4 TIPPOS DE POLIMERASA

TAQ
T. aquaticus es una bacteria que vive en manantiales calientes y fuentes hidrotermales, y
la polimerasa Taq que de ella se extrae ha sido caracterizada1 como
una extremoenzima capaz de soportar las condiciones de alta temperatura requeridas
durante el proceso de PCR sin desnaturalizarse.2 Por esta razón ha reemplazado a la ADN
polimerasa proveniente de E. coli (Eco pol) que era la que originalmente se utilizaba en
esta técnica, pero que requería ser reemplazada luego de cada ciclo de calentamiento
aumentando las probabilidades de contaminación y prolongando los tiempos.3 La
temperatura óptima de funcionamiento de la Taq es de 75 °C-80 °C, con
una semivida mayor a las dos horas a 92,5° C, 40 minutos a 95º C y 9 minutos a 97,5º C.
Esta enzima puede replicar una cadena de ADN de 1000 pares de bases en menos de 10
segundos funcionando a 72º C de temperatura.4
Uno de los inconvenientes de la Taq es su relativamente baja fidelidad. Carece de
actividad correctora de errores 3'→5' exonucleasa,4 y posee una tasa de introducción de
errores de aproximadamente 1 cada 9000 nucleótidos.5 Sin embargo los dos dominios
restantes pueden actuar en coordinación por medio del movimiento acoplado de
dominios.6 Se han aislado algunas otras polimerasas de ADN de otras bacterias
termofílicas y arqueas, tales como la polimerasa Pfu(aislada de Pyrococcus furiosus) que
sí poseen actividad correctora de errores; estas polimerasas se utilizan solas o
combinadas con la Taq cuando se requiere una amplificación de alta fidelidad.
La polimerasa Taq produce ADNs que poseen una adenina terminal no apareada colgando
de su extremo 3'. Esto puede resultar útil en técnicas de clonación TA, donde un vector de
clonación (tal como por ejemplo un plásmido) que posee una timina 3' sobresaliente puede
ser utilizado para complementar la adenina sobresaliente del producto de la PCR,
permitiendo de esta forma ligar el producto de PCR dentro del vector plásmido.
PFU
La polimerasa de ADN Pfu (PfuPol) es una enzima encontrada en
la arqueobacteria hipertermófila Pyrococcus furiosus, donde funciona copiando el ADN del
organismo durante la división celular. En el laboratorio de biología molecular, PfuPol suele
utilizarse para amplificar ADN en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde la
enzima realiza la función central de copiar una nueva hebra de ADN en cada paso de
extensión.
PfuPol tiene mayor termoestabilidad y capacidad proofreading (variable relacionada con la
fidelidad de la enzima) comparada con Taq polimerasa (TaqPol). A diferencia de esta
última, Pfu polimerasa posee actividad exonucleasa 3' a 5', lo que le permite
retirar nucleótidos incorporados de manera errónea del extremo 3' de la hebra de ADN.
Consiguientemente, Pfu polimerasa generará productos de PCR con menos errores que
aquellos sintetizados por TaqPol.
Disponible comercialmente, PfuPol generalmente posee un índice de error de 1 en 1.3
millones de pares de bases. Sin embargo, es más lenta que TaqPol, requiriendo entre 1 y
2 minutos por ciclo para amplificar mil bases de ADN a 72 °C.
La utilización de PfuPol en reacciones de PCR resulta también en extremos romos.
PfuPol es entonces conveniente respecto a TaqPol en técnicas que requieran alta fidelidad
de síntesis de ADN, pudiendo ser utilizado conjuntamente con TaqPol para obtener la
velocidad de esta enzima.
Científicos asociados con la compañía biotecnológica Stratagene, establecida en La
Jolla, California, describieron la superioridad de PfuPol en 1991 en su trabajo "Una
polimerasa termoestable de alta fidelidad aislada de Pyrococcus furiosus", publicado
en Strategies 4:34-35 (1991) y Gen en diciembre de aquel año (Gen. 1991 Dec
12;108(1):1-6).
 VENT
Vent DNA Polymerase es una DNA polimerasa termófila de alta fidelidad. La fidelidad de Vent
DNA Polymerase es 5-15 veces mayor que la observada para Taq DNA Polymerase (1,2). Esta
alta fidelidad se deriva en parte de una actividad integral de exonucleasa de corrección 3 '→ 5'
en la ADN polimerasa Vent (1,3). Más del 90% de la actividad de la polimerasa permanece
después de una incubación de 1 hora a 95 ° C.

ent ® DNA Polymerase ofrece una fidelidad moderada y un rendimiento robusto

 No hay actividad de exonucleasa de corrección de 3'→ 5 '

 5 veces más fidelidad que Taq
 Plantillas difíciles: ideal para secuencia rica en GC o en bucle
 Alta termoestabilidad: vida media de 6,7 horas a 95 ° C para una actividad máxima durante
la PC
rTTH

 La rTth ADN polimerasa es una polimerasa recombinante de ADN termoestable

derivada de Thermus thermophilus, con una actividad óptima a 70-80 °C, utilizado en
algunas aplicaciones de la PCR. La enzima posee una eficiente actividad
como transcriptasa inversa en presencia de manganeso.
s una enzima recombinante y termoestable que actúa como transcriptasa inversa y como ADN
polimerasa.

 En el caso de patógenos que son difíciles de crecer in vitro o

que presentan crecimiento lento, así como en el de todas
aquellas infecciones clínicamente atribuibles a diferentes
agentes.
 La PCR ha aportado un gran valor diagnóstico de bacterias,
hongos, virus y parásitos.
 A partir de múltiples protocolos que permiten identificar de forma
específica y rápida bacterias de diagnóstico difícil hasta ahora,
como Mycobacterium spp., Chlamydia spp., etc., así como
detectar la presencia de genes de relevancia clínica, como los
que codifican resistencia a antibióticos o los que confieren
mayor virulencia a los organismos que los portan.
 Una vez optimizadas tales aplicaciones individuales de la PCR y
comprobada su utilidad clínica, durante los últimos años ha
cobrado gran interés el desarrollo de las denominadas PCR
múltiples, reacciones que consiguen detectar de forma
simultánea y en un único tubo diferentes secuencias diana,
permitiendo la detección e identificación simultánea de distintos
genes de interés.
 Por otro lado, durante los últimos años se han empezado a
desarrollar protocolos de PCR múltiple muy prometedores
 mediante la utilización de PCR en tiempo real. Esta es una
nueva metodología que combina la PCR con el uso de
marcadores fluorescentes de forma que se pueda monitorizar la
cinética de la reacción, conocer la cantidad de ADN molde y
detectar la presencia de variaciones genéticas. En este capítulo
no se profundizará en los protocolos de PCR múltiple en tiempo
real, que se abordarán en un próximo número de Enfermedades
Infecciosas y Microbiología Clínica .

USOS
TMEDA se usa con persulfato amónico para catalizar la polimerización de acrilamida en la
fabricación de geles de poliacrilamida, utilizados en electroforesis en gel para la
separación de proteínas o ácidos nucleicos. También se emplea como agente
antihiperlipidémico, estimulador del crecimiento vegetal, inhibidor del crecimiento de
patógenos5 y componente de propergoles hipergólicos.9