expresión

expresión heteróloga
heteróloga de
de proteínas
proteínas
1. Gen de interés
Es aquel que codifica la proteína de interés, el cual será ubicado
en el vector con el fin de facilitar su incorporación al sistema de
expresión.
Se le pueden hacer modificaciones si se considera necesario.

Proyecto
2. Sistema de expresión
Organismo (bacteria en nuestro caso) que contendrá el vector (un plásmido en
Educativo
nuestro caso) Todos los seres vivos tienen miles de
proteínas con estructuras y funciones
El sistema de expresión utilizado: una cepa de Escherichia Coli K1202,
diferentes.
En cuanto al plásmido, éste será pGLO™, compuesto por: un ORI, el gen bla, el
gen araC y el gen GFP. Muchas de estas proteínas se utilizan con
fines terapéuticos, como vacunas, o en
Marcador de selección industrias.
El marcador de selección es el cual le da una característica Su producción a gran escala y segura se
biológica al sistema de expresión de manera de poder comprobar ha logrado gracias a la producción de
si el vector fue incorporado. En nuestro caso se utilizó el gen bla. proteínas recombinantes, que son proteí-
nas a partir de una especie que no la
producía de manera original.
Para eso se genera el proceso explicado
3.Detección de expresión tras el cual se lograría insertar un gen
heterólogo en el ADN de un ser y que
Una vez comprobado la incorporación del plásmido, se debe comprobar si el gen sintetice la proteína de interés.
de interés es capaz de ser sintetizado por el sistema de expresión.
La separación y purificación de proteínas son necesarias para llevar a cabo el Desde la orientación de química se
estudio y caracterización de la totalidad de las proteínas de los sistemas biológi- decidió vincular las materias “Genética”
cos. Para ello, éstas deben ser separadas selectivamente a partir de muestras y “Laboratorio III” bajo el eje de producir
complejas mediante un procedimiento de fraccionamiento adecuado. Los méto- y purificar proteínas recombinantes
dos de separación se basan en diferentes características de las proteínas tales abordando tanto los aspectos teóricos
como solubilidad, tamaño o carga, entre otras. como prácticos tales como el concepto
Electroforesis de “gen” y su importancia, los procesos
de replicación, transcripción y traduc-
La electroforesis es una metodología separativa de uso habitual ción, y el funcionamiento de la expre-
en el laboratorio. En líneas generales, esta técnica se fundamen- sión heteróloga de proteínas.
ta en la separación de macromoléculas cargadas en un campo
eléctrico debido a la movilidad diferencial derivada de la relación Más allá de su relevancia en la actuali-
carga, forma y peso que posee cada macromolécula en cuestión. En este dad de las ciencias biológicas/bioquími-
ensayo, la electroforesis será de proteínas, dado que lo que buscamos es com- cas/ingenierías genéticas,
probar la expresión de la GFP. Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilami- la biotecnología es una gran manera de
da en condiciones desnaturalizantes, llamado SDS-PAGE, al desnaturalizarlas las plantear en modo de “vida real” aprendi-
proteínas se vuelven lineales, de esta manera la separación se basará únicamen- zajes sin tener que cuestionar la utilidad
te en el peso molecular de cada molécula. de estos conocimientos.
Se puede plantear en:
La utilización de proteínas recombi-
4. Transformación nantes en vacunas, hormonas de
En este proceso se intenta la absorción del plásmido por parte de la bacteria, lo crecimiento y hasta algo tan familiar
cual logramos generando un ambiente desestabilizante para el organismo tal como la producción de insulina.
como un choque térmico. También te permite emplazar a la
A grandes rasgos, se compone de agregar el plásmido seleccionado a un medio electroforesis, siendo ésta una técni-
con solución de transformación y las bacterias ya añadidas. Hacerlas pasar por un ca de enorme relevancia profesional,
choque térmico en el cual se busca desestabilizar a las bacterias, aumentando las por ejemplo, en el área de diagnósti-
posibilidades de que incorporen el plásmido. Luego se las nutre con caldo LB para cos, separando fragmentos de ADN
compensar el tratamiento anterior y finalmente se siembra en placas de petri para durante pruebas de paternidad y
posteriormente poder comprobar resultados. enfermedades hereditarias.

Poder enseñar este tema en el aula y

posteriormente llevar a cabo lo apren-
5. Purificación dido, genera en el alumno una sensa-
ción de importancia y potencialidad,
El paso de purificación es necesario para la producción industrial que después se puede plasmar tanto
de la proteína. En el comienzo, este debe llevarse a cabo aumen- en la comprensión del tema como en
tando lentamente la escala de producción verificando la viabilidad futuros trabajos profesionales en los
del proceso. que se pueda explotar estos conoci-
mientos incorporados.

El gen araC codifica para la proteína AraC

AraC: proteína reguladora de Mutación:
Operón Arabinosa(inducible) Se cambian los genes AraB, AraA y AraD por GFP
En naturaleza: 1.Arabinosa en el medio
1.Arabinosa en el medio 2.Se expresa el gen AraC, el cual sintetiza prot AraC
2.Se expresa el gen AraC, el cual sintetiza 3.AraC se une al operador del Operón Arabinosa
proteína AraC 4.Se expresa el gen GFP
3.AraC se une al operador del Operón Arabinosa 5.Se sintetiza GFP
4.Se expresan los genes
araC
Green fluorescent protein
Peso molecular: 27 kda, 239 aa.
Origen natural: medusa Aequorea Victoria.
Fluoróforo: Ser - Tyr - Gly.
ori pGLO En naturaleza: Forma complejo con la proteína
aequorina:
1. Estímulo externo
El origen de replicación es lo 2. Aumenta calcio
que le da la característica de 3. Aumenta nivel de energía de aequorina
heredable al plásmido 4. Transferencia de energía a GFP
bla GFP 5. Aumenta energía de GFP
6.GFP fluoresce para descargarse.
El gen bla codifica para la enzima In vitro: Se excita al GFP con luz U.V.
β-lactamasa, que degrada ampicilina Energía de emisión= 509μm
Al ser expuestas a un medio que contiene Energía de excitación=395μm
ampicilina, las betalactamasas inactivan la Se modifica la cadena de aa:
ampicilina presente, permitiendo el Met154Thr; Phe100Ser; Val164Ala.
crecimiento bacteriano. Únicamente las (Cambios para disminuir
bacterias transformadas con el plásmido y hidrofobicidad)
que expresan las betalactamasas
sobrevivirán.