PRACTICA Nº 01

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Introducción:

Las enzimas pueden ser descritas como catalizadores complejos de origen

biológico que tienen un alto grado de especificidad y eficiencia, esto permite que las
reacciones químicas dentro de la célula ocurran rápidamente a través de vías bien
definidas. Sin estas proteínas especializadas, la vida tal como es no podría existir.

Para poder demostrar la actividad enzimática se debe tener presente

fundamentalmente que la acción catalítica de las enzimas es de carácter específico, es
decir, cada reacción química debe ser catalizada por una determinada enzima.

Existen diversos tipos de enzimas, cuya funcionalidad es muy variada. Las

enzimas contribuyen al desdoblamiento de las moléculas de los principios nutritivos
(proteínas, grasa y carbohidratos) en otras más pequeñas durante la digestión de los
alimentos. Asimismo, facilitan su paso a la sangre a través de la pared intestinal; catalizan
la formación de moléculas grandes y complejas con el fin de producir los constituyentes
celulares, y favorecen el almacenamiento y gasto de energía. Las enzimas, también actúan
en las funciones de la reproducción, procesos de la respiración, y en todos los demás
mecanismos orgánicos.

En el desarrollo de la práctica nos centramos en una de ellas: la α-amilasa salival,

todo esto para demostrar la actividad enzimática que posee (o no) para degradar el
almidón en productos más simples como la maltosa, α dextrina limitante y glucosas;
basándonos en la presencia de precipitados y distintas coloraciones obtenidas utilizando
los reactivos adecuados para ello. Para medir si hay o no actividad enzimática, se puede
realizar de dos maneras.

a. Controlando el sustrato no transformado (sustrato residual).

b. Controlando los productos liberados después de un tiempo determinado de
incubación en condiciones específicas de pH y temperatura.

La finalidad de este trabajo experimental es determinar la actividad de la α-amilasa

salival; enzima que como la pancreática tiene la capacidad de producir la degradación del
almidón, maltosa para formar glucosa.

Objetivo:

- Utilizando como enzima la α-amilasa salival y como sustrato almidón, el alumno

será capas de demostrar la actividad enzimática (catalítica) de esta enzima,
determinando:
a. La presencia del almidón no transformado (sustrato residual).
b. Determinando la presencia de carbohidratos reductores (productos de la
reacción).
 - Reconocer la conformación del sistema enzimático: Enzima-Coenzima-
Sustrato, y observar el proceso de la actividad enzimática.

Objetivos específicos:

- Reconocer al NaCl como cofactor de la amilasa salival.

- Demostrar la presencia de azúcares reductores a través de la utilización del
reactivo de Benedict.
- Reconocer el sustrato residual utilizando solución yodada.
- Demostrar la formación de productos como consecuencia de la actividad
enzimática de la amilasa salival.

Marco Teórico

1. Definición de enzimas, sustrato y cofactores:

Enzimas:

Las enzimas son catalizadores biológicos que reducen la energía de activación que
requiere una reacción, acelerando su producción. Esto aumenta la probabilidad de que
las moléculas de reactante lleguen a un estado mínimo de energía para que se
produzca la reacción.

Propiedades de las Enzimas:

a. Aumentar la velocidad de una reacción al disminuir la barrera deenergia

de activación.
b. No se consume ni sufre cambio permanente de su estructura durante el
proceso catalítico.
c. No altera la posición de equilibrio de la reacción, sólo la velocidad a la
cual se alcanza dicho equilibrio.
d. Por lo general, actúan formando un complejo transitorio con el reactivo,
estabilizando así el estado de transición.

Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos
están catalizadas por enzimas. Las enzimas son catalizadores específicos: cada
enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato
o sobre un grupo muy reducido de ellos.

Sustrato:
En una reacción catalizada por un enzima:
1. La sustancia sobre la que actúa la enzima se llama sustrato.
2. El sustrato se une a una región concreta de la enzima, llamada sitio activo o sitio
catalítico. El sitio activo comprende: (a) un sitio de unión formado por los
aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y (b) un sitio catalítico,
formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la
reacción.
 3. Una vez formados los productos la enzima puede comenzar un nuevo ciclo de
reacción.

1.- El enzima y su 2.- Unión al centro 3.- Formación de

sustrato activo productos

Cofactores:

Los cofactores pueden ser iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc.
Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es
una molécula orgánica se llama COENZIMA. Muchos de estas coenzimas se
sintetizan a partir de vitaminas.

Materiales y Métodos

Materiales:

- Gradilla
- 6 tubos de ensayo
- Pipetas
- Incubadora para “Baño María” a 37°C
- Cocina eléctrica

Reactivos a utilizar:
1. Solución de Almidón pH 6.6 al 1%
2. Cloruro de Sodio solución 0.1M
3. Enzima al 1%
4. Ácido clorhídrico 0.05N
5. Solución yodada

Procedimiento Experimental:
Armar el siguiente sistema:
 ETAPA A:

SISTEMA
COMPONENTES I II
-Solución Almidón 1% 5 ml. 5 ml.
pH 6.6
-Solución de Cloruro de 1 ml. 1 ml.
Sodio 0.1M
Agua Destilada 4 ml. 3 ml.

1. Colocar los tubos al BAÑO MARÍA DE AGUA A 37º C. por 5 minutos.

2. AGREGAR 1ml. De ENZIMA al tubo II, sin retirar del B.M.
3. Seguir con el BAÑO MARÍA DE AGUA A 37º C. durante 30 minutos.

4. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR EL SUSTRATO

RESIDUAL.

De cada uno de los tubos de incubación (de la etapa A) transferir 01ml. de sus
correspondientes del cuadro siguiente (etapa B), inmediatamente de cumplidos los 30
minutos de incubación.

ETAPA B:

SISTEMAS
COMPONENTES I II
-De los tubos I y II: 01 ml 01 ml
De la Etapa A
-Ácido clorhídrico 0.05 N 05 ml 05ml.
- Solución yodada 0.5 ml 0.5 ml

Mezclar: observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del
color resultante.
 5. CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR LOS
PRODUCTOS FORMADOS.

ETAPA C:

SISTEMA
COMPONENTES I II
-De los tubos I y II: 1 ml. 1 ml.
De la Etapa A
-Benedict 1 ml. 1 ml.

Hervir por 10 minutos, mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de
acuerdo a la intensidad del color resultante.

Cuestionario:

1. ¿Cómo objetivó usted la presencia del sustrato en los tubos de ensayo?

2. ¿Cómo demostró usted si se ha producido o no reacción enzimática e el
experimento realizado?
3. ¿Cómo objetivó usted los productos de la reacción enzimática en el
experimento realizado?
4. ¿Qué diferencia y/o semejanza encontró entre los experimentos 4 y 5 para
determinarla actividad enzimática?

Evaluación de Resultados: