Amprentarea genetică: o privire în interior

Ideea de a identifica oamenii pe baza caracteristicilor genetice nu este nouă. Grupele sanguine ABO,
descoperite în 1900 de Karl Landsteinerrw1, au constituit primul marker genetic folosit în criminalistică, la
care s-au adăugat grupele sanguine MN (1927) şi factorul Rhesus (1937).

Dar, chiar dacă analizăm simultan toate cele trei sisteme de grupe sanguine, obţinem rezultate identice
pentru una din zece persoane; din cauza asta sunt posibile transfuziile de sânge. Din punct de vedere
criminalistic, însă, este un dezavantaj. Rezultatele îţi pot spune că proba de sânge nu provine de la Suspectul
X, dar nu pot confirma, cu certitudine, că provine de la Suspectul Y.

În anii 1970 şi ‘80 s-au făcut progrese, analizându-se diferitele forme ale unor enzime (izoenzime) din
hematii şi ser sanguin. Certitudinea că proba provenea întradevăr de la suspect depindea de numărul de
proteine analizate (de obicei patru); această certitudine se numeşte capacitate de discriminare. Capacitatea
de discriminare oferită de aceste tehnici combinate este de numai 1:1000, mai bună decât capacitatea de
1:10 a analizei grupelor sanguine, dar încă nu suficient de bună. Pentru a obţine o discriminare mai bună,
era nevoie să ne analizăm mai amănunţit structura genetică.

Structura noastră genetică – cine suntem

Genomul uman este constituit din 46 perechi de cromozomi: 23 de la mamă, 23 de la tată. Avem, aşadar,
câte doi din fiecare cromozom (excepţie – în cazul bărbaţilor – cromozomii sexuali) şi, astfel, două copii ale
fiecărei gene.

Componentul principal al cromozomilor este acidul deoxiribonucleic (ADN), care conţine informaţii pentru
producerea proteinelor necesare vieţii. Totuşi, din cele 3 miliarde de perechi de baze (pb), numai
aproximativ 4% codifică proteine, restul sunt adesea doar de „umplutură” constând din secvenţe repetitive
organizate în aglomerări (clusters). Dacă se compară ADN-ul a două persoane, el este identic în cea mai
mare parte, variabilitatea găsindu-se mai ales în aceste secvenţe repetitive.

La persoane diferite aceste secvenţe sunt repetate de un număr diferit de ori: o persoană poate avea cinci
repetiţii într-un locus (situs) ADN specific, altă persoană poate avea şapte. Folosind probe, de ex. din sânge
sau spermă, putem analiza secvenţele repetitive din mai mulţi loci ADN; această analiză se numeşte
amprentă genetică. La fel ca amprentele digitale, amprentele genetice pot fi folosite pentru identificarea
persoanelor.

Deşi termenul ‚amprentare genetică’ (sau identificarea profilului genetic) este folosit curent, nu toată lumea
ştie că el cuprinde două tehnici foarte diferite, dintre care numai una este folosită curent în practica
criminalistă.

Amprentarea genetică timpurie: polimorfismul lungimii

fragmentelor de restricţie
Prima metodă de amprentare genetică a fost inventată în 1984 de Alec Jeffreysw2, are a folosit secvenţele
ADN cunoscute ca ‘număr variabil de repetiţii în tandem’ (VNTR - variable number tandem repeats; de ex.
Secvenţa D1S80, (AGGACCACCAGGAAGG)n). Aceste secvenţe, cu 10-100 pb per repetiţie, pot fi
analizate folosind enzime de restricţiec, care funcţionează ca foarfeci moleculare şi taie ADN-ul la nivelul
unor secvenţe specifice (secvenţe de recunoaştere). În întregul genom, o secvenţă de recunoaştere de 6 pb
apare de circa 730 000 de ori.

Asta înseamnă că, dacă se taie genomul cu o anumită enzimă de restricţie, se obţin aproximativ 730 000
fragmente de restricţie de lungimi diferite. Şi aici devin importante VNTR-urile: numărul de repetiţii într-o
aglomerare VNTR particulară poate varia între indivizi, ceea ce înseamnă că şi lungimea fragmentelor
respective de restricţie este diferită între indivizi (Figura 1). Numim acest fenomen polimorfismul lungimii
fragmentelor de restricţie (RFLP - restriction fragment length polymorphism).

Dintre cele 730 000 fragmente de restricţie, numai câteva vor fi diferite între indivizi – prea puţine ca să fie
văzute cu ochiul liber. În loc de asta, cercetătorii folosesc o tehnică numită Southern blotting, care permite
să fie vizualizate numai secvenţele de interes. Pentru asta, ei separă fragmentele de restricţie în funcţie de
mărime, prin electroforeză în gel, folosind curentul electric ca să facă fragmentele de ADN încărcate electric
să se deplaseze în gel. Distanţa parcursă este determinată de mărimea fragmentului . În continuare, ei
transferă ADN-ul pe o membrană şi utilizează o sondă marcată radioactiv care este complementară cu
VNTR-urile de interest. Are loc procesul de hibridizare (ataşare) a sondei cu secvenţele corespunzătoare şi,
punând membrana peste un film radiografic, se obţine o imagine a benzilor marcate radioactiv, fiecare
reprezentând un fragment de lungime diferită . Această imagine este amprenta genetică.

Câte VNTR-uri trebuie comparate pentru a identifica cu certitudine o persoană ? Dacă cercetătorii aleg
VNTR-uri cu suficiente variante (de ex. D1S80, care poate fi repetat de 15 până la 41 de ori), ei trebuie să
compare doar patru VNTR-uri diferite pentru a ajunge la o capacitate de discriminare de 1:1 milion - mult
mai bună decât discriminarea de 1:10 oferită de tiparea ABO.

.
Tehnica actuală: amprentarea genetică prin PCR

Kary Mullis’ invention, in 1983, of the polymerase chain reaction (PCR) won him the Nobel Prize in
Chemistryw3, w4. Descoperirea, la sfârşitul anilor 1980, a ‚repetiţiilor de secvenţe scurte în tandem’ (STR –
short tandem repeats) – secvenţe de 2-9 pb repetate, numite şi microsateliţi -, împreună cu inventarea PCR,
au deschis drumul pentru tehnica rapidă de amprentare genetică folosită astăzi de criminalişti.

Prin PCR, un locus ADN de interes (de ex. STR-ul de 4 pb cunoscut ca D18S51, (AGAA) n) este amplificat
exponenţial, generându-se un miliard de copii ale unei singure molecule de ADN în câteva ore (Figura 3).
Pentru criminalişti, avantajul este că se poate analiza astfel chiar şi cea mai mică probă – începând cu 30 de
celule (observați în Tabel 1 comparaţia cu amprentarea genetică bazată pe RFLP).

Pentru analiza PCR, avem nevoie de STR-uri flancate de secvenţe comune tuturor fiinţelor umane (numim
aceste secvenţe conservate). Atunci putem folosi primeri (amorse) – molecule scurte complementare
secvenţelor marginale conservate (genele 1134 şi 1135 în Figura 4) – pentru a iniţia PCR. Odată ADN-ul
amplificat, îl putem separa fie prin electroforeză în gel fie, în medicina legală modernă, prin secvenţiere
electroforetică automată , and visualise it as a genetic fingerprint.
Există două copii ale fiecărui cromozom, deci vom avea câte două copii pentru fiecare STR. Dacă o
persoană are acelaşi număr de repetiţii (adică aceleaşi alele) pentru fiecare copie a STR, din analiza PCR vor
rezulta fragmente de ADN de aceeaşi mărime: individul este homozigot pentru alela STR respectivă. Dacă
cei doi cromozomi conţin alele diferite pentru acel STR, vom obţine fragmente de două mărimi şi spunem
că individul este heterozigot.

Dacă analizăm un singur STR, şansele ca două persoane neînrudite să aibă aceeaşi amprentă genetică
obţinută prin PCR sunt mari – între 1:2 şi 1:100 (săgeţi albastre în Figura 5). Motivul este că STR-urile au
mai puţine alele şi heterozigozitate mai scăzută decât VNTR-urile folosite pentru amprentarea genetică
bazată pe RFLP. Pentru a depăşi acest dezavantaj, analizăm simultan mai multe STR-uri; cu 16 STR, aşa
cum este uzual în criminalistica din Germania, putem obţine o capacitate de discriminare de 1:1 miliard.

RFLP PCR

Cantitatea de ADN Cel puțin 200 pg (aprox. 30 de celule) pentru un tipar STR
30–50 µg
inițial complet

Sensibilitate + +++

Genomul complet nu este necesar; produşii de degradare

sunt suficienţi din cauza secvenţelor scurte implicate
Calitatea ADN necesară
Complete genome (lungimea totală a secvenţei unui STR, inclusiv repetările
pentru analiză
multiple şi secvenţele marginale, este de aproximativ 50-
500 pb)
Ore
Durată Zile - săptămâni

+
+++ (Mai puține alele și mai puțină heterozigozitate per locus)
Capacitate de (Mai multe alele și mai Totuşi, amplificarea prin multiplex PCR (PCR cu mai mult
discriminare per locus multă heterozigozitate de o pereche de primeri) şi marcarea multicoloră permit
per locus) examinarea simultană a mai mult de 16 loci, ceea ce
asigură o excelentă capacitate de discriminare

Unitate repetitivă 10 pb – 100 pb 2 pb – 9 pb (4 pb în cazurile judiciare)

Detecție automată Nu este posibilă Este posibilă procesarea probelor în regim high-throughput

Număr de loci validați

(important dacă se
Număr limitat Număr mare
analizează persoane
înrudite)

Risc de contaminare + +++

Sunt necesare măsuri de Da (din cauza sondelor Nu (nu se folosesc sonde radioactive)
 RFLP PCR

securitate suplimentare? radioactive)

Aplicații ale amprentării genetice

Ştim acum ce este amprentarea genetică, dar cum se foloseşte ea? Amprentarea genetică prin PCR are o
largă aplicare în criminalistică: ea permite poliţiei să elimine sau să identifice suspecţi pe baza materialelor
genetice cum ar fi foliculi de păr, piele, spermă, salivă său sânge (citiți povestirea care poate fi descărcată
mai josw5). Totuşi, amprenta genetică singură nu este o dovadă suficientă pentru condamnare, întrucât rudele
apropiate pot avea amprente foarte asemănătoare (iar gemenii monozigoţi le au identice).

În plus, pentru a complica investigaţiile criminalistice internaţionale, deşi există o recomandare Europeană
de a analiza 16 STR-uri, fiecare ţară decide care STR-uri vor fi analizate, ceea ce face ca rezultatele să fie
dificil de comparat.

Metoda bazată pe PCR este folosită, la oameni, şi pentru testarea paternităţii, diagnosticarea maladiilor
genetice (de ex. Maladia Huntingdon), identificarea victimelor catastrofelor, trasarea arborelui genealogic,
căutarea persoanelor dispărute şi studierea personajelor istorice (de ex. Ultimul ţar al Rusiei şi familia sa). În
cazul altor organisme, poate fi folosită în scopul protecţiei mediului (de ex. pentru analiza fildeşului
confiscat), în investigaţiile privind drogurile (de ex. pentru analiza plantelor de canabis capturate), pentru
controlul calităţii apei şi alimentelor (de ex. prin identificarea microbilor contaminanţi), în medicină (de ex.
pentru detectarea infecţiilor virale cum ar fi HIV, hepatita sau gripă) şi în investigaţiile privind bioterorismul
(de ex. pentru identificarea tulpinilor microbiene).

Amprentarea genetică prin RFLP, deşi considerată depăşită din cauza avantajelor evidente oferite de metoda
PCR , este încă folosită pentru clasificarea plantelor şi animalelor în cercetarea fundamentală. Ea este utilă
în special atunci când nu există suficiente informaţii despre genomul unor specii – amintiţi-vă că, pentru
metoda PCR, avem nevoie de regiuni cu variaţii mari între indivizi şi care sunt flancate de regiuni
conservate cu secvenţe cunoscute.

Amprentarea genetică la școală

Izolarea ADN în clasă le va provoca elevilor un moment de uimire atunci când vor realiza că, în cele câteva
filamente de ADN precipitat cu alcool, care seamănă cu nişte şuviţe de vată, au în faţa ochilor informaţia
genetică completă care codifică un organism. Este un experiment uşor de făcut la şcoală folosind salivăw6
(sau celule epiteliale dintr-un kit comercial), mazăre (Madden, 2006), roşii, ceapăw7 sau timus de viţel (deşi
trebuie verificate restricţiile locale privind utilizarea timusului de viţel la şcoală)w8.

PCR-ul unui STR specific din ADN-ul uman, de exemplu D1S80 sau TH01, se poate realiza la şcoalăw6,
folosind la nevoie kit-uriw9 disponibile comercial. Dacă şcoala nu are acces la un termociclu, ciclul termic
poate fi realizat folosind trei băi de apă, deşi este incomod şi foarte laborios.

Dacă acest echipament nu este disponibil, există kit-uri care simulează şi, în acelaşi timp, simplifică întregul
proces de amprentare geneticăw10. Aceste kit-uri conţin fragmente de ADN care simulează amplificarea
diferitelor alele ale unui singur STR sau VNTR. (De fapt, sunt fragmente de restricţie din ADN-ul unui
plasmid sau fag lambda). ADN-ul are nevoie de electroforeză şi colorare ulterioară pentru ca elevii să poată
compara secvenţele de ADN amplificate dintr-o probă biologică cu cele ale mai multor suspecţi. Bineînţeles,
asta este foarte diferit de detectarea STR-urilor amplificate prin secvenţiere electroforetică automată (şi nu
ilustrează corect nici vizualizarea VNTR-urilor în Southern blotting, pentru că ADN-ul este colorat direct în
gel), dar demonstrează, totuşi, principiile procesului analitic. Când se folosesc aceste kit-uri de simulare,
elevilor trebuie să li se atragă atenţia că experimentele dau impresia că diferenţele dintre indivizi sunt uşor
de identificat, ceea ce nu este adevărat.