Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

Université Abdelhamid Ibn Badis-Mostaganem

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département d’Agronomie
Laboratoire de Technologie Alimentaire et Nutrition

Protocole expérimental en vue d’une inscription en Doctorat en Sciences

Intitulé du projet de recherche de Doctorat en Sciences :

« Effets antimicrobien des extraits bioactifs de Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis

(Romarin) sur les germes responsables de toxi-infections alimentaires. Impact sur la qualité
de la viande ovine au cours de la conservation au froid et après cuisson».

Présenté par : Mlle. BABADJI Khadidja

Encadreur : Dr. AIT SAADA Djamal

Co-encadreur : Dr. BENBOUZIANE Bouasria

Année Universitaire : 2018/2019

 1. Objectifs :
L’utilisation du froid est sans conteste la technique la plus répandue pour conserver les
aliments périssables. La réfrigération à des températures inférieures à 5°C, de ces aliments
fragiles dont la viande, notamment, a pour effet la diminution de l’activité métabolique de
la majorité des microorganismes tels que les coliformes fécaux et les germes pathogènes
responsables d’intoxications alimentaires en retardant leur prolifération. Cet abaissement de
la température est aussi indispensable pour contrôler les propriétés organoleptiques post
mortem de la viande (tendreté, flaveur et couleur). Les basses températures permettent
ainsi de conserver un produit pendant un temps plus ou moins long durant lequel il peut être
consommé avec sécurité tout en préservant ses qualités nutritionnelles, diététiques,
organoleptiques et hygiéniques. Toutefois, ce mode de conservation ne peut en général
excéder deux voir trois jours pour les viandes fraîches (Maas et al., 2005 ; Montel, 1984 ;
Collin, 1972 ; Craplet, 1966).

Il est aussi bien établi que les extraits des plantes médicinales riches en principaux composés
bioactifs exercent des effets antimicrobiens avérés contre de nombreux germes pathogènes, banaux,
et responsables d’intoxications ainsi que d’altérations alimentaires. Ces activités sont liées
essentiellement à la composition chimique, aux groupes fonctionnels des composés majoritaires de
ces extraits et à leurs effets synergiques.

Ces effets antibactériens nous ont conduit à poser les questions suivantes :

Hypothèse 1 : « Est ce que l'utilisation des extraits de certaines plantes médicinales comme additifs
naturels sur la viande fraiche peut avoir un effet sur la croissance des germes d’altérations et
responsables de toxi-infections alimentaires » ?

Hypothèse 2 : « Est ce que l'utilisation des extraits de certaines plantes médicinales comme adjuvant
peut améliorer la durée de conservation de la viande fraiche ovine maintenue à un froid positif de
3°C» ?

Hypothèse 3 : « Est ce que l'utilisation des extraits de certaines plantes médicinales comme adjuvant
combiné à un emballage sans vide et sous vide peut améliorer la durée de conservation de la viande
fraiche ovine réfrigérée à 3°C» ?

Hypothèse 3 : « Est ce que les extraits bioactifs de certaines plantes médicinales peuvent affecter la
qualité de la viande fraiche au cours de la conservation et après cuisson ». ?

Pour cela, nous nous somme proposé d’essayer de connaître les effets antimicrobiens des extraits
bioactifs de deux plantes médicinales autochtones à savoir le Thymus vulgaris (Thym) et
Rosmarinus officinalis (Romarin) vis-à-vis des germes responsables de toxi-infections
alimentaires et d’altération de la viande fraiche ovine en vue d’améliorer sa qualité et sa
durée de conservation au cours d’un entreposage au froid positif de 4°C.

D’une façon générale les objectifs escomptés à travers cette étude expérimentale s’articulent autour
de 5 points essentiels :

1- Faire un screening phyto-chimique des principaux composés bioactifs des deux plantes objet de
l’étude à savoir le Thymus vulgaris (Thym) et Rosmarinus officinalis (Romarin) prélevées dans la
région de Naama- Algérie.
2- Caractériser par HPLC le profil des principaux composés phénoliques et alcaloïdes des plantes
étudiées : Thymus vulgaris (Thym) et Rosmarinus officinalis.

