Identificación morfológica de células sanguíneas y

pruebas de aglutinación en sangre venosa.

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Asignatura de Inmunología, Carrera de Ingeniería en Biotecnología, Departamento de Ciencias de la
Vida y la Agricultura, Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, Sangolquí, Ecuador

Palabras clave: células inmunitarias, tinción Wright, tinción Giemsa, hemólisis.

Fecha de entrega: 24/11/2016

RESUMEN
En la presente práctica se realizó la toma de sangre venosa de diferentes individuos, cuyas muestras fueron
analizadas mediante un frotis sanguíneo para identificar células en sangre, para lo cual y se emplearon las
técnicas de tinción Wright y Giemsa, que fueron posteriormente observadas al microscopio óptico de campo
claro, en 100X. Se realizó la identificación morfológica de las células sanguíneas, eritrocitos y células
inmunitarias como: monocitos, linfocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos [Figura 1]. Se realizó también
la determinación del grupo sanguíneo mediante pruebas de aglutinación con anticuerpos monoclonales
Anti-A, Anti-B y Anti-D, en dos muestras, evidenciándose aglutinación en las pruebas con Anti-A y Anti-
D en el primer caso [Figura 2a] y aglutinación en la prueba con Anti-D en el segundo caso [Figura 2b],
identificándose el grupo A+ y O+, respectivamente.

INTRODUCCIÓN

El proceso de diferenciación de las células inmunes en un individuo ocurre durante el desarrollo

embrionario y también se presenta en la fase postnatal. En la primera fase se diferencian las células
hematopoyéticas derivando del mesénquima primitivo en el saco vitelino y de la región aorta-gonadal-
mesonefros (AGM), posteriormente ocurre en la placenta, hígado fetal, medula ósea y bazo, mientras en la
fase posnatal, el principal sitio de hematopoyesis es la medula ósea, sin embargo existen nichos en sitios
extra-medulares donde ocurre también este proceso (Mikkola & Orkin, 2006).
Las células inmunitarias en vertebrados superiores cumplen diversas funciones y se originan a partir de
células pluripotenciales en los órganos linfoides primarios, mientras en los órganos secundarios se brinda
un ambiente favorable que permita las interacciones entre células desencadenando la respuesta
inmunológica (Gonzáles, 2013). A partir de la célula hematopoyética polipotente se obtienen las células
madre mieloides y las células madre linfoides de donde pueden generarse todos los linajes sanguíneos,
siendo las células linfoides la línea blanca; basófilos, eosinófilos, neutrófilos, mastocitos, monocitos y
macrófagos la línea mieloide; los megacariocitos y plaquetas la línea trombocítica y los eritrocitos la línea
roja (Gilbert, 2005).
La célula madre mieloide puede diferenciarse en células precursoras de granulocitos-macrófagos (Sánchez
& Martín, 2011). El precursor de los granulocitos son los mieloblastos, en los monocitos encontramos a los
monoblastos, mientras los linfoblastos darán origen a los linfocitos B y T (Mesa, 2010).
Las células madre hematopoyéticas (CMH) son capaces de mantener sus características originales, como
su habilidad para proliferar y diferenciarse al cultivarse in vitro, siendo de gran interés en el área biomédica
contra enfermedades hematológicas, metabólicas, trastornos de médula ósea e inmunodeficiencia. Estas se
extraen de la médula ósea y la sangre de cordón umbilical en cantidades limitadas (Domínguez, Romero,
& Rodríguez, 2015).
Existen familias de glicoproteínas como Factores Estimulante de Colonias de Granulocitos y Monocitos
(GM-CSF), que son capaces de modular la hematopoyesis, controlar la sobrevivencia, proliferación,
diferenciación y capacidad funcional de los progenitores hematopoyéticos tanto in vivo como in vitro
(Mesa, 2010).
La línea blanca se origina a partir de las células madre linfoides, donde los linfocitos T se diferencian por
acción de la interleucina 3 y 7 (IL-3, IL-7) mientras los linfocitos B por acción de la interleucina 4 (IL-4)
(Guyton, 2011).
La tinción Giemsa contiene eosina, azul de metileno y productos de la oxidación del azul de metileno (azur
A, azur B, violeta de metilo y azul de metilo) (Cinara, 2013), mientras la tinción Wright se compone por
azul de métileno y eosina, por lo que estructuras con carácter ácido como genomas o proteínas ácidas, como
estructuras de carácter básico tales como la hemoglobina se observarán teñidas de azul de metileno y eosina,
respectivamente. La tinción de Wright es una técnica de relevancia, pues permite identificar la morfología
y diversas estructuras celulares, destacándose en la observación de estructuras del sistema inmunológico
(Lema, 2011).
Los granulocitos pueden ser neutrófilos (núcleo trilobulado), basófilos y eosinófilos y estos son
particularmente caracterizados debido a que en su estructura presentan gran cantidad de gránulos, mientras
los no granulocitos, que pueden ser monocitos y linfocitos presentan un solo núcleo, en el caso de los
monocitos este es en forma de riñón, mientras en los linfocitos el núcleo comprende prácticamente a toda
la célula (Gonzáles, 2013).
En la membrana de los eritrocitos existe gran variedad de antígenos, para los humanos se han identificado
más de 400 antígenos que pueden conformar gran variedad de sistemas, siendo los más conocidos el sistema
ABO y el sistema Rh (Silva & García, 2004). El sistema ABO es una prueba comúnmente realizada debido
a su importancia diagnóstica y pronóstica, que consiste en enfrentar a los glóbulos rojos de la muestra con
anticuerpos monoclonales de tipo IgM Anti-A, Anti-B o Anti-AB (Wiener Lab, 2000). La prueba indica
positivo a determinado antígeno al presentarse la aglutinación de la sangre. El sistema Rh presenta alrededor
de cuarenta antígenos, sin embargo, el D es el más importante debido a su antigenicidad (Iglesias, López,
Martín, & Prieto, 2007).
La presente práctica tuvo como objetivo la identificación morfológica de células de sangre venosa,
especialmente aquellas de carácter inmunológico empleando técnicas de tinción Wright y Giemsa; a su vez
determinar el grupo sanguíneo ABO a través de pruebas de aglutinación.

