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TÉCNICAS DE TINCIÓN

Mariangélica BECERRA TORRES (estudiante)

Escuela de Biología. Facultad de Ciencias Básicas. Universidad Pedagógica y Tecnológica


de Colombia. Tunja, Colombia.

marangelica.becerra@uptc.edu.co

RESUMEN

El objetivo general de esa práctica fue realizar tinción de Gram y observar la morfología
bacteriana. Los tipos de coloraciones realizadas fueron coloración simple, la cual fue hecha
con azul de metileno, el frotis de sarro dental fue observada con los objetivos de 10X, 40X
y 100X; a través de este tipo de tinción se observaron células epiteliales de la cavidad
bucal. El otro tipo de coloración realizada fue la coloración diferencial de Gram, para la
cual se utilizaron dos tintes: cristal de violeta y Fucsina de Gram, la muestra fue observada
con el objetivo de inmersión; con este tipo de coloración se observaron bacterias, según su
forma todas fueron cocos, según su agrupación se observaron cocos simples, diplococos,
estreptococos y estafilococos.

Palabras clave: tinción simple, tinción diferencial de Gram, cristal violeta, azul de
metileno, fucsina de Gram.

ABSTRACT

The general objective or this practice was to do Gram stain and to observe bacterial
morphology. The kinds of staining done were simple stain, which was done with methylene
blue, the smear of dental tartar was observed with the objectives of 10X, 40X and 100X;
through this kind of staining we observed epithelial cells from the oral cavity. The other
kind of stain done was the Gram differential staining for which were used two dyes: crystal
violet and Gram fuchsine, the sample was observed with the immersion objective lens; with
this kind of staining we observed bacterium, according to their shape all of they were
coccus, according to their groups we observed simple coccus, diplococci, streptococci and
staphylococci.
Keywords: simple stain, Gram differential staining, crystal violet, Gram fuchsine,
methylene blue.

INTRODUCCION

La tinción es un modo de preparación de muestras microscópicas en el cual con la ayuda de


un tinte, se pueden determinar características de estas. Existen cuatro tipos de tinción
(Simbaqueba, 2016):

Tinciones simples: en este tipo de tinción se utiliza un solo colorante , por lo tanto la
muestra tiñe de un solo color, permite conocer la morfología, agrupación y tamaño celular.
Las tinciones simples se realizan sobre preparaciones previamente secas. Sobre un
portaobjetos con una muestra de microorganismos previamente secada y fijada a la llama,
se vierte una solución diluida de un colorante y se mantiene durante uno o dos minutos; a
continuación se lava varias veces con agua y se seca. En la tinción simple se utilizan tintes
como safranina, azul de metileno, cristal violeta y carbolfuesina.
(http://es.scribd.com/doc/80998594/Tincion-Simple, 2012).

Tinciones diferenciales : en este tipo de tinciones suelen utilizarse dos o más colorantes,
esto con el fin de diferenciar los tipos de organismos entre unos y otros (basándose en sus
características físicas y químicas) ( Simbaqueba, 2016), al observarlos en el microscopio.
Algunas tinciones de este tipo son:

- Tinción de Gram: el objetivo de la tinción de Gram es identificar la clasificación de


bacterias entre Gram positivas y Gram negativas; el procedimiento a seguir es:
1. Fijar la muestra de bacterias sobre el portaobjetos con calor.
2. Teñir el frotis durante un minuto con cristal violeta. Esta fórmula algunas
veces ha sido hallada para dar coloración intensa, por eso ciertos organismos
gram negativos no se decoloran apropiadamente. Si este problema se
presenta, este puede ser evitado usando menos cristal violeta.
3. Lavar con el agua del grifo por no más de do segundos.
4. Sumergir un minuto en solución yódica.
5. Lavar con agua y secar.
6. Decolorar durante 30 segundos con agitación suave, en alcohol etílico al
95%. Secar.
7. Contra tinción de diez segundos dentro de solución safranina.
8. Lavar en el grifo del agua.
9. Secar y examinar.
Resultados: organismos Gram- positivos, azules; organismos Gram-
negativos, rojo. (Pelczar, et al., 1957)
- Tinción de Ziehl-Neelsen (ácido-alcohol resistencia): es un tipo especial de tinción
que permite la identificación de microorganismos con paredes celulares que
contienen ácidos graso s(ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de
carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-
ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-
alcohol resistente. El procedimiento a seguir para este tipo de tinción es:
1. Teñir frotis secos durante tres a cinco minutos con carbol fucsina de Ziehl,
aplicando suficiente calor por vapor suave.
2. Enjuagar con agua.
3. Decolorar en alcohol etílico al 95%, que contiene un volumen de HCl
concentrado al 3 %, solo hasta que quede un signo de rosado.
4. Lavar con agua.
5. Contra tinción con azul de metileno.
6. Lavar con agua.
7. Secar y examinar.
Resultados: organismos acidorresistentes, rojo; otros, azul. (Pelczar, et al.,
1957)

