DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA Y ÁCIDO BENZOICO EN BEBIDAS

COMERCIALES MEDIANTE HPLC

Delgado, Samuel1 González, Karina2

4-799-917 4-797-2380

Curso de Química Analítica II (Qm 228), Escuela de Química, Facultad de Ciencias Naturales y
Exactas, Universidad Autónoma de Chiriquí, David Chiriquí, República de Panamá.

samuel131198@hotmail.com 1 Karinamichelle231998@hotmail.com 2

RESUMEN:
Este laboratorio tuvo el objetivo general de comprender el fundamento de la cromatografía
de líquidos. Inicialmente se explicó de manera muy clara y concisa el fundamente de la
cromatografía de líquidos; las partes más importantes del HPLC y sus respectivas
funciones. Posteriormente, se procedió a preparar dos soluciones madres de 1000 ppm de
cafeína y ácido benzoico, el cual luego se extrajeron las soluciones patrón (5, 10, 20, 30,
40 y 50 ppm) de cafeína y ácido benzoico para realizar una mezcla para dichas
concentraciones. Seguidamente se construyó la curva de calibración con respecto a la
concentración y el área del pico, se inyectaron muestras de cocacola light y té negro para
encontrar la concentración aproximada de cafeína, obteniendo así una concentración para
cafeína en cocacola de 169.6 ppm y té negro de 507.2 ppm, finalmente se aumentó la
longitud de onda a 240 nm, observando que, el ácido benzoico posee más afinidad a la
misma. Concluimos que el principio de este tipo de cromatografía es el resultado de las
interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y
estacionaria y que, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento no está limitada por la
volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.

PALABRAS CLAVES:  Determinar el contenido de

Señal, área, tiempo de retención, cafeína presente en una bebida
absorbancia, solución patrón. de Cola “light” y té negro.
OBJETIVOS:

 Entender el fundamento de la MARCO TEORICO:

cromatografía de líquidos.
 Aprender el manejo de un equipo
de HPLC.
En la cromatografía líquida, la fase móvil
es un líquido que fluye a través de una
columna que contiene a la fase fija. La
separación cromatográfica en HPLC es
el resultado de las interacciones
específicas entre las moléculas de la
muestra en ambas fases, móvil y Metanol
175 mL 0.5%
estacionaria para HPLC
Muestra de
A diferencia de la cromatografía de
bebidas 5 mL pura
gases, la cromatografía de líquidos de
refrescantes
alto rendimiento (HPLC, de high-
Ácido
performance liquid chromatography) no
fosfórico 75 mL 0.5%
está limitada por la volatilidad o la
para HPLC
estabilidad térmica de la muestra.
Agua Milli Q 100 mL pura
(Ozores,2016).

MATERIALES Y REACTIVOS: FASE EXPERIMENTAL:

Esquema No 1: Preparación de solución
madre y patrones.
Material Capacidad Cantidad
Vasos 100 mL 2
químicos preparar solución 0.050 g
Micro - 1 madre de cafeina de
pipeta 1000 ppm cafeina
Probetas 10 mL 1
25 mL 1 disolver en 25
oforar en matraz
Viales - 10 mL de agua
de 50 mL
Micro 100μL 1 mille Q
jeringa
Matraz 50 mL 2 preparar a partir de la solucion madre
aforador soluciones patrones de
5,10,20,30,40,50 ppm
Filtro de - 1
membrana
de nylon repetir pasos para solucion madre
Equipo Capacidad Cantidad de ácido benzoico.
Balanza - 1
analítica
HPLC - 1
Esquema No 2: Preparación de la
Reactivo Cantidad Concentración
1000 ppm muestra:
5 ppm
10 ppm tomar 5 mL de la muestra
Ácido
0.050 g 20 ppm
benzoico
30 ppm
40 ppm oforar enrazar con fase
50 ppm movil
1000 ppm
5 ppm homoge pasar por un
10 ppm nizar filtro de nylon
Cafeína 0.050 g 20 ppm
30 ppm
40 ppm
Esquema No 3: Análisis cromatográfico.
50 ppm
 Cuadro No 2: Datos de muestras de cocacola
encender
colocar fase
cromatograf y te negro obtenidas en HPLC 220nm
movil
o
Tiempo
Concen-
de
aumentar Muestra compuesto tración área
flujo acondiciona retención
lentamrnte r la columna ppm
1.0 mL/min (min)
Coca- Cafeína 169.6 2.090 1.10425x104
seleccionar cola
inyectar
longitud de Té Cafeína 507.2 2.084 3.09281x104
solución
onda
negro

realizar grafico
imprimir
de Area vs Cuadro No 3:
cromatograma
concentración
Datos obtenidos en HPLC con 240nm
RESULTADOS: Tipo de compuesto Concen- Tiempo Área
muestra tración de
Cuadro No 1: Patrones y mezclas (ppm) retención
inyectadas en el HPLC con 220nm. (min)
Cafeína 50 2.095 1236.33
Tipo Mezcla Ácido
concen Tiempo de
de 50 3.28 3714,38
mues-
Compuesto tracion retención Área benzoico
(ppm) (min)
tra
Patro Cafeína 50 2.096 2700
-nes 0.27 Grafica No 1: área vs concentración
Acido 50 3.287 2264.
benzoico 70
Mezcla
1
Cafeína 5 2.100 1394. Área vs Concentración
88
Acido 5 3.282 1641,
benzoico 90 5000
Mezcla Cafeína 10 2.097 1628,
2 4500
03
Acido 10 3.282 1848, 4000
benzoico 85 3500
Mezcla Cafeína 20 2.096 2145.
3 3000
39
;Area

Acido 20 3.282 2543. 2500

benzoico 31
Mezcla Cafeína 30 2.096 2876. 2000
4
76 1500
Acido 30 3.282 3316.
benzoico 49 1000
Mezcla Cafeína 40 2.095 3374.
5 500
03
Acido 40 3.279 3951. 0
benzoico 86 0 20 40 60
Mezcla Cafeína 50 2.094 4020.
6 y = 58.909x + 1051.4 Concentración y = 69.504x + 1209.2
28
R² = 0.9972 R² = 0.9977
Acido 50 3.278 4726.
benzoico 21 Cafeina Ácido benzoico
Cromatograma No1: Muestra de
Cocacola light.  Ecuación: determinar la
concentración de cafeína en
muestras de cola y té negro.
y = 58.909x + 1051.4
R² = 0.9972
Calculo de concentración de cafeína
en cola.
y = 58.909x + 1051.4

𝑦−1051.4
x= 58.909

1.10425x104
− 1051.4
𝑥= = 169.6𝑝𝑝𝑚
58.909

CUESTIONARIO:
1. ¿Se puede ver modificado el
espectro de absorción UV de un
Cromatograma No 2: muestra de té compuesto en función del pH?
R// Las longitudes de onda de los
picos de absorción pueden
correlacionarse con los tipos de
enlace en una determinada molécula,
y son valiosos para determinar los
grupos funcionales dentro de la
molécula. La absorción UV-Vis no es,
sin embargo, una prueba específica
para ningún compuesto determinado.
La naturaleza del disolvente, el pH de
la solución, la temperatura, la
concentración de electrolitos, y la
presencia de sustancias interferentes
pueden influir en los espectros de
absorción de los compuestos, así
como las variaciones en la anchura de
la hendidura (ancho de banda
efectivo) en el espectrofotómetro.
2. ¿Cómo se puede predecir el orden
de elución de los analitos en
 cromatografía en fase inversa e
función del pKa de los mismos?
R// Con los compuestos ácidos se usa
metanol, y para los básicos se usa
acetonitrilo. Las columnas polares, de
fase inversa, como polietilenglicol (PEG)
contienen grupos éter que interactúan con
analitos polares. Se usan para analizar
compuestos fenólicos y multiaromáticos
con grupos hidroxilo. Si bien muchos de
ellos se pueden separar en columnas con
C18, se pueden presentar traslapos.
Cabe esperar que los órdenes de elución
sean diferentes. Una gran variedad de
compuestos orgánicos se puede disolver
en fases mixtas de agua-disolvente
orgánico para separarlos, de tal modo que
la cromatografía de fase inversa es, con
mucho, la forma más difundida de HPLC.
DISCUSIÓN:
Inicialmente se procedió a conocer el
principio fundamental y partes del HPLC y
posteriormente se procedió a preparar los
patrones de cafeína/ácido benzoico
correspondientes, para así obtener la
curva de calibración y obtener la
concentración de cafeína de la muestra
de cocacola y té negro.
Solución patrón
En química, una solución patrón es la
disolución de una sustancia utilizada
como referencia al momento de hacer una
valoración o estandarización. (Moore,
1978).
Curva de calibración
La curva de calibrado se construye
midiendo la señal analítica en cada uno de
los patrones previamente elaborados.
(Higson, 2007).
Teniendo una muestra de concentración
desconocida, se puede medir la señal
analítica y estimar la concentración por
extrapolación sobre la gráfica obtenida.
(Higson, 2007).
Principios de la técnica
En la cromatografía líquida, la fase móvil
es un líquido que fluye a través de una
columna que contiene a la fase fija. La
separación cromatográfica en HPLC es el
resultado de las interacciones específicas
entre las moléculas de la muestra en
ambas fases, móvil y estacionaria.
(Christian, 2009).
A diferencia de la cromatografía de gases,
la cromatografía de líquidos de alto
rendimiento (HPLC, de high-performance
liquid chromatography) no está limitada
por la volatilidad o la estabilidad térmica
de la muestra. (Valcarcel, 1988).
La HPLC es capaz de separar
macromoléculas y especies iónicas,
productos naturales lábiles, materiales
poliméricos y una gran variedad de otros
grupos polifuncionales de alto peso
molecular. Con una fase móvil líquida
interactiva, otro parámetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adición
a una fase estacionaria activa. (Christian,
2009).
La HPLC ofrece una mayor variedad de
fases estacionarias, lo que permite una
mayor gama de estas interacciones
selectivas y más posibilidades para la
separación.(Moore, 1978).
Fases estacionarias y móvil
Las partículas son de sílice de alta pureza,
con bajo contenido de trazas de metales,
y su diámetro típico es de 5 a 10 µm; sin
embargo, las partículas de 3 µm se están
usando cada vez más en la cromatografía
de alta velocidad (que se describirá
adelante). Los tamaños de poro están en
el intervalo de 60 a 100 Å, aunque se usan
tamaños de poro de 300 Å o más con
biomoléculas más grandes, que les
permiten penetrar los poros. La mayor
parte de las separaciones con HPLC se
lleva a cabo en el modo líquidolíquido
(cromatografía de partición), aunque la
cromatografía de adsorción es útil para
muchas aplicaciones. Las fases
estacionarias líquidas se encuentran
cubriendo a las partículas o químicamente
enlazadas. (Pasto, 1981).
La fase móvil se mueve en torno a las
partículas y el soluto se difunde entrando
a la fase móvil estancada dentro de los
poros e interactúa con la fase
estacionaria; a continuación, se difunde
saliendo del poro y entra a la fase móvil.
(Moore, 1978).
El uso de partículas pequeñas reduce al
mínimo la longitud de la trayectoria de
difusión, y en consecuencia el
ensanchamiento de la banda. (Higson,
2007).
La de sílice tiende a disolverse a un pH
mayor que 8, y así para la separación de
bases se usan partículas poliméricas
entrecruzadas, por ejemplo, de
poliestireno o polimetacrilatos. Pueden
resistir fases móviles fuertemente
básicas, pero tienen eficiencias algo
menores. Las partículas de sílice tienen
grupos silanol, -SiOH, superficiales. Éstos
se usan para unir químicamente fases
estacionarias mediante reacciones de
silanización con clorosilanos. (Pasto,
1981).
Un aparato de cromatografía de líquidos
de alta eficiencia se compone de cuatro
partes principales:
1. Sistema de suministro de fase
móvil.
Este sistema tiene una bomba para llegar
a las altas presiones que se requieren, y
suele contener algún medio para producir
un gradiente de elución (es decir, cambiar
concentraciones del eluyente, por ejemplo
su disolvente, sus sales o su H+). (Pasto,
1981).
Los depósitos de disolvente se pueden
llenar con varios disolventes de diferentes
polaridades, siempre que sean miscibles,
o bien se pueden llenar con soluciones de
pH diferente que se mezclan en el
volumen amortiguador. Los disolventes
deben ser puros y estar desgasificados
para evitar la formación de burbujas, toda
vez que entorpecen el correcto
funcionamiento de la válvula de no retorno
o pueden entrar a la cámara del pistón.
Además, generan máximos falsos cuando
llegan a pasar por el detector. El problema
es más grave cuando se mezclan
disolventes (en general, acetonitrilo o
metanol con agua), porque la solubilidad
de aire en mezclas es menor que en la
misma proporción de disolventes puros;
cuando se mezclan disolventes saturados
con aire, también se liberan
burbujas.(Moore, 1978).
2. Sistema de inyección de
muestra.
Un sistema habitual de inyección. Se
compone de un anillo de acero inoxidable
con seis conexiones diferentes, una de las
cuales va a la columna. (Bolaños, 2003).
Las muestras se pueden introducir en
forma manual a la válvula con una jeringa
que llena el circuito de la muestra. Hoy se
usan, de manera sistemática, válvulas
automáticas de muestreo en las que las
muestras se toman de un muestreador
automático y su operación no requiere
atención. (Valcarcel, 1988).
La principal limitante de los inyectores de
válvula es que el tamaño de la muestra es
fijo, y se debe cambiar el circuito para
variar la cantidad de muestra inyectada.
(Pasto, 1981).
3. Columna.
Los tramos rectos de tubo de acero
inoxidable permiten la construcción de
columnas. Son de varios diámetros y
longitudes, los cuales dependen de la
aplicación. En general, el diámetro dispersada por una rejilla a una serie
interno tiene 3.9 o 4.6 mm. (Christian, de fotodiodos para su
2009). detección.(Bolaños, 2003).
A continuación, se describirán La capacidad para resolver espectros
algunas reglas para seleccionar las matemáticamente solapados
fases estacionarias y móviles en proporciona capacidad adicional de
columnas. En general, no es separación cuando un máximo
necesario controlar la temperatura en cromatográfico consiste en dos o más
la cromatografía líquido-sólido, a analitos. Los detectores de
menos que deba trabajarse a fluorescencia pueden tener mejor
temperaturas elevadas; pero en selectividad que los de absorción
general sí se requiere para otras ultravioleta porque son menos los
formas de cromatografía de líquidos compuestos que fluorescen que los
(líquido-líquido, exclusión de tamaño, que absorben. Se alcanzan
intercambio iónico). (Valcarcel, 1988). sensibilidades cuando menos iguales,
y quizá mejores que las del detector
4. Detector
de UV, dependiendo de la geometría
En la cromatografía de líquidos de
de la disposición fuente de
alta eficiencia se requieren detectores
excitacióndetector, la intensidad de la
con gran sensibilidad, en general para
fuente y la eficiencia cuántica del
cantidades de microgramos a
fluoróforo. (Pasto, 1981)
nanogramos. Los detectores que más
se usan son refractómetros y El detector amperométrico es
detectores de ultravioleta (UV). El adecuado para detectar sustancias
detector de refractómetro diferencial, electroactivas, y ha encontrado
llamado con frecuencia “detector muchos usos en aplicaciones
universal”, mide cambios en el índice biológicas, por ejemplo, en la
de refracción del eluyente causados separación y detección de trazas de
por la presencia de solutos al salir de catecolaminas en el cerebro mediante
la columna. (Laitinen, 1982). HPLC. (Harvey, 2000).
El detector ultravioleta tiene mucho CONCLUSIONES:
mejor selectividad, alrededor de 108
g/mL (0.01 ppm). No es sensible a la  Comprendimos que, el
temperatura, cuesta relativamente principio de este tipo de
poco y se puede usar con gradiente de cromatografía es el
elución. Es sensible a una gran resultado de las
cantidad de compuestos orgánicos. interacciones específicas
(Skoog, 2005). entre las moléculas de la
muestra en ambas fases,
Una característica común de los móvil y estacionaria.
instrumentos de HPLC es un detector  Aprendimos el manejo y
de serie de diodos, La adquisición los cuidados de un equipo
instantánea del espectro de absorción HPLC.
proporciona una poderosa  Determinamos que, la
herramienta cualitativa. La fuente de cromatografía de líquidos
radiación focal pasa a través de la de alto rendimiento no está
celda de detector de flujo y es limitada por la volatilidad o
 la estabilidad térmica de la
muestra.
 Comprobamos que, el
ácido benzoico es más
sensible en rango de
longitud de onda de 240
nm.
 Determinamos que la
muestra de cocacola y té
negro poseen (169.6 y
507.2 ppm) de cafeína
respectivamente.
BIBLIOGRAFÍA:
 Serie Académicos CBS.
Cromatografía de gases y de
líquidos de alta resolución México
2000. pag. 215-231 255-305
 Serrano, L. Apuntes química
cromatografía. [En línea] Sitio de
estudiantes y docentes
universitarios Copyright 1999-
2001 Disponible en:
http://www.lafacu.com/apuntes/qu
imica/cromatografia/default/.htm
 Valcarcel, M. (1988). Técnicas
analíticas de separación. Editorial
Reverté. España. pp 335-336,
597-613.
de Química Analítica,
Internacional Thompson Editores,
México.
 Higson, S. (2007). Química
Analítica. 1ª ed.
 Harvey, D. (2000). Química
Analítica Moderna. Ed. McGraw
Hill.
 Moore W. (1978). Química Física.
Segunda edición. España.
 BURGET,C.A.; GREEN,L.E. and
BONELLI, E.J. Chromatographic
Methods in Gas Analysis. Hewlett
Packard. USA. 1979
 CRIPPEN, Raymond
C. Identification of Organic
Compounds with Aid of Gas
Chromatography. Mc Graw-Hill.
USA. 1973.
 EWING, Galen. Instrumental
Methods of Chemical Analysis.
3rd Edition. Mc Graw-Hill. USA.
1969

 Pasto, D & Johnson, R. (1981).

Determinación de estructuras
orgánicas. Reverté, Madrid

 Laitinen, H & Harris, W. (1982).

Análisis químico. (4ta ed.)
España. Editorial Reverté.

 Bolaños, V. (2003). Química

analítica cuantitativa, (2da ed.).
México.

 Christian, G. (2009). Química

Analítica. (6ta edición). México:
McGraw-Hill.

 Skoog, D., West, D., Holler, J.,

Crouch, S., (2005). Fundamentos