UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE INGENIERIA Y CIENCIAS QUÍMICAS

ZONA XALAPA

PROGRAMA EDUCATIVO

INGENIERÍA AMBIENTAL

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL SUELO

DEL CAMPO PETROLERO MIGUEL ALEMÁN, PARA SU POSIBLE
USO EN LA REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR
HIDROCARBUROS

TESIS
QUE PARA ACREDITAR LA EXPERIENCIA EDUCATIVA
DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL

PRESENTA
DANIELA MARGARITA COBOS CHONG

DIRECTOR
DR. BENITO HERNÁNDEZ CASTELLANOS

CO-DIRECTOR
DR. JOSÉ ANTONIO GARCÍA PÉREZ

XALAPA, VER. 2014

 AGRADECIMIENTOS

A Dios, por permitirme llegar hasta donde he llegado, por este logro más en mi
vida y por la vida tan maravillosa que me ha otorgado. A sus arcángeles y ángeles
por acompañarme y guiarme a lo largo de la carrera, por su apoyo y fortaleza en
momentos difíciles y su inmenso amor.

A mi mamá, por todo su esfuerzo y sacrificio, por apoyarme en todo momento, por
los valores que me ha inculcado y, por haberme dado una excelente educación.
Sobre todo por ser un gran ejemplo de fortaleza. Por haberme formado como una
mujer de bien, por ser la mujer que me dio la vida y me enseñó a vivirla… no hay
palabras en este mundo para agradecerte, mamá.

A mis abuelitos, Papi Toco y Mami Fina, por todo su apoyo y amor incondicional
en cada aspecto de mi vida.

Al Doctor Benito, por su orientación, su disposición y conocimientos brindados, su

motivación y apoyo recibido y, por haberme brindado la oportunidad de desarrollar
esta tesis. Por darme la oportunidad de crecer profesionalmente y aprender cosas
nuevas.

Al Doctor Pepe Toño, por su confianza y apoyo en la elaboración de la tesis.

A Katy, por su gran ayuda y colaboración en este trabajo, por todo el conocimiento
brindado, su apoyo incondicional, su tiempo y gran paciencia, por compartir
conmigo ese amor por la microbiología. Sobre todo por enseñarme a no darme por
vencida cuando las cosas no salen como esperaba, a seguir intentándolo una y
otra vez hasta obtener lo que se desea.

A Diana y Betty, que además de ser mis mejores amigas fueron unas excelentes
compañeras de tesis, por su gran amistad, ayuda y apoyo en toda la carrera, por
todos esos momentos que hemos pasado juntas.

A Alejandro, por brindarme su cariño desde el día que lo conocí, por estar conmigo
en mis peores y mejores momentos, por su amor y por esas emociones que no
sabía que tenía.

A Miguel, por su gran ayuda en el laboratorio.

A los miembros del jurado de esta tesis, por sus sugerencias y comentarios.
 DEDICATORIAS
Esta tesis la dedico principalmente a mi mamá, que estuvo siempre a mi lado
brindándome su apoyo, dándome a cada instante una palabra de aliento para
llegar a culminar mi profesión y por ser una mamá bien padre. Gracias mami,
sabes que te estoy eternamente agradecida. Te dedico este trabajo con todo mi
corazón.

A Papi Toco, por su inmenso amor y por ser el pilar de la familia. Eres el hombre
de mis ojos. Gracias por estar conmigo a lo largo de toda mi vida, por esa felicidad
que irradias, tu gran sonrisa llena de amor, por las carcajadas y regañizas.

A Mami Fina, por estar siempre ahí, cuidarme y amarme, por su lindo corazón y
por ser mi segunda madre.

A mi tía Eli, por abrirme las puertas de su casa. Porque te debo la fascinación que
siento por la vida más allá de la muerte, sobre el alma, los seres de luz, porque
gracias a ti me acerqué a un mundo que no sabía que existía y porque gracias a
eso me convertí en una persona espiritual.

A mi prima Caro, mi hermanita, mi cómplice. Por tus palabras de ánimo, tu apoyo,

tu compañía y todas las risas.
 ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS ...................................................................................................................... 6
ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................................ 7
RESUMEN ......................................................................................................................................... 9
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................................ 11
CAPÍTULO l. GENERALIDADES ................................................................................................. 13
1.2 Antecedentes........................................................................................................................ 13
1.3 Planteamiento del problema .............................................................................................. 15
1.4 Justificación .......................................................................................................................... 17
Objetivo general ...................................................................................................................... 19
Objetivos específicos ............................................................................................................. 19
1.6 Hipótesis................................................................................................................................ 19
CAPÍTULO ll. MARCO TEÓRICO................................................................................................ 20
2.1 El suelo .................................................................................................................................. 20
2.1.1 Suelo del área de estudio............................................................................................ 22
2.2 Contaminación del suelo .................................................................................................... 25
2.3 Derrames petroleros ............................................................................................................ 27
2.4 Hidrocarburos ....................................................................................................................... 28
2.4.1 Degradación microbiana de los HAPs....................................................................... 33
2.4.2 Antraceno....................................................................................................................... 35
2.5 Tecnologías de remediación .............................................................................................. 35
2.6 Biorremediación ................................................................................................................... 39
2.7 Microorganismos del suelo................................................................................................. 40
2.8 Bacterias ............................................................................................................................... 41
2.9 Bacterias hidrocarburolíticas .............................................................................................. 43
2.10 Área de estudio .................................................................................................................. 45
CAPÍTULO III. METODOLOGÍA .................................................................................................. 47
3.1 Muestreo ............................................................................................................................... 48
3.2 Análisis físicos y químicos del suelo ................................................................................. 49
3.2.1 Textura ........................................................................................................................... 49
3.2.2 pH.................................................................................................................................... 49
3.2.3 Materia orgánica ........................................................................................................... 50
 3.2.4 Nitrógeno ....................................................................................................................... 50
3.2.5 Fosforo extraíble ........................................................................................................... 51
3.2.6 Cationes intercambiables (Ca2, Mg, Na y K) ............................................................ 51
3.3 Análisis de los hidrocarburos ............................................................................................. 51
3.3.1 Hidrocarburos totales de petróleo fracción pesada................................................. 52
3.3.2 Hidrocarburos aromáticos policíclicos ....................................................................... 53
3.4 Pruebas microbiológicas..................................................................................................... 53
3.5 Pruebas bioquímicas ........................................................................................................... 54
3.6 Pruebas de degradación de antraceno ............................................................................ 55
3.7 Análisis estadísticos ............................................................................................................ 55
CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.......................................................................... 56
4.1 Parámetros físicos y químicos del suelo .......................................................................... 56
4.2 Caracterización de hidrocarburos totales de petróleo fracción pesada e
hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) ....................................................................... 59
4.3 Aislamiento e identificación de bacterias ......................................................................... 60
4.4 Pruebas bioquímicas ........................................................................................................... 62
4.5 Degradación de antraceno por las bacterias ................................................................... 63
4.6 Conclusión ............................................................................................................................ 65
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................................... 67
Anexo A: Glosario para la determinación de parámetros físicos y químicos del suelo....... 79
Anexo B: Glosario para la determinación de hidrocarburos poliaromaticos y fracción
pesada.............................................................................................................................................. 95
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Suelos del estado de Veracruz. .................................................................................. 25

Figura 2. Estructura química y sistema de numeración de anillo de los 16 HAPs

prioritarios. ....................................................................................................................................... 30

Figura 3. Reacciones iniciales del metabolismo de los HAPs. .............................................. 34

Figura 4. Mapa de los sitios de muestreo en el campo petrolero Miguel Alemán, (los
números indican los pozos petroleros en estudio con sus respectivos controles). ............. 46

Figura 5. Fotos de los monolitos realizados. .............................................................................. 48

Figura 6. Crecimiento del género Edwardsiella en el medio con antraceno como única
fuente de Carbono.......................................................................................................................... 64

Figura 7. Crecimiento de Citrobacter en el medio con antraceno como única fuente de

Carbono. .......................................................................................................................................... 64

Figura 8. Crecimiento de la especie C. Neteri en el medio con antraceno como única

fuente de Carbono.......................................................................................................................... 65
 ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Comparación de los efectos de algunos contaminantes en suelo. ......................... 26

Tabla 2. Datos relativos a los efectos carcinogénicos, genotóxicos y mutagénicos de

algunos PAHs. ................................................................................................................................ 32

Tabla 3. Ventajas y Desventajas de las tecnologías de Remediación, clasificadas de

acuerdo con el tipo de tratamiento. ............................................................................................. 38

Tabla 4. Poblaciones promedios de microorganismos determinados en suelos. ................ 41

Tabla 5. Parámetros físicos y químicos del suelo, comparación entre el suelo contaminado
y el suelo no contaminado (suelo control). Letras minúsculas iguales entre el suelo
contaminado y el no contaminado indican que no existen diferencias significativas (p
<0.05). .............................................................................................................................................. 57

Tabla 6. Parámetros físicos y químicos del suelo en los diferentes sitios de muestreo del
campo petrolero Miguel Alemán. ................................................................................................. 57

Tabla 7. Comparación entre la concentración de Hidrocarburos Fracción pesada e

hidrocarburos aromáticos policíclicos entre el suelo contaminado y el suelo no
contaminado (suelo control) del campo petrolero Miguel Alemán, Letras minúsculas
iguales entre el suelo contaminado y no contaminado indican que no existen diferencias
significativas (p<0.05). ................................................................................................................... 60

Tabla 8. Aislamiento de bacterias. ............................................................................................... 61

Tabla 9. Pruebas bioquímicas para la determinación de bacterias. ....................................... 62

Tabla 10. Género y especies de bacterias encontradas en el campo petrolero Miguel

Alemán, con capacidad para utilizar el hidrocarburo antraceno como fuente de carbono. El
Signo – indica que no hubo crecimiento, signo + indica crecimiento..................................... 63
Este estudio se realizó dentro del proyecto “Efecto de la contaminación por
derrames petroleros a los organismos del suelo en Poza Rica, Veracruz,
México” dentro del Programa Retención y Repatriación del Consejo Nacional
de Ciencia y Tecnología (CONACyT). “Apoyos Complementarios para la
Consolidación Institucional de Grupos de Investigación”. Convenio MOD-
ORD-12- 2013 PCI-1054-11-13(5521699).
 RESUMEN

Los derrames petroleros vertidos al suelo resultan inevitables en la industria

petrolera, debido a los grandes volúmenes de hidrocarburos que se manejan. En
sitios como Poza Rica Ver., donde existe una alta actividad petrolera las
contingencias ambientales son frecuentes.

Los derrames de hidrocarburos ocasionan impactos negativos a los

ecosistemas, además, representan importantes pérdidas económicas y son un
peligro para la salud. Los derrames pueden ocurrir por fugas, rupturas de ductos,
por tomas clandestinas o durante su transporte.

En la actualidad existen diferentes técnicas de remediación, siendo las

biológicas la mejor alternativa para la recuperación de un suelo contaminado
además de ser las menos costosas. Los tratamientos biológicos consisten en el
uso de organismos vivos para atenuar o remover contaminantes, algunos de estos
organismos son las bacterias, las cuales han demostrado tener la capacidad de
transformar una gran variedad de contaminantes orgánicos e inorgánicos a
sustancias inocuas.

Por lo anterior en este estudio se caracterizó el suelo y los contaminantes

presentes del campo petrolero Miguel Alemán en Poza Rica Veracruz y se
aislaron e identificaron los diferentes géneros y especies de bacterias del suelo.
Se observó que el suelo está contaminado con HTP fracción pesada y dichos
contaminantes sobrepasan los niveles permitidos por la Norma Oficial Mexicana
138 y diferencias significativas fueron encontradas entre el P y la arena del suelo
contaminado y el no contaminado y al observar estas diferencias entre pozos
petroleros fueron encontradas en P, Na, K, Ca, Mg y arena. En el aislamiento ocho
géneros de bacterias fueron identificadas, las cuales fueron inoculadas en un
medio que utilizó como única fuente de carbono al hidrocarburo poliaromático
~9~
antraceno, con el objetivo de observar las capacidades de dichas especies en la
degradación de este contaminante, de las cuales tres (Cedacea neteri, Citrobacter
y Edwardsiella) fueron capaces de degradar al antraceno. Con base en este
estudio estas especies podrían ser utilizadas como una alternativa para la
remediación de suelos contaminados por hidrocarburos en zonas petroleras como
Poza Rica Ver.

~ 10 ~
 INTRODUCCIÓN

En Poza Rica, Veracruz la principal actividad económica es la industria

petrolera por lo que hay mayor probabilidad de que el suelo de dicha zona esté
contaminado debido a los derrames, por lo tanto es posible encontrar especies de
bacterias con potencial de tolerar altos niveles de contaminación por
hidrocarburos, lo que convierte a este sitio en un lugar ideal para la búsqueda de
especies de bacterias con potencial capacidad para participar en la remoción de
estos contaminantes.

Según estadísticas de la Procuraduría Federal de Protección al Ambiente

(PROFEPA, 1999), entre los años de 1997 y 2001, de 2,592 emergencias
ambientales con materiales peligrosos a nivel nacional, Petróleos Mexicanos
provocó 57 % de ellas. Entre los estados con mayores emergencias ambientales
se encuentra Veracruz, donde el 80 % de estos eventos son causados por
PEMEX. La mayoría de las emergencias se presentan en ductos, provocando
derrames con sustancias como petróleo crudo, combustóleo, diesel, gasolina,
turbosina, gas natural y amoniaco.

El desecho de mezclas de hidrocarburos tiene un efecto negativo en el suelo,

agua y aire. En el caso de suelo, los hidrocarburos están expuestos a una serie de
transformaciones químicas, físicas y biológicas, siendo las biológicas las más
interesantes debido a la posibilidad de resolver el problema.

Existen distintos métodos para la recuperación de un suelo contaminado pero

suelen ser muy costosas y complejas, los métodos de biorremediación suelen
tener un menor costo y suelen ser muy eficientes (Volke y Velasco, 2002).

En la actualidad diversos tipos de microorganismos han sido identificados

como capaces de degradar mezclas de hidrocarburos, entre ellos las bacterias
han sido las más empleadas para los procesos de biorremediación.

~ 11 ~
 El presente estudio pretende conocer las diferentes especies de bacterias
existentes en un suelo con actividad petrolera. Al conocer que especies habitan en
este tipo de suelo, podremos saber cuáles tienen mayor resistencia a los
hidrocarburos, y el posible potencial de estas especies en la remediación de
suelos contaminados por hidrocarburos. Este trabajo también pretende conocer
que especies de bacterias existentes en dicho suelo son capaces de llevar a cabo
la degradación del antraceno, un hidrocarburo aromático policíclico.

~ 12 ~
 CAPÍTULO l. GENERALIDADES

1.2 Antecedentes

Los microorganismos juegan un papel importante en la eliminación de los

HAPs en los ecosistemas terrestres y acuáticos, siendo la degradación microbiana
el principal proceso de descontaminación natural (Prince, 1993; Sutherland et al.,
1995). Por lo tanto es necesario un buen conocimiento y control de este proceso
natural para aplicarlo a tecnologías de biorremediación (Whise, 2000).

La capacidad de degradación de compuestos que contienen anillos

aromáticos está ampliamente distribuida en la naturaleza, y de hecho, se han
aislado numerosas especies de bacterias y hongos degradadores de compuestos
aromáticos conteniendo entre 2 y 5 anillos (Gibson y Subramanian, 1984; Cerniglia
et al., 1992; Sutherland et al., 1995; Kanaly et al., 2000).

Se han descrito una gran variedad de géneros bacterianos degradadores de

HAPs que incluyen: Achromobacter, Acidovorax, Acinetobacter, Aeromonas,
Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Beijerinckia, Burkholderia,
Comamonas, Corynebacterium, Flavobacterium, Microbacterium, Micrococcus,
Moraxella, Mycobacterium, Neptunomonas, Nocardia, Paenibacillus,
Porphyrobacter, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodococcus, Sphingomonas,
Streptomyces, Vibrio y Xanthomonas, según “The Biodegradative strain database”
una base de datos, publicada por la Universidad de Michigan, que reúne cepas
degradadoras de moléculas orgánicas.

Aitken (1998) aisló 11 cepas de una variedad de sitios contaminados (aceite,

aceite de motor, tratamiento de la madera, y refinería) con la capacidad de
degradar BaP. Los organismos fueron identificados como, al menos, tres especies
de Pseudomonas, así como especies de Agrobacterium, Bacillus, Burkholderia y
Sphingomonas.

~ 13 ~
 Romero at al. (1998) aislaron Pseudomonas aeruginosa a partir de una
corriente fuertemente contaminada por petróleo de una refinería. Se encontró que
la especie está en crecimiento activo en altas dosis de fenantreno con la remoción
completa del contaminante en un período de 30 días.

Rehmann et al. (1998) aislaron Mycobacterium spp., de un suelo

contaminado por HAP de una planta de gas, que fue capaz de utilizar pireno como
única fuente de carbono y energía.

Yuan et al. (2002) aislaron Pseudomons fluoresens y Haemophilus spp de un

sitio de eliminación de residuos petroquímicos con capacidad de degradar
fenantreno, antraceno, fluoreno y acenafteno.

Dean-Ross et al. (2002) aislaron dos cepas bacterianas (Mycobacterium

flavescens y Rhodococcus spp) a partir de sedimentos del río Grande Calumet de
dos sitios diferentes. Se comprobó que ambas bacterias fueron capaces de
degradar HAP. M. flavescens degradó antraceno y Rhodococcus spp pireno.

De acuerdo a Benavides et al. (2007) las cepas aisladas e identificadas de

los lodos contaminados con capacidad degradadora de hidrocarburos son
Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris,
Proteus penneri y Acinetobacter iwoffi.

León et al. (2009) identificaron 5 géneros de bacterias diferentes con alta

capacidad hidrocarburolítica y de producción de biosurfactantes: Enterobacter,
Pantoea, Citrobacter, Klebsiella y Comamonas.

En un estudio por Tang et al (2010) se aplicaron Edwardsiella tarda,

Bacterium aliphaticum, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Pseudomonas
maltiphilia, Fusarium vertiaculloide, Botryodiphodia thiobroma, Fusiarum
oxysporum, Cryptococcus neofomas, Aspergillus niger y Candida tropicales como
microorganismos para remediar un suelo contaminado por petróleo.

~ 14 ~
1.3 Planteamiento del problema

La Industria petrolera es la actividad económica más rentable, no sólo para

México sino para muchos países; el petróleo es el recurso natural que sustenta el
consumo energético a nivel mundial. La industria petrolera Mexicana (PEMEX)
actualmente es la más importante en América Latina, generado por la enorme
producción de crudo que se refleja en sus exportaciones.

Sin embargo las diferentes actividades de la industria petrolera como son la

perforación, extracción, refinación y traslado traen consecuencias negativas al
medio ambiente y a la salud de los organismos.

En México se estima que entre el periodo de 2000-2013 fueron derramados

un total de 13,176,654 litros de petróleo crudo (Comisión Nacional de
Hidrocarburos, 2013). De acuerdo a los informes de PEMEX, existe una amplia
diferencia entre la cantidad de derrames de hidrocarburos producidos en tierra y
mar, pues se calcula que más del 80% de los casos de derrames reportados entre
el periodo de 2001 al 2007 se generaron en tierra (Résendez, 2009). Los
derrames en tierra generalmente ocurren principalmente por ruptura de ductos, y
su transporte.

Los principales hidrocarburos derramados que afectan la salud de los

organismos son la fracción pesada (por ser mayormente tóxicos y contaminantes)
y los hidrocarburos poliaromáticos, la Agencia de Protección al Ambiente de los
Estados Unidos por sus siglas en inglés EPA (U.S. Environmental Protection
Agency) ha identificado 16 de ellos como prioritarios por ser potencialmente
carcinogénicos, mutagénicos y teratogénicos.

Además se ha visto que los derrames también afectan las propiedades

físicas y químicas del suelo, como la materia orgánica, el P extractable, el N total y

~ 15 ~
el pH así como la biodiversidad biológica, causando un deterioro ambiental y por
ello la modificación de los procesos naturales.

En ciudades petroleras como Poza Rica, Ver, en donde existe una gran
cantidad de pozos petroleros y por consiguiente hay una gran cantidad de
derrames, la mayoría de estos derrames no fueron remediados oportunamente y
siguen causando efectos negativos al ambiente.

El Activo de Producción Poza Rica-Altamira fue el responsable del 28% de

las fugas en ductos e instalaciones registradas en el año 2012 (Informe Anual
PEMEX, 2012). Cabe mencionar que tan solo en los primeros tres meses de ese
año, se registraron 15 derrames petroleros en Poza Rica, Ver. (PROFEPA, 2012)
lo que nos da una idea de la magnitud del problema.

~ 16 ~
1.4 Justificación

La industria petrolera en México ha ocupado un papel fundamental en la

historia debido a la gran contribución a la economía nacional. Debido a esto la
intensa actividad petrolera ha contribuido en gran medida a la contaminación del
suelo provocada por derrames de petróleo. Tan sólo en el 2012 la tendencia de
fugas y derrames en ductos de Petróleos Mexicanos presentó un incremento del
87% comparado con el cierre de 2011. Las principales causas de estos eventos
fueron daños por corrosión interior, corrosión exterior y falla de materiales
(PEMEX, 2012).

Los derrames petroleros afectan el suelo, agua, aire y a los

microorganismos que lo habitan, ocasionando la pérdida de los servicios
ambientales que nos brindan.

Es importante conocer el grado de contaminación existente en zonas

impactadas por derrames petroleros, para ejercer acciones de control y
remediación de dichos sitios. Una alternativa para esto son los tratamientos
biológicos como la biorremediación al ser una tecnología más benéfica para el
ambiente y económicamente viable.

Algunos de los microorganismos presentes en el suelo son las bacterias las

cuales predominan por encima de los demás microorganismos.

Las bacterias son consideradas los componentes más importantes del grupo
total de microorganismos del suelo. Así, de todas las actividades del suelo
vinculadas a microorganismos, las bacterias son responsables de las más
importantes (Alexander, 1961). Las bacterias también son las más importantes en
la degradación de hidrocarburos (Sarubbi, 2000).

Ambientalmente son muy importantes porque tienen la capacidad de

transformar los contaminantes en sustancias inocuas. Es por esto que son las más
utilizadas para la biorremediación de un sitio contaminado.
~ 17 ~
 Este estudio en Poza Rica Veracruz cobra relevancia, ya que permitirá la
búsqueda de organismos autóctonos, con posible potencial en la remoción de
hidrocarburos de difícil degradación como los poliaromáticos, que podrían ser
utilizados para futuras remediaciones de suelo en Poza Rica y la región con
organismos propios del sitio, evitando el ingreso de organismos exóticos y
ocasionando un desequilibrio a nivel ecológico.

Zonas con una gran cantidad de sitios contaminados como Poza Rica
resultan ser muy interesantes para la búsqueda de nuevas especies de bacterias
que participen en la remoción de hidrocarburos por la adaptación a dichos sitios
con más de 20 años de contaminación.

~ 18 ~
 1.5 Objetivos

Objetivo general

Aislar e identificar las bacterias existentes en el suelo del campo petrolero

Miguel Alemán y probar su capacidad en la degradación de un hidrocarburo
poliaromático, así como determinar los parámetros físicos y químicos del suelo y
caracterizar los hidrocarburos en dicho suelo.

Objetivos específicos

 Determinar los parámetros físicos y químicos del suelo en la zona de

estudio (campo petrolero Miguel Alemán).
 Caracterizar los hidrocarburos presentes en el suelo de la zona de estudio.
 Aislar e identificar las bacterias en el suelo contaminado y no contaminado
del campo petrolero Miguel Alemán.
 Determinar si las bacterias aisladas participan en la degradación del
hidrocarburo poliaromático antraceno.

1.6 Hipótesis

En sitios donde la principal actividad es la extracción petrolera existen

bacterias en el suelo con capacidad para la degradación de hidrocarburos
poliaromáticos (hidrocarburolíticas).

~ 19 ~
 CAPÍTULO ll. MARCO TEÓRICO

2.1 El suelo

El suelo puede definirse como aquel material no consolidado compuesto por

partículas inorgánicas, materia orgánica, agua, aire y organismos, que comprende
de la capa superior de la superficie terrestre hasta diferentes niveles de
profundidad; mientras que un suelo contaminado puede definirse como aquél
donde se encuentran presentes uno o más materiales peligrosos y/o residuos de
toda índole y que pueden constituir un riesgo para el ambiente y la salud (Medina
et al., 2001).

Se puede considerar al suelo como un gran reactor natural en el cual pueden

ser mineralizados los compuestos orgánicos y precipitados y/o adsorbidos otros
contaminantes (Bautista, 1999).

El suelo es uno de los recursos naturales más importantes, de ahí la

necesidad de mantener su productividad, es esencial para la vida, como lo es al
agua y el aire, y cuando es utilizado de manera prudente puede ser considera
como un recurso renovable.

El suelo constituye un recurso natural que desempeña diversas funciones en

la superficie de la Tierra, proporcionando un soporte mecánico así como nutrientes
para el crecimiento de plantas y microorganismos. La matriz del suelo está
formada por cinco componentes principales: minerales, aire, agua, materia
orgánica y organismos vivos. Los materiales minerales son los principales
componentes estructurales y constituyen más del 50% del volumen total del suelo.
El aire y el agua juntos ocupan el volumen de los espacios, y usualmente
conforman de 25% a 50% del volumen total. La proporción relativa de aire/agua
fluctúa considerablemente con el contenido de humedad del suelo. El material
orgánico ocupa entre 3% y 6% del volumen promedio, mientras que los
organismos vivos constituyen menos del 1% (Eweis et al., 1998).
~ 20 ~
 Las propiedades particulares de cada unidad de suelo, como pueden ser su
profundidad, textura, estructura, capacidad de intercambio catiónico, entre otras,
determinan la capacidad de los suelos de cumplir con una o más funciones en el
ecosistema. La función del suelo más conocida es la de soporte y suministro de
nutrientes a la plantas (Brady y Weil, 1999).

Porta y Acevedo (2005) han establecido las siguientes funciones de los suelos:

Funciones ecológicas:

Producción de biomasa (suministro de nutrientes, aire y agua, y soporte para

las raíces de las plantas), proporcionando alimentos, energía renovable, materias
primas y rasgos naturales (las masas forestales proporcioan un hábitat importante
para muchas especies).

Funciones de filtrado, tampón, almacenamiento y transformación. Estas

funciones tienen gran importancia en relación con los contaminantes. Así, por
ejemplo, el poder tampón del suelo permite que éste resista los procesos de
acidificación o se recupere de ellos. Pero no sólo esto, sino que también indica la
capacidad de un suelo para adsorber agroquímicos, para admitir purines como
nutrientes o sustancias que derivan de vertidos (aguas residuales, lodos de
depuradora, etc.) o de deposiciones atmoesféricas. La capidad tampón es, por
consiguiente, una función que hace que una sustancia añadida a un suelo pueda
ser inmovilizada y no sea tranferida a otro compartimiento ambiental.

Hábitat biológico y reserva de genes: el conocimiento sobre la microbiología

del suelo permite entender y cuantificar una serie de procesos que tienen lugar en
el suelo. La flora y la fauna del suelo son mucho menos aparentes que las que
están encima del suelo, pero su papel resulta fundamental para el ciclo de muchos
elementos y para la vida de las plantas.

~ 21 ~
Funciones relacionadas con las actividades humanas:

Medio físico: funciones de los suelos como espacio soporte de

infraestructuras técnicas e industriales y actividades socioeconómicas:
construcciones, vías de comunicación, campos de deportes, áreas recreativas,
vertidos de escombros y basura, etc.

Fuente de materias primas: gravas, arena, yeso, agua y minerales.

Herencia geogénica y cultural: los suelos forman parte de un paisaje en el

que pudo haber habido asentamientos humanos, cuyos restos arqueológicos
pueden estar enterrados y quizá permanezcan desconocidos. El suelo que tienen
encima desempeña una función protectora, y determinadas acciones antrópicas
podrían provocar su deterioro. Los suelos también contienen información
geológica y geomorfológica valiosa.

Por la gran importancia que representa el suelo para la vida del hombre y de
todos los seres vivos, es un recurso que se debe conservar.

2.1.1 Suelo del estado de Veracruz

En Veracruz las condiciones de temperatura y precipitación han ocasionado

un fuerte intemperismo en las rocas sedimentarias, relativamente suaves, y aun en
las ígneas, de tal manera que dominan los suelos profundos sobre los limitados
por rocas a menos de un metro de profundidad. Por otra parte, el relieve
predominantemente llano ha dado lugar a que los procesos de evolución de los
suelos sean lentos, por lo que el 70 por ciento de los mismos son jóvenes (en su
mayoría arcillosos), pues no han perdido gran cantidad de sus nutrientes
naturales. Los suelos jóvenes se distribuyen por todo el estado, en tanto que los
maduros, en los cuales la pérdida de elementos esenciales para la nutrición de las

~ 22 ~
plantas ha sido considerable, se concentran en el sureste y representan el 30 por
ciento restante (Medina et al., 2010).

La Base Referencial del Recurso Suelo (WRB 2006), es la propuesta

vigente de clasificación internacional para los suelos y fue elaborada en conjunto
por la International Society of Soil Science (ISSS), the International Soil Reference
and Information Centre (ISRIC) y la Food and Agriculture Organization of the
United Nations (FAO). En esta clasificación se presentan 32 grupos de referencia
de suelos a nivel mundial, de los cuales catorce están presentes en el estado de
Veracruz (figura 1), siendo en orden de importancia los siguientes: vertisoles,
feozems, leptosoles, cambisoles, regosoles, luvisoles, acrisoles, andosoles,
nitosoles, gleysoles, planosoles, solonetz, solonchaks y gypsisoles. Asimismo, el
INEGI (2001) en su información edáfológica menciona para el estado de Veracruz
la presencia de otros suelos, entre ellos: rendzinas, litosoles y xerosoles. Es
importante aclarar que tanto rendzinas como litosoles para la WRB 2006 están
incluidos dentro del grupo de los leptosoles, mientras que los xerosoles quedan
dentro del grupo de los gypsisoles.

Los vertisoles (del latín vertere, invertir) son suelos de climas semiáridos a
subhúmedos y de tipo mediterráneo, con marcada estacionalidad de sequía y
lluvias. La vegetación natural que se desarrolla en ellos incluye sabanas,
pastizales y matorrales. Se pueden encontrar en los lechos lacustres, en las
riberas de los ríos o en sitios con inundaciones periódicas. Se caracterizan por su
alto contenido de arcillas que se expanden con la humedad y se contraen con la
sequía, lo que puede ocasionar grietas en esta última temporada. Esta propiedad
hace que aunque son muy fértiles, también sean difíciles de trabajar debido a su
dureza durante el estiaje y a que son muy pegajosos en las lluvias (IUSS, 2007). A
nivel mundial ocupan alrededor de 335 millones de hectáreas, de las cuales cerca
de la mitad se destinan al cultivo de maíz (IUSS, 2007).

~ 23 ~
 En Veracruz los vertisoles son, por su extensión, los suelos más impor-
tantes, ya que representan el 17.07 por ciento de la superficie del estado. Se
localizan en diferentes zonas en la entidad, pero en el noreste son más
abundantes. Se han formado a través de lutitas, aresniscas, calizas, conglome-
rados, rocas ígneas básicas y aluviones. El horizonte A que presentan es
profundo, de textura arcillosa o de migajón arcilloso, que debido a su alto
contenido de material fino (arcillas montmorinolíticas) los hace compactos y
masivos al estar secos y muy adhesivos y expandibles cuando se humedecen.
Estos cambios provocan la formación de grietas en su superficie de por lo menos
un centímetro de ancho (Medina et al., 2010).