3- Procéder à une extraction des principaux composés bioactifs des plantes par usage de solvants à
polarités croissantes dont: Hexane, Méthanol, Ethanol et à l’Eau.

4- Suivre les effets antimicrobiens des extraits aux solvants à différentes polarités de Thymus
vulgaris (Thym) et Rosmarinus officinalis (Romarin) sur quelques germes retrouvés dans les
viande et responsables d’intoxications alimentaires.

5- Enfin, suivre les effets d’ajout d‘extraits de Thymus vulgaris (Thym) et de Rosmarinus
officinalis (Romarin) sur la qualité microbiologique, physicochimique, nutritionnelle, diététique et
organoleptique de la viande fraiche ovine au cours de la conservation au froid à 4 °C.

2. Région de prélèvement et traitements préliminaires des plantes expérimentales

Les plantes objet de l’étude le Thymus vulgaris (Thym) et le Rosmarinus officinalis (Romarin)
seront prélevé, à maturité, à la fin du mois de Mai dans la région de Naama- Algérie. Un échantillon
de 2 à 3 kg pris uniquement sur la partie aérienne de chaque espèce étudiée sera récolté
aléatoirement dans la région expérimentale (les zones exactes de prélèvements seront déterminées
avec précision ultérieurement).
Les matières végétales seront ensuite étalées sur du papier aluminium, puis séchées à l’air ambiant.
Les échantillons séchés seront enfin broyés dans un broyeur à lame de cuisine puis mis dans des
bocaux hermétiques et conservés à sec (température ambiante) et à l'abri de l'humidité et de la
lumière.

3. Extraction des composés bioactifs aux solvants à différentes polarités

Selon Almas et Al-Bagieh (1999) et Almas (2001), les extraits à l’eau arrivent à agir en général sur
la croissance de certaines bactéries appartenant au genre Streptococcus à des taux d’extractions de
5g/100ml de matière végétale de Kikar (Acacia arabica) provenant du Pakistan et de l’Arak
(Salvadora persica) d’Arabie Saoudite.

Pour l'extraction des principaux composés bioactifs tels les polyphénols contenus dans le Thymus
vulgaris (Thym) et Rosmarinus officinalis (Romarin) on a opté pour l'utilisation d’une méthode
décrite par (Sultana et al., 2009). Cette méthode d'extraction n’est qu’un procédé d’extraction
discontinu solide-liquide par macération et qui consiste à laisser tremper le solide dans un solvant à
température ambiante durant quelques temps et à extraire les constituants solubles par évaporation
du solvant sous vide.
L'extraction des composés bioactifs sera réalisée par usage de plusieurs solvants à polarité croissante
(Hexane, méthanol, éthanol et eau). Elle sera effectuée séparément pour chaque solvant
d’extraction sur des prises d’échantillons de matière végétale broyée de 10 g. Chaque échantillon de
broyat de matière végétale sera mélangé avec 100 ml de solvant aqueux (80/20, solvant / eau, v / v).
L’extraction par macération à froid de chaque mélange sera laissée ensuite se poursuivre pendant 6
heures à température ambiante sous agitation. La durée de l'extraction favorisera ainsi la
dépolymérisation des principaux composés constitutifs de la plante tels que la lignine ainsi que les
substances pectiques et permet une meilleure solubilisation des principaux composés bioactifs.
Les extraits à l’hexane, à l’eau et hydro alcooliques obtenus seront filtrées en utilisant un papier filtre
Whatman N°3 ayant une porosité de 0,3µm et débarrassés des solvants par évaporation sous vide à
45 °C.
Les extraits purs riches en composés bioactifs récupérés seront enfin dilués à l’eau distillée stérile à
des taux variables de 0, 20, 40, 60, 80 et 100%, respectivement.