Tinción de estructuras: Se tiñen selectivamente ciertas estructuras o formas celulares


(Universidad de Granada). Por ejemplo:

- Tinción de esporas (Wirtz-Conklin): este tipo de tinción permite identificar ciertos


tipos de bacterias que producen esporas de resistencia cuya pared celular es
característica (Universidad de Navarra, 2008). El proceso de tinción consiste en:
1. Hacer frotis usual y fijarlo con calor.
2. Sumergir el portaobjetos en verde de malaquita 5% acuoso, y dar vapor
durante 10 minutos, manteniendo el portaobjetos sumergido en la adición de
líquido de tinción fresco.
3. Lavar durante 30m segundos en el chorro de agua.
4. Contra tinción 1 minuto con mercurocromo acuoso al 5%.
5. Lavar en el chorro de agua.
6. Secar y examinar.
Resultados: esporas, verdes; el resto de la célula roja. Un problema a veces
experimentado con decoloración verde después de que los se han tenido
unos pocos días. Aparentemente este es el resultado de una reacción alcalina
y puede der prevenido tratando los portaobjetos en ácido antes de hacer el
frotis. ( la alcalinidad puede ser debida a una invisible capa de jabón). .
(Pelczar, et al., 1957).

Tinciones microquímicas: son tinciones específicas para depósitos intracelulares de PHB


(Ácido polihidroxibutírico), glucógeno o polifosfato.

Tabla 1. Clasificación de las técnicas de coloración (Gonzalez,1996).

Vitales: cuando no Supravitales: cuando se aplican una vez que se han fijado. Se
provocan la muerte clasifican en:
celular se utilizan Difusas:
para teñir material a) Directas: cuando el colorante se aplica directamente al tejido
vivo. Ejemplo: o material que se desea colorear.
azul de metileno, b) Indirectas: cuando antes de aplicar el colorante, el tejido ha
rojo neutro, permanecido en un mordente durante algún tiempo.
moreno de c) Progresivas: cuando se aplican varios colorantes en tiempos
Bismarck. diferentes cada uno.
d) Regresivas: cuando se deja el colorante sobretiña y después
poco a poco se decolora con alcohol o agua acidulada hasta
obtener el tono deseado.
Selectas:
a) Pancromáticas: cuando en un solo colorante se obtienen
diferentes tonos de los componentes celulares o tisulares.
b) Totales: cuando el material se tiñe con un solo colorante.
Especiales:
a) Fluorescencia: cuando los colorantes llamados fluorocromos,
tiñen diversas regiones celulares, las cuales emiten luz. Es
una técnica que se utiliza en fisiología de antígenos,
anticuerpos, mineralogía, etc.
b) Negativas: cuando el colorante tiñe más el fondo que el
espécimen, se utiliza en microbiología.
Los colorantes se agrupan en básicos que tiñen especialmente bacterias ya que la membrana
de estas suele tener una cierta carga eléctrica negativa (a este grupo pertenecen la safranina,
fucsina básica, cristal violeta y azul de metileno); y ácidos más adecuados para teñir células
animales en muestras de tejidos infectados. A este último grupo pertenecen la fucsina ácida,
la eosina y el rojo Congo. (Universidad de Navarra).

Hans Cristiam Gram fue un medico danés nacido en 1853 . “…estudió las técnicas de tinción
de las bacterias, trabajo que desarrolló en Berlín cuando trabajaba con Karl Friedländer
(1847-1887). Sus hallazgos se publicaron en la revista Fortschritte der Medezin. Gram
señaló que “He publicado un método, aunque soy consciente de que todavía es defectuoso e
imperfecto; pero deseo que en manos de otros investigadores pueda resultar de utilidad”.