Para el estado de Veracruz dominan los vertisoles pélicos, de color gris

oscuro, y en menor proporción, los vertisoles crómicos, de tonos pardos, ambos
con un pH que varía de ligeramente ácido a moderadamente alcalino. Su
contenido de materia orgánica es medio y la capacidad para absorber cationes de
calcio, magnesio y potasio va de alta a muy alta; encontrándose a disposición de
las plantas cantidades altas de los dos primeros elementos, y bajas del último. Los
vertisoles situados en las márgenes del río Pánuco contienen sales solubles y
sodio que limitan su uso agrícola; otros como los de Villa Tejeda y Paso del
Macho, son muy poco profundos; sin embargo, de manera global lo que impone
mayores restricciones para su manejo es el alto porcentaje de arcilla que los
integra, pues deben tener un grado de humedad adecuado, de otra forma si están
muy secos o tienen exceso de agua es difícil introducir los implementos de
labranza. Actualmente en estos suelos se cultivan pastos, se realizan actividades
agrícolas de temporal y de riego, además se desarrollan pastos inducidos, selva
mediana subperennifolia y baja caducifolia en estado secundario (Medina et al.,
2010).

~ 24 ~
 Figura 1. Suelos del estado de Veracruz.

2.2 Contaminación del suelo

El término contaminación se refiere a la introducción o incremento anormal

de sustancias que pueden ejercer un efecto dañino sobre los organismos de los
ecosistemas. A veces, la contaminación es de origen natural, pero en general,
está relacionada con la actividad del hombre, que en su búsqueda de
supervivencia dispersa sustancias agresivas, algunas de las cuales pueden ser
transformadas por organismos vivos (biodegradables) y otras que son persistentes
(no biodegradables) (Bautista, 1999).

~ 25 ~
 Las sustancias naturales también pueden contaminar pero eventualmente
serán degradadas, en cambio las sustancias no biodegradables ingresarán a las
redes tróficas y su concentración permanecerá a través de los niveles tróficos.

En el suelo, el tiempo de residencia de los contaminantes sueles ser alto y

generalmente los contaminantes tanto del agua como del aire llegan a él. El daño
a los organismos con frecuencia es de medio a alto; considerándolo medio para
los animales y alto para las plantas, y la uniformidad de la dispersión es de baja a
muy baja ya que a menudo la contaminación es puntual (Bautista, 1999).

En la tabla 1 se muestran algunos contaminantes y sus posibles efectos sobre el

suelo de una forma muy general.

Tabla 1. Comparación de los efectos de algunos contaminantes en suelo.

Contaminante Suelo
Sales X
Fertilizantes B
Metales pesados ?
Plaguicidas X
H+ —
Lodos Residuales ?B
Hidrocarburos X
Fuente: Bautista, 1999

(X= dañino; B= benéfico; — = sin efecto; ? = que puede ser dañino o benéfico dependiendo de las
condiciones en las que se presente).

Las fugas de hidrocarburos están recibiendo más atención en los últimos

años tanto por la población como por las autoridades ya que es un gran problema
ambiental que afecta al planeta. Los hidrocarburos pueden llegar al medio
ambiente, mediante fugas crónicas de pequeña o gran intensidad. Ambas
contribuyen negativamente al equilibrio de los suelos.

Diversos ecosistemas han sido afectados por la contaminación ocasionada

por las actividades de la industria petrolera, como son: la exploración, extracción,
traslado y refinación, siendo los derrames de petróleo crudo la principal causa de
contaminación de estos ecosistemas. Poco se sabe de la sensibilidad de los
~ 26 ~
organismos del suelo a la contaminación, aunque es sabido que la contaminación
por hidrocarburos reduce la macrofauna y microfauna del suelo. Derrames
petroleros han sido reportados como dañinos para la flora y fauna (Perez et al.,
2010).

2.3 Derrames petroleros

Uno de los orígenes más frecuentes de los accidentes en la industria

petrolera es el relacionado con las fugas de sustancias en forma de escapes
(gases y vapores) y derrames (líquidos) (Storch, 1998).

Las fallas humanas son la principal causa de un derrame, seguidas por

problemas de infraestructura por deterioro de equipos y materiales (Castro, 2009).

Todas las actividades que están envueltas en la exploración y explotación del

petróleo provocan impactos potencialmente negativos sobre el medio ambiente y
sobre las personas que lo usan o que están en contacto con él (Castro, 2009).

De acuerdo a la SEMARNAT las propiedades físicas del suelo más

afectadas por derrames de hidrocarburos son la estructura del suelo debido a la
ruptura de los agregados, aumento de la retención del agua en la capa superficial
y el potencial hídrico

Las propiedades químicas del suelo más afectadas por un derrame de

hidrocarburos son el aumento de carbono orgánico, ya que el 75% del carbono del
petróleo crudo es oxidable, la disminución del pH, debido a la acumulación del
carbono orgánico y generación de ácidos orgánicos, el aumento del manganeso y
hierro intercambiable, el aumento del fósforo disponible (SEMARNAT, 1996).

Los efectos tóxicos de los hidrocarburos en el ambiente dependerán de la

cantidad y composición del petróleo, la frecuencia y tiempo de exposición, el
estado físico del derrame, las características del sitio donde sucedió el derrame,

~ 27 ~
las variables ambientales como temperatura, humedad y oxígeno, el uso de
dispersantes químicos (está restringido su uso) y la sensibilidad de la biota
específica del ecosistema impactado (SEMARNAT, 1996)

Según un estudio realizado por el Centro de Derechos Económicos y

Sociales (CDES), una ONG radicada en Nueva York desde 1992, las poblaciones
que viven en zonas contaminadas por petróleo se exponen a concentraciones de
hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA) y de componentes orgánicos volátiles
(COV) muy por encima de las normas sanitarias estadounidenses y europeas.

Esos productos pueden ser absorbidos por el organismo humano por vía
oral, táctil o por inhalación y generan diversas enfermedades que van desde las
infecciones secundarias como hongos cutáneos, verrugas o eczema, hasta
cánceres de la piel, la sangre o el esófago, pasando por las neumonías y abortos
espontáneos.

2.4 Hidrocarburos

Los hidrocarburos son compuestos formados por átomos de carbono e

hidrógeno, de gran abundancia en la naturaleza, presentes principalmente en el
petróleo (Chappín, 1988).

Se consideran como una mezcla compleja de gases, líquidos y sólidos,

existiendo cantidades combinadas de nitrógeno, oxígeno y azufre, además de
contener compuestos de hierro, níquel, vanadio y otros metales (PEMEX, 1988).

El petróleo tiene una proporción de 76 a 86% de carbono y 10 a 14% de

hidrógeno. Los hidrocarburos se clasifican en biogénicos y antrópicos.

Los hidrocarburos biogénicos son sintetizados por casi todas las plantas,
animales terrestres y marinos, incluyendo a la microbiota, bacterias, plancton
marino, diatomeas, algas y plantas superiores (Bedair y Al-Saad, 1992).
~ 28 ~
 Los hidrocarburos antrópicos son introducidos como resultado de la
actividad humana. Los procesos de combustión industrial contribuyen con la
contaminación debido principalmente al humo generado por la quema del carbón,
combustibles fósiles y petróleo refinado, las descargas de aguas municipales, las
actividades de transporte y los derrames son algunas de las principales fuentes de
estos contaminantes (Bidleman et al., 1990).

Los hidrocarburos del petróleo se agrupan en las siguientes familias:

parafinas volátiles y no volátiles (alcanos), naftenos (cicloalcanos o cicloparafinas),
oleofinas (alquenos) y aromáticos (monoaromáticos y poliaromáticos) (Viñas,
2005).

Los hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs) son compuestos

orgánicos formados al menos por dos anillos fusionados de benceno, los cuales
difieren en el número y posición del anillo aromático (Furton y Pentzke, 1998).

La estructura de los HAPs consiste de átomos de carbono e hidrógeno

(Cutright and Hwang, 2006). Son compuestos no polares, neutros e hidrofóbicos
(Juhasz and Naidu, 2000). Los HAPs poseen diferentes propiedades físicas y
químicas debido a su estructura química (Haritash y Kaushik, 2009)

La agencia de protección al medio ambiente de los Estados Unidos (EPA)

ha clasificado a 16 hidrocarburos poliaromáticos (Figura 2) como contaminantes
prioritarios por el riesgo que representan al ambiente y a la salud. Entre los 16
destaca el benzo(a)pireno, fenantreno y antraceno (Hernández, 2013).

~ 29 ~
Figura 2. Estructura química y sistema de numeración de anillo de los 16 HAPs prioritarios.

Hay dos clases de hidrocarburos aromáticos: los de bajo peso molecular

que tienen de 2 a 3 anillos aromáticos como el naftaleno, fenantreno, antraceno y
derivados, y los de alto peso mo lecular que tienen de 4 a 7 anillos aromáticos
como el criseno y benzo(a)pireno. Sus características físicas y químicas varían de
acuerdo con su peso molecular y, en consecuencia, en su distribución y efecto en
el ambiente, lo mismo sus efectos en los sistemas biológicos (Corona e Iturbide,
2004).

El comportamiento de estos compuestos depende en gran medida de su

número de anillos y, de hecho, se agrupan de acuerdo con este factor. Presentan
una fuerte adsorción de materia orgánica y pueden ser biodegradados (Jiménez,
2001).

La importancia de los HAPs está relacionada con la movilidad debido a

su peso molecular: los HAPs de alto peso molecular son relativamente inmóviles y,
por ende, de baja volatilidad y solubilidad. Algunos compuestos como naftaleno,

~ 30 ~
acenaftileno, acenafteno, fluoreno, fenantreno, antraceno, fluoranteno y pireno por
mencionar algunos, son considerados como contaminantes prioritarios por la
Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (Por sus siglas en inglés,
EPA), la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Comunidad Europea (CE)
debido a sus efectos carcinogénicos (Menzie et al., 1992).

Estos compuestos se encuentran distribuidos en el suelo, mar, sistemas

pluviales y sedimentos y su presencia se ha atribuido principalmente a los
derrames de petróleo y descargas de plantas petroquímicas, aun cuando se puede
deber al transporte atmosférico por los aportes de la combustión (Padilla, 1989).

Entre los HAPs sobresalen los compuestos que tienen entre cuatro y seis
anillos aromáticos por ser potencialmente carcinógenos y mutagénicos (USEPA,
1987). La EPA ha clasificado a 16 hidrocarburos poliaromáticos como
contaminantes prioritarios por el riesgo que reprsentan al ambiente y a la salud.
Entre los 16 destaca el benzo(a)pireno, fenantreno y antraceno.

Los HAPs son compuestos no polares o muy débilmente polares que tienen
afinidad por las fases hidrofóbicas, presentando una baja solubilidad en agua
(McBride, 1994).

La fuente más importante de HAPs es la combustión incompleta de

cualquier material orgánico que contenga carbono e hidrógeno. Esto puede ocurrir
naturalmente por incendios forestales, actividad volcánica y procesos diagénicos
(Schnitzer y Khan; Wilcke y col., 2000; Thiele y Brummer, 2002). Pero se reconoce
que la mayoría de los HAPs detectados en matrices ambientales provienen de
fuentes antopogénicas debidos a la quema de madera y combustibles fósiles.

Muchos procesos de carbonización producen HAPs durante la degradación

de material orgánico a bajas temperaturas (200°C) y a altas presiones en un
periodo de millones de años como es el petróleo y el carbón (Prince y Drake,
1999), por lo que el crudo y sus derivados representan una fuente importante de
HAPs en el ambiente en zonas de explotación petrolera.

~ 31 ~
 Se ha observado que las concentraciones de HAPs en el ambiente de
regiones tropicales son más bajas que en las regiones polares debido a una rápida
degradación microbiana, fotooxidación y volatilización (Wilcke, 1999).

Los HAPs tienden a adsorberse a las superficies de partículas,

especialmente a las constituidas por materia orgánica del suelo, lo que dificulta su
degradación haciendo que estos compuestos tengan una gran persistencia en
condiciones naturales (Singleton, 2005).

Los HAPs pueden persistir en el medio durante largos periodos de tiempo sin
modificar sus propiedades tóxicas, con el consecuente riesgo para la salud
humana y el ecosistema. Se acumulan en diferentes puntos de la cadena trófica y
presentan toxicidad por inhalación, contacto o ingestión (Eisler, 1987).

La baja hidrosolubilidad de los HAPs los convierte en compuestos altamente

liposolubles que se adsorben con facilidad a través del tracto gastrointestinal de
mamíferos distribuyéndose rápidamente en los tejidos, preferentemente en el
tejido adiposo (Twiss et al., 1999).

En la siguiente tabla se muestran los efectos carcinogénicos, genotóxicos y

mutagénicos de algunos HAPs.

Tabla 2. Datos relativos a los efectos carcinogénicos, genotóxicos y mutagénicos de algunos

PAHs.

HAPs Carcinogenicidad Genotoxicidad Mutagenicidad

Fenantreno I L +
Antraceno N N −
Pireno N L +
Benzofluorenos I I ?
Benzo(a)antraceno S S +
Benzo(e)pireno I L +
Benzo(a)pireno S S +
Dibennz(a)antraceno S S +
Benzo(ghi)perileno I I +
Dibenzopirenos S I +
2-Nitronaftaleno N L −
1-Nitropireno I S +
Fuente: Mastandrea et al., 2005

~ 32 ~
(S= suficiente; I= insuficiente; N= no carcinogénico; L= limitados.)

Mutagenicidad (Test de Ames): + (positivo); - (negativo); ? (inconcluso).

2.4.1 Degradación microbiana de los HAPs

La degradación de los HAPs que contienen hasta cuatro o cinco anillos

fusionados por bacterias y hongos ha sido bien documentado. El proceso que
implica la biodegradación es inversamente proporcional al tamaño del anillo de la
molécula del HAP. Los HAPs de menor peso se degradan más rápidamente que
los HAPs de mayor peso que contienen tres o más anillos fusionados.
Normalmente, los HAPs de mayor peso molecular no sirven como sustratos
susceptibles de metabolismo microbiano (Cerniglia et al., 1992).

En la figura 3 se muestran las primeras reacciones de transformación

aeróbica de los HAPs, siendo característico de los hongos y los mamíferos la
introducción de un sólo átomo de oxígeno mediante una monooxigenasa que
contiene el citocromo P-450, y la transfromación a trans-dihidrodioles. En este
proceso de transformación se generan metabolitos más solubles, para su posterior
eliminación (proceso de detoxificación) (Cerniglia, 1984; Cerniglia et al., 1985;
Sutherland et al., 1995).

~ 33 ~
Figura 3. Reacciones iniciales del metabolismo de los HAPs.

Las bacterias inician la oxidación del anillo aromático mediante la

incorporación de dos átomos de oxígeno catalizado por una diooxigenasa (figura
3). A partir de esta reacción se forma un cis-dihidrodiol, a diferencia de los hongos
y mamíferos que generan un trans-dihidrodiol, y el anillo pierde la aromaticidad. A
continuación una deshidrogenasa NAD+ depediente, reconstituye el anillo
aromático formando un catecol (diol). Los dioles son moléculas a partir de las
cuales se produce la ruptura del anillo aromático mediante dioxigenasas
estereoselectivas. La ruptura se puede dar entre dos grupos hidroxilos,
denominándose orto-ruptura, o adyacente a estos grupos, denominándose meta-
ruptura.

~ 34 ~
2.4.2 Antraceno

El antraceno es no cancerígeno así como sus metabolitos, su emisión al

medio ambiente en cantidades traza durante los procesos de gasificación y
licuación de carbón han despertado un interés considerable. Además, el antraceno
se utiliza como modelo de sustrato en los estudios relativos a la degradación
ambiental de HAPs, ya que su estructura se encuentra en HAPs cancerígenos
tales como benzo(a)pireno, benzo(a)antraceno y 3-metilcolantreno (figura 3).

Algunos microorganismos aislados del suelo tienen la habilidad de usar al

antraceno como única fuente de carbono y energía.

2.5 Tecnologías de remediación

En términos generales las tecnologías de remediación de suelos y/o aguas

subterráneas abarcan todas aquellas operaciones que tienen por objetivo reducir
la toxicidad, movilidad o concentración del contaminante presente en el medio,
mediante la alteración de la composición de la sustancia peligrosa o del medio, a
través de acciones químicas, físicas o biológicas. La elección de cada tecnología
depende de las características del suelo y del contaminante, de la eficacia
esperada y por supuesto de la factibilidad técnico-económica y el tiempo requerido
para su ejecución (Alcaino, 2012).