4. Effets antimicrobiens des extraits de Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis :

4.1 Activation des inocula microbiens :
L’étude concerne les souches pures de références responsables de toxi-infections alimentaires et
d’altérations de la viande au cours de la réfrigération dont Staphylococcus aureus, Clostridium
botulinum, Salmonella, shigella, Clostridium perfringens, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes,
Yersinia enterocolitica, E.coli entero hémorragique, Pseudomonas (Dennai et al., 2000 ; Fournaud,
1982 ; Heredia et al., 1982 et ROSSET, 1982).
Chaque espèce microbienne sera tout d’abord activée avant son utilisation expérimentale. Une
prise de 0.25 g de la souche lyophilisée conservée au froid à 4 °C est au préalable ensemencée dans
10 ml de bouillon nutritif MH liquide, puis incubée à 37°C durant 03 heures. 0,1 ml de cette dernière
solution constituant la solution mère sera pris pour être ensemencée en surface d’une boite de Petri
contenant le milieu MH solide puis le mélange est incubé à 37°C pendant 24 heures.

4.2 Méthode de contact direct (Bourgeois et Leveau, 1980):

Une colonie issue d’une culture jeune de chaque espèce microbienne activée comme préalablement
sur milieu solide gélosé MH sera prélevée à l’aide d’une anse à platine stérile, chacune sera ensuite
ensemencée dans un tube contenant 10 ml de bouillon MH, suivi d’une incubation à 37°C durant 03
heures. A partir de ces dernières solutions dont chacune constitue la solution mère d’une espèce de
bactérie donnée, des dilutions décimales isotopiques croissantes dans l’eau physiologique seront
effectuées ; allant à 10-5 pour chaque espèce. Des prélèvements de 01 ml de chaque dernière dilution
décimale seront ensuite individuellement ajoutés à 09 ml de chaque extrait de Thymus vulgaris
(Thym) ou de Rosmarinus officinalis (Romarin) dilué à l’eau distillée, respectivement, à raison
de 0, 20, 40, 60, 80 et 100%.
Les mélanges des solutions seront enfin ensemencés en triple essais (03 boites de Petri) chacune en
surface à raison de 0.1 ml sur le milieu gélosé MH. La lecture du nombre de colonies développé sera
effectuée après incubation des milieux ensemencés à 37oC pendant 24, 48 à 72 heures (Bourgeois et
Leveau, 1980).

4.3 Méthode des disques par diffusion sur gélose :

Les disques seront confectionnés à partir de papier filtre (Whatman n° 3), à raison de 6mm de
diamètre. Pour éviter tous risques de contamination aux germes exogènes au cours de
l’expérimentation les disques seront stérilisés à 120°C pendant 15 minutes dans un autoclave.
Une colonie de chaque espèce microbienne étudiée prélevée du milieu gélosé MH de culture après
activation sera ensemencée dans 10 ml de bouillon MH ; ce mélange constituera la solution mère.
Des prises de volume de 1ml de cette dernière solution seront étalées séparément en surface de
plusieurs boites de Petri contenant le milieu gélosé MH solide. Trois disques imbibés pendant 5
minutes dans chaque extrait des plantes obtenu selon le solvant utilisé, ainsi que dans une solution
contenant un puissant antibiotique dont la Gentamycine, seront ensuite déposés successivement à
la surface de chaque boite de Petri contenant le milieu gélosé MH ensemencé à un germe test
donné (Prescott et al., 2003).
La lecture des diamètres d’inhibition se fera après incubation des boites de Petri à 37°C pendant 24,
48 à 72 heures à l’aide d’un pied à colis (Guignar, 1998).

4.4 Détermination de la concentration minimale inhibitrice : CMI

La concentration minimale inhibitrice est la plus petite concentration en antibiotique, en
antifongique et /ou en principes composés actifs nécessaires pour inhiber la croissance d’un
microorganisme (Denis et al., 2011).

Dans le cas de notre étude, c’est les principes actifs des extraits des matières végétales de Thymus
vulgaris (Thym) et de Rosmarinus officinalis (Romarin) obtenus par extraction aux différents
solvants qui sont utilisés pour déterminer la concentration minimale inhibitrice des espèces de
germes responsables d’intoxications alimentaires et d’altérations des viandes. Ainsi, des prises à
raison d’une colonie jeune de chaque germe étudié prélevée à l’aide d’une anse à platine dans 10 ml
de bouillon MH seront incubées pendant 03 heures à 37°C en vue d’obtenir les inoculas. Des prises
de 0,2 ml de chaque inoculum seront introduites respectivement dans 2 ml de chaque extrait dilué
non pas avec de l’eau mais avec le bouillon Mueller Hinton.
Les mélanges des tubes contenant séparément chaque extrait préparé à différentes concentrations
(0, 20, 40, 60, 80 et 100%) et l’inoculum d’une bactérie pathogène seront ensuite incubés à 37 °C
pendant 18 à 24 heures (Moroh et al., 2008).
La détermination de la concentration minimale inhibitrice CMI sera effectuée à partir de la mesure
de la turbidité induite par la croissance du microorganisme étudié. La CMI correspondra donc à la
plus petite concentration pour laquelle il y a absence de turbidité. Par conséquent c’est le premier
tube où la valeur di sera égale à df (di = df).
Le taux de survie du microorganisme sera mesuré au spectrophotomètre réglé à 560 nm comme
suit :
S=
d f- d i X 100.
D f- D i
-S : Taux de survie du microorganisme en %.
-df-di : différence de densité optique dans la solution phénolique ensemencée avant et
après incubation à 37°C durant 18 heures.
-Df-Di : différence de densité optique sans extraits deMentheavant et après incubation
à 37°C durant 18 heures (Kra et al., 2001 ; Zrihi et al., 2007).

4.5 Détermination de la concentration minimale bactéricide (CMB) :

La concentration minimale bactéricide d’une espèce de germe étudié représente la plus petite
concentration d’extrait de la plante qui laisse 0,01% au moins de survivant de l’inoculum initial après
incubation (Moroh et al., 2008).
Pour sa détermination, le tube témoin (inoculum) a été dilué à l’eau physiologique jusqu’à 10 -4.
Cette dilution représente 0,01% de survie du microorganisme test. Elle est ensemencée par strie de
5 cm sur une Gélose Mueller Hinton puis incubée à 37°C pendant 24 heures. Le nombre de colonies
de bactéries obtenu sur la strie de la dilution 10-4 est comparé à celui de chaque tube expérimental
contenant l’inoculum bactérien, également ensemencé sur le même milieu de culture en strie de
5cm et incubé à 37 °C durant 18 à 24 heures. Ainsi, le premier tube expérimental dont le nombre de
colonies présent sur sa strie est inférieur ou égal à celui de la dilution 10-4 correspondra à la CMB.

5. Etude phytochimique
5.1. Alcaloïdes :

A 500 mg d’extrait hydroéthanolique sec sont ajoutés 10 ml de HCl 2N aqueux. Le mélange est
ensuite porté au bain marie bouillant pendant 5 mn tout en agitant avec une baguette de verre.
Après refroidissement, on y ajoute 500mg de NaCl. Le mélange est alors agité puis filtré sur papier
Whatman. Le volume du filtrat est ensuite ramené à 10mL par addition de HCl 2N puis réparti dans
quatre tubes à essai dont l’un servira de témoin et les trois autres sont testés respectivement par
addition de 5 gouttes de réactif d’alcaloïde (Ranarivelo, 2004). La réalisation de trois tests au
minimum est nécessaire pour pouvoir affirmer la présence d’alcaloïdes dans le matériel végétal testé
et éviter des réactions faussement positives (Bruneton, 1999 ; Luhata, 2008).

· Test au réactif de Mayer : la présence d’alcaloïde est indiquée par l’apparition de flocon de précipité
blanc lors de l’addition de tétraiodomercurate de potassium (solution mélange de HgCl2 et de KI)
dans l’extrait acide.

· Test au réactif de Wagner : la présence d’alcaloïde se révèle à l’apparition de précipité rouge orangé
lors de l’addition de réactif iodo-ioduré (solution mélange de I2 et de KI) dans l’extrait analysé.

· Test au réactif de Dragendorff : la présence d’alcaloïde est révélée par l’apparition de précipité
orange lors de l’addition de tétraiodobismuthate de potassium (solution mélange de sous-nitrate de
bismuth et de KI) dans l’extrait testé.

