sintetaza II existenta in citosol. Una din cele doua molecule de ATP care se consuma in reactie
furnizeaza o grupare fosfat iar cealalta contribuie cu energia necesara la carboxilarea azotului
aminic, fara implicarea biotinei, coen-zima tipica angajata in reactiile de carboxilare la atomul de
carbon. Am vazut la ciclul ureogenetic ca enzima similara, carbamoil fosfat sintetaza I,
catalizeaza carboxilarea si fosforilarea unui atom de azot din amoniac si este localizata in
mitocon-drie. La procariote exista o singura sintetaza care catalizeaza ambele cai metabolice
(pirimidinoge-neza si ureogeneza).

2. Sinteza carbamoil aspartatului este catalizata de aspartat transcarbamoilaza (ATC).

Formarea dihidroorotatului are loc prin inchi-derea ciclului catalizata de dihidoorotaza. Primele
3 enzime, sintetaza II, ATC si dihidroorotaza fac parte dintr-o singura proteina trifunctionala la
eucariote. Aceasta proteina numita CAD, consta din 3 catene polipeptidice identice avand mase
moleculare de 230 kDa, fiecare continand cei 3 centri activi ai enzimelor aratate. Integrarea
acestor enzime intr-un complex multienzimatic este de asteptat datorita caracterului relativ
dezor-ganizat al citosolului.

4. Oxidarea dihidroorotatului este o reactie reversibila catalizata de dihidroorotat dehidro-

genaza, enzima eucariotica continand FMN si fer neheminic fiind asociata la membrana interna
mitocondriala. Chinone intermediaza transferul atomilor de hidrogen. Aceasta dehidrogenaza
este singura enzima mitocondriala toate celelalte enzime ale pirimidinogenezei fiind citosolare.

5. Plasarea dihidroorotatului pe fosforiboza are loc cu implicarea compusului macroergic 5-

fosforibosil-pirofosfat (PRPP) rezultand orotidin-5'-monofosfat (OMP). Reactia este catalizata de
orotat fosforil transferaza care poate actiona si ca "enzima de salvare" pentru baze pirimidinice
ca uracilul si citozina pe care le transforma in nucleotidele monofosforice corespunzatoare.
Figura 28. Biosinteza de novo a UMP. Inelul pirimidinic este sintetizat inaintea atasarii la inelul ribozic.

6. Formarea UMP are loc prin decarboxilarea OMP de catre OMP decarboxilaza. La animale
reactiile 5 si 6 sunt catalizate de o singura catena polipeptidica ceea ce releva integrarea in com-
plexe multienzimatice a urmatoarelor enzime citosolare (reactia 4 este catalizata de o enzima
mitocondriala). Integrarea reactiilor 1,2,3,5 si 6 creeaza conditiile canalizarii intermediarilor pen-
tru a parcurge succesiunea de reactii cu viteza mare, protejati fata de actiunea degradatoare a
altor enzime celulare.
7.si 8. Sinteza UDP si UTP are loc prin actiunea secventiala a nucleozid monofosfat kinazei si
nucleozid difosfat kinazei:

UMP+ATP↔UDP+ADP UDP+ATP↔UTP+ADP

9. Conversia UTP in CTP are loc sub actiunea CTP sintetazei.

Figura 29. Sinteza CTP din UTP.

1.2. Reglarea biosintezei

nucleotidelor pi-rimidinice

Aspartat transcarbamoilaza (ATC) este principala enzima reglatoare la bacterii (fig. 30)

Asocierea moleculelor substraturilor carbamoil-fosfatul si aspartatul este cooperativa, ceea ce

determina forma sigmoidala a curbei viteza-con-centratia. CTP inhiba enzima prin micsorarea
afi-nitatii acesteia fata de substrat, fara sa afecteze numarul de turnover (viteza maxima).
Inhibitia poate atinge 90%.

ATP este un activator al ATC. Acesta mareste afinitatea enzimei fata de

substrat fara sa afecteze vmax. In plus, legarea CTP si ATP la centrul
alosteric este competitiva (un singur centru alosteric pentru ATP si CTP).
Concentratii mari de ATP deplaseaza CTP de pe enzima care nu-si mai poate
exercita efectul inhibitor. Semni-ficatia activitatii ATC-azei de ATP este
dubla:

a) Sunt egalizate vitezele de formare ale

nucleotidelor purinice si pirimidinice ceea ce satisface necesarul in
raportul 1:1.
b) Sunt puse de acord vitezele reactiilor consu-matoare de ATP(sinteza
carbamoil-P, fosfori-larea UMP si UDP) cu rezerva de ATP. Deci daca ATP
creste, creste sinteza precursorilor reactiilor consumatoare de ATP. La
animale ATC nu este enzima reglatoare. Biosinteza pirimidi-nelor este
controlata si la nivelul carbamoil fosfat sintetazei II (fig. 30). Aceasta este
inhibata de UDP si UTP si este activata de ATP si PRPP.

Figura 30. Controlul biosintezei pirimidinelor la E. coli (a) si la animale (b). Inhibitia retroactiva are
loc la nivelul enzimelor indicate cu octogon. Activarea este indicata cu patrate pline.

La animale ATC-aza nu este enzima reglatore. Biosinteza pirimidinelor este controlata la

nivelul carbamoil fosfat sintetazei II (fig. 30). Aceasta este inhibata de UDP si UTP si este
activata de ATP si PRPP. Al doilea nivel de reglare a caii la mamifere este OMP decarboxi-laza
care este inhibata competitiv de UMP. La toate organismele productia de OMP variaza cu nivelul
precursorului PRPP.

Aciduria orotica ereditara este caracte-rizata prin tulburari de crestere, anemie megalo-
blastica severa, excretia unor mari cantitati de acid orotic (cristalurie orotica). Baza biochimica a
excretiei de acid orotic este absenta orotat fos-foribozil transferazei si/sau orotidilat decar-
boxilazei.
Cu toate ca boala este rara, intelegerea bazei me-tabolice a ei a permis aplicarea unui tratament
adecvat si confirmarea etapei reglatoare a biosin-tezei pirimidin nucleotidelor.

Cand acesti pacienti sunt alimentati (per oral) cu citidina sau uridina ei prezinta o evidenta
ame-liorare a manifestarilor hematologice precum si o descrestere a excretiei de acid orotic.
Explicatia consta in faptul ca aceste nucleozide adminis-trate sunt transformate in nucleotide,
astfel fiind ocolit blocajul de la nivelul celor doua enzime. Scheletele lor intra in procesele de
crestere celulara ca de exemplu in procesul eritropoietic care sunt intense in sintezele de ARN si
ADN. Prin urmare este eliminata anemia. In plus, for-marea CTP si a UTP din aceste nucleozide,
prin feed-back negativ, inhiba aspartat transcarba-moilaza si carbamoil-fosfat sintetaza II,
enzime precursoare sintezei de acid orotic, ceea ce reduce excretia de acid orotic.

1. Formarea deoxiribonucleotidelor

Deoxiribonucleotidele pirimidinice si purinice sunt sintetizate din ribonucleotidele

corespunzatoare prin reducerea atomului de carbon C(2΄) al acestora din urma, nu prin sinteza de
novo din precursori care contin

deoxiriboza.

Enzimele care catalizeaza aceasta transformare se numesc ribonucleotid reductaze. Se cunosc 3

tipuri de reductaze de acest fel:

a. enzime care contin Fe(III) neheminic;

b. enzime care utilizeaza 5΄ deoxi-adenozil cobalamina (coenzima B12 );

c. enzime Mn-dependente(fig. 31).

Figura 31. Reciclarea ribonucleotid reductazelor prin reducere cu tioredoxina redusa.

Figura 32. Sistemul de transfer electronic prin care puterea reducatoare reduce un ribonucleotid.

1.4. Formarea timinei

dTMP, component al ADN, se formeaza prin metilarea dUMP de catre

un donor de grupa-re metil, sub actiunea timidilat sintazei(fig. 33).

