Sunteți pe pagina 1din 12

3.

MEDII DE CULTURĂ

3.1. Noțiuni generale


Mediul de cultură (mediul nutritiv) reprezintă orice substrat (lichid sau solid, organic
sau anorganic), obținut prin amestecarea mai multor substanțe cu proprietăți și compoziție
specifice, ce poate asigura dezvoltarea și multiplicarea microorganismelor, în afara mediului
lor natural.
Mediile nutritive sunt utilizate la izolarea, creșterea, înmulțirea și conservarea timp
îndelungat a microorganismelor, precum și pentru studierea proprietăților lor (caractere de
cultură, proprietăți biochimice) în vederea identificării taxonomice (a se vedea Anexa 3).
Pentru ca microorganismele să se poate dezvolta, mediile de cultură trebuie să
îndeplinească următoarele condiții:
 Să asigure microorganismelor cultivate cantitățile optime de apă și substanțe nutritive
specifice, care pot avea rol de sursă de carbon și energie, sursă de azot, săruri minerale sau
factori de creștere (tabel 4.1).
 sursa de carbon și energie – este necesară reacțiilor de biosinteză, creșterii și
multiplicării microorganismelor. Este reprezentată de compuși organici și anorganici:
1. monozaharide (arabinoza, glucoza sau dextroza, fructoza, galactoza, manoza,
ramnoza, xiloza);
2. di- şi oligozaharide (celobioza, lactoza, maltoza, rafinoza, trehaloza, zaharoza sau
sucroza);
3. polizaharide (amidon, celuloză, chitină, glicogen etc.);
4. acizi organici (citric, oxalic, tartric etc.);
5. lipide
 sursa de azot - este necesară biosintezei de proteine și acizi nucleici.
Microorganismele utilizează surse de azot organic și anorganic:
1. substanţe anorganice azotate (nitraţi, nitriţi, săruri de amoniu);
2. peptide şi proteine (peptonă, hidrolizat de cazeină, gelatină, keratină,
ovalbumină);
3. aminoacizi (glicină, glutamină, histidină, triptofan etc.);
4. uree
 sărurile minerale - sunt necesare în cantități mici și au rolul de a menține echilibrul
ionic al celulei:
- substanţe minerale (sub formă de săruri care să conţină Na, K, Mg, Ca, Fe, Cu, Zn,
Co, P, S etc.)
 factorii de creștere - sunt necesari în cantități mici acelor tulpini microbiene, numite
tulpini auxotrofe, care sunt incapabile sa îi sintetizeze pornind de la substanțele cu rol de
sursă de carbon sau azot
1. vitamine (tiamină, acid nicotinic, inozitol etc.);
2. acizi graşi cu lanţ lung de atomi de carbon (C12-C24), necesari pentru
dezvoltarea levurilor lipodependente.
Aceste substanțe trebuie să corespundă indicațiilor tehnice, să fie cântărite exact și să
fie introduse în ordinea indicată în compoziția mediului respectiv. De asemenea, sterilizarea
nu trebuie să altereze compoziția mediului; mediul trebuie să rămână steril până în momentul
însămânțării.
 Să ofere condiții optime de aerobioză / anaerobioză corespunzătoare microorganismului
de analizat;
 Să asigure un grad de umiditate optim microorganismului cultivat;
 Să aibă un anumit grad de alcalinitate sau aciditate corespunzător necesităților
microorganismului cultivat;
 Să fie repartizat în recipiente care să asigure menținerea sterilității și protecția față de
lumină;
 Să fie cât mai limpede pentru a putea fi studiate cât mai ușor caracterele
microorganismului aflat în cultură.

Tabel 4.1. Câteva ingrediente utilizate frecvent la prepararea mediilor nutritive


Ingrediente Obținere Compoziție/Utilizare
Peptona - prin hidroliza cărnii cu ajutorul - proteine cu greutate moleculară mare
pepsică pepsinei conținute de mucoasa
gastrică de porc, la 45-55ºC și la
pH acid = 1,7-2,2
Peptona - prin acțiunea tripsinei extrase la - amestec de oligolipide și aminoacizi
tripsică 37-40ºC și la pH = 7-8, timp de 12- (în proporție mai mică decât în
24 ore peptona pepsică)
Peptona - prin acțiunea pancreatinei - amestec de oligolipide și aminoacizi
pancreatică (tripsină+lipază+amilază )
Peptona - din soia - conținut ridicat de vitamine și
papainică de aminoacizi
soia - pentru cultivarea fungilor și
germenilor pretențioși
- nu se recomandă pentru studiul
fermentației
Sânge - se recoltează în condiții aseptice - se poate păstra la frigider la 4°C timp
de la animale sănătoase (berbec, de 2-3 săptămâni
cal, iepure) - se adaugă ca ingredient în
într-un balon cu perle de sticlă proporție de 5-10 %, într-un mediu
pentru defibrinare agarizat (lichefiat în prealabil și răcit
la 45-50ºC)
Serul - prin decantarea sângelui defibrinat - se folosește ca ingredient de
și apoi sterilizare prin filtrare sau îmbogățire a unor medii de cultură
tindalizare timp de 5-8 zile
Bila de bou - prin puncție din vezica biliară și - are acțiune selectivă față de
apoi sterilizare la 100ºC, timp de Salmonella sp.
30 min., 3 zile la rând
Gelatina - prin hidroliza colagenului din os - agent solidificator al mediilor de
și piele cultură
Agarul - extras din algele marine - agent solidificator al mediilor de
cultură (se adaugă 1,5-2%)
Extract de - sursă de aminoacizi și vitamine
drojdie - studiul drojdiilor și bacteriilor
- de porumb - cultivarea bacteriilor și ciupercilor
fitopatogene
Extracte
- de fasole - cultivarea bacteriilor din genul
vegetale
Rhizobium
- de cartof - cultivarea mucegaiurilor
4.2. Pregătirea şi sterilizarea mediilor

Prepararea mediilor este o etapă extrem de importantă, care condiţionează creșterea și


multiplicarea, precum și exprimarea fenotipică a tuturor caracterelor culturale ale
microorganismelor. Calitatea ingredientelor și modul de solubilizare a acestora, succesiunea
adăugării lor, ajustarea pH-ului şi repartizarea mediilor în vederea sterilizării, metoda de
sterilizare aplicată sunt factori importanți în reușita unui experiment.
La prepararea unui mediu de cultură se parcurg următoarele etape:
1. Cântărirea ingredientelor conform rețetei (cu ajutorul balanței analitice și farmaceutice),
dizolvarea completă și omogenizarea acestora în jumătate din cantitatea de apă, după care
se adaugă restul de apă până la volumul dorit. În unele cazuri, substanțele se dizolvă prin
încălzire;
2. Determinarea pH-ului și corectarea acestuia în funcție de specia ce urmează a fi cultivată.
pH-ul se poate determina:
o prin metoda colorimetrică (cu ajutorul substanțelor-indicator: albastru bromtimol,
metil-orange, roșu de metil, fenolftaleină) sau hârtia de pH (impregnată cu
indicatori de diferite culori):
o prin metoda electrometrică utilizând pH-metrul (măsoară diferența de potențial
electric generat de diferența de concentrație a ionilor de hidrogen între cei doi
electrozi)
3. Filtrarea mediului de cultură pentru a îndepărta eventualele precipitate și recorectarea pH-
ului (dacă este cazul);
4. Sterilizarea se realizează în funcție de compoziția mediului pentru a evita degradarea
anumitor componente. Pentru majoritatea mediilor, sterilizarea se realizează prin
autoclavare la 121°C, timp de 15-20 minute. În cazul mediilor ce conțin zaharuri,
sterilizarea se realizează prin autoclavare la 110°C, timp de 10-15 minute sau prin filtrare
sterilizantă sau soluțiile conținând glucide se introduc separat prin filtrare cu ajutorul
filtrelor Puradisc. În cazul mediilor conținând substanțe termolabile (ser, sânge, lapte,
must, vitamine etc.), sterilizarea se realizează prin tindalizare sau filtrare sterilizantă;
5. Reajustarea pH-ului, dacă este cazul (în general după autoclavare, pH-ul scade cu
aproximativ 0,3 uniăți);
6. Repartizarea mediului nutritiv în recipienți sterili (eprubete, tuburi Weinberg, tuburi Roux,
flacoane Erlenmeyer sau plăci Petri) se face în preajma becului de gaz sau în hota cu flux
laminar, în condiții aseptice, dar numai după ce mediul a fost deja sterilizat. Mediul de
cultură steril poate fi păstrat câteva săptămâni la 4°C.
7. Înainte de folosirea mediilor, controlul sterilității se realizează prin incubare la temperatura
de 28-37°C, timp de 24 de ore.

4.3. Clasificarea mediilor de cultură

Diversitatea compoziției mediilor de cultură impune realizarea unei clasificări care să


țină cont de mai multe criterii:

1. După proveniență
 Medii naturale : medii care conțin produse de origine:
 vegetală (fragmente de tulpină, must de malț, tuberculi, rădăcini etc.);
 animală (bilă, lapte etc).

 Medii sintetice: medii care au o compoziție chimică bine definită (de exemplu mediul
Czapek-Dox).
 Medii artificiale: medii care conțin ingrediente cu compoziție chimică nedefinită (de
exemplu: extracte de drojdii, extracte vegetale sau animale).
2. După consistență
 Medii lichide
 Medii semisolide
 Medii solide - se subclasifică în:
 Medii solide propriu-zise, care prin însăși compoziția lor sunt în stare solidă,
(Exemplu: cele preparate din semințe, fragmente de tulpină, tuberculi, rădăcini etc).
 Medii solidificate cu ajutorul gelatinei, silicagelului sau agarului. Agarul este cel mai
utilizat agent de solidificare a mediilor, deoarece nu este metabolizat de către
microorganisme, nu modifică pH-ul mediului și are proprietatea că la 40°C se
prezintă sub formă de gel, iar la 100°C sub formă lichidă;

3. După compoziție
 Medii minimale: sunt utilizate la cultivarea microorganismelor cu necesități nutriționale
scăzute.
 Medii complexe: sunt folosite la cultivarea și conservarea germenilor care necesită
numeroși factori de creștere (în această categorie intră majoritatea mediilor de cultivare a
germenilor patogeni)
 Solidificate: geloză-sânge, geloză-ser;
 Lichide: bulion-sânge, bulion-ser, bulion-lichid de ascită

4. După scopul utilizării


 Medii uzuale simple: sunt folosite în mod curent în laborator pentru cultivarea unui
număr mare de microorganisme. Exemple: bulion nutritiv, apa peptonată, geloza simplă).
 Medii speciale: prin compoziția lor complexă permit creșterea preferențială a unor
anumite specii dintr-un amestec heterogen de microorganisme sau punerea în evidență a
unor anumitor caractere metabolice ale microorganismelor. Din categoria mediilor
speciale fac parte:
 Mediile de îmbogățire: favorizează dezvoltarea unei specii de microorganisme dintr-
un amestec heterogen în care numărul germenilor este redus. Ele nu conțin substanțe
bacteriostatice, dar prin compoziția lor asigură condiții preferențiale de creștere
pentru anumite specii bacteriene, care se pot înmulți și dezvolta mai rapid decât
microorganismele din asociație. Exemplu: mediul cu ou (mediu Löwenstein)
favorizează dezvoltarea speciei de Mycobacterium tuberculosis.
Există mai multe procedee care favorizează creșterea numărului de celule din specia
de interes, cum ar fi: tratamentele termice, pH-ul selectiv al mediului, anumite
substanțe nutritive din mediu, etc.
 Mediile selective: conțin unul sau mai mulți agenți inhibitori (coloranți, antibiotice,
săruri biliare etc.) . Scopul acestor inhibitori este de a limita multiplicarea anumitor
microorganisme dintr-un amestec și favorizarea creșterii altor specii microbiene față
de care nu au efect agenții inhibitori respectivi. Exemple: un mediu ce conține cristal
violet (1:500.000) sau penicilină (50 UI/mL mediu) inhibă dezvoltarea bacteriilor
Gram-pozitive. Azida de sodiu sau teluritul de potasiu inhibă creșterea bacteriilor
Gram-negative și permite dezvoltarea celor Gram-pozitive. Sărurile biliare inhibă
microorganismele cu excepția bacteriilor coliforme.
 Mediile elective: nu conțin inhibitori de creștere, dar prin compoziția lor specifică
satisfac necesitățile minime ale unei anumite specii microbiene. Exemplu: mediul
Loeffler este folosit pentru izolarea speciei de Corynebacterium diphteriae.
 Mediile de conservare sau de menținere: sunt destinate conservării timp îndelungat a
microorganismelor. Ele trebuie să asigure o bună viabilitate a microorganismelor
cultivate pentru un timp mai îndelungat. Exemple: mediul geloză simplă pentru
bacterii, mediul YPG- Yeast Peptone Glucose pentru drojdii și mediile Sabouraud și
Czapek-Dox pentru fungi.
 Mediile de transport: permit supraviețuirea tulpinilor microbiene ce nu pot fi
însămânțate imediat după recoltare. Exemplu: mediul Carry-Blair pentru vibrionul
holerei.
 Mediile de diagnostic preferențial: prin compoziția lor, evidențiază anumite
particularități metabolice, caracteristice unei specii de microorganisme. Exemple:
speciile de drojdii care fermentează substratul glucidic se recunosc prin acidifierea
mediului, evidențiată cu ajutorul unei substanțe-indicator de pH și prin producerea
de gaz. Pe geloza MacConkey (conține lactoză și roșu neutru), coloniile unor specii
care fermentează lactoza se coloreză în roșu sau roz. Ele se diferențiază de cele care
nu fermentează lactoza și rămân necolorate.

5. După prezența sau absența oxigenului


 Medii pentru cultivarea microorganismelor aerobe
 Medii pentru cultivarea microorganismelor anaerobe
 pot avea aceeași compoziție ca și mediile pentru aerobi, dar li se adaugă substanțe cu
efect reducător (acid ascorbic, cisteină, fragmente proaspete de organe vegetale sau
animale, boabe de orez în curs de germinare, boabe de strugure, bucăți de ridiche, ficat,
splină);
 Pentru eliminarea aerului dizolvat în ele, mediile din această categorie trebuie fierte
înainte de însămânțare;
 Pentru cultivarea microorganismelor anaerobe pe medii lichide, după însămânțare se
adaugă la suprafață un strat de ulei de parafină;
 Pentru cultivarea microorganismelor anaerobe pe medii solide, acestea se repartizează în
coloană pentru a evita difuzia oxigenului.

EXEMPLE - Medii de cultură pentru bacterii


Bulion nutritiv
Peptonă 10,0 g
Extract de carne 10,0 g
NaCl 5g
Apă distilată 1000 mL
Ingredientele se dizolvă la cald, iar după răcire pH-ul se ajustează la 7,6 cu NaOH.
Mediul se filtrează prin hârtie și se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.
Mediul geloză simplă
Bulion nutritiv 1000 mL
Agar 20 g
Amestecul se încălzește pe baie de apă până la dizolvarea agarului și se sterilizează
prin autoclavare la 121°C, timp de 30 minute. Pentru a izola bacteriile acetice se folosește
mediul geloză simplă, la care se adaugă pentru fiecare 10 mL de mediu câte 0,1 mL soluție de
penicilină 0,25% și 0,2 mL soluție de natamicină 0,25%. Mediul se autoclavează timp de 10-
15 minute la 110°C sau se filtrează prin membrană sterilizantă.
Mediul Luria-Bertani – cultivarea și conservarea bacteriilor
Extract de drojdie Difco 5g
Peptonă Difco 10 g
Glucoză 20 g
Agar 20 g
Apă distilată 1000 mL
pH = 7,0
Mediul se autoclavează la 120°C, timp de 15 minute.
Apă peptonată
Peptonă 10-20 g
NaCl 5g
Apă distilată 1000 mL
Mediul se autoclavează la 121°C, timp de 30 minute.

EXEMPLE - Medii de cultură pentru fungi

Mediul YPG – cultivarea și conservarea drojdiilor


Extract de drojdie Difco 5-10 g
Peptonă Difco 10 g
Glucoză 20 g
Agar 20 g
Apă distilată 1000 mL
Mediul se sterilizează prin autoclavare la 121°C, timp de 15 minute.
Mediul Czapek-Dox – pentru cultivarea fungilor saprobionte
Sucroză 30,0 g
NaNO3 3, 0 g
K2HPO4 0,35 g
MgSO4 0,5 g
KCl 0,5 g
Sulfat feros 0,01 g
Apă distilată 1000 mL
pH = 7,3
Mediul se autoclavează la 121°C, timp de 15 minute.
Mediul Czapek-pentru recoltarea fungilor
Glucoză 30,0 g
Extract de drojdie 5,0 g
NaNO3 3,0 g
MgSO4 x 7H2O 1,0 g
KCl 0,5 g
Sulfat feros 0,01 g
Agar 20,0 g
Apă distilată 1000 mL
pH = 6,0
Dacă se adaugă 40µg streptomicină/mL de mediu răcit la 45-50°C, mediul devine
selectiv pentru mucegaiuri și drojdii. Mediul se sterilizează prin autoclavare, la temperatura
de 121°C, timp de 15 minute.
Mediul nutritiv cu amidon
Amidon solubil 40 g
Extract de drojdie 5g
Agar 20 g
Agar nutritiv (geloză Martin) 1000 mL
Mediul se sterilizează la 121°C, timp de 15 minute.
Mediu cartof- glucoză-agar
Infuzie de cartofi 200 g
Glucoză 20 g
Agar 15 g
Apă distilată 1000 mL
Componentele se pun în suspensie și se amestecă cu grijă. Se încălzește suspensia
până la fierbere, agitând continuu. Se repartizează în flacoane și se sterilizează în autoclavă la
118°C timp de 15 minute.
4. PRELEVAREA ȘI PREPARAREA PROBELOR PENTRU
TESTAREA MICROBIOLOGICĂ

4.1. Prelevarea probelor


Orice probă destinată testării microbiologice trebuie să îndeplinească anumite condiții:
 Proba repezentativă trebuie să reprezinte caracteristicile generale ale lotului din care a
fost prelevată, motiv pentru care aceasta trebuie prelevată atât din profunzime, cât și de la
suprafață;
 Stabilirea punctelor de prelevare a probelor se face în funcție de configurația lotului,
recoltând în zig-zag, în diagonală sau în alte moduri care să asigure uniformitatea
recoltării (figura 5.1).

Figura 5.1. Mod de recoltare a probelor în zig-zag (A) sau în diagonală (B)
(sursa www.alcedoltd.ro)

 Prelevarea trebuie să se facă în condiții aseptice, în apropierea flăcării unei spirtiere, în


recipienți și cu ustensile sterile (care pot fi flambate pe loc sau sunt sterilizate în prealabil
prin autoclavare: bisturie, scalpere, pense, spatule inox).
 Etichetarea corectă a probei permite identificarea ușoară a acesteia. În unele cazuri se
completează o fișă de prelevare. Se vor nota lotul din care a fost prelevată, locul, data,
numărul probei, precum și alte caracteristici particulare utile testării microbiologice.
 Transportul probelor în recipienți izotermi și depozitarea acestora în frigider (0-4°C) au ca
scop conservarea tuturor caracteristicilor probei, în principal a microflorei prezente în
produs la momentul recoltării probei (atât din punct de vedere calitativ cât și cantitativ),
până la efectuarea analizelor ce se impun (cât mai rapid posibil).

În continuare sunt prezentate câteva exemple referitoare la modul în care se poate face
recoltarea probelor.
 Prelevarea probelor de sol
 se face în fiole de sticlă sau altfel de recipienți prevăzuți cu o bună închidere (inclusiv
pungi) sterile;
 se folosesc spatule care se flambează la flacăra unei spirtiere în momentul recoltării
probei, atunci când proba provine de la mică adâncime sau sonde special destinate
extragerii de la diferite adâncimi (figura 5.2).
Figura 5.2. Sonde destinate prelevării probelor de sol
(sursa www.multilab.ro)

 Prelevarea probelor de apă


 Din rețeaua de apă potabilă (de la robinet)
 se folosesc sticle de 100-150 mL, cu dop rodat sau de cauciuc sterile;
 se deschide robinetul şi se lasă să curgă în jet puternic, timp de 5-10 min., după care se
închide robinetul şi se flambează;
 se deschide din nou robinetul şi se reglează debitul apei, astfel încât să se formeze o
coloană de apă continuă de maxim 1 cm diametru.
 se scoate dopul flaconului, se aşează vertical sub coloana de apă, se umple şi se acoperă
cu dopul.
 Din râuri, lacuri, bazine, de acumulare sau alte surse de adâncime
 se folosesc recipienți speciali, fixați pe tije sau prevăzuți cu dispozitive de scufundare
(figura 5.3)
Pentru examen microbiologic, probele de apă recoltate vor avea un volum minim de
500 mL, iar flacoanele vor fi umplute pâna la aproximativ 2 cm sub dop.

Figura 5.3. Sonde de prelevare manuală/automată a apelor de suprafață și subterane/de


adâncime (sursa www.multilab.ro)
 Analiza aerului (determinarea aeroflorei)
Aceasta are drept scop îndeplinirea şi realizarea criteriilor de igienă şi a criteriilor de
siguranţă a alimentelor din diverse spaţii de procesare, transport şi comercializare, destinate
industriei alimentare, farmaceutice, localurilor publice și mediului spitalicesc.
O metodă clasică cu minimum de dotare reprezintă metoda Koch. Această metodă
constă în expunerea la aer timp de 10 min. a unor cutii Petri conținând mediu nutritiv și astfel,
colectarea pe suprafața acestuia a particulelor microbiene care se depun gravitațional, urmată
de incubarea materialului. În funcție de dimensiunile încăperii, numărul cutiilor Petri utilizate
poate să varieze între 7-12. Plăcile se aşează astfel:
- repartizarea lor în încăpere trebuie să fie cât mai uniformă;
- la o distanță de 1-1,5m față de pereți și de 2 m unele față de altele;
- în încaperile de lucru – la nivelul suprafeţelor de lucru;
- în depozite: - la înălţimea de 0,8 – 1,0 m.
Dupa 10 min., plăcile se acoperă cu capacele lor și se incubează imediat la 37°C, timp
de 48 de ore).
În prezent se folosesc tot mai des aparate care aspiră un volum determinat de aer din
incinta de analizat pe suprafața unui mediu de cultură solid care, după incubare va face
posibilă aprecierea numărului de unități formatoare de colonii (UFC), adică a germenilor
viabili din volumul de aer aspirat (figura 5.4).

Figura 5.4. Aparate pentru prelevarea probelor de aer


(sursa www.multilab.ro)

 Prelevarea probelor de lichide, solide și pulberi industriale


Activitățile industriale îmbracă forme foarte variate, iar volumul produselor (materii prime
și finite) care trebuie controlat este foarte mare, motiv pentru care, în prezent, tehnicile de
prelevare a eșantioanelor destinate controlului sunt extrem de performante și foarte bine
adaptate situațiilor (figura 5.5).

Figura 5.5. Instrumente pentru recoltarea probelor lichide, solide și pulberi industriale (sursa
www.multilab.ro)
 Prelevarea probelor pentru determinarea microflorei de pe fructe, legume
Se recoltează fructele de analizat în pungi de plastic sterile, se trec apoi în baloane cu apă
distilată sterilă, fie întregi, fie bucăți, în cazul celor mai mari. Prin agitarea lor în balon,
microorganismele trec în suspensie în apa distilată sterilă din balon, din ea urmând a se
recolta probe, în fiole sterile, cu ajutorul unor pipete sterile.
 Prelevarea produselor patologice (sânge, spută, urină, materii fecale, secreții și exudate
etc.) se realizează conform unor tehnici care presupun anumite reguli stricte pentru fiecare
categorie de produs în parte și o anumită pregătire medicală.
o prelevarea unei probe provenind din organe și țesuturi:
- cauterizarea suprafeței organului cu o spatulă special destinată acestui scop;
- aspirarea lichidului cu o pipetă Pasteur sterilă, înțepând ușor organul de analizat;
- însămânțarea probei pe un mediu de cultură adecvat, steril, prin una dintre
metodele prezentate mai sus.
o prelevarea unor probe din produse patologice fluide:
- recoltarea sângelui cu o pipetă Pasteur prin puncții cu instrumente (ace, seringi)
sterile, la nivelul cordului pentru animalele mici sau prin puncții venoase la cele
mari;
- recoltarea exudatelor (puroi, lichid pleural, peritoneal etc) cu acul sau pipeta
Pasteur prin puncții sterile ale cavității respective;
- recoltarea secrețiilor și excrețiilor cu sonde sterile;
- însămânțarea probelor pe medii de cultură adecvate, sterile, prin una dintre
metodele prezentate mai sus.
o prelevarea unei probe provenind de pe suprafața mucoaselor:
- recoltarea cu tampoane sterile, urmând însămânțarea directă cu tamponul pe
suprafața mediului sau diluarea probei într-un lichid diluant (soluție fiziologică
sterilă) și apoi etalarea suspensiei obținute prin una din tehnicile descrise anterior.
Abordarea aprofundată a acestor metode face obiectul unei discipline de microbiologie
specială (Microbiologie medicală).

4.2. Pregătirea probelor prelevate


Determinarea încărcăturii microbiene a unui eșantion se poate analiza atât din punct de
vedere calitativ, cât și cantitativ. În majoritatea cazurilor, analiza microbiologică a oricărui
produs se realizează pornind de la suspensii obținute din eșantionul respectiv.
Pregătirea probelor se face în condiții aseptice:
 se ia tarra recipientului steril și se cântărește;
 se cântârește aseptic o cantitate din proba de analizat, astfel încât rezultatele
numărătorilor să se raporteze la greutatea produsului de analizat (echivalent per gram
sau per mL);
 se adaugă diluantul stabilit prin calcul, astfel încât să obținem soluția mamă cu titrul
determinat 1/5, 1/10, 1/15 etc., în funcție de cât se presupune că este încărcată
microbian proba respectivă.

masa eșantionului din proba de analizat


volumul total (eșantion + diluant)
Exemplu
Dacă am cântărit 5 g dintr-un produs, atunci pentru a obține o soluție mamă de 1/10 se
adaugă de 10 ori mai mult diluant. Aceasta înseamnă:

Atunci când se cuantifică încărcătura microbiană a unui gram de produs se realizează


prin înmulțirea rezultatului obținut în urma analizei microbiologice a 1 mL soluție mamă cu
10.
Diluantul utilizat la obținerea de suspensii este apa distilată sterilă sau soluție
fiziologică sterilă (0,9% NaCl). El trebuie să asigure supraviețuirea tuturor microorgansimelor
și nu trebuie să influențeze cantitativ sau calitativ microflora prezentă în produsul de analizat.
În plus, pentru trecerea microorganismelor de pe suprafața produsului de analizat în
diluant sau pentru cele care au un conținut ridicat de grăsimi se recomandă adăugarea la
diluant a unui agent tensioactiv (de exemplu, Tween 80), fără efect microbiocid.
Omogenizarea probei cu diluantul trebuie să se realizeze fără distrugerea
microorganismelor prezente, astfel încât suspensia rezultată să fie cât mai limpede, fără
particule de produs.
După pregătirea eșantionului conform tehnicii prezentate mai sus, se trece la
efectuarea unor diluții și la însămânțarea pe medii de cultură solide în vederea determinării
U.F.C. (unități formatoare de colonii), folosind una dintre metodele prezentate la capitolul 8.

S-ar putea să vă placă și