5.2. Flavonoïdes :

200 mg d’extrait organique sont dissouts dans 10 ml d’éthanol à 80%. Après filtration, 1 ml de cette
solution hydroéthanolique est additionné de 0,5 ml de HCl concentré et de quelques grains de
tournures de magnésium. Après 10 min, l’apparition d’une coloration rouge indique la présence de
flavonoïdes (Ranarivelo, 2004).

5.3. Détection d’anthocyanes :

A 2 ml de solution éthanolique d’extrait, on ajoute 2 ml de solution d’acide chlorhydrique à 25%.

L’apparition d’une coloration rose-rouge qui vire au bleu violacé par addition de solution
d’ammoniaque à 25% indique la présence d’anthocyanes (Gurib-Fakim, 1997).

5.4. Détection des leucoanthocyanes :

A 2 ml de solution éthanolique d’extrait sont additionnés 2 ml de HCl concentré. Le mélange est

placé au bain marie bouillant pendant une vingtaine de minutes. L’apparition d’une coloration rouge
démontre la présence de leucoanthocyanes (Gurib-Fakim, 1997).

5.5. Tanins et autres composés phénoliques :

L’extrait organique de masse 100mg est dissout dans 25mL d'eau distillée bouillante puis additionné
de quatre gouttes de solution aqueuse de NaCl à 10%. La solution ainsi obtenue est filtrée sur papier
Whatman. Le filtrat refroidi est alors réparti dans quatre tubes à essai, le 4ème tube servant de
témoin (Ranarivelo, 2004 ; Rizk, 1982).

_ Tube n°1: addition de cinq gouttes de gélatine à 1%. L’apparition d’un précipité éventuel indique la
présence de polyphénols.
_ Tube n°2: addition de cinq gouttes de gélatine salée (mélange volume à volume de gélatine à 1% et
de solution NaCl à 10%). L'apparition d'une précipitation par la gélatine salée signifie la présence de
tanins.

_ Tube n°3: addition de cinq gouttes de FeCl3 dilué à 1% dans le méthanol.

· La présence de tanins galliques et ellagiques (tanins hydrolysables) est indiquée par

l’apparition d’une coloration bleue noire.

· La présence de tanins catéchiques (tanins condensés) s’observe par l’apparition

d’une coloration brune verdâtre.

· Une réaction négative à la gélatine salée accompagnée d'une coloration verte ou

bleue noire avec FeCl3, est due à la présence d'autres types de composés
phénoliques.

5.6. Coumarines :

Le test de détection des coumarines est basé sur leur propriété à présenter une fluorescence nette
aux rayons UV. A 200 mg d’extrait, on ajoute 10 ml d’eau distillée. Après dissolution et filtration, à 5
ml du filtrat est additionnée goutte à goutte une solution aqueuse de soude à 20 %, puis on la
chauffe au bain marie bouillant pendant quelques minutes. Le mélange est ensuite observé sous
rayonnement UV 365 nm : une fluorescence nette (jaune, vert, bleu, orange) sous UV 365nm indique
la présence des coumarines (méthode indicative et non une identification) (Rizk, 1982 ; Bruneton,
1999).

5.7. Triterpènes et stéroïdes :

Prendre 500mg de l’extrait hydroalcoolique dépigmenté ou d’extrait organique et y ajouter 20 mL de

dichlorométhane puis agiter pendant 5 à 10 min. Laisser décanter puis sécher la solution avec
Na2SO4 anhydre. Filtrer et répartir le filtrat dans 5 tubes à essais propres et secs ; le tube n°5 servira
de témoin (Ranarivelo, 2004 ; Bolivar, 2011).

_ Test de Liebermann Burchard : Dans le 1er tube, additionner 4 gouttes d’anhydride acétique et 4
gouttes d’acide sulfurique concentré. La présence des composés chimiques est indiquée par la
coloration observée suivante :

a) pourpre : présence de triterpènes ;

b) violet ou bleu-vert : présence de stéroïdes.

_ Test de Salkowski : Incliner le tube à 45° puis ajouter 1ml d’acide sulfurique concentré. Après 30mn,
la présence de stérols insaturés est indiquée par l’apparition d’un anneau de séparation des phases
de couleur rouge.

_ Test de Badjet Kedde : Additionner quelques grains d’acide picrique à la solution. L’observation
d’une coloration rouge dénote la présence de stéroïdes lactoniques.

_ Test de Keller-Killiani : Incliner le tube de 45° et additionner quelques gouttes de FeCl3 à 10% dans
le méthanol et quelques gouttes d’acide acétique glacial. La présence d’un anneau de séparation de
phase de couleur rouge pourpre indique la présence de désoxy-2-sucre.

5.8. Quinones :

200 mg d’extrait organique sont dissous dans de l’eau distillée, puis filtrés. Le filtrat est extrait deux
fois au benzène. A 10 ml d’extrait benzénique sont ajoutées 5 mL de solution aqueuse
d’ammoniaque NH4OH à 20 %, puis le mélange est agité. Après décantation, une coloration rouge
orangée ou rouge violacée de la phase ammoniacale indique un test positif (Bruneton, 1999 ; Dohou,
2003 ; Alilou, 2014).

5.9. Saponines (test de mousse) :

Une masse de 2 g de matériel végétal sec ou son équivalent en extrait brut est agitée
vigoureusement pendant 30 secondes avec 20mL d’eau distillée dans un tube à essai. Le tube est
ensuite disposé verticalement. Après 10 mn de repos, une hauteur de la mousse persistante,
supérieure ou égale à 3 cm, indique la présence de saponines (Ranarivelo, 2004).

5.10. Composés cyanogénétiques :

Dans un tube à essai, humecter 2g de matériel végétal sec avec une quantité suffisante d’eau puis
ajouter 1 ml de CHCl3. Insérer ensuite une bandelette de papier filtre Whatman imprégnée de
solution fraîchement préparée de picrate de sodium (5g de Na2CO3 + 0,5g d'acide picrique + 100mL
d'eau distillée) juste au-dessus de la drogue et plier sur le bord du tube à essai. Boucher le tube avec
du coton hydrophile et chauffer à 35°C au bain marie pendant 3 heures. La présence des composés
cyanogénétiques est indiqué par le virage de la coloration du papier picrossodé au rouge orangé par
production de HCN (Dohou, 2003 ; Alilou, 2014).

6. Détermination des Composés Phénoliques Totaux (CPT) (Chaovanalikit et Wrolstad, 2014).

La teneur en composés phénoliques totaux des extraits de Menthe verte (Mentha pipérita L) sera
évaluée à l'aide du réactif Folin-Ciocalteu. Les extraits phénoliques récupérés en solution sont
évaporés dans un lyophilisateur pour ne pas endommager les principaux composés bioactifs, on
mélange ensuite les extraits bruts récupérés (50 mg) avec du réactif Folin-Ciocalteu (0,5 ml) et de
l'eau distillée (7,5 ml). Le mélange sera maintenu à la température ambiante pendant 10 minutes
puis on ajoutera 1,5 ml du carbonate de sodium à 20%. Le mélange sera chauffé ensuite dans un bain
marie à 40 ° C pendant 20 minutes et puis refroidi dans un bain de glace. La teneur en CPT de
Menthe verte (Mentha pipérita L) sera calculée enfin suite au dosage du mélange après
refroidissement au spectrophotomètre réglé à une absorbance de 730 nm et ce en se référant à une
courbe d’étalonnage qui sera réalisée avec de l’acide gallique. Tous les échantillons seront analysés
en trois répétitions et les résultats seront exprimés en mg Equivalents d'Acide Gallique (EAG) / 100 g
de Matière Sèche (MS) de l’espèce végétale étudiée [mg EAG / 100g MS] ou en mg Equivalents
d'Acide Gallique (EAG) / 100 ml d’Extrait hydro-alcoolique (EHA) [mg EGA / 100 ml EHA].