Existe una gran variedad de tecnologías de remediación, las cuales se

pueden clasificar bajo distintos criterios:

Según objetivo de remediación:

- Descontaminación
- Contención
- Confinamiento

~ 35 ~
Según lugar de aplicación de la remediación:

- Ex Situ
- In Situ

Según tipo de tratamiento:

- Biológico
- Fisicoquímico
- Térmico

Según grado de desarrollo:

- Tradicional
- Innovadora

Según el objetivo de remediación, las técnicas de descontaminación se

enfocan en la disminución o eliminación de la concentración de los contaminantes
del medio, las técnicas de contención son las que aíslan los contaminantes del
medio sin tener que actuar en él, y las técnicas de confinamiento alteran las
condiciones fisicoquímicas del medio consiguiendo las reducción de la movilidad
de los contaminantes (Alcaino, 2012).

Si se considera el lugar de aplicación, las técnicas In Situ son las que se

aplican directamente en el sitio contaminado y las técnicas Ex Situ son aquellas en
que se requiere de la extracción del medio contaminado para poder ser tratado
(Alcaino, 2012).

Si las tecnologías de remediación se clasifican según el tipo de tratamiento,

los tratamientos biológicos (biorremediación) utilizan las actividades metabólicas
de ciertos organismos (plantas, hongos, bacterias) para degradar (destrucción),
transformar o remover los contaminantes a productos metabólicos inocuos. Los

~ 36 ~
tratamientos fisicoquímicos utilizan las propiedades físicas y/o químicas de los
contaminantes o del medio contaminado para destruir, separar o contener la
contaminación. Los tratamientos térmicos utilizan calor para incrementar la
volatilización (separación), quemar, descomponer o fundir (inmovilización) los
contaminantes en un suelo (Volke y Velasco, 2002).

Finalmente si se clasifica según el grado de desarrollo, las tecnologías

tradicionales se refieren a las que son comúnmente usadas a gran escala y cuyos
costos y accesos son relativamente fáciles. Las tecnologías innovadoras
involucran a las que se encuentran recientemente propuestas o en etapas de
investigación (Alcaino, 2012).

Por ejemplo, al basarse en el criterio del tipo de tratamiento utilizado, las

diversas tecnologías de remediación se pueden agrupar como sigue (Alcaino,
2012).

Tratamientos biológicos:

- Bioaumentación
- Biodegradación asistida
- Bioestabilización
- Bioventing
- Compostaje
- Fitorremediación
- Losdos Biológicos

Tratamientos fisoquímicos:

- Lavado de suelos
- Electrorremediación
- Extracción de agua
- Extracción de aire
- Flushing

~ 37 ~
 - Oxidación UV
- Pozos de recirculación
- Sellado de suelos

Tratamientos térmicos:

- Calentamiento por conducción térmica

- Calentamiento por radiofrecuencia
- Calentamiento por resistencia eléctrica
- Desorción térmica
- Pirólisis
- Vitrificación

En la siguiente tabla se presentara un resumen de las ventajas y

desventajas de los distintos tipos de tecnologías para remediación de suelos:

Tabla 3. Ventajas y Desventajas de las tecnologías de Remediación, clasificadas de acuerdo con el

tipo de tratamiento.

Tipo de Ventajas Desventajas

tratamiento
Tratamientos - Son efectivos en cuanto a -Requieren mayores tiempos de
Biológicos costos. tratamiento.

- Son tecnologías más -Es necesario verificar la

benéficas para el ambiente. toxicidad de intermediarios y/o
productos.
- Los contaminantes
generalmente son destruidos. - No pueden emplearse si el tipo
de suelo no favorece el
- Se requiere un mínimo o crecimiento microbiano.
ningún tratamiento posterior.
Tratamientos - Son efectivos en cuanto a - Los residuos generados por
Fisicoquímicos costos. técnicas de separación, deben
tratarse o disponerse: aumento
- Pueden realizarse en en costos y necesidad de
periodos cortos. permisos.

- El equipo es accesible y no se -Los fluidos de extracción

necesita de mucha energía ni pueden aumentar la movilidad
ingeniería. de los contaminantes: necesidad
de sistemas de recuperación.

~ 38 ~
 Tratamientos - Permite tiempos rápidos de - Es el grupo de tratamientos
Térmicos limpieza más costoso.

Fuente: Volke y Velasco, 2002

Como se puede observar en la tabla anterior los tratamientos biológicos

(biorremediación) son la mejor alternativa para la recuperación de un suelo
contaminado.

2.6 Biorremediación

Las prácticas de biorremediación consisten en el uso de organismos como

plantas, hongos, bacterias naturales o modificadas genéticamente para neutralizar
sustancias toxicas, transformándolas en sustancias menos tóxicas o
convirtiéndolas en inocuas para el ambiente y la salud humana (Benavides et al.,
2005).

La degradación microbiana es el principal proceso de descontaminación

natural. Este proceso se puede acelerar y/o mejorar mediante la aplicación de
tecnologías de biorremediación (Alexander, 1999). El crudo de petróleo se
caracteriza por ser una matriz contaminante que contiene una elevada diversidad
de compuestos, por lo que es un sustrato ideal para evaluar el potencial catabólico
de cepas o consorcios microbianos de interés en biorremediación (Viñas, 2005).

El petróleo crudo está compuesto por una mezcla de miles de compuestos

químicos diferentes. Como la composición de cada tipo de hidrocarburo es única,
hay diferentes maneras de lidiar con ellos a través de los microorganismos y la
flora. La biorremediación puede ocurrir de manera natural o puede ser estimulada
con la adición de microorganismos y fertilizantes (Viñas, 2005).

Los principales organismos degradadores del petróleo son bacterias y

levaduras, y en menor cuantía, hongos oxidantes de los hidrocarburos.

~ 39 ~
 La biorremediación puede emplear organismos propios del sitio contaminado
(autóctonos) o de otros sitios (exógenos), puede realizarse in situ o ex situ, en
condiciones aerobias (en presencia de oxígeno) o anaerobias (sin oxígeno) (Eweis
et al, 1998). Aunque no todos los compuestos orgánicos son susceptibles a la
biodegradación, los procesos de biorremediación se han usado con éxito para
tratar suelos, lodos y sedimentos contaminados con hidrocarburos del petróleo
(HTP), solventes (benceno y tolueno), explosivos (TNT), clorofenoles (PCP),
pesticidas (2,4-D), conservadores de madera (creosota) e hidrocarburos
aromáticos policíclicos (HAP) (Van Deuren et al. 1997, Semple et al. 2001).

La biorremediación, mediante el uso de microorganismos es una buena

alternativa que puede ser utilizada para la recuperación de suelos contaminados.

2.7 Microorganismos del suelo

Para los microorganismos, el suelo no solo aporta la materia necesaria para

la síntesis de sus células, sino que también la energía para sus actividades vitales.
Las características físicas y químicas del suelo, van a determinar el ambiente en el
que se desarrollan los microorganismos. Dichas características afectan la
composición de la comunidad microbiana tanto cuantitativa como cualitativamente
(Alexander, 1961).

En la tabla 4 se presenta una estimación del número de microorganismos

presentes en forma natural en los suelos.

Algunos tipos de microorganismos son capaces de degradar hidrocarburos

de petróleo y usarlos como fuente de carbono y energía como es el caso de
algunas algas, hongos y bacterias.

~ 40 ~
Tabla 4. Poblaciones promedios de microorganismos determinados en suelos.

Poblaciones promedios de microorganismos de suelo

superficial
Organismos Valores típicos Extremos
(células/g de suelo) (células/g de suelo)
Bacterias 0.1 – 1 billones >10 billones
Actinomices 10 – 100 millones 100 millones
Hongos 0.1 – 1 millones 20 millones
Algas 10000 – 100000 3 millones
millones
Subsuelo (células/g de suelo)
Bacterias 1000 – 10 millones 200 millones
Fuente: Dragun (1988), citado por Sarubbi, (2000).

En la degradación de los hidrocarburos del petróleo, se involucran consorcios

de microorganismos, incluyendo procariontes y eucariontes. Las bacterias y
levaduras son los organismos dominantes en la degradación de compuestos del
petróleo en ecosistemas acuáticos, mientras que bacterias y hongos son los que
dominan en muestras de suelo. Durante la biodegradación, los microorganismos
están equipados con la maquinaria metabólica para utilizar al contaminante como
fuente de carbono y energía para su crecimiento, produciendo biomasa,
subproductos, dióxido de carbono y agua (Eweis, 1998).

2.8 Bacterias

Las bacterias son organismos procariontes unicelulares rodeados por una

membrana lipídica (Verlag, 2007). Constituyen un grupo muy heterogéneo de
organismos y predominan en el suelo por sobre los demás grupos de
microorganismos. La determinación del número total de bacterias presentes en el
suelo se hace muy difícil y solo es posible lograr determinar solo algunas
poblaciones de estas (Alexander, 1991).

Las bacterias en el suelo, además de requerir nutrientes para generar su

energía y multiplicarse, demandan de un entorno químico y físicamente adecuado

~ 41 ~
para vivir. La temperatura, el pH, presión parcial de oxígeno y la presión osmótica
son fundamentales para la sobrevivencia bacteriana (Rittmann, 2001). De acuerdo
a lo anterior, pueden mencionarse dos grandes poblaciones bacterianas presentes
en los suelos y en estrecho vínculo con sus propiedades: bacterias autóctonas,
que son residentes verdaderos del suelo y aquellas bacterias alóctonas
(Alexander, 1991).

Las poblaciones autóctonas o nativas pueden presentarse en estados de

resistencia y perdurar por largos periodos de tiempo en el suelo. Estos
microorganismos son naturales de un hábitat determinado; en él pueden
sobrevivir, crecer y realizar sus actividades metabólicas, ocupando los nichos
ambientales disponibles para las poblaciones microbianas de un ecosistema dado.
Estos organismos presentan generalmente características adaptativas que los
hacen fisiológicamente compatibles con su ambiente físico y químico (Alexander,
1991). Por otro lado, las poblaciones alóctonas, son miembros temporales de un
hábitat y no ocupan los nichos funcionales del ecosistema. Por regla general,
estos microorganismos han proliferado en otro lugar y han sido transportados a un
ecosistema que les resulta extraño, lo que no descarta su variabilidad en el
tiempo; algunos pueden desaparecer en menos de 24 horas, mientras que otros
pueden presentar adaptaciones a su nuevo medio y perdurar en él por largos
períodos de tiempo (Atlas y Bartha, 2002).

Dentro del grupo de las bacterias, se encuentran aquellas formadoras de

esporas y aquellas no formadoras de esporas, con forma de cocos, bacilos y
espirilos. Estas varían en el suelo en tamaño, forma, requerimientos de oxigeno
(aerobias y anaerobias), obtención de carbono (autótrofas y heterótrofas) y su
relación con plantas y animales (saprofitos y parásitos). Los bacilos se encuentran
en mayor proporción en los suelos y tienen la capacidad de persistir en estos bajo
situaciones desfavorables o extremas, mediante la formación de esporas de
resistencia que funcionan como parte del ciclo de vida de dicho microorganismo
(Montenegro, 2007).

~ 42 ~
 Las bacterias son consideradas los componentes más importantes del grupo
total de microorganismos del suelo. Así, de todas las actividades del suelo
vinculadas a microorganismos, las bacterias son responsables de las más
importantes (Alexander, 1991).

2.9 Bacterias hidrocarburolíticas

Ambientalmente, las bacterias son muy importantes, pues tienen la

capacidad de transformar una gran variedad de contaminantes orgánicos e
inorgánicos a sustancias inocuas, que pueden ser reciclados al medio ambiente.
Aquellas bacterias disponen de la capacidad de oxidar una gran cantidad de
compuestos orgánicos producidos y utilizados industrialmente (Rittmann, 2001).
Se estima, que de todos los microorganismos presentes en el suelo, las bacterias
son aquellas que se presentan en un mayor número y también las más
importantes en la degradación de hidrocarburos (Sarubbi, 2000).

Las bacterias son la clase de microorganismos que participan activamente en

la degradación de contaminantes orgánicos procedentes de sitios contaminados.
Un número de especies bacterianas son conocidas por su capacidad para
degradar los HAP (Haritash y Kaushik, 2009).

El fundamento de la degradación bacteriana de hidrocarburos, se basa en la

utilización de estos por los microorganismos como fuente de carbono y energía.
Los hidrocarburos en efecto, proveen de alimento a ciertas bacterias y
microorganismos (American Petroleum Institute, 1972).

Se estima que del total de microorganismos conocidos, un número

considerable de especies son capaces de utilizar los hidrocarburos como fuente
nutricional (Beerstecher 1954; Sharpley, 1966). Estos microorganismos logran
sobrevivir en hábitat contaminados pues son capaces de utilizar metabólicamente
este recurso, de esta manera, el contaminante se transforma a la vez en una
~ 43 ~
potencial fuente de energía (Madigan, 1998; Ilyna et al., 2003). Existen ciertas
bacterias capaces de degradar hidrocarburos de petróleo, y que luego de una
exposición por un periodo de tiempo determinado a éstos, son capaces de
adecuarse y aumentar su población. Lo anterior explicaría que la mayoría de los
microorganismos, si son capaces de sobrevivir en ese ambiente, pueden degradar
a aquellos compuestos sin mayor inconveniente (Parrish et al., 1999; Fontúrbel y
Achá, 2000).

Esta tolerancia microbiana a la presencia de hidrocarburos de petróleo en el

suelo, induce a la selectividad y a la disminución de la diversidad. Los
microorganismos tolerantes a este ambiente de estrés, desarrollan y utilizan
respuestas enzimáticas y fisiológicas especializadas para la degradación del
hidrocarburo (Atlas et al. 1991; Rivera et al. 2002).

De todos los factores necesarios para desarrollar un sistema de

biorremediación, es de importancia inmediata conocer la presencia o ausencia de
una población bacteriana capaz de degradar el residuo peligroso (Levin y Gealt,
1997). Para Rittmann (2001), incluso a pesar que un contaminante sea fácilmente
biodegradable, la ausencia de población microbiana con capacidad degradativa
puede constituirse en un factor limitante para la biorremediación del suelo
afectado.

Se hace necesario por lo tanto, realizar antes de comenzar un proyecto de

remediación biológica, un estudio de factibilidad para caracterizar las propiedades
específicas del sitio. Así, no solo la determinación de las propiedades
físicoquímicos del material a remediar es importante, otra caracterización no
menos importante es la determinación de los potenciales microorganismos del sitio
con capacidad de utilizar los hidrocarburos (Adams, 1999).

Levin y Gealt (1997) estiman que son varios los microorganismos capaces
de llevar a cabo este proceso degradativo. En algunos casos se han identificado y
caracterizado, mientras que en otros ha sido extremadamente difícil cultivarlos e

~ 44 ~
inclusive aislarlos. Para tal objetivo, la primera etapa la constituye la toma de
muestras representativas, cuyos resultados se aplican a la totalidad de la
comunidad o del ecosistema. Cada muestra es, por necesidad, minúscula en
comparación con todo el medio; por lo tanto puede llevar a resultados
poblacionales muy por encima o muy por debajo de la abundancia real (Atlas y
Bartha, 2002).

2.10 Área de estudio

Los sitios de muestreo se encuentran ubicados en el campo petrolero

Miguel Alemán, localizado entre el municipio de Poza Rica y Papantla Ver., al
noreste del estado de Veracruz, los sitios seleccionados para el muestreo
sugeridos por PEMEX fueron las presas de recorte de perforación de los
siguientes pozos: el pozo petrolero número 48 (20º 27’25.6 NL y 97º 21’13.6 WL),
pozo número 69 (20º 26’56.3 NL y 97º 21’41.5 WL) y el pozo número 98 (20º
27’22.6 NL y 97º20’8.5 WL) (figura 4) dichos pozos se encuentran a una altitud de
200 m.s.n.m. Los suelos de estos sitios fueron contaminados por derrames de
petróleo ocasionados por las actividades de extracción hace 20 años
aproximadamente.

El clima es cálido con una temperatura promedio de 24.4° C; su

precipitación pluvial media anual es de 1,010 mm. Su vegetación es de bosque
mediano o bajo subtropical perennifolio, entre las especies arbóreas que
conforman este tipo de bosque se encuentran el guarumbo, frijolillo, caoba, palo
de rosa, humo, ceiba, alzaprima, chijol, chaca, guásima, guanacastle, sangregado
y cedro rojo. Se desarrolla una fauna compuesta por poblaciones de conejos,
armadillos mapaches, tlacuaches, tejones y coyotes.

~ 45 ~
 El suelo es de tipo vertisol, con un alto contenido de arcillas expansivas que
forman grietas anchas y profundas en época de sequía. Las principales
actividades en la zona son la industria petrolera, la agricultura y ganadería.

Figura 4. Mapa de los sitios de muestreo en el campo petrolero Miguel Alemán, (los números
indican los pozos petroleros en estudio con sus respectivos controles).

~ 46 ~
CAPÍTULO III. METODOLOGÍA

Proceso Metodológico

~ 47 ~
3.1 Muestreo

En la zona de estudio, en las presas de recorte de perforación de cada uno

de los tres pozos petroleros seleccionados (P 48, 69 y 98) y un sitio aledaño para
cada pozo libre de contaminación los cuales sirvieron como control (P 48C, 69C y
98 C), se realizaron transectos a lo largo de las presas y de los sitios control y se
excavaron monolitos a los 10, 20, 30 y 40 m respectivamente, cada monolito tuvo
una dimensión de 25 x 25 x 30 cm (Anderson e Ingram, 1993). En total se tuvieron
24 monolitos equivalentes a 24 muestras (figura 5).

Los sitios aledaños para cada pozo libre de contaminación se encontraban

fuera de las presas de recorte de perforación aproximadamente a 300 m de
distancia a una pendiente mayor.

Para las pruebas microbiológicas se tomó una fracción similar a 200 g de

suelo de cada monolito. Las muestras de suelo se depositaron en bolsas de
plástico y se colocaron en una hielera para su traslado al laboratorio de la Facultad
de Biología de la Universidad Veracruzana. En el laboratorio, las muestras fueron
colocadas a 4º C.

Figura 5. Fotos de los monolitos realizados.

~ 48 ~
3.2 Análisis físicos y químicos del suelo

En cada monolito se tomó un kg de suelo y se depositó en su respectiva

bolsa de plástico debidamente etiquetada para su traslado, para determinar en el
laboratorio las características físicas y químicas del suelo. Una vez en el
laboratorio las muestras fueron secadas al aire y tamizadas a 2 mm. para la
identificación de pH, textura, materia orgánica (MO), carbono, nitrógeno total (NT),
relación C/N, fósforo extractable, sodio (Na), potasio (K), calcio (Ca) y magnesio
(Mg) y capacidad de intercambio catiónico (CIC). Todas las técnicas para la
determinación de estos parámetros físicos y químicos están incluidas en la Norma
Oficial Mexicana NOM-021-SEMARNAT-2000. Ésta se basa en la Soil Science
Society of America Methods of Soil Analysis (SSSA, 1996).

3.2.1 Textura

Se llevó a cabo el método de Bouyoucos que elimina la agregación debida

a materia orgánica y la floculación debida a los cationes calcio y magnesio. No se
eliminan otros cementantes como carbonatos. El tiempo de lectura se ha
escogido de 40 segundos para la separación de partículas mayores de 0.05 mm
(arena) y de 2 horas para partículas de diámetro mayores de 0.002 mm (limo y
arena). Estos límites han sido establecidos por el Departamento de Agricultura de
Estados Unidos (U.S.D.A. por sus siglas en inglés) y se han usado para construir
el triángulo de texturas que se observa en la figura 7 (NOM-021-SEMARNAT-
2000).

3.2.2 pH

Método electrométrico para la determinación del pH en muestras de suelo

en una solución de agua pura. La evaluación electrométrica del pH se basa en la
determinación de la actividad del ion H mediante el uso de un electrodo cuya
membrana es sensitiva al H. En el caso de los suelos el pH se mide
~ 49 ~
potenciométricamente en la suspensión sobrenadante de una mezcla de relación
suelo: agua 1:2 (NOM-021-SEMARNAT-2000).

3.2.3 Materia orgánica

La determinación de Materia Orgánica (M.O.) del suelo se evalúa a través

del contenido de carbono orgánico con el método de Walkey y Black. Este método
se basa en la oxidación del carbono orgánico del suelo por medio de una
disolución de dicromato de potasio (K2Cr2O7) y el calor de reacción que se genera
al mezclarla con ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado. Después de un cierto tiempo
de espera la mezcla se diluye, se adiciona ácido fosfórico (H3PO4) concentrado
para evitar interferencias de Fe +3 y el dicromato de potasio residual es valorado
con el sulfato ferroso. Con este procedimiento se detecta entre un 70 y 84% del
carbono orgánico total por lo que es necesario introducir un factor de corrección, el
cual puede variar entre suelo y suelo. (NOM-021-SEMARNAT-2000).

3.2.4 Nitrógeno

La determinación de nitrógeno total por el método de Micro-Kjeldahl

involucra dos pasos: (a) digestión de la muestra para convertir el nitrógeno a NH4
(b) la determinación de NH4 en el digestado. La digestión de la muestra es
desarrollada por calentamiento de la muestra con ácido sulfúrico concentrado y
sustancias como el K2SO4 que promueven la oxidación de la materia orgánica y la
conversión del nitrógeno orgánico a amonio por incremento de la temperatura de
digestión y también emplea catalizadores como el Cu y Se, que aumentan la
velocidad de oxidación de la materia orgánica por el ácido sulfúrico. El amonio en
el digestado es determinado por titulación del amonio liberado por destilación del
digestado con álcali (NOM-021-SEMARNAT-2000).

~ 50 ~
3.2.5 Fosforo extraíble

La determinación del fosforo extraíble por el método Olsen es ampliamente

utilizado en estudios de fertilidad de suelos para la determinación de fosforo
disponible tanto en suelo neutros como alcalinos. El fosforo es extraído del suelo
con una solución NaHCO3 0.5 M ajustada a un pH de 8.5.

3.2.6 Cationes intercambiables (Ca2, Mg, Na y K)

Método para la determinación de la capacidad de intercambio catiónico

(CIC) y bases intercambiables (Ca 2+, Mg 2+, Na+ y K+) de los suelos, empleando
acetato de amonio 1N, pH 7.0, como solución saturante. El método para la
determinación consiste en la saturación de la superficie de intercambio con un
catión índice, el ion amonio; lavado del exceso de saturante con alcohol;
desplazamiento del catión índice con potasio y determinación del amonio mediante
destilación. El amonio se emplea como catión índice debido a su fácil
determinación, poca presencia en los suelos y porque no precipita al entrar en
contacto con el suelo. La concentración normal que se usa asegura una completa
saturación de la superficie de intercambio y como está amortiguada a pH 7.0, se
logra mantener un cierto valor de pH. El lavado con alcohol pretende desplazar el
exceso de saturante y minimizar la pérdida del amonio adsorbido (NOM-021-
SEMARNAT-2000).

3.3 Análisis de los hidrocarburos

Adicionalmente 250 g de suelo fueron colectados en cada sitio y

depositados en frascos de vidrio y colocados en una hielera a 4ºC para la posterior
caracterización de los hidrocarburos poliaromáticos, siguiendo las
recomendaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM-138-SEMARNAT/SSA!-
2012, Límites máximos permisibles de hidrocarburos en suelos y lineamientos

~ 51 ~
para muestreo en la caracterización y especificación para la remediación, que
tomando como referencia los métodos establecidos por la Environmental
Protection Agency (EPA).

3.3.1 Hidrocarburos totales de petróleo fracción pesada

Para los hidrocarburos totales fracción pesada se utilizó el método de reflujo

con equipo Soxhlet.

La extracción de hidrocarburos del petróleo por Soxhlet provee fracciones

de C6 a C50. Para la óptima extracción de los compuestos orgánicos, los sólidos
deben de estar en partículas pequeñas; mientras más pequeñas sean las
partículas, más área de superficie y contacto y, por lo tanto, mejor extracción. Así,
sólidos de mayor tamaño deben ser reducidos a pequeñas partículas antes de la
extracción. El desarrollo del método de extracción Soxhlet incluye encontrar un
solvente o mezclas de solventes que tengan una alta afinidad por los analitos y
una baja afinidad por la matriz de la muestra sólida.

El solvente debe tener una alta volatilidad porque debe ser removido al final
de la extracción para concentrar el analito de interés. Este método consiste en
extraer los hidrocarburos contenidos en el suelo, mediante la acción de un
disolvente orgánico volátil apropiado, que es reflujado a través de la muestra
varias veces durante un tiempo determinado. El disolvente es evaporado y
posteriormente condensado en un refrigerante, se le hace pasar por la muestra y
se le regresa al origen para ser nuevamente evaporado.

La muestra sólida es mezclada con sulfato de sodio anhidro para eliminar el

agua residual, se le coloca en un dedal o cartucho de papel o fibra de vidrio y se
usa un solvente orgánico apropiado en este caso fue una mezcla de cloruro de
metileno y hexano para su extracción en un equipo Soxhlet. Mediante los reflujos
del solvente y la temperatura se permite el contacto íntimo de la muestra con el
disolvente de extracción, de esta manera se logra la liberación de los

~ 52 ~
hidrocarburos presentes en la muestra. El extracto orgánico fue evaporado para
realizar el intercambio de solvente, acorde con el método de cuantificación.

3.3.2 Hidrocarburos aromáticos policíclicos

Para la determinación de los hidrocarburos poliaromáticos se pesaron 1.5 g

de suelo, se mezclaron con 3 g de sulfato de sodio anhidro y se añadió 10 ml de
acetona. La mezcla se agitó en un vórtex por 20 minutos. Los HAPs extraídos con
acetona fueron separados del suelo por centrifugación a 13,700 x g durante 15
min. El mismo procedimiento se repitió tres veces y los extractos filtrados se
concentraron hasta 2 ml y después se analizó en un 4890D Agilent GC equipado
con un detector FID fijado en 310 °C equipado con una columna capilar HP-5 (15
m x 0.53 mm, espesor de película 1.5 m).

3.4 Pruebas microbiológicas

Para la primera siembra se tomó una pequeña porción de suelo la cual se

suspendió dentro de unos tubos eppendorf previamente esterilizados que
contenían 1 mL de agua desionizada para su posterior sembrado.

Se sembró por estriado en agar MacConkey y en agar eosina azul de

metileno. Las muestras se incubaron a 37 ºC en la estufa durante 24 horas.

Se aislaron las colonias de las diferentes cajas, de acuerdo a su morfología

de crecimiento. Luego se resembraron las colonias de bacterias por estriado en
agar eosina azul de metileno y se incubaron de nuevo a 37 ºC en la estufa durante
24 horas.

De esos aislamientos se llevó a cabo la tinción de Gram. De acuerdo a los

resultados obtenidos las cepas bacterianas fueron agrupadas según su morfología
en cocos, bacilos y estreptobacilos y según sus características tintoriales, en
bacterias Gram negativas y Gram positivas.

~ 53 ~
 También se les realizó la prueba de catalasa para demostrar la presencia de
la enzima catalasa.

Del aislamiento se realizó una resiembra en agar MacConkey y agar

Salmonella Shigella. La resiembra en el agar MacConkey se llevó a cabo para
saber que colonias fermentaban lactosa y en el agar Salmonella Shigella para
saber si había alguna especie de Salmonella.

3.5 Pruebas bioquímicas

Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar

bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es
capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de
compuestos, mediante la producción de compuestos coloreados. Por lo cual en
este experimento se utilizaron las siguientes pruebas bioquímicas para la
identificación; TSI (agar hierro y triple azúcar), LIA (agar de hierro y lisina), urea,
citrato de Simons y MIO (movilidad, indol y ornitina) (Faddin, 2003).

Se prepararon una serie de tubos con cada una de las pruebas

bioquímicas, tomando una asada de la cepa, iniciando por TSI, que es un medio
que se va a inocular por picadura y estría y así determinar si se lleva a cabo la
fermentación de azúcares, con la misma asada se procede a inocular el medio LIA
inoculando por picadura y estría para determinar la descarboxilación oxidativa,
seguido de Urea inoculando por estría para determinar la capacidad de un
organismo de desdoblar la urea, seguido de la inoculación de citrato inoculando
por estría para determinar si la bacteria utiliza el citrato como única fuente de
carbono, finalizando por la inoculación del medio MIO que se inocula por picadura
en el cual observaremos la movilidad, indol y ornitina.

~ 54 ~
3.6 Pruebas de degradación de antraceno

Se preparó un medio específico con el antraceno el cual contenía 2 g de

NaCl, 3.75 g de agar bacteriológico y 0.1 g de antraceno. De esta forma se
aseguró de que la bacteria tendría crecimiento en este medio si su única fuente de
carbono había sido el antraceno.

Se sembraron por estriado las 8 especies diferentes que se identificaron en

las pruebas bioquímicas en el medio específico. Se incubaron a 37 ºC en la estufa
y se observó si había crecimiento a las 24, 48 y 72 horas.

3.7 Análisis estadísticos

Se realizó una evaluación mostrando las diferencias significativas entre

cada sitio contaminado y su sitio aledaño, como las características del suelo y la
concentración de hidrocarburos poliaromáticos, fueron determinados por análisis
de varianza (ANOVA) de una vía, y basadas sobre diferencias mínimas
significativas usando un modelo lineal generalizado (p<0.05), (PROC GLM,SAS
Institute Inc., 1989).

~ 55 ~
 CAPÍTULO IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Parámetros físicos y químicos del suelo

Los parámetros físicos y químicos analizados indican que tanto el suelo

contaminado como el libre de contaminación son suelos ricos en nutrimentos, los

suelos son ligeramente alcalinos, poseen una gran cantidad de arcillas, presentan

una alta capacidad de intercambio catiónico, por lo que existen niveles elevados

de Na, K, Ca y Mg, La Materia orgánica, el Carbono, el Nitrógeno Total y el

Fósforo se encuentran en concentraciones altas, así como la relación C/N y la

conductividad eléctrica.

Estas características físicas y químicas analizadas de los suelos

concuerdan con la descripción general del INEGI (2006) para suelos vertisol,

aunque no se realizaron en este estudio perfiles de suelo para la caracterización

del sitio, los resultados obtenidos concuerdan con lo documentado para dichos

parámetros por INEGI.

Al comparar los parámetros físicos y químicos del suelo contaminado contra

el suelo control (suelo no contaminado) se observa que existen diferencias

estadísticamente significativas tanto en la concentración del fósforo como en él

porcentaje de arena (p< 0.05). Todos los demás parámetros no presentaron

diferencias significativas entre el suelo contaminado y el suelo no contaminado

(Tabla 5).

~ 56 ~
Tabla 5. Parámetros físicos y químicos del suelo, comparación entre el suelo contaminado y el
suelo no contaminado (suelo control). Letras minúsculas iguales entre el suelo contaminado y el no
contaminado indican que no existen diferencias significativas (p <0.05).

Suelo
Parámetros contaminado no contaminado F p
pH 7.6±0.2a 7.5±0.2a 1.2 0.28
M.O. (%) 7.9±3.9a 5.9±1.8a 2.5 0.12
N T( %) 0.3±0.1a 0.3±0.1a 0.1 0.75
C/N 12.5±3.6a 10.1±1.9a 3.8 0.06+
P mg kg-1 12.3±8.1a 4.5±1.3b 10.7 0.00**
Na cmol kg-1 0.9±0.2a 0.9±0.4a 0.0 0.97
K cmol kg-1 0.7±0.4a 0.6±0.2a 1.3 0.25
Ca cmol kg-1 14.4±10.6a 14.6±10.7a 0.0 0.96
Mg cmol kg-1 1.7±0.6a 1.5±0.5a 0.6 0.42
CIC cmol kg-1 28.3±6.1a 31.1±8.3a 0.8 0.36
C.E. µS/cm 178.9±20.8a 194.2±18.8a 3.5 0.07+
Arcilla % 53.2±14.7a 45.8±7.5a 2.3 0.13
Limo % 32.9±7.9a 29.1±8.6a 1.2 0.26
Arena % 14.1±11.1a 25±10.6b 5.9 0.02*

Al comparar los parámetros físicos y químicos del suelo por pozos de los
diferentes sitios se observa que existen diferencias significativas en el P, Na, K,
Ca, Mg, CIC, y Textura (tabla 6), pero no para pH, C.E, C, MO, NT, C/N.

Tabla 6. Parámetros físicos y químicos del suelo en los diferentes sitios de muestreo del campo
petrolero Miguel Alemán.

Suelo F p
Pozo 48 Pozo 48C Pozo 69 Pozo 69C Pozo 98 Pozo 98C
pH 7.5±0.118 7.3±0.094 7.6±0.115 7.7±0.064 7.7±0.070 7.4±0.095 2.77 0.05037
C.E. µS/cm 181.9±5.47 179.1±8.2 176.3±15.12 211.2±8.10 178.6±11.57 192.2±3.96 1.96 0.13338
P mg kg-1 10.66±3.22 4.64±0.66 6.63±0.55 5.47±0.19 19.68±4.42 3.62±0.66 6.95 0.00088
M.O. % 6.19±0.76 5.53±0.41 10.13±2.23 4.50±0.35 7.53±2.46 7.81±0.83 1.88 0.14776
C% 3.59±0.44 3.21±0.24 5.88±1.29 2.61±0.20 4.37±1.42 4.53±0.48 1.88 0.14691
Na cmol kg-1 0.96±0.08 1.35±0.17 1.1±0.10 0.9±0.04 0.79±0.11 0.59±0.04 6.28 0.00153
K cmol kg-1 1.17±0.16 0.86±0.14 0.67±0.05 0.64±0.03 0.53±0.07 0.45±0.06 6.29 0.00152
Ca cmol kg-1 0.67±0.05 0.64±0.03 23.28±1.69 19.88±0.68 19.37±1.55 23.42±2.23 66.30 0.00000
Mg cmol kg.1 2.21±0.12 1.86±0.15 1.84±0.22 1.77±0.12 1.20±0.27 1.07±0.25 4.62 0.00685
CIC cmolkg-1 34.14±1.83 40.4±1.96 27.88±2.225 24.47±1.09 23.01±2.25 28.43±3.47 8.25 0.00033
N% 0.31±0.03 0.36±0.02 0.33±0.01 0.28±0.02 0.34±0.09 0.39±0.06 0.58 0.70911
C/N 11.5±1.65 9±0.40 14.25±2.05 9.5±0.64 11.75±1.88 12±1 1.77 0.16840
Arcilla % 67.7±7.04 52.2±2.75 43.2±2.5 48.2±0.5 48.7±5.7 37.2±1.70 6.42 0.00136
Limo % 28.78±4.03 20.7±0.95 36.28±4.12 38.78±3.09 33.78±3.77 27.78±1.5 4.29 0.00979
Arena % 4.5±4.5 27±1.91 20.5±6.18 13±3.31 17.5±2.5 35±2.51 7.95 0.00041

~ 57 ~
 En diferentes estudios se ha observado que generalmente el pH del suelo
disminuye cuando este ha sido contaminado por hidrocarburos (Zamora et al.,
2012), sin embargo en este estudio esto no fue observado, esto podría deberse al
tiempo del derrame ya que al ser un pasivo ambiental de más de 20 años las
condiciones naturales se han restablecido paulatinamente. Por otro lado la MO y el
C incrementaron en los sitios contaminados esto es debido a que los
hidrocarburos son absorbidos principalmente sobre la materia orgánica, la cual
tiene una polaridad similar a los hidrocarburos (Cram et al., 2004) sin embargo
esto no fue estadísticamente significativo. En el caso del fósforo disponible este se
incrementó en los sitios contaminados significativamente (p<0.05), esto ha sido
observado en otros estudios, por ejemplo en Nigeria (Adenipekun et al., 2013)
encontraron que en un sitio contaminado por hidrocarburos el fósforo se
incrementó a través del tiempo, esto podría deberse a la transformación del P total
a fósforo disponible por acción de hongos y microorganismos (fosfatasas),
aumento del fósforo ha sido reportado como un efecto directo de la contaminación
por hidrocarburos al suelo (SEMARNAT, 1996). En el caso del CIC se ha
observado que este disminuye en los sitios contaminados por hidrocarburos, esto
mismo pudo verificarse en este estudio al observarse una disminución significativa
del CIC en los suelos contaminados (pozo 48 y 98), lo cual está relacionado con la
adsorción de los hidrocarburos en las partículas minerales del suelo (Zamora et
al., 2012); Algunos autores (Martínez y López, 2001; Okolo et al., 2005) indican
que la CIC disminuye debido a que los hidrocarburos interfieren en los sitios de
intercambio de los cationes y en las interacciones electrostáticas (Pignatello y
Xing, 1996). En el caso de la textura del suelo está reportado que es uno de los
parámetros físicos más alterados durante los derrames petroleros debido a la
ruptura de agregados lo que genera una mayor acumulación, el componente más
importante del suelo en relación con la persistencia de sustancias tóxicas son las
arcillas ya que estas partículas aportan una gran área superficial para la absorción
de productos químicos contaminantes como los hidrocarburos (Imbellone et al.,
2009).

~ 58 ~
4.2 Caracterización de hidrocarburos totales de petróleo fracción
pesada e hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs)

En el campo petrolero Miguel Alemán en los sitios seleccionados para el

muestreo se caracterizaron los hidrocarburos aromáticos policíclicos y los
hidrocarburos totales de petróleo fracción pesada, encontrándose la presencia de
estos hidrocarburos solo en las presas de recorte de perforación de los pozos
estudiados, mientras que en los sitios donde no hubo extracción petrolera no
fueron detectados dichos parámetros. En las presas de recorte de perforación de
los pozos 48, 69 y 98 los niveles de contaminación para la fracción pesada son
superiores a los estipulados por la Norma Oficial Mexicana, NOM 138, mientras
que la concentración de los hidrocarburos poliaromáticos se encuentran dentro de
los límites permisibles por dicha Norma.

Al comparar las concentraciones de hidrocarburos poliaromáticos e

hidrocarburos totales de petróleo fracción pesada entre el suelo contaminado y el
suelo no contaminado se observa que existen diferencias significativas entre todos
ellos (p< 0.05) (tabla 7).

~ 59 ~
Tabla 7. Comparación entre la concentración de Hidrocarburos Fracción pesada e hidrocarburos
aromáticos policíclicos entre el suelo contaminado y el suelo no contaminado (suelo control) del
campo petrolero Miguel Alemán, Letras minúsculas iguales entre el suelo contaminado y no
contaminado indican que no existen diferencias significativas (p<0.05).

Sitio
Hidrocarburos Suelo Suelo F p
contaminado No contaminado
Fracción pesada 8386±44.82 ND 26251.5 0.0000
Benzo(B) fluoranteno 0.040±0.003 ND 141.6 0.0002
Benzo(k) fluoranteno 0.041±0.001 ND 930.2 0.0000
Benzo(a) pireno 0.039±0.002 ND 380.2 0.0000
Dibenzo(a,h) antraceno 0.041±0.002 ND 240.2 0.0001
indeno (1,2,3,c-d) pireno 0.043±0.001 ND 1849.0 0.0000
Benzo (a) antraceno 0.041±0.001 ND 1681.0 0.0000

4.3 Aislamiento e identificación de bacterias

Las diferentes muestras de suelo de los sitios contaminados (presas de

recorte de perforación de los pozos petroleros) y no contaminados (suelos
aledaños a los sitios contaminados libres de contaminación) sembradas en agar
eosina azul de metileno tuvieron crecimiento y fueron aisladas, excepto cuatro
muestras del suelo contaminado porque no hubo crecimiento (P48M1, P48M3,
P69M4, P98M3) y tres del suelo libre de contaminación de igual manera sin
crecimiento (P48CM3, P48CM4, P98CM4) (Tabla 7).

Las diferentes cepas fueron diferenciadas mediante la tinción de gram

encontrándose que todas las cepas fueron gram negativo, excepto una cepa de la
muestra del pozo 69C que dio tanto positivo como negativo a la tinción de gram.

En la prueba de la catalasa todas las cepas dieron positivas a excepción de

una cepa del suelo libre de contaminación (P69CM2).

En otros estudios se ha observado que la mayor cantidad de bacterias en

suelo contaminado son gram (-) (Kaplan y Kitts, 2004) esto mismo fue observado
~ 60 ~
en este estudio, aunque recientes investigaciones han demostrado la presencia de
bacterias gram (+) en sitios contaminados (Quatrini et al., 2008).

En cuanto a la morfología, tanto en el suelo contaminado como en el libre

de contaminación la mayoría de las especies presentó forma de bacilos, la forma
de cocos sólo fue observada en el suelo contaminado (P 48,69 y 98). La forma de
estreptobacilos solo fue observada en el suelo libre de contaminación (P69C)
(Tabla 8).

Tabla 8. Aislamiento de bacterias.

Suelo 1º Aislamiento Gram Morfología Catalasa

Siembra
P48M1 X NO NO NO NO
P48M2 X 1 − Cocos +
P48M3 X 1 − Bacilos +
2 − Bacilos +
P48M4 X 1 − Bacilos +
P48CM1 X 1 − Bacilos +
P48CM2 X 1 − Bacilos +
P48CM3 X NO NO NO NO
P48CM4 X NO NO NO NO
P69M1 X 1 − Bacilos +
P69M2 X 1 − Cocos +
P69M3 X 1 − Bacilos +
P69M4 X NO NO NO NO
P69CM1 X 1 − Bacilos +
P69CM2 X 1 +− Estreptobacilos -
P69CM3 X 1 − Bacilos +
P69CM4 X 1 − Bacilos +
P98M1 X 1 − Bacilos +
P98M2 X 1 − Bacilos +
P98M3 X NO NO NO NO
P98M4 X 1 − Bacilos +
2 − Bacilos +
3 − Cocos +
P98CM1 X 1 − Bacilos +
2 − Bacilos +
P98CM2 X 1 − Bacilos +
P98CM3 X 1 − Bacilos +
P98CM4 X NO NO NO NO

~ 61 ~
4.4 Pruebas bioquímicas

Las pruebas bioquímicas permitieron identificar 8 géneros de bacterias, el

género frecuentemente encontrado en el suelo contaminado como en el suelo libre
de contaminación fue Arizona, el género Providencia sólo fue encontrado en dos
sitios uno contaminado y otro libre de contaminación (pozo 69 y 69C), la especie
Citrobacter sólo se encontró en los pozos 48, 98 y 98C, la especie C. diversus y C.
freundi sólo se encontraron en los pozos 48C y 98C, Cedecea neteri (C. neteri)
sólo fue encontrada en un sitio contaminado (P98), la especie Klebsiella sólo se
encontró en un suelo contaminado (P69), Edwardsiella sólo se encontró en suelo
libre de contaminación P69C (Tabla 9).

Tabla 9. Pruebas bioquímicas para la determinación de bacterias.

Suelo Prueba Bioquímica Género/Especie

TSI LIA UREA CS M I O
P48M2 + + − − + + + Citrobacter
P48M3-1 + + − + + + + Arizona
P48M3-2 + + − + + + + Arizona
P48M4 + + − + + + + Arizona
P48CM1 − + − + + + + C. diversus
P48CM2 + + − + − + + C. freundi
P69M1 − + − + − − + Klebsiella
P69M2 + + − + + + + Arizona
P69M3 − + − − + + + Providencia
P69CM1 − + − − + + + Providencia
P69CM2 + + − − − + + Edwardsiella
P69CM3 − + − − − + + Providencia
P69CM4 + + − + + + + Arizona
P98M1 − + − + + + + C. diversus
P98M2 + + − + + + + Arizona
P98M4-1 + + − − + + − C. neteri
P98M4-2 + + − + + + − C. freundi
P98M4-3 + + − − + + + Citrobacter
P98CM1-1 + + − − + + + Citrobacter
P98CM1-2 + + − + + + + Arizona
P98CM2 + + − + + + + Arizona
P98CM3 + + − + + + + Arizona
TSI= Agar Hierro y Tripe Azúcar; LIA= Agar Hierro y Lisina; Urea; CS= Citrato de Simmons, M=
Movilidad, I= Indol y O= Ornitina.

~ 62 ~
 De los ocho géneros identificados en este estudio solo tres Klebsiella,
Citrobacter y Edwardsiella han sido reportados como especies existentes en sitios
contaminados por hidrocarburos (León et al., 2009).

4.5 Degradación de antraceno por las bacterias

Los diferentes géneros y especies que fueron capaces de utilizar al

hidrocarburo poliaromático antraceno como fuente de carbono fue Edwardsiella,
Citrobacter y C. neteri (Tabla 10; figura 6, 7 y 8).

El crecimiento de las tres cepas fue hasta las 48 horas de incubación.

Tabla 10. Género y especies de bacterias encontradas en el campo petrolero Miguel Alemán, con
capacidad para utilizar el hidrocarburo antraceno como fuente de carbono. El Signo – indica que no
hubo crecimiento, signo + indica crecimiento.

Género/Especie Degradación de
Antraceno
Klebsiella −

C. neteri +

C. freundi −

C. diversus −

Citrobacter +

Edwardsiella +

Providencia −

Arizona −

La especie que obtuvo mejor degradación de antraceno fue Edwardsiella, al

tener mayor crecimiento en el agar (Figura 6).

~ 63 ~
Figura 6. Crecimiento del género Edwardsiella en el medio con antraceno como única fuente de
Carbono.

Figura 7. Crecimiento de Citrobacter en el medio con antraceno como única fuente de Carbono.

~ 64 ~
Figura 8. Crecimiento de la especie C. Neteri en el medio con antraceno como única fuente de
Carbono.

4.6 Conclusión

En el campo petrolero Miguel Alemán, donde la contaminación por

hidrocarburos está presente, la bacteria del género Arizona fue la especie más
abundante, sin embargo, aunque presenta una alta tolerancia a los niveles de
contaminación no fue capaz de incorporar al antraceno como fuente de carbono.

Los géneros de bacterias que demostraron actividad hidrocarburolítica

fueron Citrobacter, Edwardsiella y Cedecea neteri lo que indica que estas pueden
utilizar al hidrocarburo poliaromático antraceno como fuente de carbono, por lo
que dichas especies podrían ser utilizadas en la biorremediación de suelos
contaminados por hidrocarburos por el potencial demostrado en este estudio.

~ 65 ~
 Aunque la bacteria Edwardsiella presentó el mejor crecimiento en el agar
específico para la degradación de Antraceno, ésta no fue encontrada en el suelo
contaminado, sino que se presentó en el suelo sin contaminación.

La contaminación por hidrocarburos si tuvo un efecto significativo sobre los

parámetros físicos y químicos del suelo, en el caso del fósforo disponible y la CIC.

~ 66 ~
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~ 78 ~
Anexo A: Glosario para la determinación de parámetros físicos y
químicos del suelo.

Textura

Determinación de la Textura del suelo método Bouyoucous

Reactivos

1. Agua oxigenada al 30%.

2. Oxalato de sodio saturado. Disolver 30 g de oxalato de sodio en 1 litro de

agua.

3. Metasilicato de sodio con 36 g L-1 de lectura con el hidrómetro. Disolver 50 g

de matasilicato de sodio en 1 litro de agua ajustar la solución hasta que se
obtenga una lectura de 36 con el hidrómetro.

4. Hexametafosfato de sodio (calgón). Disolver 50 g de (Na 3PO3)6 en agua

destilada y aforar a un litro.

Material y equipo

1. Hidrómetro de Bouyoucos con escala de 0-60.

2. Probetas de 1000 cc.

3. Cilindro de Bouyoucos.

4. Agitador con motor para dispersión.

5. Agitador de mano.

6. Termómetro de -10 a 110°C.

Procedimiento

1. Pesar 60 g de suelo de textura fino o 120 g de suelo de textura gruesa en un

vaso de precipitados de 500 ml agregar 40 ml de agua oxigenada y poner a

~ 79 ~
evaporar hasta sequedad, agregar otros 40 ml y observar la reacción. Evaporar
nuevamente a sequedad. Repetir hasta que no haya efervescencia al agua
oxigenada.

2. En general dos ataques son suficientes para la mayoría de suelos. Después de

eliminar la materia orgánica y llevar a sequedad el suelo, pesar 50 g de suelo de
textura arcillosa o 100 g de suelo de textura arenosa y ponerlos en un vaso de
precipitados de 250 ml. Adicionar agua hasta cubrir la superficie con una lámina
de 2 cm. Agregar 5 ml de oxalato de sodio y 5 ml de metasilicato de sodio y dejar
reposar durante 15 minutos. Si el suelo tiene mucha arcilla puede prolongarse el
tiempo hasta media hora.

3. Pasar las muestras de los vasos de precipitado a las copas del agitador
mecánico, pasando todo el material con la ayuda de una piceta. Activar los
agitadores y proceder a dispersar cinco minutos. Al finalizar el tiempo de
agitación, bajar la copa del dispersor y pasar el contenido a una probeta de 1000
ml o al cilindro de Bouyoucos enjuagando la copa con ayuda de una piceta.

4. Agregar agua destilada hasta completar un litro con el hidrómetro dentro de la

suspensión en el caso de la probeta y si utiliza el cilindro de Bouyoucos llevar a la
marca inferior (1113 ml) con el hidrómetro dentro de la suspensión. Sacar el
hidrómetro y suspender el suelo con un agitador de mano operando durante un
minuto.

5. Tomar las lecturas del hidrómetro a los 40 segundos y después de 2 horas de

terminada la dispersión con el agitador de mano.

6. Para hacer una lectura, colocar el hidrómetro dentro de la probeta 20

segundos antes del momento de la determinación, cuidando de alterar lo menos
posible la suspensión. Después de hacer la lectura se seca el hidrómetro, se
lava, se seca y se toma la temperatura. Si por alguna razón al hacer la lectura se
acumula espuma alrededor del hidrómetro, agregar unas gotas de alcohol etílico.

Cálculos

~ 80 ~
Corregir las lecturas del hidrómetro agregando 0.36 por cada grado centígrado
arriba de 19.5°C restando la misma cantidad por cada grado abajo de dicha
temperatura (tabla de corrección por temperatura). La lectura a los 40 segundos
multiplicada por 2 es igual al porcentaje de arcilla más limo. Restando de 100 se
obtiene el porcentaje de arena. La lectura obtenida a 2 horas multiplicadas por 2
es igual al porcentaje de arcilla. El porcentaje de limo se obtiene por diferencia.
Cuando se usan 100 g no debe multiplicarse por 2 ya que el hidrómetro está
calibrado en porcentajes considerando 100 g de suelo. Con los porcentajes de
limo, arena y arcilla se determina la textura correspondiente con el triángulo de
texturas.

pH

Determinación de pH

Reactivos

Los reactivos utilizados en esta determinación deben ser grado analítico y el

agua utilizada en la preparación de las soluciones debe ser destilada o
desionizada.

1. Agua destilada o desionizada.

2. Soluciones reguladoras de referencia, pH 4.00, 7.00 y 10.00, las cuales se

adquieren preparadas o concentradas para diluirse de acuerdo a la instrucción.
Estas soluciones deben estar a temperatura ambiente al momento de calibrar el
medidor de pH.

Material y equipo

1. Potenciómetro o medidor de pH equipado con electrodo de vidrio en

combinación con electrodo de referencia.

2. Balanza con 0.1 g de sensibilidad.

~ 81 ~
 3. Frascos de vidrio o plástico transparente de boca ancha con capacidad de 50 a
100 ml.

4. Pipeta volumétrica de 20 ml.

5. Varilla de vidrio que sirva como agitador manual.

6. Piceta.

7. Cinta métrica.

Procedimiento

1. Pesar 10 g de suelo en un frasco de vidrio o plástico de boca ancha.

2. Adicionar 20 ml. de agua destilada al frasco conteniendo el suelo.

3. Con una varilla de vidrio, agitar manualmente la mezcla de suelo: agua a

intervalos de 5 minutos, durante 30 minutos.

4. Dejar reposar durante 15 minutos.

5. Calibrar el medidor de pH con las soluciones reguladores pH 4.00 y 7.00 o

7.00 y 10.00 según el suelo, enjuagando con agua destilada los electrodos antes
de iniciar las lecturas de las muestras.

6. Agite nuevamente la suspensión e introduzca el electrodo en la suspensión.

7. Registre el pH al momento en que la lectura se haya estabilizado.

Informe de la prueba

Debe incluir la información que a continuación se indica:

1. Datos completos de identificación de la muestra.

2. Reportar el valor con número entero y una cifra decimal.

3. Fecha de realización de la prueba.

Materia Orgánica (MO):

~ 82 ~
Determinación de materia orgánica Walkley y Black.

Reactivos

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a

menos que se indique otra cosa.

1. Dicromato de potasio 0.166 M o 1N.- Disolver 48.82 g de K2Cr2O7 en agua

destilada aforar a 1000 ml en un matraz volumétrico.

2. Acido sulfúrico concentrado (H2SO4).

3. Acido fosfórico concentrado (H3PO4).

4. Indicador de difenilamina. Disolver 0.5 g de difenilamina en 20 ml de agua y

añadir 100 ml de ácido sulfúrico concentrado.

5. Sulfato ferroso 1.0 M (aproximadamente). Disolver 278 g de FeSO 4.7H2O en

agua a la que previamente se le añadieron 80 ml de H2SO4 concentrado, enfriar y
diluir a un litro. Esta solución debe ser valorada con K2Cr2O7 1 N antes de realizar
la determinación.

Material

Matraces Erlenmeyer de 500 ml.

Bureta para K2Cr2O7 (50 ml).

Bureta para FeSO4.7H2O (50 ml).

Pipeta volumétrica (10 ml).

Probeta de vidrio (25 ml).

Procedimiento

1. Pesar 0.5 g de suelo seco y pasado por un tamiz de 0.5 mm y colocarlo en un

matraz Erlenmeyer de 500 ml. Procesar un blanco con reactivos por triplicado.

2. Adicionar exactamente 10 ml de dicromato de potasio 1 N girando el matraz

cuidadosamente para que entre en contacto con todo el suelo.

~ 83 ~
 3. Agregar cuidadosamente con una bureta 20 ml de H2SO4 concentrado a la
suspensión, girar nuevamente el matraz y agitar de esa forma durante un minuto.

4. Dejar reposar durante 30 minutos sobre una lámina de asbesto o sobre una
mesa de madera, evitando las mesas de acero o cemento.

5. Añadir 200 ml de agua destilada.

6. Añadir 5 ml de H3PO4 concentrado.

7. Adicionar de 5 a 10 gotas del indicador de difenilamina.

8. Titular con la disolución de sulfato ferroso gota a gota hasta un punto final
verde claro.

Cálculos

Donde:

B = Volumen de sulfato ferroso gastado para valorar el blanco de reactivos (ml).

T = Volumen de sulfato ferroso gastado para valorar la muestra (ml).

N = Normalidad exacta del sulfato ferroso (valorar por separado al momento de

analizar las muestras).

g = Peso de la muestra empleada (g).

mcf = factor de corrección de humedad.

% Materia orgánica = % C Orgánico x 1.724

Nitrógeno total (NT):

Determinación de nitrógeno total

Reactivos

1. Acido sulfúrico concentrado.

~ 84 ~
2. Solución de ácido bórico con indicador. Colocar 80 g de ácido bórico (H3BO3)
en un frasco de cinco litros de capacidad en el cual se ha marcado el nivel de 4
litros, adicionar 3.8 litros de agua destilada, calentar y agitar hasta la completa
disolución de ácido. Enfriar la solución y agregar 80 ml de la siguiente mezcla de
indicadores: 0.099 g de verde de bromocresol y 0.066 g de rojo de metilo
disueltos en 100 ml de alcohol etílico 95%.

El pH de la mezcla de H3BO3-indicador debe ser aproximadamente 5.0. Si fuese

más ácido agregar cuidadosamente gotas de NaOH 0.1 N hasta que la solución
adquiera una coloración purpúrea rojiza o se alcance el pH indicado. Completar a
4 litros con agua destilada y mezclar vigorosamente.

3. Mezcla de catalizadores-K2SO4. Mezclar perfectamente 1 kg de K2SO4, 100 g

de CuSO4, 5H2O y 10 g de Selenio metálico. La mezcla debe homogeneizarse
completamente para evitar agregación de las partículas de los componentes.

4. Hidróxido de sodio 10 N. Colocar 4.0 Kg de NaOH en un botellón de vidrio

Pyrex de pared gruesa de aproximadamente 10 litros de capacidad. Adicionar 4
litros de agua destilada y rotar el botellón hasta que el hidróxido se disuelva.
Dejar que la solución se enfríe en el depósito al cual se debe proveer de una tapa
para evitar la absorción de CO2 ambiental. Dejar decantar durante la noche, o
más si es necesario, y sifonar el sobrenadante a otro botellón marcado a 10 litros
que contiene 1.5 litros de agua destilada libre de CO 2 (hervida). Completar al
volumen indicado con agua de igual calidad y agitar vigorosamente. El hidróxido
de sodio debe protegerse de CO2 atmosférico utilizando un filtro de ascarita o
cualquier otro.

Acido sulfúrico 0.01 N. Diluir 1 litro de ácido sulfúrico 0.05 N (1.4 ml por litro) a 5
litros con agua destilada. Estandarizar con Na2CO3 seco. Pesar 0.250 g de sal y
disolver en un matraz de 50 ml. Llevar a volumen. Titular 3 alícuotas de esta
solución de 10 ml cada una, usando 5 o 6 gotas de anaranjado de metilo como
indicador. Calcular la normalidad mediante la fórmula siguiente:

Normalidad (H2SO4) = (0.025 g/53) x (1/V H2SO4).

~ 85 ~
 V = Volúmenes de ácido sulfúrico gastado en la titulación, expresado en litros.

Material y equipo

1. Balanza analítica.

2. Matraces semi-micro Kjeldahl de 50 ml.

3. Aparato de digestión semi-micro Kjeldahl.

4. Destilador con arrastre de vapor.

5. Matraces Erlenmeyer de 125 ml.

6. Microbureta de 10 ml.

Procedimiento

1. Colocar una muestra de suelo previamente tamizada a través de malla 60 y

que contenga aproximadamente 1 mg de N en un frasco micro-Kjeldahl seco (1,
0.5, y 0.25 g de muestra para suelos con 2, 4 y 8% de materia orgánica,
respectivamente).

2. Adicionar 1.1 g de mezcla de catalizadores K2SO4, 3 ml de ácido sulfúrico

concentrado calentar en la unidad digestora a temperatura media alta hasta que
el digestado se torne claro.

3. Ebullir la muestra por 1 hr a partir del momento en que se torne claro. La

temperatura en esta fase debe regularse de modo que los vapores de ácido
sulfúrico se condensen en el tercio inferior del cuello del tubo de digestión.

4. Una vez completada esta fase, dejar enfriar el frasco y agregar suficiente agua
para colocar en suspensión, mediante agitación, el digestado (15 a 20 ml son
generalmente suficientes).

5. Dejar decantar las partículas de sílice evitando la precipitación de cristales de

sulfato de amonio.

~ 86 ~
 6. Transferir el contenido líquido a la cámara de destilación del aparato, lavando
el matraz de digestión con pequeñas porciones de agua.

7. Colocar en el tubo de salida del aparato de digestión un matraz Erlenmeyer de

125 ml conteniendo 10 ml de la solución H3BO3 + indicadores.

8. Adicionar cuidadosamente 10 ml de NaOH 10 N de modo que la sosa se

deposite en el fondo de la cámara de destilación.

9. Conectar el flujo de vapor e iniciar la destilación. Destilar hasta que el volumen

alcance la marca de los 75 ml en el frasco Erlenmeyer.

10. Determinar el nitrógeno amoniacal presente en el destilado titulando con el

ácido sulfúrico 0.01 N. Debe usarse una microbureta de 10 ml con graduaciones
de 0.01 ml. El cambio de color de la mezcla de indicadores en el punto final de la
titulación, es de verde a rosado fuerte. Se preparan blancos siguiendo
exactamente el mismo procedimiento que en las muestras.

Cálculos

% N total = (Vm-Vb) x N x 14 /p x 10

Donde:

Vm = Volumen de ácido sulfúrico empleado en titular la muestra

Vb = Volumen de ácido sulfúrico empleado en titular blanco

N = Normalidad exacta del ácido sulfúrico

14 = Peso equivalente del nitrógeno

10 = Factor de conversión a porcentaje

P = Peso de la muestra de suelo en g.

Fosforo extraíble (P):

~ 87 ~
Determinación de fósforo extraíble para suelos neutros y alcalinos método de
Olsen.

Reactivos

1. Hidróxido de sodio 1M. Disolver 4 g de NaOH en 100 ml de agua.

2. Bicarbonato de sodio (NaHCO3) 0.5 M. Disolver 42 g de NaHCO3 en

aproximadamente 1 litro de agua. Ajustar el pH de esta solución a 8.5 mediante
la adición de solución de NaOH 1 M. Llevar a volumen con agua destilada.
Algunos autores recomiendan adicionar aceite mineral para evitar la exposición
de la solución al aire. Guardar la solución en un recipiente de polietileno y revisar
el pH de la solución antes de usarse, de requerirse, volver a ajustar a 8.5.

3. Solución de tartrato de antimonio y potasio al 0.5%. Pese 0.5 g de K(SbO)

C4H4O6.1/2 H2O, transfiéralo a un matraz volumétrico de 100 ml disuélvalo y
afore con agua destilada.

4. Solución de molibdato de amonio [(NH4)6Mo7O24. 4H2O]. Disolver 20 g de

molibdato de amonio [(NH4)6Mo7O24. 4H2O]. en 300 ml de agua destilada.
Agregue lentamente bajo constante agitación y con cuidado, 450 ml de H 2SO4 (14
N) (194.4 ml H2SO4 concentrado diluido a 500 ml con agua da una concentración
de aproximadamente 14 N). Agregue 100 ml de una solución al 0.5% (p/v) de
tartrato de antimonio y potasio. Diluya las mezclas a 1 L con agua destilada. Este
frasco se debe tapar y con papel aluminio, proteger de la luz.

5. Solución reductora con ácido ascórbico. Disolver 0.50 g de ácido ascórbico con
un poco de solución de molibdato de amonio y aforar a 100 ml con la misma
solución. Esta solución es preparada cada vez que se vaya a formar color.

6. Solución patrón de fósforo (200 mg L-1). Pesar exactamente 0.8786 g de

fosfato de potasio monobásico (KH2PO4) seco al horno a 105ºC, disolver en agua
y aforar a 1 litro. Guardar en envase de plástico o vidrio y conservar en
refrigeración. Algunos autores recomiendan adicionar 25 ml de H 2SO4 7 N antes
de aforar para conservar la solución libre de contaminantes biológicos.

~ 88 ~
 7. Solución patrón de 5 mg L-1 de P Diluir 5 ml de la solución de 200 mg L-1 de P
a 200 ml con agua destilada. Preparar fresca cada 5 días.

Material y equipo

1. Tubos de polietileno de 100 ml.

2. Papel Whatman No. 42 o equivalente.

3. Agitador mecánico recíproco, ajustado a 180 oscilaciones por minuto.

4. Balanza analítica.

5. Matraces volumétricos de 50 ml.

6. Bureta de 10 ml.

7. Espectrofotómetro para leer a 880 nm y celdas de vidrio.

Procedimiento

1. Pesar 2.5 g de suelo previamente tamizado por malla de 2 mm y colocarlos en

los tubos de polietileno.

2. Adicionar 50 ml de la solución extractora tapar y agitar la suspensión en

agitador de acción recíproca durante 30 min. a 180 oscilaciones por minuto.

3. Filtrar inmediatamente a través de papel filtro Whatman No. 42 u otro de

calidad similar.

4. Preparar blancos a partir de alícuotas de solución extractora y adicionando

todos los reactivos como en las muestras.

5. Tomar una alícuota de 5 ml (o 10 ml si la concentración de P es muy baja) del

filtrado y colocarla en un matraz aforado de 50 ml.

6. Agregar 5.0 ml de la solución reductora, agitar y aforar. Leer después de 30

min. pero antes de una hora a una longitud de onda 882 nm (leer previamente la
curva de calibración).

~ 89 ~
 7. Preparar una curva de calibración con patrones de 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y
1.0 mg L-1 de P.

8. Pipetear 0, 1, 2, 4, 6 y 10 ml de una solución de 5 mg L -1 de P a matraces

aforados de 50 ml.

9. Adicionar un volumen de solución extractante de NaHCO 3 0.5 M igual a la

alícuota empleada para medir en las muestras desconocidas.

10. Llevar a aproximadamente 40 ml con agua y adicionar 5 ml de la solución

reductora con ácido ascórbico, aforar.

11. Agitar nuevamente. Leer después de 30 minutos pero antes de una hora a
882 nm, leer las muestras y los patrones al mismo tiempo de reacción, contando
el tiempo desde que se agrega el reactivo que genera el complejo hasta el
momento de la lectura.

Cálculos

P (mg Kg-1 de suelo) = CC x Vi/p x Vf/a

Donde:

CC= mg L-1 de P en la solución. Se obtiene graficando la curva de calibración

(absorbancia contra mg L-1) e interpolando en la misma los valores de
absorbancia de las muestras analizadas a las cuales previamente se les ha
estado el valor promedio de los blancos o por medio de una regresión simple.

Vi= volumen de la solución extractora adicionada.

p= peso de la muestra de suelo seca al aire.

Vf= volumen final de la solución colorimétrica a leer.

a= alícuota de la muestra empleada para la cuantificación.

Cationes intercambiables (Ca, Mg, K y Na):

~ 90 ~
La determinación de la capacidad de intercambio catiónico y bases
intercambiables del suelo se realizará a través del método AS-12, con acetato de
amonio.

Principio y aplicación

Método para la determinación de la capacidad de intercambio catiónico (CIC) y

bases intercambiables (Ca2+, Mg2+, Na+ y K+) de los suelos, empleando acetato de
amonio 1N, pH 7.0, como solución saturante. El método para la determinación
consiste en la saturación de la superficie de intercambio con un catión índice, el
ion amonio; lavado del exceso de saturante con alcohol; desplazamiento del catión
índice con potasio y determinación del amonio mediante destilación. El amonio se
emplea como catión índice debido a su fácil determinación, poca presencia en los
suelos y porque no precipita al entrar en contacto con el suelo. La concentración
normal que se usa asegura una completa saturación de la superficie de
intercambio y como está amortiguada a pH 7.0, se logra mantener un cierto valor
de pH. El lavado con alcohol pretende desplazar el exceso de saturante y
minimizar la pérdida del amonio adsorbido.

Reactivos

Los reactivos que a continuación se mencionan deben ser grado analítico a

menos que se indique otra cosa, cuando se hable de agua se debe entender
agua desionizada o destilada. Las soluciones para este análisis deben
almacenarse en recipientes de polietileno.

1. Solución de acetato de amonio 1.0N, pH 7.0. Diluir 57 ml de ácido acético

glacial (99.5%) con agua a un volumen de aproximadamente 500 ml. Agregar 60
ml de hidróxido de amonio concentrado, diluir con agua a un volumen de 990 ml,
mezclar completamente, ajustar a pH 7.0 y diluir a un volumen final de 1 litro con
agua.

2. Una alternativa en el punto anterior consiste en pesar y disolver 77 g de

acetato de amonio (NH4C2H3O2) en 900 ml de agua y de ser necesario ajustar a
pH 7.0 y entonces completar a un litro con agua.
~ 91 ~
3. Alcohol etílico, usar CH3CH2OH grado industrial.

4. Solución de cloruro de sodio al 10%. Pesar 100 g de cloruro de sodio grado

analítico y disolver en 1 L de agua empleando un matraz aforado.

5. Solución de cloruro de amonio 1N. Pesar 53.50 g de NH4Cl y disolver en agua.

Ajustar a pH 7.0 con hidróxido de amonio y diluir a 1 litro empleando un matraz
aforado.

6. Solución de cloruro de amonio 0.25N. Pesar 13.38 g de NH4Cl y disolver en

agua. Ajustar a pH 7.0 con hidróxido de amonio y diluir a 1 litro empleando un
matraz aforado.

7. Indicador mixto. Mezclar volúmenes iguales de rojo de metilo al 0.66% y de

verde de bromocresol al 0.99%. Ambos disueltos en etanol al 95%.

8. Solución de ácido bórico. Usar H3BO3 al 2% en agua destilada que contenga

10 ml del indicador por litro.

9. Acido clorhídrico diluido valorado. Usar HCl 0.01 N.

10. Hidróxido de sodio al 40%. Disolver 400 g. de NaOH en agua destilada y

llevar a 1000 ml.

11. Nitrato de plata 0.1 N. Disolver 16.98 g de AgNO3 en agua destilada y llevar a
1000 ml.

12. Solución de lantano acidificada. Pesar 7.742 g de La(NO 3)3·6H2O en un

matraz volumétrico de 250 ml con agua destilada añadir 17.5 ml de
HNO3 concentrado y aforar.

13. Solución diluida de lantano acidificada. Tomar 50 ml de la solución de lantano

acidificada en un matraz volumétrico de 500 ml y aforar con agua destilada.

14. Solución de cloruro de cesio acidificada. Disolver 11.12 g de CsCl y 250 ml de

Al(NO3)3·9H2O en 500 ml de agua en un matraz volumétrico de 1000 ml, añadir
20 ml de HNO3 2 M y aforar con agua.

~ 92 ~
 15. Solución de ácido nítrico 2 M. Diluir 7 ml de HNO3 concentrado en agua,
aforar a 100 ml en un matraz volumétrico.

Material

1. Tubos de centrífuga de 50 ml con fondo redondo.

2. Agitador mecánico.

3. Centrífuga con capacidad para 8 o 16 tubos.

4. Matraces volumétricos de 100 ml.

5. Matraces Erlenmeyer de 125 ml.

6. Aparato de destilación.

Procedimiento

1. Pesar 5 g de suelo secado al aire y tamizado por malla de abertura de 2 mm y

transferirlo a un tubo de centrífuga de 50 ml. Agregar 33 ml de solución de
acetato de amonio. Tapar y agitar en posición horizontal durante 10 minutos.
Luego, centrifugar hasta que el líquido sobrenadante esté claro. Esto se logra
fácilmente centrifugando a 2500 rpm. Decantar el líquido en un matraz de 100 ml
y repetir la extracción otras dos veces, aforar con acetato de amonio y guardarlo
para la posterior determinación de las bases intercambiables (solución A).

2. Agregar 30 ml de la solución de cloruro de amonio 1N; agitar durante 10

minutos y luego centrifugar hasta que el líquido sobrenadante esté claro y
desecharlo. Adicionar 30 ml de la solución de cloruro de amonio 0.25N, agitar
durante 10 minutos, centrifugar y desechar el sobrenadante. Lavar la muestra
con porciones de alcohol de 30 ml agitando durante 10 minutos, centrifugar y
eliminar el sobrenadante cada vez. El lavado termina cuando la prueba de
cloruros en el decantado sea mínima.

3. Prueba de cloruros. Pipetear 10 ml del sobrenadante alcohólico en un tubo de

ensaye y agregar 4 o 5 gotas de nitrato de plata, si se observa un ligero

~ 93 ~
 precipitado blanco, la reacción es positiva y se debe continuar el lavado hasta
que la prueba de cloruros sea negativa.

4. Reemplazar el amonio adsorbido con tres porciones de 33 ml de cloruro de

sodio al 10%, agitando durante 10 minutos y centrifugando cada vez. Decantar
cada reemplazo en un matraz volumétrico de 100 ml y completar al volumen.
Determinar el amonio a partir de una alícuota de 10 ml, la cual se transfiere a un
matraz Kjeldahl de 300 ml, se le agregan aproximadamente 8 ml de NaOH al
40% y se conecta al aparato de destilación microkjeldahl. Recoger el producto de
la destilación en un matraz Erlenmeyer que contenga 10 ml de mezcla de
indicador y ácido bórico. Determinar por titulación con HCl 0.01N.

Cálculos

Si se pesan 5 g de muestra entonces la capacidad de intercambio catiónico

expresado en Cmol(+) Kg-1 de suelo (CIC) se calculará de la forma siguiente:

CIC = 200 (V) (N)

En donde:

V = volumen (ml) de HCl empleado al titular lo destilado en la solución valorada.

N = normalidad del HCl.

alícuota = 10 ml y peso de suelo = 5 g.

Determinación de Ca y Mg intercambiables:

1. Pipetear 0.5 ml de la solución A en un tubo de ensaye.

2. Añadir 9.5 ml de la solución diluida de lantano y mezclar.

3. Medir la concentración de Ca y Mg en las series estándar, el blanco y la

muestra por espectrofotometría de absorción atómica a una longitud de onda de
422.7 y 285.2 nm, respectivamente, usando una flama de aire-acetileno.

Cálculos

Donde:

~ 94 ~
 a= Concentración de Ca o Mg medido en la muestra (mg L -1).

b= Concentración de Ca o Mg medido en el blanco (mg L-1).

w= Peso del suelo seco (g)

Determinación de Na y K intercambiables:

1. Pipetear 1.0 ml de la solución A en un tubo de ensaye.

2. Añadir 1.0 ml de la solución de cloruro de cesio acidificada.

3. Añadir 8 ml de agua y mezclar.

4. Medir la concentración de Na y K en las muestras el blanco y las series

estándar por espectrofotometría de emisión de flama.

Cálculos

Donde:

a= Concentración de Na o K medido en la muestra (mg L-1).

b= Concentración de Na o K medido en el blanco (mg L-1).

w= Peso del suelo seco (g).

Anexo B: Glosario para la determinación de hidrocarburos

poliaromaticos y fracción pesada.

Determinación de hidrocarburos de la fracción pesada:

El análisis de hidrocarburos de la fracción pesada deberá cubrir pesos

moleculares mayores a C18. Los métodos de referencia son el EPA 9071B para la
extracción de los HCFP del suelo con n-hexano y su purificación y determinación
gravimétrica por el método EPA 1664A.

~ 95 ~
La determinación cuantitativa se deberá realizar gravimétricamente a partir del
extracto con n-hexano de la muestra de suelo cribada y secada con Na 2SO4
anhidro y procesada con sílica gel estandarizada.

1. Preparación de la muestra

Para el análisis es necesario que la muestra de suelo homogeneizada y cribada

sea extraída con nhexano mediante cualquiera de las técnicas que se enlistan a
continuación.

a) Soxhlet. Una muestra de suelo homogeneizada y cribada se mezcla con

sulfato de sodio anhidro hasta eliminar el agua contenida. Se coloca en un
cartucho de celulosa para extraer los hidrocarburos en un equipo tipo
Soxhlet con n-hexano.
b) Sonicación. Una muestra de suelo homogeneizada y cribada se mezcla con
sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua contenida. Se somete a
sonicación en presencia del n-hexano de una a tres veces, según el
contenido de hidrocarburos. El extracto se separa del suelo por filtración al
vacío o por centrifugación.

2. Limpieza de la muestra

Un aspecto importante para la confiabilidad de este análisis radica en la limpieza

de la muestra, la cual se deberá hacer con gel de sílice en una proporción de 30
gramos por cada gramo de material extraído, según se refiere en el método EPA
1664A.

Además, se debe someter la muestra en su totalidad a un proceso de

homogeneización y cribado antes de iniciar el análisis; este paso es necesario
para evitar sesgo en la selección de la submuestra que va a ser destinada para las
determinaciones analíticas.

~ 96 ~
3. Calibración

Se debe utilizar una balanza analítica calibrada y se debe estandarizar la gel de

sílice como se especificaen el método EPA 1664A.

Determinación de hidrocarburos poliaromaticos (HPAs):

Los métodos de referencia son el EPA 8310 1986 o el EPA 8270C 1996 o
versiones posteriores.

La determinación cuantitativa de hidrocarburos poliaromáticos se debe realizar en

un cromatógrafo de líquidos de alta resolución con detector de DAD acoplado con
un detector de fluorescencia (EPA 8310 1986) o por cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas (EPA 8270C 1996).

Cuando existan interferencias que no permitan identificar o cuantificar los HPAs

por Cromatografía de Líquidos, se deberá utilizar Espectrometría de Masas para la
identificación y cuantificación, los límites de detección aumentarán dependiendo
de las interferencias, por lo que deberán estimarse e informarse en el reporte de
resultados o aplicar un método de limpieza adecuado al extracto obtenido y
analizar ya sea por Cromatografía de Líquidos o por espectrometría de masas.

Con estos métodos se pueden identificar y cuantificar 16 HPAs diferentes, aunque

los importantes para efectos de aplicación de esta Norma son: benzo(a)pireno,
dibenzo(a,h)antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(b)fluoranteno,
benzo(k)fluoranteno e indeno(1,2,3-cd)pireno.

1. Preparación de la muestra

Para el análisis es necesario extraer previamente los hidrocarburos que están

presentes en la muestra de suelo homogeneizada y cribada, mediante cualquiera
de las técnicas que se enlistan a continuación.

a) Soxhlet. Una muestra de suelo homogeneizada y cribada se mezcla con

sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua contenida. Se coloca en un

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 cartucho de celulosa para extraer los hidrocarburos en un equipo tipo
Soxhlet. El disolvente puede ser una mezcla de acetona/hexano (1:1), o
bien, cloruro de metileno/acetona (1:1) (v/v).
b) Sonicación. Una muestra de suelo homogeneizada y cribada se mezcla con
sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua contenida. Se somete a
sonicación en presencia de un disolvente orgánico de una a tres veces,
según el contenido de hidrocarburos. El disolvente puede ser una mezcla
de acetona/hexano (1:1) (v/v), o bien, cloruro de metileno/acetona (1:1). El
extracto se separa del suelo por filtración al vacío o por centrifugación.

En cualquiera de los dos casos, se puede requerir una limpieza para eliminar
interferencias.

2. Calibración

Para la calibración del equipo se deberá utilizar al menos los siguientes

compuestos puros certificados o una mezcla de materiales de referencia
certificados: benzo(a)pireno, dibenzo(a,h)antraceno, benzo(a)antraceno,
benzo(b)fluoranteno, benzo(k)fluoranteno e indeno(1,2,3-cd)pireno. Se deberán
cumplir los requisitos de calidad para métodos analíticos establecidos por la
normatividad correspondiente.

En el caso de Cromatografía de Líquidos, se deben programar los detectores para

tener las siguientes longitudes de onda de cuantificación en el detector de
fluorescencia a los tiempos de retención de cada uno de los compuestos, el
detector de DAD debe programarse de 200 a 350 nm con objeto de obtener los
espectros UV que ayudarán a identificar los picos de los HPAs detectados y
utilizar 270 nm para cuantificar los tres primeros HPAs.

Compuesto Longitud de onda Longitud de onda de Longitud de onda de

UV excitación (nm) emisión (nm)
pireno 237 385
benzo(a)antraceno 277 376

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benzo(b)fluoranteno 255 420
benzo(k)fluoranteno 255 420
benzo(a)pireno 255 420
dibenzo(a,h)antraceno 300 415
indeno(1,2,3-cd)pireno 250 495

La curva de calibración debe iniciar para cada compuesto en una concentración 10

veces menor al límite máximo permisible más bajo de la NOM-138-SEMARNAT-
2003 y hasta el rango lineal de trabajo del método.

3. Cuantificación

Se deberá considerar el área bajo la curva de cada compuesto a partir de la línea

base con la señal de la longitud de onda especificada en la tabla anterior.

En el caso de Espectrometría de Masas, no se debe utilizar el TIC para cuantificar,

la cuantificación deberá realizarse considerando la técnica de Perfil de Extracto de
Iones con el área bajo la curva del ión principal de cada compuesto a partir de la
línea base y se deberá confirmar la identidad de cada compuesto por medio de la
comparación del espectro de masas con la biblioteca de espectros del equipo.

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