Figura 3 Sinteza dTMP din dUMP. Enzima catali-zatoare este timidilat sintaza.

1.5. Agenti anticancerosi

Reciclarea acidului dihidrofolic(DHF) pentru sinteza N 5,N10-

metilentetrahidrofolatului are loc prin parcurgerea unei secvente de 2 reactii
(fig. 34) cu participarea enzimelor dihidrofolat reductaza si serin hidroximetil
transferaza.
Figura 34. Sistemul enzimelor timidilat sintaza-DHF reductaza-serin hidroximetil transferaza
catalizeaza

un ciclu metabolic prin care dUMP este convertit in dTMP cu participare puterii reducatoare si a serinei.

Antifolatii, antimetaboliti ai sintezei timin nu-cleotidelor, sunt analogi ai DHF

care se leaga competitiv, aproape ireversibil, la DHF reduc-taza. Blocarea
acestei enzime impiedica sinteza dTMP. Exemple de antifolati sunt
methoprim, metotrexat, trimethoprim.

2. Catabolismul nucleotidelor pirimidinice

Sediul catabolismului pirimidinelor este ficatul. Produsii acestui catabolism

sunt gaze usor solubile in apa(NH3, CO2) precum si compusi usor
metabolizabili. Celulele animalelor degra-deaza nucleotidele pirimidinice
pana la starea de baza (uracil, timina). Aceste transformari au loc prin
reactii de defosforilare(hidroliza) sub actiu-
 nea nucleotidazelor si deaminare si clivaj a legaturii N-glicozidice sub actiunea unei fosfori-
laze. Nucleobazele sunt reduse in hepatocite iar dihidronucleobazele sunt deciclizate si hidroli-
zate rezultand δ-Ala sau β-aminoizobutirat alaturi de NH3 si CO2. Prin urmare, spre deosebire de
catabolismul purin-nucleotidelor, produsii finali ai pirimidin-nucleotidelor sunt substante usor
solubile in apa. Astfel, in conditiile unei supra- productii de pirimidine nu vor apare semne
clinice deoarece produsii de degradare ai acestora nu se acumuleaza ca acidul uric si uratii.
Hiperproductia de PRPP determina cresterea acestor compusi. Aminoacizii rezultati sunt
procesati prin succesiuni de reactii similare cu cele intalnite la degradarea aminoacizilor cu
catene ramificate.
 Figura 35. Catabolismul pirimidin nucleotidelor la animale. Aminoacizii rezultati prin reactii
specifice sunt preluati de alte procese metabolice cum ar fi catabolizarea aminoacizilor. UMP si dTMP
sunt de-gradati de aceleasi enzime.
 Excretia de -amino-izobutirat creste in ira-dierea cu raze X, leucemie. Ea se explica prin
faptul ca in iradierea cu raze X exista o distrugere de celule crescuta si deci distrugerea ADN din
care rezulta nucleotide pirimidinice.
Biosinteza de novo a nucleotidelor pu-rinice. 1. Mecanismul chimic

Figura 36. Biosinteza de novo a nucleotidelor monofosforice purinice pana la inozin monofosfat.
 Global, nucleul purinic rezulta din contri-butia a 2 aminoacizi(Gly si Gln), a unor subuni-tati
C1 activate de acidul tetrahidrofolic si a CO2, asa cum se vede mai jos.

Figura 37. Biosinteza AMP si GMP pornind de la inozin monofosfat.

 2. Ciclul purin nucleotidelor

Atunci cand dezaminarea AMP sub actiu-nea AMP deaminazei, cu formare de IMP, este
combinata cu sinteza AMP din IMP(fig. 36, 37) global are loc dezaminarea neoxidativa a acidului
aspartic prin care resulta acidul fumaric(ne amin-tim ca dezaminarea neoxidativa a histidinei produce
acid urocanic). Aceasta combinatie se numeste ciclul purin nucleotidelor(fig. 38). Acesta are un
important rol in metabolismul mus-chiului scheletic. Intensificarea activitatii muscu-lare impune
intensificarea ciclului citric care are loc prin anapleroza. Totusi, miocitele muschiului scheletic sunt mai
sarace in enzime anaplerotice decat celulele altor tesuturi. Miocitele isi 'rein-carca' ciclul citric mai
degraba cu fumaratul generat de ciclul purin nucleotidelor. Importanta ciclului purin nucleotidelor in
muschi este dove-dita de observatia ca cele 3 enzime implicate in ciclul purin nucleotidelor sunt mult
mai active in acest tesut decat in altele. Indivizii cu deficit inascut de AMP deaminaza obosesc usor si
sufera de crampe musculare dupa efortul fizic.

Figura 38. Ciclul purin nucleotidelor. In efort fizic acest ciclu incarca ciclul citric furnizandu-i fumarat.
Jos este prezentata reactia globala a ciclului.
 Reglarea biosintezei nucleotidelor puri-nice

Cel mai important reglator al biosintezei "de novo" a purinelor este concentratia intrace-lulara
a PRPP. Pe de alta parte viteza de sinteza a PRPP depinde de activitatea PRPP sintetazei. Activitatea
PRPP sintetazei depinde de efectele alosterice ale purin si pirimidin nucleotidelor.

Figura 39. Controlul biosintezei de novo a purin-nucleotidelor. Octogoanele pline indica punctele de
control. Inhibitia prin feed-back si activarea prin feed-forward sunt reprezentate prin linii intrerupte.

Viteza de utilizare a PRPP depinde in special de consumul lui pe caile de salvare a bazelor
purinice (in mai mica masura de viteza biosintezei "de novo"). Prin urmare orice deficit enzimatic
aparut pe aceste cai determina o cres-tere marcata a PRPP si deci o intensificare a biosintezei de novo.
Pe de alta parte, amido-transferaza, prima enzima implicata in sinteza specifica a purinelor, este
obiectul a doua efecte opuse:

- efectul inhibitor al IMP si nucleotidelor finale

- efectul activator al PRPP ca substrat, competitiv cu cel inhibitor al IMP.

Schema arata ca in afara reglarii procesului global de biosinteza este reglat si echilibrul dintre AMP si
GMP.

4. Medicamente inhibitoare ale sintezei purin nucleotidelor

6-mercaptopurina si 6-tioguanina sunt convertite in ribonucleotidele de catre hipoxan-tin-

guanin fosforibozil transferaza (HGPRT), enzima de salvare a nucleobazelor indicate in denumire. 6-tio-
IMP rezultat inhiba conversia IMP in AMP, respectiv 6-tio-GMP inhiba con-versia IMP in GMP. In plus,
cele doua ribonu-cleotide tiolice inhiba prin feed-back negativ etapa cheie a sintezei de novo a purin
nucleo-tidelor, reactia PRPP cu glutamina.

5. 'Salvarea' bazelor purinice - cale de sinteza a nucleotidelor purinice

Mamiferele si multe vertebrate inferioare sunt capabile sa sintetizeze "de novo" nucleotide
purinice si pirimidinice. Prin urmare supravie-tuirea lor nu depinde de prezenta acestor nucleo-tide in
alimentatie. Totusi, dieta acestor organis-me contine nucleoproteide (complexe formate din acizi
nucleici si proteine). Enzimele proteolitice ale tractului intestinal elibereaza acizii nucleici din
nucleoproteine. Sucul pancreatic contine nucleaze care degradeaza acizii nucleici in nu-cleotidele
componente: ribonucleazele actionea-za asupra ARN si deoxiribonucleazele actio-neaza asupra ADN.

Nucleotidazele hidrolizeaza mononucleotidele in nucleozide si H3PO4. Aceste nucleozide libere pot fi

absorbite in intestin sau degradate pana la sta-rea de baze libere sub actiunea fosforilazei intes-tinale:

Adenozina+ATP Adenina+Rib-1-P.