PROTOCOLO
1. Extracción de sangre
1. Lavarse las manos y desinfectarse con alcohol al 70°.
2. El paciente debe estar sentado y con su brazo descubierto.
3. Colocar el torniquete en la parte superior del brazo, de 10 a 15 cm por encima del lugar de
punción.
4. Desinfectar la zona en forma circular empleando una torunda humedecida con alcohol al 70°.
5. Una vez seco el área, puncionar la vena seleccionada con un Vacutainer y colocar un tubo tapa
morada con EDTA. Las venas más adecuadas para venopunción son fácilmente palpables,
flexibles.
6. Aflojar el torniquete.
 7. Retirar el tubo una vez que se haya llenado con la sangre, agitar para asegurar la
homogenización con EDTA y prevenir la coagulación.
8. Extraer el Vacutainer de la zona de punción cuidadosamente, mientras se coloca una torunda
de algodón humedecida con alcohol sobre el sitio de la punción.
9. Con mucho cuidado, cubrir la aguja con la tapa protectora y descartar el Vacutainer en el
depósito correspondiente.

2. Frotis sanguíneo
1. Limpiar dos portaobjetos con alcohol y dejar secar.
2. Con una micropipeta 10-100 μL tomar una gota de sangre y colocarla en un extremo del
portaobjetos.
3. El otro portaobjetos se utilizará para realizar el frotis de la sangre. Colocar el portaobjetos
sobre la gota a una inclinación de 45° y realizar la extensión de la gota hacia el otro extremo
del portaobjetos base, no deben quedar irregularidades en el frotis ni formación de burbujas.
4. Dejar secar el frotis sanguíneo.
Procedimiento modificado de: (Torres, 2016)

3. Tinción de la muestra
1. Colocar el frotis secado sobre una cubeta de tinción con la sangre hacia arriba.
2. Cubrir completamente el portaobjetos con el colorante de Wright gota a gota aproximadamente
5-8 minutos para fijar los glóbulos sanguíneos. El colorante debe cubrir completamente el
portaobjetos sin derramarse, y se agrega más colorante si comienza a evaporarse.
3. Lavar con agua en el chorro cuidadosamente hasta que la extensión presente un aspecto rosado
al examinarlo a simple vista.
4. Limpiar el dorso del portaobjetos con un papel para eliminar cualquier resto de colorante.
5. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo 100x y aceite de inmersión.
Procedimiento modificado de: (Torres, 2016)

4. Determinación del grupo sanguíneo y Rh

1. En un portaobjetos limpio, trazar tres círculos equidistantes.
2. Colocar una gota de sangre en cada círculo.
3. En cada circulo colocar una gota de reactivo distinto de anticuerpo Anti A, Anti B y Anti D
marca Plasmatec.
4. Mezclar el contenido de cada círculo con distintos palillos de madera estériles.
5. Observar la presencia o ausencia de aglutinación.
Procedimiento modificado de: (Torres, 2016)

RESULTADOS REPRESENTATIVOS

Se identificaron cinco tipos de células inmunitarias en sangre venosa [Figura 1], con ayuda del microscopio
óptico de campo claro en aumento de 100X, empleándose dos técnicas de tinción, siendo estas tinciones
Wright y Giemsa.
 a. b. c.

d. e.

Las muestras de dos individuos fueron analizadas con pruebas de hemólisis, obteniéndose para el primer
individuo el tipo sanguíneo A+ y para el segundo individuo el grupo sanguíneo O+ [Figura 2].

a. b.
Figura 2. Detección del grupo sanguíneo. (a) Muestra 1. Positivo para antígeno A, negativo para antígeno B,
positivo para antígeno Rh, respectivamente. Grupo sanguíneo A+. (b) Muestra 2. Negativo para antígeno A, negativo
para antígeno B, positivo para antígeno Rh, respectivamente. Grupo sanguíneo O+.

DISCUSIÓN
La tinción de frotis de sangre periférica permite la identificación de células sanguíneas mediante el
reconocimiento de su morfología a través del microscopio óptico de campo claro (Carr & Rodak, 2010).
Las tinciones más empleadas son las tinciones de Wrigth o Wright-Giemsa (Carr & Rodak, 2010), en la
práctica se emplearon las tinciones Wrigth y Giemsa, según Cruz & Camargo, (2001) este tipo de tinciones
reciben el nombre de colorantes de Romanovsky y son ampliamente usadas debido a que reaccionan con
los grupos ácidos o básicos de las proteínas del núcleo y el citoplásma; se componen de colorantes básicos
como el azul de metileno y sus productos de oxidación (azur A, azur B y azur C) y de colorantes ácidos
como la eosina (Rubio, García, & Carrasco, 2004).

Figura 1. Observación de células inmunitarias en sangre venosa. Lente óptico 100X. (a) Monocito - Tinción Wright. (b)
Linfocito - Tinción Wright. (c) Neutrófilo - Tinción Wright. (d) Eosinófilo – Tinción Giemsa. (e) Basófilos - Tinción Wright.
En dependencia del colorante que capten las estructuras de las células sanguíneas estas toman diferentes
nombres, por ejemplo, aquellas estructuras que fijen colorantes de naturaleza ácida se denominan
acidófilas, la eosina tiñe las estructuras de color rosado y se denominan eosinófilas; si las estructuras fijan
colorantes de naturaleza básica se denominan basófilas, el azul de metileno tiñe las estructuras de color
azulado, si el colorante fijado es de tipo azur, se denominan estructuras azurófilas y se tiñen de lila o púrpura
(Rubio, García, & Carrasco, 2004; Cruz & Camargo, 2001). Esta es la razón del nombre de algunos tipos
celulares, en la práctica se observó que los gránulos de eosinófilo tienen una coloración rosa anaranjado
(Fig. 1d) mientras que los gránulos de basófilo se tiñeron de azul (Fig. 1e). En el caso de los neutrófilos,
Abbas , Litchman, & Pillai, (2015) mencionan que los lisosomas son gránulos azurófilos, durante la práctica
estos gránulos citoplasmáticos tenían una coloración tenue (Fig. 1c), esta característica neutra o de
coloración débil es la razón del nombre neutrófilo (Silverthorn, 2009).

Respecto a la morfología de los leucocitos se observó que los monocitos presentan núcleos arriñonados
color morado-azulado (Fig. 1a), mientras que los linfocitos de un tamaño ligeramente mayor al de los
eritrocitos, son esféricos y su núcleo cubre la mayor parte del citoplasma (Fig. 1b), según Manascero, (2003)
esta característica es atribuible para los linfocitos pequeños, que en contraste con los linfocitos grandes el
citoplasma, de estos últimos, es mayor y tiene una coloración azul clara. Se observó también varios
neutrófilos con dos a cuatro núcleos conectados por filamentos delgados de color azul pálido ligeramente
morados, en estos no fue muy notoria la presencia de los gránulos (Fig. 1c), en el caso de los eosinófilos,
presentaron núcleos lobulados de coloración lila oscuro (Fig. 1d, se observan tres lóbulos bastante juntos),
sus abundantes gránulos teñidos de rosa anaranjado tienen gran cantidad de proteínas catiónicas citotóxicas
antiparasitarias que se unen a la eosina (Manascero, 2003). Se observó que los basófilos tiñen su citoplasma
de color lavanda, su núcleo es morado claro y sus gránulos tienen una coloración azul o morado oscuro
(Fig. 1e), se observó que en comparación a los gránulos de eosinófilos, los gránulos de basófilos tienen una
distribución irregular, según Carr & Rodak, (2010) estos pueden desprenderse durante la tinción dejando
áreas que parecen vacías en el citoplasma (Fig. 1e, zona derecha de la célula).

