Tema 4 ST PDF

TÉCNICAS
INSTRUMENTALES –
BIOTECNOLOGÍA
TÉCNICAS INSTRUMENTALES
APLICADAS A LA BIOTECNOLOGÍA
TEMA 4.- Espectroscopia de
absorción electrónica (UV-Vis)
Prof. Ángel Orte Gutiérrez

Prof. María José Ruedas Rama
Departamento de Fisicoquímica
Facultad de Farmacia
Universidad de Granada
CC BY-SA 4.0
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TEMA 4.- Espectroscopia de absorción

electrónica (UV-Vis)
1.  Región UV-visible.
2.  Espectros electrónicos: estructura de vibración de las bandas electrónicas.
3.  Intensidad de las bandas: Principio de Franck-Condon
4.  Tránsitos electrónicos en las moléculas poliatómicas.
5.  Efecto del disolvente.
6.  Grupos cromóforos y auxocromos.
7.  Instrumentación.
8.  Aplicaciones:
1.  Determinaciones cuantitativas
2.  Determinación del pKa de colorantes
3.  Estudios cinéticos.
9.  Espectros UV-Vis de biopolímeros:
1.  Proteínas
2.  Ácidos nucleicos.
10. Dispersión rotatoria óptica.
11. Dicroismo circular
1.  Estructura de biomoléculas
Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

María J. Ruedas Rama – UGR CC BY-SA 4.0 1
TÉCNICAS INSTRUMENTALES –
BIOTECNOLOGÍA
1.- Región UV-visible

•  La región UV-Vis del espectro electromagnético incluye radiaciones de:
•  Ultravioleta: 10-400 nm
- UV lejano o de vacio: 10-185 nm (absorbe el O2)
- UV cercano: 185-400 nm
•  Visible: : 400-780 nm
- Radiaciones que el ojo humano puede detectar
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BY-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-
sa/3.0)]], via Wikimedia Commons
By Meganbeckett27 (Own work) [CC BY-SA 3.0 (http://

creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons
2.- Espectros electrónicos: estructura de

vibración de las bandas electrónicas
•  Las transiciones electrónicas suelen ir acompañadas de cambios entre niveles vibracionales
•  Los saltos espectroscópicos de E’’electr a E’electr pueden suponer variaciones (v’’-v’): 0-0, 0-1,
0-2, etc..
Niveles vibracionales Estructura
del estado excitado vibracional
(v’)
E’electr
Niveles vibracionales
del estado E’’electr
fundamental (v’’) 0-0 0-1 0-2 0-3 …

BIOTECNOLOGÍA
3.- Intensidad de las bandas: Principio

de Franck-Condon
•  La intensidad de las bandas de absorción entre diferentes niveles vibracionales no es la
misma y está regida por el principio de Franck-Condon.
•  La distancia internuclear en un momento dado no es
conocida, aunque los cálculos desarrollados por Condon
permiten conocer la probabilidad de que dicha distancia
tenga un valor determinado.
•  transiciones electrónicas más intensas -> entre

estados de máxima probabilidad.
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(http://creativecommons.org/licenses/by-sa/2.5-2.0-1.0)],
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de Franck-Condon
•  Según el principio de Franck-Condon:
•  Un salto electrónico tiene lugar a distancia
internuclear constante.
r’>r’’
El espectro de absorción
tendrá esta forma:
La transición 0à4 es la más
probable (y más intensa)

BIOTECNOLOGÍA

de Franck-Condon
•  La intensidad de las transiciones dependerá de la posición relativa de la curva de energía
potencial del estado electrónico excitado. Se pueden distinguir dos casos generales:
1. Caso1: rfundamental ~ rexcitado
Forma del espectro:
La transición más
0è2
probable será la
0à0
Energía
0è0
0è0
0è1
0è2
Eè Bandas finas
requi Distancia internuclear

de Franck-Condon
•  La intensidad de las transiciones dependerá de la posición relativa de la curva de energía
potencial del estado electrónico excitado. Se pueden distinguir dos casos generales:
2. Caso 2: rfundamental < rexcitado
Forma del espectro:
La transición más
probable será la
0à0
Energía
0è2
0è2
0è1 0è3
Bandas anchas
0è0 0è4
Eè
requi Distancia internuclear

BIOTECNOLOGÍA

de Franck-Condon
rfun ~ rex rfun < rex
4.- Tránsitos electrónicos en las

moléculas poliatómicas
•  La absorción de radiación UV-vis es un proceso en dos etapas:
1)  Excitación electrónica: M+hνàM*
2)  Relajación:
- Disipa energía en forma de calor: M*à M + calor
- Emite algún tipo de radiación (fluorescencia y fosforescencia): M*à M+hν’
•  La absorción de la radiación UV-vis origina transiciones de los e- de los enlaces de las

moléculas, por lo que pueden dar información sobre los tipos de grupos funcionales.

•  Existen diferentes tipos de transiciones:
- Implican electrones π, σ y n
- Implican electrones d y f
Energía
- Implican electrones de transferencia de carga

•  Nos centraremos únicamente en la absorción de moléculas orgánicas, por tanto, el

tipo de transiciones que originan estas moléculas son transiciones de electrones π, σ y
n.

BIOTECNOLOGÍA

Tipos de electrones absorbentes
•  En las moléculas orgánicas hay dos tipos de e- que contribuyen a la absorción:
1) e- enlazantes
2) e- no enlazantes
•  orbitales moleculares
•  OM enlazante
•  OM antienlazante

antienlazante
E
enlazante

Tipos de electrones absorbentes
Electrones n
•  Los enlaces sencillos originan orbitales σ
•  Los dobles y triples enlaces originan orbitales π
•  Los e- que no participan en los enlaces se
By DynaBlast
denominan e- no enlazantes (e- n)

Electrones σ Las energías de los orbitales moleculares se
representan en el siguiente esquema:
σ* antienlazante
π* antienlazante
σàσ*
nàσ*
nàπ*
πàπ*
Electrones π
Energía
n no enlazante
π enlazante
By Chem507f10grp4 (Own work) [Public domain], via Wikimedia Commons σ enlazante

BIOTECNOLOGÍA

1) Transiciones σàσ* σ* antienlazante
π* antienlazante
σàσ*
nàσ*
nàπ*
πàπ*
Energía
n no enlazante
π enlazante
σ enlazante
2) Transiciones nàσ* Compuesto λmax (nm) εmax (M–1 cm–1)
H2O 167 1480
CH3OH 184 150
CH3Cl 173 200
CH3I 258 365
(CH3)2S 229 140
(CH3)2O 184 2520
CH3NH2 215 600
(CH3)3N 227 900

3) y 4) Transiciones nàπ* y πàπ*
•  πàπ* se observan en el UV próximo (200-300 nm)
•  nàπ* en UV próximo-Visible (200-700 nm)
•  Ambas transiciones requieren la presencia de un grupo insaturado (dobles o triples enlaces)
que suministre los orbitales π (cromóforos).
•  Las absortividades molares de estas bandas son:
-Transiciones nàπ*: bajas (10-100 M-1cm-1)
-Transiciones πàπ*: mayores (1000-10000 M-1cm-1) antienlazante
σ*
π* antienlazante
πàπ*
σàσ*
nàσ*
nàπ*
UV vacío UV próximo Visible

çE
Energía
èλ
π è π* n no enlazante
n è π* n è π* π enlazante
σ è σ*
σ enlazante
n è σ*
100 200 300 400 500 600 700 800 λ (nm)

BIOTECNOLOGÍA
5.- Efecto del disolvente

•  El espectro de absorción es característico de las moléculas aisladas, y cuando estás se
encuentran en estado gaseoso se pueden observar detalles muy pequeños de los tránsitos
electrónicos, e incluso de los tránsitos entre niveles vibracionales de cada nivel electrónico.
•  Sin embargo, cuando la sustancia está disuelta en un disolvente se producen una serie
efectos:
1)  se pierden detalles de la estructura

vibracional de los espectros de absorción
5.- Efecto del disolvente

•  Sin embargo, cuando la sustancia está disuelta en un disolvente se producen una serie
efectos: σ*
antienlazante
2) Se producen desplazamientos de las bandas de π* antienlazante

πàπ*
σàσ*
nàσ*
nàπ*
absorción que permiten distinguir entre tránsitos

Energía
electrónicos nàπ* y πàπ*: n no enlazante

•  los tránsitos nàπ* se desplazan a menores λ (hacia π enlazante
el azul, o efecto hipsocrómico).
enlazante
•  los tránsitos πàπ* se desplazan a mayores λ (hacia σ
el rojo, o efecto batocrómico). πà π*

•  Estos desplazamientos serán mayores al aumentar la I . Heptano
II. Etanol
polaridad del disolvente.
III. Agua
Aumento
de
polaridad
nà π*

BIOTECNOLOGÍA
6.- Grupos cromóforos y auxocromos

Cromóforos orgánicos

Efecto de la conjugación de cromóforos:
antienlazante
•  El efecto de la deslocalización es σ*
rebajar en nivel de energía del π* antienlazante

πàπ*
σàσ*
nàσ*
orbital π* -> desplazamiento

nàπ*
Energía
batocrómico no enlazante
n
π enlazante
σ enlazante
•  Los cromóforos deben estar separados unos de otros por un enlace sencillo (Ejemplo tabla:
dieno conjugado y no conjugado).
•  A mayor número de dobles enlaces conjugados, el desplazamiento hacia el rojo es mayor.
•  Algo similar ocurre si se conjuga un carbonilo (C=O) y un doble enlace C=C.

BIOTECNOLOGÍA

Absorción de sistemas aromáticos y auxocromos:
•  Los espectros UV de los compuestos aromáticos se caracterizan por tres grupos de bandas
que se originan a partir de transiciones πàπ*
Ejemplo: Benceno
1)  Banda fuerte a 184 nm
2)  Banda más débil (E2) a 204 nm
3)  Banda aun más débil (Banda B) a 256 nm.
•  Sin embargo, la presencia de sustituyentes en el anillo puede producir desplazamientos de
los máximos de estas bandas de absorción.

Absorción de sistemas aromáticos y auxocromos:
•  Auxocromos
•  desplazar los picos de los cromóforos hacia λ mayores y aumentar sus intensidades.
•  tienen al menos un par de electrones n.
Ejemplos auxocromos: grupos -OH y -NH2 sobre el benceno:

antienlazante
σ*
π* antienlazante
πàπ*
σàσ*
nàσ*
nàπ*
Energía
n no enlazante
π enlazante
σ enlazante

BIOTECNOLOGÍA
7.- Instrumentación
•  Los diferentes tipos de un instrumento, y configuraciones instrumentales, para la
espectroscopia de absorción UV-vis se corresponden con los tipos generales tratados en el
tema 1 (repasar punto 8, tema 1).
Tipos de instrumentos
•  Fotómetros: Instrumentos básicos, que no hacen barridos del espectro, ya que solo emplean
filtros para la selección de la longitud de onda.
•  Espectrofotómetros: La selección de onda se realiza con monocromadores, por lo que se
pueden realizar barridos el espectro completo.
Configuraciones de espectrofotómetros
•  Espectrofotómetro de haz simple:
From UC Davis ChemWiki [CC-BY-NC-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0)]
7.- Instrumentación
Configuraciones de espectrofotómetros
•  Espectrofotómetro de doble haz:
•  Espectrofotómetro de óptica invertida o multicanal (diode array):
From UC Davis ChemWiki [CC-BY-NC-SA-3.0

(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0)]

BIOTECNOLOGÍA
8.- Aplicaciones
8.1.- Determinaciones cuantitativas
•  Una de las principales aplicaciones de la técnica de absorción electrónica UV-vis es la
posibilidad de realizar determinaciones cuantitativas de las moléculas orgánicas.
•  Para su aplicación al análisis cuantitativo se hace uso de la ley de Lambert-Beer.
A = abc
Intensidad
A (Absorbancia)
de la señal
Muestra
c0 c1 c2 c3 c4 c c c c c c
Concentración
5 6 7 8 9
Concentración de E
10
8.- Aplicaciones
•  Además, se pueden realizar determinaciones cuantitativas de varias sustancias en una
mezcla. Si no hay interacción entre las sustancias de la mezcla se cumple que:
Atotal = A1 + A2 +….+ An = ε1bc1 + ε2bc2 + ……+ εnbcn
•  Para calcular la concentración de los componentes de la mezcla hay que realizar
medidas a tantas λ como componentes tenga la mezcla.
Ejemplo: Mezcla de las sustancias M y N
A’ = AM + AN = ε’MbcM + ε’NbcN (a λ’)

A’’ = AM + AN = ε’’MbcM + ε’’NbcN (a λ’’)

BIOTECNOLOGÍA
8.- Aplicaciones
AUTOEVALUACIÓN
1. Una determinación simultánea de cobalto y níquel se puede basar en la absorción
simultánea de sus respectivos complejos de 8-hidroxiquinolinol. Las absortividades
molares correspondientes a sus máximos de absorción son:

Absortividad molar, ε (cm-1 M-1)

365 nm 700 nm
Co 3529 428.9
Ni 3228 10.2

Calcular la concentración molar de níquel y cobalto en cada una de las siguientes
disoluciones basándose en los datos siguientes:
Absorbancia, A (cubetas de 1 cm)
Disolución
365 nm 700 nm
(a) 0.598 0.039
(b) 0.902 0.072
SOL: Disolución (a): [Co]= 8.88×10-5 M; [Ni]= 8.82×10-5 M

Disolución (b): [Co]= 1.65×10-4 M; [Ni]= 9.90×10-5 M
8.- Aplicaciones
8.2.- Determinación del pKa de colorantes
•  Los colorantes son indicadores ácido-base que cumplen el equilibrio:
Forma ácida
InH D In- + H+ [H+] [In-]
(un color, una λmax)
Forma básica Ka =
(otro color, otra λmax) [InH]
In- pH = pKa + log ([In-]/[HIn])
•  Distintas disoluciones de la misma concentración del
Rojo de fenol indicador pero a diferentes valores de pH tendrán
In- diferentes proporciones de las especies ácida y básica, y
por tanto diferentes absorbancias.
Ejemplo: Rojo de •  Midiendo la absorbancia a la longitud de onda máxima
fenol de una de las especies (por ejemplo, la básica), y
representándola frente al pH se obtiene una curva cuyo
punto de inflexión permite obtener el valor del pKa.
InH
InH
λ=558 nm

pKa
pH

BIOTECNOLOGÍA
8.- Aplicaciones
8.3.- Estudios cinéticos
•  Se puede estudiar la cinética de diferentes reacciones y procesos mediante la medida de la
absorbancia de alguno de los reactivos o productos.
•  La cinética se puede seguir observando como se va formando uno de los productos o como
se va descomponiendo uno de los reactivos.
•  Algunos ejemplos pueden ser el seguimiento de reacciones de degradación de fármacos,
seguimiento de procesos como fermentaciones, oxidación de compuestos, etc
•  Ejemplo: Hidrólisis del ácido acetilsalicílico: ácido
λ=296 nm salicílico
ácido acetilsalicílico ácido salicílico

A296nm
Ácido Salicílico
ácido
Ácido Acetilsalicílico acetilsalicílico
Tiempo
9.- Espectros UV-Vis de biopolímeros:

9.1.- Proteínas
•  Las proteínas están formadas por diferentes aminoácidos unidos mediante enlace
peptídicos.
•  Por tanto, las proteínas poseen diferentes tipos de enlaces que pueden originar diferentes
tipos de transiciones en la zona UV-visible: (1) el enlace peptídico, que absorbe alrededor de
200 nm; (2) los cromóforos de los aminoácidos aromáticos que absorben entre 230-300 nm;
y (3) si existen grupos prostéticos, estos absorben en la zona del visible.
Aminoácido 1 Aminoácido 2
Enlace peptídico: ~200 nm
Aminoácidos aromáticos:
230-300 nm
Grupos prostéticos
Enlace Peptídico

BIOTECNOLOGÍA

9.1.- Proteínas
•  Los tres aminoácidos aromáticos, fenilalanina, tirosina y triptófano, poseen cromóforos
absorben entre 230-300 nm, siendo el triptófano el de mayor absortividad molar.
•  Conociendo la secuencia de aminoácidos de una proteína se puede saber el número de
triptófanos que contiene, y por tanto, se puede conocer el valor de su absortividad molar a
280 nm (ε280).
•  Así, empleando la ley de Lambert-Beer, se puede conocer la concentración de una proteína
a partir del valor de su absorbancia a 280 nm.
A 280 = ε280bc
Aminoácidos
aromáticos:
Fenilalanina Tirosina Triptófano

9.1.- Proteínas
•  Además, la concentración de proteínas de una muestra también puede obtenerse tras
hacerlas reaccionar con reactivos específicos para formar complejos coloreados, y así medir
su absorbancia en la región visible.
•  Algunos de estos métodos son el método Biuret, el método Lowry, y el método de
Bradford.
1) Método Biuret: Es poco sensible. Se basa en la formación de un complejo coloreado
entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces peptídicos en medio básico. Se mide la
absorbancia a 545 nm.
2) Método Lowry: Es muy sensible y consiste en dos pasos:
-  Reacción previa de la proteína con Cu2+ en medio alcalino, en presencia de tartrato.
-  Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles.
El producto final de estas reacciones es un complejo azul que presenta dos máximos de
absorción a 560 y a 680 nm.
3) Método de Bradford: Es muy sensible. Se basa en la unión de las proteínas con el
colorante azul de Coomassie, que al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de
una proteína origina un color azul intenso. Se mide la absorbancia a 595 nm.
•  Cuando las muestras son mezclas biológicas complejas se suele realizar la recta de
calibrado con alguna proteína comercial, como es la seroalbumina bovina.

BIOTECNOLOGÍA

9.1.- Proteínas
AUTOEVALUACIÓN
2. Se prepara una disolución de una proteína de 17500 Dalton, partiendo de 5 mg de
proteína pura y diluyendo hasta 50 mL de agua destilada. La absorbancia de esta
disolución a 280 nm, usando una cubeta de 1 cm de grosor, es de 0.24. Calcular el
valor de la absortividad molar de la proteína a 280 nm.
SOL. 42000 M-1 cm-1


9.1.- Proteínas
AUTOEVALUACIÓN
3. Se pretende calcular la concentración de una muestra problema de una proteína
empleando el método de Bradford. Para ello, se hace reaccionar la proteína con el
reactivo azul de Coomassie originándose un complejo de color azul. Se preparan
diferentes disoluciones de la proteína pura pesando las cantidades que se muestran
en la tabla, y llevándolas hasta 50 mL con agua destilada. Las absorbancias de estas
disoluciones a 595 nm también se anotaron en la tabla.
a) Realizar la recta de calibrado y obtener por mínimos cuadrados la ecuación de la
recta que mejor se ajuste a los datos experimentales.
b) Calcular los µg de proteína que contiene una disolución de 100 mL, cuya
absorbancia a 595 nm (tras hacerla reaccionar con la misma cantidad del reactivo azul
de Coomassie) es de 0.685.
Proteína (µg) A595
SOL. (b) 35.8 µg
0 0.266
4.44 0.354
9.36 0.476
18.72 0.683
28.08 0.886
37.44 1.028

BIOTECNOLOGÍA

9.2.- Ácidos nucleicos
•  Los ácidos nucleicos están formados por la unión de nucleótidos, que a
su vez constan de un grupo fosfato, una pentosa, y una base nitrogenada.
•  Las bases nitrogenadas también poseen grupos cromóforos que
proporcionan orbitales π, por lo que los ácidos nucleicos también
absorben en la región del UV. En concreto, los espectros UV de purinas y
pirimidinas presentan máximos a ∼260 nm y altos valores de ε.
•  Por tanto, conociendo la secuencia de nucleótidos también se puede
conocer el valor de ε260, lo que permite su cuantificación empleando el
valor de la absorbancia a 260 nm.
A 260 = ε260bc
Bases púricas
Bases pirimidínicas

Cadena sencilla
0.10 de ADN
•  Además, la absorbancia (la absortividad molar a 90 °C
260 nm) de los nucleótidos en las cadenas sencillas 0.08
es mayor que la correspondiente cuando las Temperatura
Absorbance
cadenas se encuentran hibridadas para formar la 0.06 Cadena doble

doble hélice. de ADN 20 °C
•  Así, mediante medidas de la absorbancia a 260 0.04
nm se puede detectar la deshibridación de dobles

0.02
cadenas de ácidos nucleicos, y calcular la
temperatura a la cual se separan dichas cadenas. 0.00
260 280 300 320
Wavelength (nm)
λ=260 nm
Temperatura a
la que se
separan las
cadenas
Temperatura

BIOTECNOLOGÍA

AUTOEVALUACIÓN
4. Un oligonucleótido correspondiente a una secuencia de ADN de un patógeno tiene un
valor de absortividad molar a 260 nm de 249930 M-1 cm-1. Una disolución problema
del oligonucleótido mostró una absorbancia de 0.144 cuando se midió en una cubeta
de 1.5 cm de grosor. Si el volumen de disolución es de 25 mL, ¿que masa de
oligonucleótido contenía la disolución?
Datos: Masa molar del oligonucleótido = 8302.42 g mol-1.
SOL. 7.97 × 10-5 M

5. Para calcular la temperatura a la que se separan las dos cadenas de una muestra de
ADN previamente hibridado se prepara una disolución de 1.2 µM de un
oligonucleótido que contiene 28 pares de bases. A continuación se mide la
absorbancia a 260 nm de esta disolución a diferentes temperaturas. Los valores de
absorbancia y las temperaturas se anotaron en la siguiente tabla.
Calcular la temperatura a la que deshibridan las dos cadenas complementarias.
SOL. 55 °C
T (°C) 20 30 40 50 60 70 80 90
A260 0.168 0.169 0.170 0.180 0.193 0.203 0.205 0.205
10.- Dispersión rotatoria óptica

Polarización de la radiación
•  El plano del campo eléctrico de la radiación electromagnética se denomina plano de
polarización.
•  La radiación natural no está polarizada, existe una distribución aleatoria de planos de
polarización.
•  Luz linealmente polarizada:
•  Contiene un único plano de polarización.
Múltiples
planos de
polarización
Radiación no
polarizada
1 única dirección
Luz polarizada de polarización

BIOTECNOLOGÍA


Luz polarizada
en el plano
horizontal
Luz polarizada
en el plano
vertical
Tutorial interactivo de polarización y dicroismo circular: Por Andras Szilagyi (http://cddemo.szialab.org)

•  Las sustancias y materiales con actividad óptica son aquellos capaces de girar el plano de la
luz polarizada, cuando ésta los atraviesa.
•  Ejemplos de estas sustancias son los azucares y minerales como el cuarzo.
Plano de
polarización de Plano de
entrada polarización de
salida

BIOTECNOLOGÍA

Actividad óptica
•  Las sustancias con actividad óptica son aquellas que poseen quiralidad:
•  Los centros quirales son centros asimétricos que generan enantiómeros (o isómeros
ópticos):
•  Los enantiómeros tienen la misma estructura química, pero son imágenes
especulares uno del otro, siendo éstas no superponibles.
•  En moléculas orgánicas, se genera un centro quiral cuando existe un átomo de
carbono sustituido con cuatro sustituyentes diferentes.
•  Los azúcares y aminoácidos son ejemplos de moléculas quirales.

•  Los enantiómeros, según su efecto
sobre el plano de la luz polarizada,
pueden ser:
•  Dextrorrotatorios (+): Giran el
plano de la luz polarizada en el
sentido de las agujas del reloj.
•  Levorrotatorios (–): Giran el
plano de la luz polarizada en el
sentido de las agujas del reloj.
Enantiómeros de un aminoácido modelo

•  El instrumento de medida de la dispersión rotatoria óptica (o polarimetría) se denomina
polarímetro, y consta de los siguientes componentes:
•  Fuente de radiación
•  Polarizador
•  Compartimento de muestra
•  Analizador de polarización
•  Detector de radiación
By Antonpaar (Own work) [CC BY-SA 3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)], via Wikimedia Commons

BIOTECNOLOGÍA

•  El ángulo de rotación del plano de polarización, α, depende de los siguientes factores:
•  La longitud de onda de la radiación.
•  De la temperatura.
•  De la concentración de la sustancia con actividad óptica.
•  De hecho, el ángulo de rotación del plano de polarización, α, cumple una ley muy similar a la
ley de Beer:
α = [α ]Tλ·b·c
Valores de rotación específica a 20 °C con luz de 589 nm

Sustancia D-Fructosa D-Glucosa D-Lactosa Colesterol
[α]58920
–92° +52.7° +52.3° –31.5°
(dm–1 g–1 mL)
•  El uso de la rotación específica, y de esta ley de proporcionalidad ha permitido desarrollar

aplicaciones para la cuantificación de azúcares en la industria, determinación de glucosa en
sangre para diabetes, determinación de la pureza de mezclas de enantiómeros…
11.- Dicroísmo Circular

Polarización de la radiación II: Polarización circular
•  Radiación polarizada circularmente.
LCP
From UC Davis ChemWiki [CC-BY-NC-SA-3.0
(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0)]
•  La radiación polarizada circularmente puede tener dos sentidos diferentes, a lo largo del
eje de propagación:
•  A la derecha, en el sentido de las agujas del
reloj (RCP).
•  A la izquierda, en el sentido contrario a las
agujas del reloj (LCP).
RCP

BIOTECNOLOGÍA

Absorción de la radiación con polarización circular
•  Al igual que cualquier otra radiación, la radiación polarizada circular puede ser absorbida por
un medio.


Absorción de la radiación con polarización circular
•  Los compuestos ópticamente activos, con centros quirales estructurales o conformacionales,
tienen la propiedad de absorber de forma diferente la radiación RCP y LCP.
•  Esta propiedad es lo que se denomina dicroísmo circular.
Muestra con
actividad óptica
RCP
LCP

BIOTECNOLOGÍA

•  La espectroscopia de dicroísmo circular (CD) mide la diferencia de absorbancia de una
muestra cuando se emplea RCP o LCP.
ΔA = ALCP − ARCP
•  Aplicando la ley de Lambert-Beer:
ΔA = (ε LCP − εRCP ) ⋅b ⋅ c
•  Se define el dicroísmo circular molar, Δε:
Δε = ε LCP − εRCP

•  El espectro de dicroísmo circular de una sustancia es la representación de Δε frente a la
longitud de onda.
Telfer, S. G., T. M. McLean, et al. (2011). Dalton Trans 40(13): 3097-3108.

BIOTECNOLOGÍA

Medida del CD e instrumentación
•  Para entender cómo funcionan los espectrofotómetros de CD hay que ahondar en la
interacción de la materia con la radiación circularmente polarizada.
•  Un punto muy importante radica en que la superposición de dos ondas polarizadas

circularmente, cada una de ellas en un sentido de giro diferente, y con la misma intensidad de
campo eléctrico, produce una radiación linealmente polarizada:
Polarización
RCP LCP lineal

•  Para medir el CD de una sustancia -> radiación con polarización lineal.
•  sustancia ópticamente activa absorbe -> a la salida de la muestra la radiación tendrá
polarización elíptica.

•  La polarización elíptica surge por la
superposición de LCP y RCP de diferente
amplitud.
Polarización
RCP LCP elíptica
de menor
intensidad

BIOTECNOLOGÍA

•  La polarización elíptica surge por la superposición de LCP y RCP de diferente amplitud.


•  El espectro de CD se obtiene comúnmente en grados de elipticidad, θ.
•  La elipticidad de una elipse, θ, es el ángulo entre el punto de amplitud máxima y el punto
de amplitud mínima de la elipse.
•  En una medida de CD, la elipticidad está relacionada con el valor de ΔA según:
" ln10 %" 180 %

θ = ΔA $ '$ '
# 4 &# π &

•  En espectroscopia de CD se suele eliminar la dependencia
con la concentración, dividiendo por la concentración de la
sustancia (según la ley de Beer).
•  Así, se define la elipticidad molar, [θ], en función de la
diferencia Δε:
[θ ] = 3298 ⋅ Δε
•  Las unidades clásicas de [θ] son grado·cm2/dmol. El

factor de 3298 convierte todas las unidades de Δε, en las
unidades clásicas de CD.

BIOTECNOLOGÍA

AUTOEVALUACIÓN
6. Una sustancia quiral absorbe radiación UV de 264 nm de longitud de onda. Esta
sustancia presenta una absortividad molar de 24990 M-1 cm-1, cuando la radiación
está circularmente polarizada a la izquierda (LCP), y una absortividad molar de 23120
M-1 cm-1, cuando la radiación está polarizada circularmente a la derecha (RCP).
a) ¿Cuál es el valor de la elipticidad molar de esa sustancia?
b) ¿Cuál sería el valor de la elipticidad molar de la especie enantiomérica contraria?

SOL. a) [θ] = 6.17×106 grados·cm2 dmol–1; b) [θ] = –6.17×106 grados·cm2 dmol–1



BIOTECNOLOGÍA

•  Fuentes de radiación:
•  Lámparas de Xe refrigeradas: No pueden llegar a longitudes de onda inferiores a 190nm.
•  Radiación de sincrotrón: La radiación que surge de los aceleradores de partículas puede
alcanzar cualquier longitud de onda (desde radio hasta rayos γ).
•  Puede emplearse radiación de sincrotrón para expandir el espectro de CD al UV más
lejano, y obtener mayores intensidades para mayor sensibilidad.
Sincrotrón Lámpara Xe
Sincrotrón

•  Monocromador para seleccionar la longitud de onda.
•  Polarizador: obtiene radiación linealmente polarizada.
•  Modulador fotoelástico (PEM):
•  Descompone la radiación linealmente polarizada en sus dos componentes polarizadas
circularmente (LCP y RCP).
•  La radiación de salida va alternando en una determinada frecuencia (normalmente 50
kHz) entre LCP y RCP.
•  Purga de N2: Se emplea una purga del oxígeno del aire mediante
un flujo continuo de N2, para:
•  Evitar la interferencia del O2 en la absorbancia en el UV
lejano.
•  Evitar que la formación de ozono (O3) dañe la óptica del
equipo.
From UC Davis ChemWiki [CC-BY-NC-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0)] http://www.psfc.mit.edu/~yuh/MSE/hndpem90.pdf

BIOTECNOLOGÍA

•  Compartimento de muestra:
•  Las cubetas deben de ser de cuarzo, ya que el vidrio (de sílice, SiO2) absorbe en el UV.
•  Pueden emplearse cubetas rectangulares convencionales o bien cubetas cilíndricas.
•  Detector:
•  Cualquier detector de radiación con buena sensibilidad en el UV (fototubos
multiplicadores, detectores de diodos, etc…).
•  La radiación transmitida llega al detector con la misma modulación generada en el PEM.
El detector mide la intensidad relativa de cada una de las componentes, RCP y LCP, para
calcular la ΔA y la elipticidad, θ.