Nucleazele, nucleotidazele si fosforilazele in-tracelulare au aceleasi functii cu ale celor intestinale.

Bazele purinice (spre deosebire de bazele pirimi-dinice), pot servi la resinteza nucleotidelor purinice
pe o cale "de salvare" care este mult mai simpla si cu un cost energetic mult mai mic decat calea
biosintezei "de novo". Exista doua "enzime de slavare" a bazelor purinice: (i) adenin fosfo-ribozil
transferaza (APRT). (ii) guanin-hipoxan-tin fosforibozil transferaza (GHPRT). Schema reactiilor
catalizate de aceste enzime este prezen-tata in figura 40.

Figura 40. Biosinteza salvatorie a purin-nucleotide-lor.

Enzima adenozin kinaza catalizeaza sinteza AMP si dAMP prin 'salvarea' adenozinei si
deoxiadenozinei.

4. Catabolismul purinelor
In functie de specia organismului puri-nele sunt degradate diferit, pana

la acid uric, sau pana la alantoina sau uree si acid glioxilic. Omul

degradeaza purinele pana la acid uric.

4.1. Mecanismul chimic

Calea urmata pentru conversia purinelor in acid uric implica reactii de dezaminare, fosfo-roliza
si oxidare(fig. 41).

Figura 41. Principalele cai de catabolizare a purin nucleotidelor la mamifere. Produsul final este acidul
uric.
Acele organisme, pasari, reptile, la care principa-la forma de eliminare a azotului aminic este acidul
uric se numesc uricotelice. La acestea, biosinteza purin nucleotidelor are o mai mare in-tensitate decat
la ureotelice avand in vedere ca, prin intermediul lor, azotul din: Asp, Gly, Glu-NH2 este excretat sub
forma de acid uric. Este si un mijloc de conservare a apei datorita solubili-tatii mici a uratului.

La oameni se pare ca acidul uric joaca un rol care il depaseste pe cel de produs final. El poate servi
ca antioxidant prin transformarea neenzimatica in alantoina. Alantoina are proprietati asemana-toare
acidului ascorbic. Alte mamifere, inferioare primatelor, secreta alantoina ca produs final de degradare
a nucleotidelor purinice datorita existentei in celulele lor a uricazei (urat oxida-zei), enzima care
catalizeaza formarea alantoinei.

Probabil ca la un anumit nivel in scara filogenetica, au existat la stamosii primatelor atat

gulonolacton oxidaza cat si uricaza. Pierderea gulonolacton oxidazei si deci incapacitatea de sinteza a
acidului ascorbic, a fost compensata ulterior prin pierderea uricazei, deci conservarea acidului uric ca
reducator. La unii pesti alantoina este degradata pana la uree si acid glioxilic.

Figura 42. Conversia acidului uric in amoniac. Procesul este intrerupt in diferite stadii la speciile
indicate in acolade.
4.2. Tulburari ale metabolismului purinelor. Hiperuricemia
 Structura acidului uric depinde de pH. In figura 43 sunt prezentate formele tautomere ale
acidului uric si echilibrul de ionizare a formei enol.

Figura 4 Acidul uric in diferite forme

tautomere.

In conditii fiziologice exista un amestec urat/acid uric, predominand uratul de sodiu. Atunci
cand concentratia ionilor acestuia depa-seste produsul de solubilitate a uratului de sodiu, serul
devine suprasaturat si in el pot precipita cristale de urat. In ser la 37C, solubilitatea uratului este 7 mg
%. Cristalele se depoziteaza in special in incheieturi. In urina solubilitatea aci-dului uric este mai mare
decat in ser, limita de solubilitate fiind 15 mg%. Acidifierea urinei primare are loc in tubul distal si
ductul colector ale nefronului. Prin acidifiere raportul urat/acid uric scade si totodata scade si
solubilitatea siste-mului urat deoarece acidul uric este de 17 ori mai putin solubil decat uratul de
sodiu. Precipi-tarea cristalelor de acid uric (piatra la rinichi) poate fi prevenita prin alcalinizarea urinei.
Boala, numita artrita hiperuricemica (guta, podagra) este cauzata de formarea cristalelor de urat de
sodiu in incheieturi si rinichi.

Una din cauzele metabolice ale bolii este lipsa unui control alosteric a PRPP-sintetazei. O alta
este lipsa activitatii guanin-hipoxantin fosforibozil transferazei (GHPRT), enzima de salvare a bazelor
purinice (guaninei). Ambele cauze determina cresterea concentratiei de PRPP si supraproductia de
acid uric pe calea de novo. Aceste cristale precipita atunci cand nivelul seric al uratului depaseste
limita sa de solubilitate. Cristalele aciforme de urat de sodiu sunt anizo-trope din punct de vedere
optic prezentand bire-fringenta negativa, ceea ce permite sa fie deosebite la microscopicopul cu
polarizare de alte cristale. Daca leucocitele polimorfonucleare din fluidul sinovial contin cristale de
urat de sodiu diagnosticul este guta. Inflamatia si eroda-rea incheieturilor apar atunci cand leucocitele
incorporeaza cristalele de acid uric care deter-mina ruptura celuleor si eliberarea enzimelor
lizozomiale. Aceste cristale, daca sunt prezente in tractul urinar, altereaza functia renala. Guta se
trateaza prin dieta si medicamente. Alimentele bogate in acizii nucleici ca ficatul sunt excluse din dieta,
la fel cafeaua si ceaiul care contin cafe-ina si teobromina.

Ca medicament se foloseste alopurino-lul, analog al hipoxantinei. Xantin oxidaza catali-zeaza

oxidarea alopurinolului cu formare de oxi-purinol(fig. 44). Acesta din urma se asociaza strans la centrul
activ al enzimei si o impiedica sa oxideze xantina sau hipoxantina pentru a forma acid uric. Acesta este
un exemplu tipic de inhibi-tie prin "sinucidere"(suicide inhibition). Pentru tratamentul gutei in timpul
puseului acut se utilizeaza colchicina, un medicament(alcaloid) antiinflamator care inhiba miscarea
leucocitelor prin inhibarea microtubulilor.

Figura 44. Oxidarea alopurinolului.

Sindromul Lesch-Nyhan are la baza lipsa aproape totala a activitatii GHPRT, defect inascut. Din
aceasta cauza guanina si hipoxantina nu sunt 'salvate' ceea ce determina scaderea nivelelor GMP si
IMP si cresterea nivelului PRPP. In consecinta este accelerata sinteza de novo a purinelor si a acidului
uric. Copiii cu aceasta boala incep sa se manifeste la 2 ani prin a-si musca buzele si degetele. Tendinta
la auto-mutilare este atat de mare incat este necesara protejarea acestor pacienti prin invelirea
mainilor in tifon. Ei sunt agresivi si fata de ceilalti. Sunt deficienti mintal, au miscari necoordonate si
fac hiperuricemie si piatra la rinichi foarte timpuriu. Tratamentul cu alopurinol reduce formarea
acidului uric insa nu amelioreaza simptomele neurologice. In ciuda faptului ca celulele acestor pacienti
au putut fi "vindecate" in vitro prin inginerie genetica, foarte putin s-a putut face pentru
insanatosirea in situ a lor.

Deficienta de adenozin deaminaza de-termina nivele crescute ale adenozinei si deoxi-

adenozinei care sunt convertite prin 'salvare' in nucleotidele corespunzatoare in leucocite. Nive-lurile
mari ale dATP inhiba ribonucleotid reduc-tazele adica reduce productia de deoxinucleotide si deci
inhiba sinteza ADN. Din aceasta cauza leucocitele nu pot prolifera (imunodeficienta). Alterarea severa
a functiunilor limfocitelor T si B determina aparitia la varsta de 6 luni a unor infectii si tulburari de
crestere. Decesul poate surveni la varsta de 18 luni. Tratamentul consta in transplantul de maduva
osoasa.