En la membrana de los eritrocitos existe gran variedad de antígenos, para los humanos se han identificado
más de 400 antígenos que pueden conformar gran variedad de sistemas, siendo los más conocidos el sistema
ABO y el sistema Rh (Silva & García, 2004). La caracterización del grupo sanguíneo se realiza por el
conocimiento de que existen aglutininas (anticuerpos) que atacan o se unen al antígeno no presente en la
sangre, aquellas personas que son del grupo A contienen aglutininas anti B, las del grupo B contienen
aglutininas anti A, el grupo O que tiene ambas aglutininas por carecer de ambos antígenos y el grupo AB
que no posee aglutininas por poseer ambos antígenos (Donnersberger & Lesak, 2002). En el caso del
sistema Rh, estos no poseen aglutininas naturales pero en presencia de sangre con incompatibilidad se
producen reacciones hemolíticas, en los eritrocitos pueden existir o no los antígenos de este sistema lo que
clasifica a los individuos como positivos o como negativos, el principal antígeno empleado para esta
determinación es el D (Silva & García, 2004).

En la práctica se emplearon antisueros comerciales anti-A, anti-B y anti-D para la determinación del grupo
sanguíneo, al unirse los anticuerpos con los antígenos correspondientes se produce una reacción de
aglutinación provocando la agregación de los eritrocitos (Dueñas, 2003). En las figuras 2a y 2b se observan
las pruebas de aglutinación para distintas muestras sanguíneas, el primer caso es de un individuo con grupo
sanguíneo A+, pues se observa la aglutinación de los eritrocitos en las muestras con anti-A y anti-D,
mientras que para el segundo individuo (Fig. 2b) se lo puede caracterizar con el grupo O+ pues no se
observa aglutinación en las muestras con anti-A, ni anti-B y tan solo existe agregación en la muestra con
anti-D.

Existen varias pruebas para determinar antígenos de superficie, en el caso de las pruebas para antígenos
ABH se emplean métodos en lámina (placa portaobjetos o similar) que la empleada en la práctica, en tubos
o en microplaca (Dueñas, 2003), existe también la prueba de hemólisis que implica la determinación del
grupo sanguíneo por lisis de los hematíes y se emplean para determinar la posible hemólisis específica de
un suero por incompatibilidad (Mollison, 2002). Adicionalmente existen pruebas de inmunodifusión, ya
sea simple o doble, e implica el uso de un soporte como el gel de agarosa al que se le añade el antígeno y
el anticuerpo de prueba, esta mezcla se deja difundir y se analizan los resultados como bandas de
precipitación (Siachoque, 2006). Las técnicas de radioinmunoanálisis utilizan antígenos o anticuerpos
marcados con radioisótopos y se cuantifican por detección de los fenómenos de desintegración radioactiva
(Abbas , Litchman, & Pillai, 2015). Una de las técnicas más utilizadas para la detección de anticuerpos o
antígenos es la técnica de enzimoinmunoensayo de adsorción (ELISA) en donde el anticuerpo o el antígeno
se une covalentemente a una enzima que por catálisis con un cromógeno permite realizar la cuantificación
(Abbas , Litchman, & Pillai, 2015; Siachoque, 2006).

CONCLUSIONES
La tinción de frotis de sangre periférica empleando tinciones Wright y Giemsa permite identificar y
diferenciar los distintos tipos de leucocitos basados en las tinciones y morfologías celulares, se lograron
observar neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos y basófilos, donde las estructuras del núcleo o
componentes citoplasmáticos se emplearon como pautas para reconocer a tipo celular.

La determinación del grupo sanguíneo basado en reacciones de aglutinación para antígenos del sistema
ABO y el sistema Rh se puede realizar empleando sueros de anticuerpos comerciales, el uso de los reactivos
anti-A, anti-B y anti-D permitió la caracterización de los grupos A+ y O+ para dos muestras sanguíneas
diferentes.

RECOMENDACIONES
Tanto para la identificación celular como para las pruebas de aglutinación se requieren portaobjetos limpios.
Una adecuada visualización de los leucocitos se consigue realizando un frotis adecuado de la sangre
evitando acumulaciones o formación de burbujas y empleando los colorantes durante el tiempo
recomendado.

BIBLIOGRAFÍA

Abbas , A., Litchman, A., & Pillai, S. (2015). Inmunología celular y molecular (8va. ed.). Barcelona:
Elsevier España.
Carr, J., & Rodak, B. (2010). Atlas de hematología clínica (3a. ed.). Buenos Aires: Médica Panamericana.
Cinara, L. (15 de julio de 2013). Hematología para el residente. Obtenido de Tinciones en hematología:
http://hematologiaparaelresidente.blogspot.com/2013/07/tinciones-en-hematologia.html
Cruz, A., & Camargo, B. (2001). Glosário de términos en parasitología y ciencias afines. México: Plaza
y Valdés .
Domínguez, M., Romero, H., & Rodríguez, J. (2015). Células Madre Hematopoyéticas: origen,
diferenciación y función. Medigraphic, http://www.medigraphic.com/pdfs/veracruzana/muv-
2015/muv151d.pdf.
Donnersberger, A., & Lesak, A. (2002). Libro de laboratorio de anatomía y fisiología (7ma. ed.).
Barcelona: Paidotribo.
Dueñas, V. (2003). El banco de sangre. Cali: Universidad del Valle.
Gilbert, S. (2005). Biología del desarrollo. Montevideo: Ed. Médica Panamericana.
Gonzáles, L. (17 de mayo de 2013). MARIANELA CASTÉS. Conciencia, Evolución, Salud. Obtenido de
CÉLULAS Y ÓRGANOS DEL SISTEMA INMUNE:
https://marianelacastes.files.wordpress.com/2013/05/cc3a9lulas-y-c3b3rganos-del-sistema-
inmune.pdf
Guyton, A. &. (2011). Tratado de Fisiología Médica. Jackson, Mississippi : ELSEVIER.
Iglesias, B., López, M., Martín, A., & Prieto, J. (2007). Bases de la Fisiolgía. Editorial Tébar.
Lema, A. (19 de septiembre de 2011). Obtenido de Tinción de Wright:
https://microeinmuno.files.wordpress.com/2011/09/tincic3b3n-de-wright.pdf
Manascero, A. (2003). Hematología herramienta para el diagnóstico: atlas de morfología celular,
alteraciones y enfermedades relacionadas (1a. ed.). Bogotá: CEJA.
Mesa, N. (2010). Universidad de Antioquia. Obtenido de Hematopoyesis:
http://medicina.udea.edu.co/emd/hematologia/clases/Hematopoyesis-2010-2.pdf
Mikkola, H., & Orkin, S. (2006). The journey of developing hematopoietic stem cells. NCBI, 3733-44.
Obtenido de The journey of developing hematopoietic stem cells.
Mollison, P. (2002). Transfusión de sangre en medicina clínica. Barcelona: Reverté.
Rubio, F., García, B., & Carrasco, M. (2004). Fundamentos y técnicas de análisis hematológicos y
citológicos (1a. ed.). Madrid: Ediciones Paraninfo.
Sánchez, F., & Martín, P. (2011). Avizores del Sistema Inmune, Guardianes del Organismo.
ResearchGate, 62-81. Obtenido de
https://www.researchgate.net/profile/Pilar_Martin3/publication/277801280_Avizores_del_Sistem
a_Inmune_Guardianes_del_Organismo/links/573c4c9d08aea45ee84171d7/Avizores-del-Sistema-
Inmune-Guardianes-del-Organismo.pdf
Siachoque, H. (2006). Inmunología: diagnóstico e interpretación de pruebas de laboratorio. Bogotá:
Universidad del Rosario.
Silva, M., & García, M. J. (2004). Manual del técnico superior de laboratorio de análisis clínicos.
Módulo I (1a. ed.). Sevilla: Mad.
Silverthorn, D. (2009). Fisiología humana: un enfoque integrado (4a. ed.). Buenos Aires: Médica
Panamericana.
Torres, M. (2016). Procedimientos para recolectar y procesar muestras sanguíneas y pruebas de
aglutinación. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. Sangolquí: Universidad de
las Fuerzas Armadas - ESPE.
Wiener Lab. (2000). Wiener Lab. Obtenido de Anti-A, Anti-B o Anti-AB: http://www.wiener-
lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/anti_a_anti_b_anti_ab_monoclonal
_sp.pdf