FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM DIFERENTES MEIOS

UTILIZANDO Saccharomyces cerevisiae RECOMBINANTE

IMOBILIZADA

PEREZ C1, SANDRI J P1, MESQUITA TJB1, MILESSI TSS1, GIORDANO R L C1,2
ZANGIROLAMI T C1,2

1Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos ,

2 Departamento de Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos
E-mail para contato: lopesperezcaroline@gmail.com

RESUMO – A levedura GSE16-T18 HAA1 foi imobilizada em alginato de cálcio e testada em

diferentes meios fermentativos contendo as mesmas composições de peptona, extrato de
levedura, glicose, xilose e cloreto de cálcio. Os meios testados foram o hidrolisado bruto
concentrado de bagaço de cana de açúcar obtido por hidrólise ácida (HB), o mesmo
hidrolisado após uma etapa de destoxificação (HD) e meio complexo (YPDX). Foram
realizadas bateladas repetidas, e os resultados, expressos em massa de CO2 liberado,
indicaram que as melhores performances foram obtidas no meio HB, no qual a capacidade de
fermentação foi mantida por sete ciclos de bateladas repetidas.

1. INTRODUÇÃO

O processo para produção do etanol 2G envolve quatro etapas: pré-tratamento, hidrólise,

fermentação e destilação. O pré-tratamento é importante para desestruturar a biomassa
lignocelulósica, deixando celulose e hemicelulose mais acessíveis à ação das enzimas que hidrolisam
os carboidratos de cadeias longas gerando, açúcares fermentescíveis. Na fermentação, estes açúcares
liberados na etapa de hidrólise são convertidos a etanol, e o mosto fermentado segue para a destilação
(LASER et al., 2002).
A fermentação dos açúcares presentes no hidrolisado de maneira ecifiente é uma etapa
importante para viabilizar o processo de produção de etanol 2G. Além de glicose, o hidrolisado
contém grande quantidade de xilose. Enquanto a fermentação alcoólica a partir de hexoses pela
levedura selvagem Saccharomyces cerevisiae é um processo consolidado, a fermentação das pentoses
ainda é um desafio. Organismos geneticamente modificados vêm sendo obtidos e utilizados para a
fermentação de xilose. No entanto, apresentam baixa tolerancia a concentrações de etanol no meio,
bem como sofrem inibição por furanos, ácidos fracos e compostos fenólicos (ALMEIDA et al., 2007).
A formação de inibidores está relacionada à composição do material lignocelulósico, bem como ao
pré-tratamento utilizado, sendo a hidrólise ácida, um dos tratamentos mais eficientes, porém com
maiores formações de inibidores em comparação com outros métodos, de maneira que demandam
etapas posteriores de destoxificação (MILESSI, 2017).
Na tentativa de reduzir os efeitos dos inibidores sobre as células livres, a técnica de imobilização
de células se mostra uma alternativa atraente para ser utilizada em processos fermentativos, uma vez
que permite a utilização de elevadas densidades celulares nos cultivos (TIAN, WANG e ZHAO,
2016).
Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi analisar o comportamento de fermentações
realizadas em bateladas repetidas em diferentes meios de cultivo sob as mesmas condições de pH e
temperatura e concentrações de açúcares, utilizando células de levedura geneticamente modificada
imobilizadas em gel de alginato de cálcio.

2. MATERIAIS E MÉTODOS
Os ensaios fermentativos foram realizados em micro-reatores de 5 mL dotados de saída para
CO2, contendo 1 mL do meio de cultivo adequado e 1mL de células de levedura geneticamente
modificada GSE16-T18 HAA1 (MEIJNEN et al., 2016), imobilizadas em gel de alginato, conforme
metodologia descrita por Milessi (2017). Os ensaios foram realizados utilizando hidrolisado de
bagaço de cana de açúcar concentrado, gentilmente cedido pelos pesquisadores da Escola de
Engenharia de Lorena/USP (ANTUNES et al., 2015) e produzido a partir da hidrólise ácida de bagaço
de cana de açúcar. O hidrolisado foi utilizado em sua forma bruta (HB) e destoxificada (HD),
conforme metodologia descrita por Antunes et al. (2016) e em ambos os hidrolisados foi feito o ajuste
do pH até 5,6 e suplementação com peptona (20 g/L), extrato de levedura (10 g/L) e CaCl2 (2 g/L).
Um experimento de referência, para comparação, foi realizado com meio YPDX contendo as mesmas
concentrações de extrato de levedura, peptona e CaCL2 adicionados ao hidrolisado, suplementado
com glicose (9,5 g/L) e xilose (63 g/L) na mesma concentração do hidrolisado. Os ensaios foram
realizados em bateladas repetidas e interrompidos quando não houvesse mais mudança no perfil de
da massa de CO2 produzido. Todas as fermentações foram conduzidas a 35 oC em condição estática.
Ao final de cada fermentação, as células imobilizadas eram retidas no micro-reator,
enquanto o meio fermentado era removido e o novo meio de fermentação era adicionado, iniciando
um novo ciclo (batelada repetida). A quantificação de viabilidade celular foi realizada pela retirada
de uma alíquota de microcápsula a cada troca de meio, seguida por dissolução da mesma em acetato
de sódio, coloração com azul de metileno e contagem em câmara de Neubauer (MILESSI,
2017). As concentrações de glicose, xilose e etanol no sobrenadante recolhido foram
determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), utilizando o cromatógrafo
Waters e2695 com detectores de índice de refração e UV (MILESSI, 2017).

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados em termos da produção de etanol, consumo de açúcares e viabilidade para cada
composição de meios após o primeiro e último ciclos são mostrados na Tabela 1.
Verifica-se que, ao final do primeiro ciclo, as células apresentavam viabilidade de quase
100% em todos os meios testados. Já após a última fermentação, as células perderam quase toda sua
viabilidade, apesar do elevado consumo de açúcares observado em ambos os ciclos.
Destaca-se que o HB contém três vezes mais compostos fenólicos em comparação com o HD,
e que na primeira batelada, a massa de CO2 liberado foi a mais elevada no meio destoxificado, como
mostra a Figura 1. A partir da segunda batelada, no entanto, a maior massa de CO2 produzido ocorreu
nos micro-retores contendo HB, sendo esta cerca de três vezes maior em relação às massas de CO2
produzidas dos reatores contendo meio HD e YPXD, que tiveram perdas de massa muito semelhantes
a partir do segundo ciclo e até a última batelada. Após a 6ª batelada as células em todos os meios
testados perderam sua viabilidade e não houve mais perda de massa significativa nos micro-reatores,
conforme mostra a Figura 1.

Tabela 1: Concentrações finais de etanol, glicose e xilose em g/L e viabilidades celulares após o
primeiro e último reciclos
1º Reciclo 7º Reciclo
HB HD YPDX HB HD YPDX
Etanol (g/L) 28,82 30,95 32,83 20,81 28,97 28,77
Glicose residual (g/L) 0,32 0 0 0,86 0,42 0
Xilose residual (g/L) 0,08 0,14 0 2,22 0,31 0
Viabilidade (%) 99 88 98 15 10 17

Figura 1: Perda de massa por fermentação em bateladas repetidas de xilose e glicose e liberação de
CO2 nos meios HB, HD e YPDX ao longo do tempo
0,16
0,14
0,12
0,1
0,08 HB
∆m (g)

0,06 HD
0,04 YPDX
0,02
0
0 20 40 60 80 100 120 140
Tempo (h)

Sabe-se que o meio HB continha maior concentração de inibidores em comparação com os

outros meios, porém apresentou maior perda de massa por liberação de CO2 nas bateladas repetidas,
à exceção da primeira. Nesse contexto, atribui-se a resistência das células de leveduras à ação dos
contaminantes à proteção conferida pelo gel de alginato, que foi determinante para manter a
viabilidade celular. Além disso, verifica-se que as performances das fermentações foram melhores no
meio HB, indicando que os inibidores não prejudicaram a fermentação e conponentes do meio bruto
que possivelmente foram removidos na etapa de destoxificação, aparentemente favorecem a reação.
O efeito protetor do gel de alginato na presença de fenóis já foi previamente reportado em
literatura por Keweloh et al. (1989), que estudaram o crescimento de Escherichia coli em glicose na
presença de fenol. De acordo com os autores, 1 g/L de fenol inibia de 3 a 4 vezes vezes mais o
crescimento de células livres do que de células imobilizadas. Já para concentração de 2 g/L de fenol,
apenas as células imobilizadas foram capazes de crescer. Concluíram ainda que as células
imobilizadas possuíam uma concentração mínima inibitória 0,5 g/L maior do que as células livres, de
maneira que supõe-se que as células no exterior do suporte protejam as células do interior. Krisch et
al. (1997) também estudaram células de S. cerevisiae imobilizadas em gel de alginato de cálcio, e
apesar de não entenderem o funcionamento do mecanismo de proteção, verificaram que as células
imobilizadas permaneciam viáveis por mais tempo em comparação com as células livres na presença
de etanol e de ácido acético. Milessi (2017) estudou o potencial de proteção do alginato de cálcio em
células de S. cerevisiae T18, e verificou que o processo fermentativo utilizando a levedura
encapsulada teve melhor desempenho no meio YPX 40 g/L com concentrações de ácido acético entre
4 e 8 g/L em comparação com as leveduras livres, bem como durou menos tempo até o consumo de
toda a xilose do meio utilizado. Desse modo, verifica-se que o efeito positivo da imobilização de
células observado neste trabalho já fora reportado em outros estudos e merece destaque, uma vez que
pode viabilizar a utilização do hidrolisado ácido de bagaço de cana para fermentação sem que seja
necessário uma etapa de destoxificação do meio, que ocasionaria em gastos adicionais no processo.

4. CONCLUSÃO
Os beads de alginato se mostraram um ótimo recurso para utilizar altas concentrações de
células de levedura nas fermentações, bem como apresentaram um efeito protetor para as células aos
contaminantes do meio, o que ocorre especialmente no meio HB, onde a concentração de compostos
fenólicos é a mais elevada. Dessa forma, encapsular a levedura T18 HAA1 em gel de alginato é uma
estratégia para manter altas taxas fermentativas por mais ciclos.

5. REFERÊNCIAS

ALMEIDA JRM, MODIG T, PETERSSON A, HAHN-HAGERDAL B, LIDÉN G, GORWA-

GRAUSLUND MF. Increased tolerance and conversion of inhibitors in lignocellulosic hydrolysates
by Saccharomyces cerevisiae. J. Chem. Technol. Biotechnol. 82: 340-349 (2007).
ANTUNES FAF, SANTOS JC, CHANDEL AK, MILESSI TSS, PEREZ GF, da SILVA SS.
Hemicellulosic Ethanol Production by Immobilized Wild Brazilian Yeast Scheffersomyces shehatae
UFMG-HM 52.2: Effects of Cell Concentration and Stirring Rate. Curr. Microbiol., v. 72, n. 2, p.
133– 138, 27 fev. 2016
FURLAN FF, LINO ARA, MATUGI K, CRUZ AJG, SECCHI AR, GIORDANO RC. A simple
approach to improve the robustness of equation-oriented simulators: Multilinear look-up table
interpolators. Comput. Chem. Eng.,v.86, p.1-4, 2016.
KEWELOH, H.; HEIPIEPER, H.J.; REHM, H.J.. Protection of bacteria against toxicity of phenol by
immobilization in calcium alginate. PPL. Microbiol. Biotechnol., v.31, p.383-389, 1989.
KRISCH, J.; SZAJÁNI, B. Ethanol and acetic acid tolerance in free and immobilized cells of
Saccharomyces cerevisiae and Acetobacter aceti. Biotechnol. Lett., v. 19, p. 525-528, 1997.
LASER M, SCHULMAN D, ALLEN SG, LICHWA J, ANTAL MJ JR, LYND LR. A comparison
of liquid hot water and steam pretreatments of sugar cane bagasse for bioconversion to ethanol.
Bioresour. Technol., v. 81, p. 33-44, 2002.
MILESSI TSS. Produção de etanol 2G a partir de hemicelulose de bagaço de cana-de-açúcar
utilizando Saccharomyces cerevisiae selvagem e geneticamente modificada imobilizadas. Tese
doutorado. PPG-EQ/UFSCar, 2017.
SANTOS, J. C.; MARTON, J. M.; FELIPE, M. G. A. Continuous System of Combined Columns of
Ion Exchange Resins and Activated Charcoal as a New Approach for the Removal of Toxics from
Sugar Cane Bagasse Hemicellulosic Hydrolysate. Ind. Eng. Chem. Res., v. 53, n. 42, p. 16494–16501,
2014.
TIAN SQ, WANG XW, ZHAO RY. Effect of doping pretreated corn stover conditions on yield of
bioethanol in immobilized cell systems. Renew Energ. 2016;86:858–65.

6. AGRADECIMENTOS
Ao PPG-EQ/ UFSCar e às agências financiadoras CAPES, FAPESP (Processo FAPESP
2016/10.636-8) e CNPq (#409366/2016-1).