7. Profil des poly phénols

a/ Broyage tamisage :

Le broyage de la matière végétale de Menthe verte (Mentha pipérita L) (Menthe verte (Mentha
pipérita L)us vulgaris) sera effectué avec un broyeur à billes (PM 200 Broyeur planétaire à billes).
Les broyats sont ensuite tamisés avec un tamis ayant des mailles de 1mm de diamètre.

b/ Extraction et filtration (Jerez et al., 2009)

02 g de poudre de la plante est dissoute dans 100 ml de méthanol à 98o (CARLO ERBA ; Milano,
Italie). Le mélange disposé dans des flacons de 100 ml avec une agitation à 140 rpm est laissé à
température ambiante (au lieu seulement pour une période de six heures) pendant une durée
d’extraction de 20 heures; en raison du caractère ligneux des échantillons traités, la longue durée
d’extraction favorisera la dépolymérisation des principaux constituants (dont la lignine, les
substances pectiques) et une meilleure solubilisation progressive des poly phénols). Les extraits
phénoliques sont ensuite filtrés sur (filtre cellulose nitrate - SARTORIUS) de porosité de 0,2µm.
C/ Conditions chromatographique
Les principales conditions d’Identification du profil des poly phénols de Menthe verte (Mentha
pipérita L)par Chromatographie Liquide Haute Pression (CLHP) sont résumées comme suit :

Détermination par HPLC modèle SHIMADZU

Gradient concentration phase mobile

Durée en min 0 35 40 45 50 55
Méthanol 5 75 100 100 5 5
Acide phosphorique 2Mm 95 25 0 0 95 95
· Longueur d’onde de détection : 327nm
· Débit : 1 ml / min
· Colonne : Lichrospher ODS2 5µm 25 cm
· Température de la colonne : 30°C
· Volume d’injection : 20 µl

Les étalons standards disponibles utilisés sont :

C3Q Acide 3-OCaffeoylquinique

C5Q Acide 5-OCaffeoylquinique
C4Q Acide 4-OCaffeoylquinique
F5Q Acide 5-OFeruloylquinique
Acides chlorogéniques
Di3,4CQ Acide 3,4-ODcaffeoylquinique
Di3,5CQ Acide 3,5-ODcaffeoylquinique
Di4,5CQ Acide 4,5-ODcaffeoylquinique
Kaemphérol Flavonol
Narengénine Flavanones
Quercétine Flavonol
Catéchine Flavonol
Epicatéchine Flavonol
Trigonelline Alcaloïde
Théobromine Alcaloïde
Cafeine Alcaloïde

7. Effets des extraits de Thymus vulgaris et de Rosmarinus officinalis sur la qualité de la

viande ovine au cours de la conservation au froid et après cuisson».

7.1. Protocoles expérimentaux

Notre choix sera porté sur la viande ovine. Des prises d’échantillons de 300 g de cote et gigot de
viande seront directement prélevés de l’abattoir une heure après l'abattage. Les prélèvements
seront déposés dans des sachets stériles et transportés immédiatement au laboratoire dans une
glacière.
Arrivée au laboratoire, des échantillons seront traités dans une première approche expérimentale,
par pulvérisation en surface des viandes avec chaque extrait obtenu selon la polarité du solvant
utilisée (Hexane, Méthanol, Ethanol et Eau) des plantes étudiées (Thymus vulgaris et de
Rosmarinus officinalis) à des concentrations variables de 0 ; 0.5 ; 1 ; 1.5 et 2 %,
respectivement.

Dans une seconde expérimentation, les échantillons de la viande de mouton, seront tout d’abord
déposés dans des barquettes de 500 g. Ils seront couverts ensuite par un film alimentaire absorbant
préparé à différentes doses (0 ; 0.01 ; 0.02 et 0.03 ml/cm2) de chaque extrait de Thymus
vulgaris et de Rosmarinus officinalis.
Dans une troisième expérimentation, les échantillons de la viande ovine, ramenés au laboratoire,
seront tout d’abord stérilisés sous UV durant 15 à 20 minutes et mis aseptiquement dans des sachets
stériles. Les échantillons de viande seront, ensuite, contaminés en surface avec 4ml d’une suspension
bactérienne de référence donnée (Staphylococcus aureus, Salmonella, shigella, E.coli,
Pseudomonas…etc.). Enfin, les viandes, seront traitées en surface avec chaque extrait
phénolique préparé aux solvants à différentes polarités à des taux de 0 ; 0.5 ; 1 ; 1.5 et 2 %,
respectivement.
Chaque traitement sera effectué en triple essais sur un nombre de 03 prélèvements de viande.
Les échantillons traités aux extraits phénoliques des plantes selon les trois approches expérimentes
seront conservés au froid positif de 2°C pendant une période n’excédant pas 14 jours.