Mientras analizaba los tejidos de los fallecidos por pulmonía descubrió que algunas
mantenían la coloración y otras no. Realizó la tinción con violeta de genciana, después la
fijó con lugol; luego las lavó con etanol. Había bacterias que retenían el color y aparecían
de color violeta al micoscopio y otras que no. Más tarde Carl Weigert incorporó un nuevo
paso al proceso; añadió safranina después del lavado con etanol. De esta manera las
bacterias que no retenían la coloración morada aparecían teñidas de rojo, y fueron llamadas
Gram negativo, frente a las que sí se teñían primitivamente de violeta que eran las Gram
positivo.” (Fresquet, 2014)

Como se mencionó anteriormente, la coloración diferencial de Gram, pretende diferenciar


bacterias Gram positivas y Gram negativas. Las diferencias generales de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas son:
MATERIALES Y METODOS

Coloración simple:

Se tomó la muestra de sarro dental, se puso sobre una gota de agua destilada en un
portaobjetos, se realizó frotis; la preparación se cubrió con azul de metileno en solución
alcohólica al 1%, se dejó actuar durante cuatro minutos y se procedió a lavar con agua el
exceso de colorante, se secó al aire y se observó con el objetivo e 100X.

Coloración diferencial de Gram:

Sobre una gota de agua en un portaobjetos, se puso una muestra de bacterias, se fijó la
muestra al portaobjetos con la llama del mechero, se cubrió el frotis con cristal violeta
durante un minuto, posteriormente se lavó con agua y se escurrió, el frotis fue cubierto con
lugol durante un minuto, nuevamente se lavó con agua y se escurrió, posteriormente se
cubrió el frotis con alcohol durante diez segundos y luego se lavó, se cubrió con Fucsina de
Gram por un minuto y se lavó; finalmente la muestra fue observada en el microscopio con
el objetivo de 100X.

RESULTADOS

Coloración simple: Con los tres objetivos utilizados fue posible observar varias células
epiteliales.

Figura 1. Resultado de la observación de frotis de sarro dental con el objetivo de 10X.

Figura 2. Resultado de la observación de frotis de sarro dental con el objetivo de 40X.

Figura 3. Resultado de la observación de frotis de sarro dental con el objetivo de 10X.


Coloración diferencial de Gram: se observaron bacterias Gram positivas, con forma de
cocos. En cuanto a su agrupación se observaron de cuatro tipos: cocos simples, diplococos,
estreptococos y estafilococos.

Figura 4. Resultado de la observación de frotis bacteriano con el objetivo de 100X.

Figura 5. Clasificación de las bacterias observadas según su agrupación.

DISCUSION

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

FRESQUET FERBER, JL. Hans Christian Joaquim Gram (1853-1938). Medicina, Historia
y Sociedad; 2014. Disponible en:
https://historiadelamedicina.wordpress.com/2014/09/13/hans-christian-joaquim-gram-
1853-1938/

GONZÁLEZ MORÁN, MG. Técnicas en biología celular. Teoría y práctica.1 ed. México:
A.G.T. Editor, S.A.; 1996.

PELCZAR, MJ, Junior., BARD, RC, BURNETT, GW, CONN, HJ, DEMOSS, RD,
EVANS, EE, JENNISON, MW, MCKEE, AP, RIKER,AJ, WARREN, J,
WEEKS,OB,WEISS, FA. Manual of Microbiological Methods. New York, Toronto,
London: Mc Graw-Hill Book Company; Inc.; 1957.

SIMBAQUEBA GUTIÉRREZ, AL. Guías de laboratorio Biología General. Universidad


Pedagógica y Tecnológica de Colombia.2016
STAINER, RY, INGRAHAM, JL, WHEELIS, ML, PAINTER, PG. Microbiología. 2 ed.
Barcelona: Editorial Reverté, S.A.; 1992.

VAELNZUELA DE SILVA, EM. DE SILVESTRI SAADE, JA. Microbiología General.


Unidad Universitaria del Sur de Bogotá. Bogotá: División de Recursos Educativos-
UNISUR; 1990.

VERA ALFONSO, VJ. Microbiología. Unidad Universitaria del Sur de Bogotá UNISUR;
1993.