Diagrama de Flujo

1. Obtención de plasma sanguíneo.

Rotular un tubo eppendorf para

colectar plasma sanguíneo

Centrifugar por 2 minutas a 800

x g(1500 rpm) la muestra de
sangre heparinizada

Aspirar con la micropipeta el

plasma, sin distorsionar el pellet
celular

Recolectar el plasma en el tubo

eppendorf previamente rotulado

2. Aislamiento de ssRNA de HIV

Rotular un tubo de 15 ml para

asilar el ssRNA viral

Transferir 560 µ L del plasma

al tubo rotulado.

Agregar 2,240 µ L de buffer de

lisis viral que incluye RNA
carrier para facilitar la
precipitación del RNA viral.

Mezclar energéticamente y
luego incubar por 10 minutos a
temperatura ambiente

Mezclar enérgicamente, para

Agregar
luego cargar la µmezcla
2,240 L de etanol
a la
absoluto para precipitar el RNA
columna y después centrifugar Luego eliminar el filtrado
durante un minuto a 6000 x
g(8000rpm)
 Lavar la columna con 500 µ L de
buffer lavado

Centrifugar durante un minuto a

6000 x g(8000rpm)
Luego eliminar el filtrado

Cuantificar el RNA aislado en

función de su absorbancia a 260
nm según la formula:
ssRNA(µ g/ml)= 40 x A260

Almacenar el RNA a –80ºC

3. Transcripción reversa

Rotular un tubo eppendorf para

realizar la transcripción reversa

Agregar 2 µ L de buffer RT, 2

µ L de dNTP 5 mM cada uno, 2 Se agrega el inhibidor
µ L de oligo dT 10 µ M, 1 µ L de RNAsa para impedir
de inhibidor RNAsa 10 U/µ L, 1 que no se copie
µ L transcriptasa reversa completo
sensiscript, 8µ L de agua libre de
nucleasas

Agregar 4 µ L de ssRNA
Incubar
(volumen 1 hora
final a2037ºC,
µ L)para luego
calentar la muestra durante 5
minutos a 93ºC y enfriarla
rapidamente en hielo para
inactivar a la transcriptasa reversa

Almacenar el cDNA a –80ºC

4. PCR

Rotular un tubo eppendorf para No incluye el DNA

preparar Master Mix templado

Preparar Master Mix agregando al

tubo eppendorf los siguientes
volúmenes de reactivos: 13 µ L
de H20 libre de nucleasas; 2 µ L
de MgCl 25 mM; 2.5 µ L de
partidores F + R 5µ M cada uno;
2.5 µ L Master LC

Preparar las mezclas de reacción,

agregando a los 2 capilares los Después de agregar el DNA
volúmenes de reactivos indicados templado tapar el capilar y
en la tabla 1. eliminar la punta utilizada
para evitar contaminaciones.

Introducir capilares en el
termociclador programado de la
manera indicada en la tabla 2

Observar el curso temporal de la

reacción de PCR y luego obtener
Estimar
el Tm dellaamplicón
carga viral de la
muestra problema comparando
con la curva estándar que se
Comparar en
encuentra el Tm empírico
la figura 4 y con el
Tm teórico deltodas
considerando amplicón
las diluciones
hechas durante el aislamiento y la
trascripción reversa

Recuperar las muestras

amplificadas y luego determinar
el tamaño de los amplicónes por
análisis electroforético.
5. Análisis Electroforético

Preparar 30 ml Agarosa 2%(p/v)

en TAE

Hervir agarosa y luego verter la

agarosa liquida en la cámara de
electroforesis.

Colocar peinetas para formar

pocillos donde se cargarán las
muestras

Dejar gelificar agarosa a

temperatura ambiente.

Mezclar 10 µ L de cada reacción

de PCR con 2 µ L de buffer de
carga.

Cargar 10 µ L en los pocillos del

gel, registrando su ubicación.
Luego
Aplicarcerrar
campo la electrico
cámara de fijando la
electroforesis
corriente en 60 mA
aproximadamente. 100 V

Correr electroforesis hasta que

frente de corrida llegue al final
del gel (aproximadamente 45
minutos)

Teñir gel de agarosa con bromuro

de etidio, para luego observar el
gel en el transiluminador, bajo luz
UV
 Estimar tamaño relativo del
amplicón.

Comparar tamaño empírico con

tamaño teórico

Con los datos de Tm y tamaño,

elaborar un putativo diagnóstico
del paciente.

Tabla 1.
Capilar Master Mix Muestra
Control Negativo 8µ L 2 µ L agua libre nucleasas
Control Positivo 8µ L 2 µ L cDNA HIV
Muestra 8µ L 2 µ L cDNA muestra problema

Tabla 2.

Nº de ciclos. Temperatura (ºC) Tiempo (segundos) Etapas

1 95 10 minutos Activación de la
DNA Polimerasa
40 (amplificación) 95 5 denaturación.
71 10 apareamiento.
62 5 elongación.
1 (análisis Tm) 95 0
65 15 denaturación gradual.
95 0
Figura 4