7.2. Mesures et contrôles :

7.2.1. Analyses physicochimiques :

Les analyses physicochimiques seront effectuées en triple essais au 1èr, 4ème, 8ème et 12ème jour de
conservation des échantillons de viande conservés au froid à 4°C et porteront sur :

7.2.1.1. Extrait sec total :

7.2.1.2. Teneur en eau :
7.2.1.3. Teneur en protéines :
7.2.1.4. Teneur en matière grasse :
7.2.1.5. pH :
7.2.1.6. Aw :
7.2.1.7. ABVT :
7.2.1.8. Teneurs en matière minérale :
7.2.1.9. Dosage du malondialdéhyde (MDA) :
7.2.1.10. Profil des acides gras :

7.2.2. Analyses microbiologiques :

Les analyses microbiologiques seront effectuées en triple répétitions, chaque 2 jour à partir du
premier jour de l’étude, pendant toute la période d’entreposage des échantillons au froid et vont
concerner :
 FTAM : sur gélose nutritive (GN) ou sur Plate Count Agar (PCA)/ Incubation à 30C° pendant
72h.
 Flore psychrotrophe : sur plate Count Agar (PCA)/ Incubation à 3°C pendant 10 jours.
 Pseudomonas : sur milieux de culture King A et King B / Incubation à à 3°C pendant 48h. Le
milieu king A permet d’identifier Pseudomonas aeruginosa par la production d’un pigment
verdâtre, la pyocyanine. Alors que le milieu king B permet la culture d’autre espèce de
Pseudomonas en produisant un vert fluorescent, la pyoverdine.
 Coliformes thermo tolérants : sur milieu de culture gélose Lactosée à la Bile au Cristal Violet
et au Rouge Neutre (VRBL)/ Incubation à +44°C / seules sont comptées les colonies rouge vif
à rosâtre.
  E.coli : sur milieu gélosé PTX / Incubation à +44°C / les colonies apparaissent avec un liseré
bleu.
 Staphylococcus aureus : sur milieu Baird Parker (BP) auquel on ajoute du jaune d’œuf au
tellurite. Les dilutions utilisées sont 10-2 et 10 -3. L’ensemencement se fait avec 0,1 ml par
dilution sur du BP préalablement coulé dans des boîtes de Pétri et sont incubés à l’étuve
+37°C pendant 24 heures .Les colonies de Staphylococcus aureus apparaissent noires
brillantes, bombées et entourées d’un liséré blanc opaque et d’un halo d’éclaircissement. La
présence de Staphylococcus aureus est confirmée par les tests de la catalase et de la
coagulase (Figure 1).

Fig 1. Tests de confirmation de présence ou d’absence de Staphylococcus aureus

7.2.3. Analyses organoleptiques :

Les analyses organoleptiques seront effectuées au 2ème, 3ème, 4ème et 5ème jour de conservation des
viandes réfrigérées et traitées aux extraits des plantes. Les viandes seront badigeonnées avec un peu
de beurre et cuite au four sans addition d’aucun autre condiment (sel, ail…etc.). Un jury de
dégustation sera constitué et devra apprécier la qualité sensorielle des viandes selon une échelle de
notation variable de 1 à 10 et selon les critères organoleptiques suivants : jutosité, flaveur, odeur,
couleur, dureté, tendreté…etc.

8. Traitement statistique :

Les résultats paramétriques vont être traités statistiquement par une analyse de variance bi
factorielle en randomisation totale suivie d’une comparaison des moyennes deux à deux
selon le test de NEWMAN et KEULS. Par contre, ceux relatifs au test organoleptique vont
être analysés statistiquement par le test non paramétrique de Friedman (Stat Box 6.4).
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