UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA

CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS

CURSO DE BACHARELADO EM MEDICINA VETERINÁRIA

RAIANE GALES MACEDO

Relatório de Estágio Curricular Supervisionado em Microbiologia

Veterinária

Boa vista, RR

2018
 2

RAIANE GALES MACEDO

Relatório de Estágio Curricular Supervisionado em Microbiologia

Veterinária

Relatório apresentado como requisito

para aprovação na disciplina Estágio
Curricular Supervisionado, do Curso
de Bacharelado em Medicina
Veterinária, da Universidade Federal
de Roraima.

Orientador: Prof. Dr. André Buzutti

de Siqueira.

Boa Vista, RR

2018
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 4

Agradecimentos

Aos meus pais Ana e Raimundo, pela vida de amor, carinho e esforços dedicados a mim.
À Professora Maria Eduarda Potes, pela orientação, amizade e paciência.
Ao Professor André Buzutti, pela parceria, orientação nos trabalhos desenvolvidos ao longo
do Curso, pela amizade e incentivo de sempre, o meu muito obrigada.
Aos professores Heloisa Godoy e Everton Ferreira por sempre se fazerem presentes no
desenvolvimento dos meus trabalhos, pela amizade e conselhos.
A todos os professores do Curso de Medicina da Universidade Federal de Roraima, agradeço
a colaboração de cada um no meu processo de formação, os guardarei na memória e no
coração.
À equipe de trabalho do Laboratório de Microbiologia da Universidade de Évora pelo
companheirismo, ajuda e aprendizado compartilhado durante realização do estágio.
A todos os meus amigos do Curso de Medicina Veterinária, com quem compartilhei
momentos aprendizado, de estresse, de felicidade, de conquistas e crescimento pessoal.
Agradeço, em memória, ao Fábio Maia, com quem tive o privilégio de desfrutar de curta e
bonita amizade, cujos conselhos e palavras de amigo deixaram marcas na vida.
E a todos que de forma direta ou indiretamente contribuíram para a minha formação
profissional.
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RESUMO

Este relatório apresenta os procedimentos e atividades desenvolvidas durante o Estágio Curricular

Supervisionado em Microbiologia Veterinária, realizado em duas instituições. A primeira foi o
Laboratório de Microbiologia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de
Roraima- Brasil, de 02 a 23 de outubro de 2017, totalizando 90 horas, onde foram realizadas
atividades de pesquisa a respeito da organização, conhecimento das instalações e funcionamento
do Laboratório de Análise de Alimentos de Produtos de Origem Animal. A segunda instituição foi
o Laboratório de Microbiologia do Pólo de Mitra da Universidade de Évora- Portugal, no período
de 02 de novembro de 2017 até 17 de janeiro de 2018, totalizando 368 horas. Dentre as principais
atividades realizadas neste laboratório estão: preparação e esterilização de materiais de
laboratório, técnicas de preparação de meios de cultura, técnicas de inoculação e cultivo de
amostras para detecção de microrganismos e testes de sensibilização a antimicrobianos. Um dos
estudos realizados com antibiogramas foi relatado e discutido. O estágio curricular supervisionado
proporcionou a aplicação dos conhecimentos teóricos adquiridos ao longo do curso e experiências
práticas na rotina de um Laboratório de Microbiologia Veterinária, constituindo aprendizado
fundamental para a formação médica veterinária.

Palavras- chave: Antibiogramas. Microbiologia. Rotina laboratorial.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Laboratório de Microbiologia do Centro de Ciências Agrárias da Universidade

Federal de Roraima ................................................................................................ 11
Figura 2- Complexo de prédios do Pólo de Mitra da Universidade de Évora, situado em
Valverde a 10 km da Cidade de Évora, Portugal. .................................................. 11
Figura 3- Visão interna do setor preparatório de meios de cultura e soluções. ....................... 12
Figura 4- Autoclave usada esterilização de meio de cultura e vidrarias. ................................. 13
Figura 5- Autoclave usada para descarte de material de risco biológico. ................................ 13
Figura 6- Bancada com as balanças de precisão utilizadas em laboratório. ............................. 13
Figura 7- Estufas utilizadas em laboratório. ............................................................................. 14
Figura 8 - Geladeira em uso, com armazenamento de diversos meios de culturas e outros
materiais. ................................................................................................................ 14
Figura 9- Materiais de consumo dispostos nas prateleiras de armazenamento......................... 15

Figura 10- Ao fundo câmara de fluxo laminar utilizada para manipulação dos microrganismos
e processamento das amostras................................................................................16

Figura 11- Ao fundo câmara de fluxo laminar utilizada para manipulação dos microrganismos
e processamento das amostras................................................................................16

Figura12- Material utilizado para a realização do teste de sensibilidade a

antimicrobianos........................................................................................................24

Figura 13- Aferição em milímetros dos diâmetros dos halos formados com régua
milimetrada...............................................................................................................24
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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Padrões interpretativos do método de difusão em disco em testes de sensibilidade a

antimicrobianos equivalentes para Enterococcus spp. ............................................25

Tabela 2- Resultados dos testes de sensibilidade a antimicrobianos realizados com culturas de

Enterococcus spp, provenientes de amostras distintas dos queijos de Évora..........25
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SUMÁRIO

1. RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR .............................................................. 9

1.1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 9
1.2 ESTRUTURA DOS LABORATÓRIOS DE MICROBIOLOGIA DAS INSTITUIÇÕES
ONDE FOI REALIZADO O ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO.......................11
1.2.1 Preparação meios de cultura e soluções............................................................................. 12
1.2.2 Lavagem e esterilização de materiais................................................................................. 12
1.2.3 Pesagem de meios e soluções............................................................................................. 13
1.2.4 Utilização de estufas e geladeiras....................................................................................... 13
1.2.5 Armazenamento de reagentes e materiais.......................................................................... 15
1.2.6 Análises microbiológicas................................................................................................... 15
1.3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS................................................................................ 16
1.3.1 Produção dos meios de cultura................................................................................................. 17
1.3.2 Inoculação de microrganismos........................................................................................... 18
1.3.3 Incubação de microrganismos............................................................................................ 18
1.3.4 Visualização da multiplicação bacteriana nos meios de cultura........................................ 18
1.3.5 Preservação dos microrganismos....................................................................................... 19
1.3.6 Limpeza e esterilização de materiais.................................................................................. 19
2. Teste de sensibilidade a antimicrobianos da bactéria Enterococcus spp. provenientes
de queijos de Évora ................................................................................................................ 20
2.1 INTRODUÇÃO................................................................................................................. 20
2.2 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................... 21
2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................... 24
2.4 CONCLUSÃO................................................................................................................... 27
CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................. 28
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 29
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1. RELATÓRIO DE ESTÁGIO CURRICULAR

1.1 INTRODUÇÃO

A realização do estágio curricular supervisionado é essencial para a prática dos

conhecimentos construídos ao longo do Curso de Medicina Veterinária e proporciona
experiências reais em diferentes áreas da profissão.

A primeira parte do estágio foi realizada no Laboratório de Microbiologia do Centro

de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Roraima (UFRR), de 02 a 23 de outubro de
2017, situado no Campus Cauamé, no Distrito de Monte Cristo, Boa Vista, Roraima, com
supervisão e orientação do Prof. Dr. André Buzutti de Siqueira.

O Centro de Ciências Agrárias da UFRR abriga as coordenações e as instalações de

ensino dos cursos de Agronomia, Zootecnia e Medicina Veterinária. O Curso de Medicina
Veterinária iniciou em 2013 e possui setores que funcionam de apoio a tríplice ensino,
pesquisa e extensão, dentre eles o laboratório de histopatologia, de anatomia, o complexo
clínico veterinário e o laboratório de microbiologia, que desenvolve atividades de segunda-
feira a sexta-feira das 8:00 horas às 12:00 horas e das 14:00 horas às 18:00 horas. O
laboratório conta com a colaboração de um técnico que auxilia nas atividades.

Em seguida, realizou-se a segunda parte do Estágio Curricular Supervisionado no

período de 02 de novembro de 2017 a 17 de janeiro de 2018 no Laboratório de Microbiologia,
do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade de Évora, localizado no Pólo da
Mitra junto à povoação de Valverde, a cerca de 10 km de Évora, Portugal, com supervisão
interna da Professora Doutora Maria Eduarda Marques Madeira da Silva Potes.

Após a fundação da Universidade de Coimbra, em 1537, fez-se sentir a necessidade de

outra universidade que servisse o sul do país. A Universidade de Évora foi então inaugurada
em 01 de novembro de 1559, sendo a segunda Universidade fundada em Portugal. A
Universidade é composta por várias Escolas, Departamentos e o Instituto de Investigação e
Formação Avançada.

O Departamento de Medicina Veterinária da Universidade de Évora está integrado na

Escola de Ciências e Tecnologia e dispõe ainda de laboratórios de apoio, nas áreas de
reprodução, microbiologia e parasitologia. São da sua responsabilidade domínios
 10

fundamentais na formação clínica do Médico Veterinário. A formação abrange também áreas

essenciais, a medicina veterinária preventiva, a saúde pública e a inspeção sanitária.

O horário de funcionamento do laboratório de microbiologia é das 9:00 horas às 13:00

horas e das 14:00 horas às 18:00 horas de segunda a sexta-feira e constitui a base para
realização de aulas práticas da disciplina de microbiologia veterinária do Curso de Medicina
Veterinária, estudos e experimentos de discentes graduandos, mestrandos, doutorandos e pós-
doutorandos, além de pesquisas externas de parcerias com outras instituições.

O interesse em realizar o estágio curricular supervisionado no laboratório de

microbiologia da Universidade de Évora surgiu devido a participação da seleção de estudantes
para realização de intercâmbio em países ibero-americanos promovida pela Universidade
Federal de Roraima em parceria com o Banco Santander, oportunidade esta que possibilitou
conhecer melhor a Universidade de Évora e aproveitar as experiências e aprendizado
adquiridos no laboratório de microbiologia.

Este relatório foi elaborado com o objetivo de descrever a infraestrutura e

funcionalidade dos locais de estágio e as respectivas atividades desenvolvidas durante todo o
período, além de demonstrar parte de estudos realizados com testes de sensibilidade a
antimicrobianos em culturas isoladas de bactérias do gênero Enterococcus spp., originadas de
pesquisas anteriores dos trabalhos de doutorado da professora Dra. Maria Eduarda Potes,
supervisora do estágio realizado no laboratório de microbiologia da Universidade de Évora.
 11

1.2 ESTRUTURA DOS LABORATÓRIOS DE MICROBIOLOGIA DAS

INSTITUIÇÕES ONDE FOI REALIZADO O ESTÁGIO CURRICULAR
SUPERVISIONADO

O laboratório de microbiologia do Curso de Medicina Veterinária da UFRR é

constituído por uma sala onde ficam localizados os registros de atividades do laboratório,
bancadas para preparação de meios, pias, geladeiras, estufas, balanças e armários com alguns
reagentes armazenados. E outra pequena sala que abriga microscópico óptico, capela e demais
materiais de consumo do laboratório armazenado.

Figura 1 - Laboratório de Microbiologia do Complexo

Didático II do Centro de Ciências Agrárias da Universidade
Federal de Roraima

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

O laboratório de microbiologia da Universidade de Évora está localizado no complexo

de prédios do Pólo de Mitra (Figura 2) e é constituído de cinco setores distintos, setor
preparatório de meios de cultura e soluções anexo ao setor de lavagem e esterilização de
materiais, sala de ambiente controlado, sala de estufas, armazém de reagentes e materiais e
laboratório de bacteriologia.

Figura 2- Complexo de prédios do Pólo de Mitra da Universidade de Évora,

situado em Valverde a 10 km da Cidade de Évora, Portugal.

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

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1.2.1 Preparação meios de cultura e soluções

Os meios e soluções utilizados na rotina laboratorial são preparados em setor separado

de onde se realizam análises microbiológicas. As duas instituições de estágio contam com
espaço físico (Figura 3) onde ficam armazenados os meios de cultura e soluções em uso,
equipamentos necessários para o preparo dos mesmos, além de utensílios como béqueres,
tubos, placas de cultivo, pipetas, provetas, bastões de vidros, forno de micro-ondas, banho-
maria, pia, reservatório para água destilada, entre outros.

Figura 3- Visão interna do setor preparatório de meios de

cultura e soluções.

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

1.2.2 Lavagem e esterilização de materiais

A limpeza das vidrarias e demais materiais utilizados é feita por meio das pias de
lavagem e de máquinas de lavagem. A esterilização é feita por meio do uso de autoclave, de
todo o material que é utilizado e/ou descartado no laboratório.

Dessa forma, existe uma autoclave para descarte de materiais de risco biológico (Figura
4) e uma autoclave para esterilização de meios de cultura e vidraria (Figura 5).
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Figura 5- Autoclave usada esterilização de Figura 4- Autoclave usada para descarte

meio de cultura e vidrarias. de material de risco biológico.

Fonte: Arquivo pessoal (2017). Fonte: Arquivo pessoal (2017).

1.2.3 Pesagem de meios e soluções

São utilizadas balanças de precisão para de medição de meios e soluções que são
de uso necessário nos laboratórios (Figura 6).

Figura 6- Bancada com as balanças de precisão utilizadas em laboratório.

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

1.2.4 Utilização de estufas e geladeiras

Os laboratórios de microbiologia utilizam estufas diversas (Figura 7) para

secagem de materiais plásticos, secagem de vidrarias, como também para incubação dos
materiais de cultivo microbiológico. Além disso, dispõem de geladeiras (Figura 8) que
auxiliam no armazenamento de meios, soluções, amostras microbiológicas, testes específicos,
antibióticos, entre outros.
 14

Figura 7- Estufas utilizadas em laboratório.

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

Figura 8 - Geladeira em uso, com armazenamento de

diversos meios de culturas e outros materiais.

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

 15

1.2.5 Armazenamento de reagentes e materiais

Os laboratórios possuem espaço destinado ao armazenamento de todos os materiais de

suporte utilizados, como reagentes, meios de culturas novos, fitas de esterilização, placas para
cultivo, tubos, materiais de limpeza, entre outros (Figura 9).

Figura 9- Materiais de consumo dispostos nas prateleiras de

armazenamento.

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

1.2.6 Análises microbiológicas

Há uma sala específica onde são recebidas e armazenadas as amostras (Figura 10), que
em seguida serão processadas para a realização dos exames bacteriológicos, fúngicos e/ou
citológicos. Neste ambiente, ocorre distribuição dos meios de cultura, realização dos
antibiogramas, técnicas de coloração de Gram, diluições de amostras, técnicas de inoculação
de microrganismos, entre outros.

O setor é constituído por pias, microscópios ópticos, câmara de fluxo laminar, e

materiais utilizados na rotina (álcool 70%, reagentes para coloração de Gram, reagentes para
os testes bioquímicos, lâminas para microscopia, placas de Petri, entre outros) (Figura 11).
 16

Figura 10- Instalações internas onde são realizadas análises

microbiológicas.

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

Figura 11- Ao fundo câmara de fluxo laminar utilizada para

manipulação dos microrganismos e processamento das amostras.

Fonte: Arquivo pessoal (2017).

1.3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS

As atividades realizadas nos laboratórios de microbiologia da UFRR e da

Universidade de Évora constituíram-se de atividades de pesquisa a respeito da organização,
conhecimento das instalações e funcionamento dos laboratórios de microbiologia,
acompanhamento da rotina laboratorial para o aprendizado de funções básicas como lavagem
de vidrarias de uso laboratorial, esterilização de material, preparação e distribuição de meios
 17

de cultura, prática de técnicas de inoculação de microrganismos para cultivo e organização de

material.
Os laboratórios não realizam prestação de serviços externos, dessa forma, as atividades
realizadas são de âmbito acadêmico e fazem parte dos trabalhos de pesquisas internas dos
discentes das universidades.
Durante o segundo período de estágio, realizei em parceria com uma estudante do
Curso de Bioquímica da Universidade de Évora parte de estudo envolvendo a realização de
testes de sensibilidade a antimicrobianos em culturas isoladas de bactérias do gênero
Enterococcus spp.

1.3.1 Produção dos meios de cultura

Para a produção de meios de cultivo eram utilizados meios de cultura comerciais em

pó, conforme necessidade dos estudos desenvolvidos. Os meios eram inicialmente
identificados e pesados em potes plásticos de uso laboratorial em balança de precisão. Em
seguida, eram diluídos em água destilada conforme instruções do fabricante, aquecidos em
uma panela em placa de amianto, até sua total homogeneização.
Quando o meio utilizado é de natureza ágar (meio sólido), este é distribuído em placas
de Petri e quando é de base líquida, também chamada de caldo, é acondicionado em tubos de
vidro.
Os meios a base de ágar antes de serem distribuídos em placas de Petri precisam
passar pelo processo de esterilização, onde são colocados em frascos de vidro, devidamente
identificados, enquanto os meios líquidos, vão para a autoclave já em tubos, também
identificados, ambos com fita de controle de esterilização. A esterilização é realizada em
autoclave durante quinze minutos à temperatura de 121 ºC.
Após a esterilização, os meios líquidos são retirados da autoclave e ficam em
temperatura ambiente para o arrefecimento, ficando prontos para uso ou armazenamento
posterior em geladeira em temperatura em torno de 8ºC. Os meios sólidos são retirados da
autoclave e ficam em banho-maria até o arrefecimento em torno de 50ºC para em seguida
serem distribuídos em placas de Petri, dentro da câmara de fluxo laminar. Posteriormente,
ocorre a solidificação, as placas podem ser utilizadas ou armazenadas nas mesmas condições
dos meios líquidos.
 18

1.3.2 Inoculação de microrganismos

A transferência de um microrganismo para um meio de cultura é também chamada de

repique, semeadura, ou inoculação. Para realização das inoculações de microrganismos são
utilizadas alças de Drigalsky (também conhecidas como zaragatoas), pipetas comuns,
micropipetas automáticas e swabs. Essa transferência de microrganismos é feita em condições
de assepsia, utilizando como inóculo colônias já isoladas de outras placas de Petri ou porção
de meio líquido (caldo) com cultivo dos microrganismos, dentro de uma câmara de fluxo
laminar e quando era necessária a flambagem, utilizava-se o bico de Bunsen. O tipo mais
comum de semeadura utilizada nas placas de Petri era a de superfície, realizada com a alça de
Drigalsky, fazendo-se na superfície do meio um espalhamento inicial do inóculo e em seguida
uma sequência de estrias não sobrepostas, que vão das bordas para o centro da placa, em três
sentidos diferentes Para os meios líquidos, a cultura era repassada de uma placa de Petri com
o auxílio da alça de Drigalsky ou ainda, era pipetada de culturas acondicionadas de outros
meios líquidos.

1.3.3 Incubação de microrganismos

Após a inoculação nos meios de culturas, é necessário realizar a incubação dos

microrganismos em uma temperatura adequada ao seu desenvolvimento. Dessa forma, as
amostras em placas de Petri ou em meio líquido eram colocadas em estufas com temperaturas
controladas e tempo de incubação dependendo das condições de cultivo do microrganismo
estudado, do tipo de meio de cultura utilizado e das instruções do fabricante.
Além disso, eram utilizadas jarras de anaerobiose, quando os microrganismos eram
anaeróbios estritos.

1.3.4 Visualização da multiplicação bacteriana nos meios de cultura

Após o período de incubação, os meios de cultura eram retirados das estufas e levados
para a câmara de fluxo laminar. Era observada a turvação, formação de película ou depósito
no meio de cultura, indicativo de multiplicação dos microrganismos inoculados. Nas placas de
Petri era possível observar a presença das colônias bacterianas conforme semeadura realizada.
 19

1.3.5 Preservação dos microrganismos

A preservação de microrganismos por períodos curtos é normalmente feita em

geladeiras a cerca de 4º - 8ºC. Para períodos mais longos utilizam-se freezers a -20ºC, ou
ainda a -80ºC. As amostras podem ser acondicionadas em tubos, eppendorfs ou em criotubos.

1.3.6 Limpeza e esterilização de materiais

Todo material utilizado no laboratório, como vidrarias e utensílios de suporte eram

lavados em máquina de lavar, com posterior enxágue em água destilada, organizados em
suportes e levados a estufa para secagem (em torno de 37ºC). Após isso, eram embalados,
identificados e levados a autoclave para o processo de esterilização durante quinze minutos á
temperatura de 121ºC. Por fim, após serem retirados da autoclave, eram armazenados
conforme a natureza em armários apropriados.
Os materiais que apresentavam risco biológico, também passavam pelo processo de
esterilização antes de serem descartados.
 20

2. Teste de sensibilidade a antimicrobianos da bactéria Enterococcus spp.

provenientes de queijos de Évora

2.1 INTRODUÇÃO

O queijo produzido na região de Évora (Sudeste de Portugal), designado

comercialmente por queijo de Évora, é um queijo curado, de pasta dura ou semi-dura,
fabricado com leite crú de ovelha, segundo técnicas artesanais. É um queijo pequeno com
cerca de 60 a 90 g de peso e forma cilíndrica achatada com cerca de 6 cm de diâmetro e 2 a 3
cm de altura, ou com peso entre 120 a 200g ou 200 a 300g, com a mesma forma cilíndrica
achatada mas diâmetro maior sendo, então, designado por merendeiras (POTES, 2000).

Segundo Potes e Marinho (1998) as propriedades organolépticas o tornam um produto

típico da região de Évora, muito apreciado pelos consumidores, com características especiais
de sabor e tamanho que facilitam a comercialização do produto. O processo artesanal de
produção envolve a maturação dos queijos com cerca de 30 a 45 dias em condições
ambientais de temperatura, humidade e ventilação avaliadas empiricamente.

O fato do queijo de Évora ser fabricado com leite crú, que não é submetido a qualquer
tratamento térmico eficaz e ainda ser muito apreciado pelos consumidores, designa a
necessidade de identificar microrganismos presentes nestes queijos, que podem comprometer
a qualidade higiênica do produto e pôr em risco a saúde pública (POTES e MARINHO,
1998).

São vários os microrganismos que podem estar presentes em queijos artesanais, sejam
eles de caráter patogênico e/ou deteriorador. Os gêneros Lactococcus, Lactobacillus,
Streptococcus, Leuconostoc e Enterococcus são comumente encontrados em queijos,
principalmente artesanais (DOLCI et al., 2008).

Os Enterococcus spp. pertencem à família Enterococcaceae e são cocos Gram

positivos, catalase-negativos e constituem um importante grupo de microrganismos que se
destacam como patógenos oportunistas. Atualmente, são conhecidas mais de 30 espécies
(TRABULSI e ALTERTHUN, 2008), sendo E. faecium e E. faecalis as espécies de maior
ocorrência na microbiota natural de vários tipos de queijos (EATON; GASSON, 2001). Seu
principal reservatório é o trato gastrointestinal dos seres humanos e dos animais, mas também
 21

é encontrado no solo e na água. A partir de contaminação por material fecal, pele dos animais,
água poluída, equipamentos de ordenha e tanques de recepção do leite a bactéria pode entrar
em contato com o leite e seus derivados.
A presença de Enterococcus em alimentos preocupa os órgãos de saúde pública pela sua
característica ambígua (MORAES et al., 2012). Apesar de contribuir para o desenvolvimento
das características sensoriais (FOULQUIÉ-MORENO et al., 2006) e apresentar potencial para
a biopreservação em queijos, por produzir bacteriocinas ativas contra patógenos (SANTOS et
al., 2014), podem abrigar vários genes codificadores de fatores de virulência (MORAES et al.,
2012) além de uma característica marcante: a resistência intrínseca aos principais grupos de
antimicrobianos usados em terapias, destacando-se como as bactérias de maior versatilidade
no cenário atual da resistência bacteriana aos antimicrobianos (TRABULSI e ALTERTHUN,
2008).

Dessa forma, é possível notar a importância da realização de testes de sensibilidade a

antimicrobianos para a identificação de resistência associada aos microrganismos e ainda da
qualidade e eficácia das terapias utilizadas no tratamento das infecções bacterianas
(VERMELHO et al., 2006).

Antibiogramas são testes com o objetivo de verificar a sensibilidade de determinado

microrganismo a vários antibióticos mediante comparação usando um padrão preestabelecido.

No presente estudo, foram realizados testes de sensibilidade a antimicrobianos em

culturas isoladas de bactérias do gênero Enterococcus spp., originadas de pesquisas anteriores
com amostras obtidas de “queijos de Évora” , realizadas no laboratório de microbiologia da
Universidade de Évora.

2.2 MATERIAL E MÉTODOS

Para a realização dos testes de sensibilidade a antimicrobianos deste estudo foram

utilizadas oito culturas de Enterococcus spp, provenientes de amostras distintas de queijos de
Évora de uma mesma queijaria.

As culturas estavam preservadas em meio contendo 50% de MRS® caldo mais 50% de
glicerol em criotubos com capacidade de 300µl (microlitros) e todos eles estavam
 22

acondicionados em ultracongelamento a -80ºC. Ao todo foram utilizadas oito amostras com a

seguinte identificação: 526, 675, 677, 874, 781, M14, M132 e M160. Foram colocadas em
temperatura ambiente para o descongelamento. Após isso, dentro da câmara de fluxo laminar
foram micropipetados 100µl de cada amostra utilizando-se ponteiras com capacidade para
100µl e uma micropipeta adequada para este volume, depositados em tubos de vidro com
rosca com 4ml (mililitros) identificados com os números das amostras, contendo meio de
enriquecimento Man, Rogosa e Sharpe - MRS® caldo (Becton, Dickinson and Company,
Sparks, USA) para ativação das culturas.

Os tubos com as amostras foram incubados em estufa a 30ºC durante 48 horas, em

ambiente aeróbio. Em seguida, foi visualizada turvação e formação de película no meio de
cultura, indicativo de multiplicação dos microrganismos inoculados em cada um dos tubos
das amostras. Posteriormente, com o auxílio da alça de Drigalsky previamente flambada foi
recolhida parte da porção do caldo contendo os microrganismos e feita semeadura de
esgotamento na superfície do meio, com linhas em diferentes sentidos nas placas de Petri
contendo MRS® ágar, para visualização e isolamento de colônias novas, necessárias para os
testes de sensibilidade a antimicrobianos. Todas essas manobras foram realizadas no ambiente
interno da câmara de fluxo laminar.

As placas de Petri recém inoculadas foram identificadas e incubadas em estufa a 30ºC

durante 48 horas. Depois do período de incubação foi possível observar a presença de
colônias características de Enterococcus spp, de cor amarela e de forma arredondada
(TRABULSI e ALTERTHUM, 2008).

Para a avaliação microscópica das colônias foi coletada de forma aleatória uma colônia
isolada de cada uma das amostras com o auxílio da alça de Drigalsky flambada para
realização de esfregaço e posterior coloração de Gram conforme Brasil (1997). A coloração
de Gram possibilita dividir as bactérias em Gram-positivas e Gram-negativas, ao adquirem,
respectivamente, coloração roxo e rosa (PELCZAR, 1997).

Depois da técnica de coloração de Gram de acordo Vermelho et al., (2006), todas as

lâminas provenientes das amostras foram visualizadas em microscópio óptico com aumento
de 1000 vezes.

O teste de catalase foi realizado conforme técnica descrita por PELCZAR (1997).
 23

Para a realização dos testes de sensibilidade a antimicrobianos foi seguida a norma de

Padronização dos Testes de Sensibilidade a Antimicrobianos, utilizando-se o método de
difusão em disco: método de Kirby-Bauer, o qual é recomendado como método padrão pelo
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2003). Foi avaliada a eficácia de quatro
antibióticos comerciais: vancomicina (30µl), oxacilina (1µl), gentamicina (10µl) e
teicoplamina (30µl).

Foi selecionada uma colônia isolada das placas de MRS® ágar já cultivadas para o
preparo do inóculo. Cada colônia foi coletada com o auxílio da alça de Drigalsky e colocada
em tubos de vidro com 4ml de solução fisiológica a 8,5%. Os tubos foram agitados em
equipamento Vortex para a leitura de turbidez próxima de 0,5 na escala de Mc Farland, que
equivale a uma concentração de aproximadamente 10 8 organismos/ml (CLSI, 2003).

O ágar Müller Hinton® é um meio que foi padronizado para realização de teste de
sensibilidade aos antimicrobianos através do método de difusão em disco dos antibióticos
(CLSI, 2005)..

Realizou-se a semeadura do inóculo com swab estéril, aplicando-o sobre a superfície

das placas de Ágar Müeller Hinton, em várias direções, de forma a cobrir toda a placa. Em
seguida, aplicaram-se os discos de antibióticos sobre a superfície das placas inoculadas
utilizando um dispensador de discos automático (Figura 12). As placas foram incubadas em
posição invertida, durante 24 horas, em estuda a 37ºC, conformes normas dispostas pelo CLSI
(2003).

A sensibilidade das amostras do microrganismo estudado foi determinada pela medida

do diâmetro dos halos de inibição em torno dos discos com o auxílio de uma régua
milimetrada (Figura 13), sendo classificada como sensível, intermediária e resistente com
base nos halos de referência para cada antibiótico testado, estabelecidos na Norma de
Desempenho para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 15° Suplemento Informativo,
Normas Interpretativas do Teste de CIM (µg/mL-1) para Enterococcus spp., conforme
recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2005).
 24

Figura 12- Material utilizado para a realização do teste de Figura 13 - Aferição em milímetros dos diâmetros dos
sensibilidade a antimicrobianos. halos formados com régua milimetrada.

Fonte: Arquivo pessoal (2017). Fonte: Arquivo pessoal (2017).

2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na avaliação microscópica das colônias isoladas de cada uma das amostras foi possível
observar células em formato de cocos, dispostas aos pares e em pequenas cadeias, coradas
com aspecto roxo, portanto classificadas como Gram-positivas.

No teste da catalase realizado, todas as culturas originadas das amostras classificaram-se

como catalase-negativas.

As oito culturas de Enterococcus spp, provenientes de amostras distintas dos queijos de

Évora apresentaram resultados semelhantes em relação à sensibilidade ao antibiótico
oxacilina (1µg) nos antibiogramas realizados. Do total de testes, cerca de 87, 5% (7/8) foram
classificados como suscetíveis e 12,5% (1/8) como intermediários.
Esta classificação é estabelecida pela Norma de Desempenho para Testes de
Sensibilidade Antimicrobiana: 15° Suplemento Informativo, Normas Interpretativas do Teste
de CIM (µg/mL-1) para Enterococcus spp., de acordo com o Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI, 2005), que define as três categorias dos antibiogramas:
“suscetível” indica que o microrganismo deve responder às doses habituais do agente
antimicrobiano administrado por via adequada, incluindo a via oral; “intermediário” indica
que o microrganismo isolado pode ser inibido por concentrações do fármaco atingidas quando
são administradas doses parenterais máximas, o agente microbiano pode ser escolhido, mas
 25

devem-se considerar outras escolhas para uma terapia ideal; “resistente” é indicativo de
quando a bactéria não é inibida pelas concentrações atingíveis do fármaco e, portanto, ele não
deve ser eleito para a terapia. Essa classificação é feita de acordo as medidas milimetradas dos
diâmetros dos halos das zonas de inibição formadas no meio de cultura (Tabela 1).

Tabela 1 - Padrões interpretativos do método de difusão em disco em testes de sensibilidade a antimicrobianos

equivalentes para Enterococcus spp.

Antibiótico Concentração (μg) Grau de sensibilidade* de acordo com o diâmetro do halo

da zona de inibição em mm

Sensível Intermediário Resistente

Vancomicina 30 >17 15-16 <14
Oxacilina 1 >13 11-12 <10
Gentamicina 10 >15 13-14 <12
Teicoplamina 30 >14 11-13 <10
O grau de sensibilidade das amostras dos microrganismos foi determinado de acordo com as Normas de
Desempenho Para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 15º Suplemento Informativo (CLSI, 2005)

Os demais antibióticos utilizados (vancomicina (30µl), gentamicina (10µl) e

teicoplamina (30µl)) não apresentaram eficácia nos antiobiogramas, todas as amostras (8/8)
foram resistentes (Tabela 2). Em estudos realizados por Porto et al.; (2016) com culturas de
Enterococcus endógenos obtidos de queijo coalho artesanal, as cepas apresentaram ampla
resistência aos antibióticos vancomicina e teicoplamina também utilizados nos testes de
sensibilidade a antimicrobianos.

Tabela 2 – Resultados dos testes de sensibilidade a antimicrobianos realizados com culturas de

Enterococcus spp, provenientes de amostras distintas dos queijos de Évora.

Antibiótico Identificação das amostras

526 675 677 781 874 M14 M132 M160
Vancomicina R R R R R R R R
(30μg)
Oxacilina (1μg) S S I S S S S S
Gentamicina R R R R R R R R
(10μg)
Teicoplamina R R R R R R R R
(30μg)
O grau de sensibilidade das amostras dos microrganismos foi determinado de acordo com as Normas de
Desempenho Para Testes de Sensibilidade Antimicrobiana: 15º Suplemento Informativo (CLSI, 2005).
S – Sensível I – Intermediário R – Resistente
 26

A resistência de Enterococcus à antibióticos de caráter clínico tem sido relatada em

cepas isoladas de diferentes tipos de queijos (JAMET et al., 2012; MORANDI et al., 2013;
YOGURTCU e TUNCER, 2013). Yogurtcu e Tuncer (2013) avaliaram 47 cepas de
Enterococcus isoladas de queijo Turkish Tulum quanto à sensibilidade a antibióticos e
observaram que todas as cepas apresentaram sensibilidade a ampicilina, penicilina,
vancomicina e gentamicina.

No Brasil, Riboldi et al. (2009) avaliaram o perfil de resistência antimicrobiana de E.

faecalis, E. faecium e Enterococcus spp. isolados de vários alimentos, incluindo queijos, e
observaram fenótipos de resistência a tetraciclina, eritromicina, gentamicina, estreptomicina,
ampicilina e vancomicina.

De acordo com Foulquié-Moreno et al. (2006), os antibióticos mais relevantes no

tratamento de infecções causadas por Enterococcus resistentes a múltiplos antibióticos são
ampicilina, vancomicina e gentamicina. No presente estudo, todas as amostras avaliadas
apresentaram sensibilidade a vancomicina e gentamicina.

Cepas de Enterococcus que abrigam fenótipos de resistência a antibióticos

glicopeptídeos como teicoplanina e vancomicina são considerados patógenos emergentes
(JOHANSSON e RASMUSSEN, 2013). Esses dados são um alerta para os laticínios
artesanais e para os órgãos de saúde pública de qualquer parte do mundo, uma vez que os
antibióticos representam a única opção terapêutica no tratamento de infecções nosocomiais
(infecções hospitalares) por exemplo, causadas por Enterococcus spp.

A resistência bacteriana aliada à prática inadequada do uso de antibióticos pela

população, somadas à existência de condições higiênicas precárias durante manipulação da
matéria-prima e de toda produção de queijos, principalmente os artesanais como já foi
identificado em estudos realizados por Potes (2000), podem trazer efeitos graves à saúde dos
consumidos e consequentemente tornar-se um problema na Saúde Pública.
 27

2.4 CONCLUSÃO

Dos testes de sensibilidade a antimicrobianos realizados com culturas isoladas de

bactérias do gênero Enterococcus spp., de amostras obtidas de “queijos de Évora”, apenas um
dos cinco antibióticos utilizados apresentou eficácia contra a multiplicação bacteriana no meio
utilizado, (Oxacilina 1µg). Os demais, Vancomicina 30µg, Gentamicina 10µg e Teicoplamina
30µg não apresentaram efeito desejável, caracterizando resistência bacteriana dos
microrganismos estudados.
 28

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estágio curricular supervisionado realizado nos laboratórios de microbiologia da

Universidade Federal de Roraima e da Universidade de Évora proporcionou experiências
únicas e um maior conhecimento teórico e prático nas diversas atividades da microbiologia
veterinária. Ao fim deste período foi possível compreender a importância do trabalho
realizado em tais laboratórios, que auxiliam às diferentes áreas da medicina veterinária.
Todas as pessoas que me auxiliaram, orientaram e ensinaram durante o período de estágio
contribuíram para o meu desenvolvimento pessoal e profissional. Além disso, o estágio
curricular supervisionado auxiliou no compartilhamento de aprendizado entre estagiário e
médicos veterinários atuantes, despertando o interesse em cada vez mais buscar atualizações e
conhecimentos das áreas que nos identificamos, com o intuito de sempre contribuir com a
evolução da profissão do médico veterinário.
 29

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Políticas de Saúde. Programa Nacional de

Doenças Sexualmente Transmissíveis e AIDS. Técnica de coloração de Gram. Brasília:
Editora do Ministério da Saúde, 1977. 67 p.

CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. Normas de desempenho

para testes de sensibilidade antimicrobiana: 15º suplemento informativo. Pennsylvania,
2005. (Document, M100-S15). Disponível em: <http://www.
anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/ clsi/clsi_OPASM100S15. pdf>. Acesso em: 19 jan.
2018.

CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE. Padronização dos testes de

sensibilidade a antimicrobianos por disco-difusão: norma aprovada – oitava edição.
Pennsylvania, 2003. (CLSI Document, M2-A8). Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/clsi/clsi_ OPASM2-A8.pdf>. Acesso em:
19 jan. 2018.

DOLCI, P. et al. Microbiological characterization of artesanal Raschera PDO cheese: analysis

of its indigenous lactic acid bacteria. Food Microbiology, v. 25, n. 2, p. 392-399, 2008.

EATON, T. J.; GASSON, M. J. Molecular screening of Enterococcus virulence determinants

and potential genetic exchange between food and medical isolates. Applied and
Environmental Microbiology, v. 67, n. 4, p. 1628-1635, 2001.

FOULQUIÉ-MORENO, M. R. et al. The role and application of enterococci in food and

health. International Journal of Food Microbiology, v. 106, n. 1, p. 1-24, 2006.

JAMET, E. et al. Prevalence and characterization of antibiotic resistant Enterococcus faecalis

in French cheeses. Food Microbiology, v. 31, n. 2, p. 191-198, 2012.

JOHANSSON, D; RASMUSSEN, M. Virulence factors in isolates of Enterococcus faecalis

from infective endocarditis and from the normal flora. Microbial Pathogenesis, v. 55, p. 28-
31, 2013.

MORAES, P. M. et al. Bacteriocinogenic and virulence potential of Enterococcus isolates

obtained from raw milk and cheese. Journal of Applied Microbiology, v. 113, n. 2, p. 318-
328, 2012.

MORANDI, S.; SILVETTI, T.; BRASCA, M. Biotechnological and safety characterization of

Enterococcus lactis, a recently described species of dairy origin. Antonie Van
Leeuwenhoek, v. 103, n.1, p. 239-249, 2013.

PELCZAR, M. J. J.; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações.

v 2. 2 ed. São Paulo: Pearson Education do Brasil, 1997. 525 p.
POTES, M. E. Microbiologia do queijo artesanal produzido na região de Évora. 2000.
102 p. Tese (Doutorado em Higiene e Sanidade Animal) Universidade de Évora, Évora,
Portugal, 2000.
 30

POTES, M. E.; MARINHO, A. Variabilidade microbiológica do queijo produzido na região

de Évora durante o processo de maturação. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, v.
93, n. 527, p. 154-160, jul-set, 1998.
PORTO, B. C.; FUJIMOTO, G.; BORGES, M.F.; BRUNO, L.M.; CARVALHO, J. D. J.
Determinantes de virulência em Enterococcus endógenos de queijo artesanal. Revista
Ciência Agronômica, v. 47, n. 1, p. 69-76, jan-mar, 2016.

RIBOLDI, G. P. et al. Antimicrobial resistance profile of Enterococcus spp. isolated from

food in southern Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 40, n. 1, p. 125-128, 2009.

SANTOS, K. M. O. et al. Brazilian artisanal cheeses as a source of beneficial Enterococcus

faecium strains: characterization of the bacteriocinogenic potential. Annals of Microbiology,
v. 64, n. 4, p. 1463-1471, 2014.

TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F. Microbiologia. 5 ed. São Paulo: Atheneu, 2008. 800
p.
VERMELHO, A. B.; PEREIRA, A. F.; COELHO, R. R. R.; SOUTO-PADRÓN, T. Práticas
de Microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. 239 p.

WINN. W. J.; ALLEN, S.; JANDA, W.; KONEMAN, E.; PROCOP, G.;
SCHRECKENBERGER, P.; WOODS, G. Diagnóstico microbiológico: texto e atlas
colorido. 6. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 1565 p.

YOGURTCU, N. N.; TUNCER, Y. Antibiotic susceptibility patterns of Enterococcus strains

isolated from Turkish Tulum cheese. International Journal of Dairy Technology, v. 66, n.
2, p. 236-242, 2013.