11.1.- Estructura de Biomoléculas

•  La estructura conformacional de macromoléculas, proteínas o ácidos nucleicos, dispone a los
grupos cromóforos en diferentes ambientes asimétricos (ej. hélices, láminas anti-paralelas,
etc…).
•  Esto hace que las transiciones con luz polarizada circular tengan diferente intensidad,
según la dirección de la polarización, y, por tanto, son estructuras activas en CD. La
quiralidad conformacional también es activa en CD.
•  El CD se puede emplear en el estudio de macromoléculas en diferentes aspectos:

•  Estructura de macromoléculas: contenido en estructura
secundaria (UV-lejano) y terciaria (UV-cercano), y grado de
movilidad de ciertos compuestos.
•  Transiciones estructurales: como por ejemplo procesos de
replegamiento y desplegamiento de estructuras desnaturalizadas y
nativas, respectivamente.
•  Cambios conformacionales inducidos por la unión de pequeñas
moléculas, como substratos, coenzimas, etc.

BIOTECNOLOGÍA


Estructura de proteínas
•  Las diferentes “clases” de estructura secundaria de proteínas poseen diferentes perfiles
espectrales característicos en el CD de UV-lejano (190-250 nm).
•  Las transiciones responsables de esta absorción en el UV-lejano son πgπ* y ngπ* de los
grupos amido de los enlaces peptídicos.
80000$
Elip%cidad)molar,)[θ])(deg)cm2)dmol–1))
60000$
α-hélice
40000$
Estructura 2ª Transiciones CD (190-250nm)
(+) 192 nm: (πgπ*)perpendicular 20000$
lámina β
α-hélice (–) 209 nm: (πgπ*)paralela ovillo estadístico
(–) 222 nm: (ngπ*) 0$
(–) 218 nm: (πgπ*)

lámina β !20000$
(+) 196 nm: (ngπ*)
(+) 212 nm: (πgπ*) !40000$
Ovillo estadístico
(–) 195 nm: (ngπ*)
!60000$
190$ 200$ 210$ 220$ 230$ 240$ 250$
λ)(nm))


•  Así, puede obtenerse el contenido de estructura secundaria de cada “clase” para cualquier
proteína mediante una combinación lineal de las estructuras conocidas, y análisis multivariante
de componentes.
[θ ]( λ ) = a ⋅ [θ ]αhél ( λ ) + b ⋅ [θ ]lamβ ( λ ) + c ⋅ [θ ]ovill ( λ )

•  A cada longitud de onda, λ, la elipticidad molar será una combinación lineal de las
contribuciones de cada tipo de estructura al total de la proteína.
•  Para ello, antes es necesario normalizar el valor de la elipticidad molar para hacerlo
independiente de la longitud de la cadena polipeptídica. Es decir, la elipticidad molar se divide
por el número de residuos (aminoácidos) de la cadena.
•  Actualmente existen varios programas de ordenador con diferentes algoritmos para analizar
los espectros de CD de proteínas, así como bases de datos de espectros de CD de diferentes
proteínas (PCDDB: the protein circular dichroism data bank).

BIOTECNOLOGÍA


•  Ejemplo: Estructura secundaria de la insulina
Estructura 2ª %
α-hélice 46.1%
lámina β 5.9%
Ovillo estadístico 27.5%
Otras (310-hélice) 11.8%
Otras 8.7%
From PCDDB: Whitmore, L., Woollett, B., Miles, A.J., Klose, D.P., Janes, R.W. and Wallace, B.A., Nucleic Acids Res. (2011) 39, D480-D486.
Insulin entry: Lees, J.G., Wien, F., Miles, A.J. & Wallace, B.A., Bioinformatics (2006) 22, 1955-1962


•  Otros usos del CD en proteínas:
•  Cambios conformacionales (plegamiento-desplegamiento)
•  Cambios en la estructura de mutaciones o interacciones con otras moléculas
•  En la región del UV-cercano (250-300 nm) las transiciones se deben a grupos aromáticos
de la fenilalanina, tirosina, triptófano, y puentes disulfuro de citosina. En esta región puede
obtenerse información sobre la estructura terciaria e interacciones con grupos prostéticos.
•  Ejemplo: pérdida de estructura secundaria (hélice) de la proteína de unión a maltosa –
citocromo b6, en presencia de un detergente (SDS: dodecilsulfato de sodio).
+ SDS MBP-b6
MBP-b6
+ SDS
Adapted from Michał A. Surma, Andrzej Szczepaniak, Jarosław Króliczewski [CC BY 2.5 (http://creativecommons.org/licenses/by/2.5)], via Wikimedia Commons

BIOTECNOLOGÍA


Estructura de ácidos nucleicos
•  Las estructuras helicoidales de los ácidos nucleicos también son conformaciones quirales, y
por tanto, activas en CD.
•  El espectro de CD ha permitido encontrar diferentes estructuras de los ácidos nucleicos:
•  B-DNA:
•  es la doble hélice convencional descrita por Watson y Crick (sentido de giro a la
derecha, dextrógira); la más común en la naturaleza.
•  A-DNA:
•  doble hélice dextrógira; más abierta, más ancha y corta que el B-DNA.
•  se encuentra en condiciones de deshidratación de la doble cadena e hibridaciones
DNA-RNA.
•  Z-DNA:
•  doble hélice levógira (sentido de giro
hacia la izquierda)
•  se encuentra en secuencias ricas en GC,
y durante la transcripción, formando
complejos con los ribosomas.
A-DNA B-DNA Z-DNA

Zephyris at the English language Wikipedia
[GFDL (http://www.gnu.org/copyleft/fdl.html)], from Wikimedia Commons


Estructura de ácidos nucleicos
α-hélice
•  El espectro de CD ha permitido encontrar A-DNA
diferentes estructuras de los ácidos nucleicos:
[θ]#(grado#cm2#dmol–1)#
•  Los perfiles de CD de las estructuras B-, A- y lámina β

Z-DNA son diferentes, por lo que puede ovillo estadístico
B-DNA
determinarse los cambios conformacionales
entre estas estructuras.
•  Igualmente, los estudios de CD en ácidos
Z-DNA
nucleicos permiten obtener:
•  Información sobre la hibridación o ruptura
de la doble cadena, por ejemplo, con la 220# 240# 260# 280# 300#
temperatura. Longitud#de#onda#/nm#
•  Cambios conformacionales provocados por la
unión de otras moléculas, como los h Temp.
intercaladores de DNA.
[θ]×10–3
h Temp.
longitud de onda (nm)

BIOTECNOLOGÍA
Bibliografía
•  Principios de análisis instrumental. 5ª Ed. D.A. Skoog, F.J. Holler, T.A. Nieman. Ed.
McGraw-Hill.
•  Methods in Molecular Biophysics. I.N. Serdyuk, N.R. Zaccai, J. Zaccai. Cambridge

University Press.

•  Recursos on-line de: UC Davis ChemWiki
•  https://chem.libretexts.org/LibreTexts/University_of_California_Davis


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TÉCNICAS

Prof. Ángel Orte Gutiérrez

TEMA 4.- Espectroscopia de absorción

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

1.- Región UV-visible

Modified from work by By Inductiveload, NASA [CC-

By Meganbeckett27 (Own work) [CC BY-SA 3.0 (http://

2.- Espectros electrónicos: estructura de

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

3.- Intensidad de las bandas: Principio

• transiciones electrónicas más intensas -> entre

By Mark M. Somoza (Own work) [CC BY-SA 2.5-2.0-1.0

3.- Intensidad de las bandas: Principio

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

3.- Intensidad de las bandas: Principio

1. Caso1: rfundamental ~ rexcitado

Forma del espectro:

requi Distancia internuclear

3.- Intensidad de las bandas: Principio

2. Caso 2: rfundamental < rexcitado

Forma del espectro:

requi Distancia internuclear

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

3.- Intensidad de las bandas: Principio

rfun ~ rex rfun < rex

4.- Tránsitos electrónicos en las

• La absorción de la radiación UV-vis origina transiciones de los e- de los enlaces de las

- Implican electrones de transferencia de carga

• Nos centraremos únicamente en la absorción de moléculas orgánicas, por tanto, el

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

4.- Tránsitos electrónicos en las

4.- Tránsitos electrónicos en las

By Chem507f10grp4 (Own work) [Public domain], via Wikimedia Commons σ enlazante

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

4.- Tránsitos electrónicos en las

4.- Tránsitos electrónicos en las

UV vacío UV próximo Visible

100 200 300 400 500 600 700 800 λ (nm)

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

5.- Efecto del disolvente

1) se pierden detalles de la estructura

5.- Efecto del disolvente

2) Se producen desplazamientos de las bandas de π* antienlazante

absorción que permiten distinguir entre tránsitos

electrónicos nàπ* y πàπ*: n no enlazante

el rojo, o efecto batocrómico). πà π*

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

6.- Grupos cromóforos y auxocromos

6.- Grupos cromóforos y auxocromos

rebajar en nivel de energía del π* antienlazante

orbital π* -> desplazamiento

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

6.- Grupos cromóforos y auxocromos

6.- Grupos cromóforos y auxocromos

Ejemplos auxocromos: grupos -OH y -NH2 sobre el benceno:

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

From UC Davis ChemWiki [CC-BY-NC-SA-3.0 (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0)]

• Espectrofotómetro de óptica invertida o multicanal (diode array):

From UC Davis ChemWiki [CC-BY-NC-SA-3.0

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

• Para su aplicación al análisis cuantitativo se hace uso de la ley de Lambert-Beer.

A’ = AM + AN = ε’MbcM + ε’NbcN (a λ’)

Profs. Ángel Orte Gutiérrez y

•  transiciones electrónicas más intensas -> entre

•  La absorción de la radiación UV-vis origina transiciones de los e- de los enlaces de las

•  Nos centraremos únicamente en la absorción de moléculas orgánicas, por tanto, el

1)  se pierden detalles de la estructura

•  Espectrofotómetro de óptica invertida o multicanal (diode array):

•  Para su aplicación al análisis cuantitativo se hace uso de la ley de Lambert-Beer.

•  Así, mediante medidas de la absorbancia a 260 0.04

•  El uso de la rotación específica, y de esta ley de proporcionalidad ha permitido desarrollar

•  Se define el dicroísmo circular molar, Δε:

•  Un punto muy importante radica en que la superposición de dos ondas polarizadas

•  Las unidades clásicas de [θ] son grado·cm2/dmol. El

•  El CD se puede emplear en el estudio de macromoléculas en diferentes aspectos: