Universidad de Granada

Departamento de Ingeniería Química

Máster en Ingeniería Química

Producción de biodiesel por vía enzimática

a partir de aceite de pescado

Trabajo Fin de Máster

Rodolfo Vela Peña

2015-2016

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 PRODUCCIÓN DE BIODIESEL POR VÍA ENZIMÁTICA

A PARTIR DE ACEITE DE PESCADO

Por:

Rodolfo Vela Peña

Fdo: Rodolfo Vela Peña

Licenciado en Ingeniería Química

Tutores del Trabajo de Fin de Máster

Dra. Marta Marín Suárez del Toro Dr. Antonio María Guadix Escobar
Departamento de Ingeniería Química Departamento de Ingeniería Química
Universidad de Granada Universidad de Granada

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Agradecimientos

El autor desea expresar sus agradecimientos

 Al departamento de Ingeniería Química de la Universidad de Granada. Por el apoyo

brindado en todo momento en la realización de este proyecto y por la buena disposición
de todos los profesores y personal docente. Muchas gracias.
 Al grupo de investigación de Biorreactores y a su directora la Dra. Emilia M. Guadix
Escobar por brindarme la oportunidad de integrarme al grupo para la realización de mis
prácticas y TFM.
 A los tutores de este trabajo, la Dra. Marta Marín Suárez del Toro y al Dr. Antonio María
Guadix Escobar por su ayuda en todo momento, sin la cual no hubiera sido posible la
realización del presente trabajo. Por su disposición, dedicación, actitud y trato personal,
lo cual me ayudó mucho durante todo este tiempo. Muchas gracias.
 A los miembros de este laboratorio: Dr. Raúl Pérez, Dr. F. Javier Espejo y Rocío Morales
por su apoyo personal y consejos en todo momento
 A mis compañeros de Máster por su valioso apoyo desde el inicio del curso y por los
buenos momentos que hemos pasado dentro y fuera del aula.
 Finalmente a mi familia por su apoyo, amor y sabiduría transmitida en todo momento y a
mis amigos en México por sus ánimos en la realización de este proyecto. Gracias totales.

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Tabla de Contenido
Resumen ............................................................................................................................................ 9
Abstract .......................................................................................................................................... 11
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 13
1.1. Definición del biodiesel ....................................................................................................... 13
1.1.1. Biodiesel vs Petrodiesel ............................................................................................ 14
1.2. Historia del biodiesel ........................................................................................................... 17
1.3. Situación actual del biodiesel .............................................................................................. 19
1.4. Química del biodiesel .......................................................................................................... 22
1.4.1. Ácidos grasos y glicéridos.......................................................................................... 22
1.5. Producción de biodiesel por vía química............................................................................. 25
1.5.1. Tipos de procesos químicos de biodiesel .................................................................. 26
1.6. Producción de biodiesel por vía enzimática ........................................................................ 28
1.6.1. Tipos de procesos enzimáticos de biodiesel ............................................................. 32
1.7. Biodiesel de Aceite de Pescado ........................................................................................... 33
1.8. Aceite de Pescado ............................................................................................................... 36
1.8.1. Mercado mundial aceite de pescado ........................................................................ 38
1.8.2. Aceite de pescado de descarte ................................................................................. 39
1.9. Objetivos ............................................................................................................................. 41
2. MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................................. 43
2.1. Materiales............................................................................................................................ 43
2.1.1. Aceite de pescado ..................................................................................................... 43
2.1.2. Enzima ....................................................................................................................... 45
2.1.3. Etanol ........................................................................................................................ 45
2.1.4. Metanol ..................................................................................................................... 46
2.1.5. Cloroformo ................................................................................................................ 46
2.1.6. Acetona ..................................................................................................................... 47
2.1.7. Cloruro de Acetilo ..................................................................................................... 47
2.1.8. Hexano ...................................................................................................................... 48
2.1.9. Metil Heptadecanoato .............................................................................................. 48
2.1.10. Ácido Nonadecanóico ............................................................................................... 49
2.1.11. Detergente alcalino ................................................................................................... 49

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 2.1.12. Precauciones y Seguridad ......................................................................................... 49
2.2. Métodos .............................................................................................................................. 50
2.2.1. Reacción de transesterificación enzimática .............................................................. 50
2.3. Métodos Analíticos.............................................................................................................. 54
2.3.1. Cromatografía de gases (GC) .................................................................................... 55
2.3.2. Determinación de % FAEE´s por método de Inyección Directa (ID) ......................... 60
2.3.3. Cromatografía en capa fina (TLC) .............................................................................. 62
2.3.4. Cromatografía de Gases Directa (CGD) ..................................................................... 64
2.3.5. Reacción de Metilación ............................................................................................. 64
2.4. Diseño experimental ........................................................................................................... 66
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................... 69
3.1. Contenido de FAEE´s en biodiesel ....................................................................................... 69
3.2. Contenido de glicéridos en biodiesel .................................................................................. 71
3.2.1. Perfil de ácidos grasos en biodiesel .......................................................................... 74
3.3. Optimización y análisis de la varianza ................................................................................. 77
4. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 89
5. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................... 91
ANEXOS .......................................................................................................................................... 97
Anexo 1. Cromatogramas............................................................................................................ 97

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Resumen

Este trabajo de investigación tiene como propósito el estudio de la producción de biodiesel por
vía enzimática mediante la transesterificación de aceite de pescado con etanol así como los
métodos analíticos que determinan la calidad del producto obtenido. Se comienza con una
introducción al biodiesel, su historia, situación actual, sus principales diferencias con el
petrodiesel, así como ventajas y desventajas entre sí desde los puntos de vista: medioambiental,
técnico, económico y social, los tipos de producción química y enzimática y se comenta también
sobre el aceite de pescado y una visión del uso de aceite de descarte de pescado para la
producción de biodiesel. Seguido se introducen los materiales y métodos para la producción de
biodiesel mediante la reacción de transesterificación en laboratorio. Así mismo se han estudiado
los métodos analíticos para la determinación del contenido de biodiesel (Fatty Acid Ethyl Esters,
FAEE´s) en el producto obtenido y el perfil lipídico del aceite de pescado de partida, analizando el
contenido de ácidos grasos por especie agrupados en: Monoacilgliceroles (MAG), Ácidos Grasos
Libres (FFA), Diacilgliceroles (DAG), Triacilgliceroles (TAG) y Esteres Etílicos (EE).

El diseño experimental incluye como variables de estudio: tiempo de reacción (1, 2, 4 y 8 horas) y
cantidad de enzima (50% w/w respecto al aceite, 25% w/w y 12.5% w/w). La relación molar en
exceso de etanol-aceite se fijó en 70:1 y la temperatura en 35 C.

Los resultados mostraron que la conversión máxima de EE obtenida fue de 86.91% a 8 horas de
reacción, 50% w/w de enzima en aceite. La norma Europea EN 14214, define que el contenido de
FAME o FAEE debe ser mínimo de 96.5%, por lo que se debería aplicar un proceso posterior por
ejemplo de purificación.

Finalmente se realizó el análisis de varianza ANOVA a los resultados para obtener las ecuaciones
que ajustan el comportamiento de las variables tiempo y cantidad de enzima para las variables de
salida que son: % de EE, % MAG, % FFA, % DAG y % TAG+EE. Así mismo se llevó a cabo la
optimización de dichas variables proporcionando gráficos de contorno de las superficies de
respuesta del análisis.

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10
Abstract

The aim of this research work is to study the production of biodiesel enzymatically by
transesterification of fish oil with ethanol and develop the analytical methods that determine the
quality of the product. It begins with an introduction to biodiesel, its history and current situation,
the main differences with petrodiesel as well as the advantages and disadvantages to each other
from the environmental, technical, economic and social aspects and includes a brief explanation
about the types of chemical and enzymatic production. The report contains also information
about the fish oil market and trends and a vision of the use of fish oil discards as a raw material
for the production of biodiesel. To continue, materials and methods for the transesterification
reaction in the laboratory for the production of biodiesel are introduced. It has also been studied
the analytical methods for the determination of biodiesel (Fatty Acid Ethyl Esters, FAEE's) and lipid
profile in the product and fish oil, starting by analyzing the fatty acid content by species grouped
into: Monoacylglycerols (MAG), Free Fatty Acids (FFA), Diacylglycerols (DAG), Triacylglycerols
(TAG) and Ethyl Esters (EE).

The experimental design included as variables of study: Reaction time (1, 2, 4 and 8 hours) and
amount of enzyme (50% w/w respect to oil, 25% w/w and 12.5% w/w). The molar ratio in excess
of ethanol-oil was set at 70: 1 and the temperature at 35 C.

The results showed that the maximum conversion obtained of EE was 86.91% at 8 hours reaction,
and 50% w/w of enzyme in oil. The European standard EN 14214, defines the content of FAME
and FAEE should be at least 96.5%, thus further treatment should be applied, such as a
purification process.

Finally, ANOVA analysis was performed to obtain the equations which adjust the behaviour of the
variables of time and amount of enzyme for output variables which are: % EE% MAG, % FFA,%%
DAG and TAG + EE. It was also performed the optimization of these variables to maximize yield of
EE and minimize %MAG %FFA, %DAG providing contour plots of the response surface analysis.

11
12
1. INTRODUCCIÓN

1.1. Definición del biodiesel

El biodiesel es un biocombustible formado principalmente por alquil ésteres de ácidos grasos de

cadena larga y es producido a partir de materias primas de lípidos renovables como aceites
vegetales o grasas animales, aunque existen otras fuentes alternativas como lípidos de algas
(Knothe, 2010). La producción de alquil ésteres se lleva a cabo por la reacción de
transesterificación mediante de diversos sistemas catalíticos o en condiciones supercríticas (Gog
et al., 2012).

Este biocombustible representa una alternativa ecológica con numerosas ventajas frente al diesel
derivado del petróleo (destilado intermedio). Entre ellas se encuentran que es biodegradable, no
es tóxico, genera una combustión limpia, es un buen sustituto para el diesel de petróleo porque
reduce las emisiones de compuestos carcinogénicos hasta en un 85%, es esencialmente libre de
azufre, hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH) hidrocarburos aromáticos policíclicos nitrados
(nPAH), metales y partículas. Reduce las emisiones de monóxido de carbono (CO), sin embargo los
niveles de NOx aumentan comparado con el diesel de petróleo (Behçet, 2011). El biodiesel tiene
también un excelente balance energético comparado con su contrapartida de petróleo ya que
posee 3.2 veces la cantidad de energía que requiere para producirlo (Christopher et al., 2014).

El desarrollo de motores de combustión y el avance de la tecnología han llevado al consumo de

energéticos del petróleo, sin embargo el incremento en la demanda energética, a la disminución
de las reservas de combustibles fósiles así como los daños que causan al medio ambiente han
aumentado la importancia del estudio de fuentes renovables de combustibles. Con ello ha
aumentado también el interés por desarrollar procesos de producción más eficientes de
biocombustibles, enfocándose gran medida en el desarrollo de nuevos catalizadores para
aumentar la eficiencia y operar a condiciones de proceso con costes competitivos.

Para poder hacer del biodiesel un producto ecológico es indispensable hacer uso de materias
primas renovables y que provengan de procesos ecológicos, por ejemplo: con el uso de bioetanol,
así como el aprovechamiento aceites de descarte recuperables, aceites de fritura, fuentes de
aceites no comestibles como la semilla de Jatropha, planta originaria de México que produce un
fruto no comestible con alto contenido de aceite y finalmente algas que contienen un alto
porcentaje de lípidos en su composición y pueden encontrarse disponibles en cantidades
considerables (Lin and Li, 2009a). En particular, el uso de aceite de pescado obtenido mediante el

13
aprovechamiento de materiales de descarte de la industria es actualmente considerado como una
fuente aprovechable de aceites y que puede contribuir a la reducción de costes de producción de
biodiesel.

El biodiesel de primera generación se producía a partir de aceites vegetales comestibles como el

de semillas de soja, colza, girasol, algodón, palma, coco, cacahuate, entre otros. En un principio,
estos aceites representaban una alternativa ecológica y “neutral de carbono” (cero emisiones
netas de CO2) frente al diesel de petróleo y atrajeron la atención de la industria y gobiernos,
principalmente en Europa y Estados Unidos. Sin embargo los costes asociados al uso de estos
cultivos resultan significativos, además que la producción de combustibles provenientes de
aceites para consumo humano ha generado cuestionamientos éticos por grupos de interés y
organizaciones no gubernamentales (Aminul Islam, 2015).

El tipo y la calidad de lípidos usados para la producción de biodiesel dependen principalmente de

las materias primas que se encuentran en mayor abundancia y la facilidad de distribución en la
zona geográfica donde estén localizados los centros de producción. Por ejemplo, en el caso de la
Unión Europea, el uso de aceites de canola y girasol es predominante, en Latinoamérica es mayor
el uso de aceite de palma, en los Estados Unidos el aceite de soya y las grasas animales, en Asia el
aceite de palma. (Knothe, 2010).

Los aceites de origen animal son también objeto de investigación para la producción de biodiesel;
dentro de ellos se encuentran el sebo, grasas de aves y el aceite de pescado. En particular, el
aceite de pescado proveniente de productos de descarte de la industria pesquera, que no cumple
con las propiedades alimenticias mínimas para ser comercializado (bajo contenido en ácidos
grasos omega 3, DHA y DPA) y que por tanto no es destinado al consumo humano, puede tener
ventajas competitivas y económicas como materias primas para biodiesel por tener un menor
coste, influyendo en ello la reducción en tratamiento de desperdicios y por obtención de valor
adicional al haber mayor aprovechamiento de materiales.

1.1.1. Biodiesel vs Petrodiesel

Los aceites derivados de fuente vegetal o animal y sus ésteres metílicos o etílicos (biodiesel),
poseen cualidades similares al diesel de petróleo, una de las más importantes para su uso como
combustible es el índice de Cetano, el cual es la relación del tiempo que transcurre entre la
inyección del carburante y el comienzo de su combustión, denominado “Intervalo de encendido”.
Una combustión de calidad ocurre cuando se produce una ignición rápida seguida de un quemado

14
total y uniforme del carburante. Pero si los aceites por si mismos pueden usarse directamente
como combustibles ¿Cuál es la razón por la que se requiere transformarlos químicamente a
biodiesel? Una de las principales razones es que los derivados, alquil ésteres, poseen una menor
viscosidad cinemática. Esta propiedad es fundamental para mejorar el desempeño de los motores
de combustión interna, incluyendo otras características fisicoquímicas importantes que el
combustible debe tener, como son: Calor de combustión, punto de fluidez, punto de
enturbiamiento, estabilidad a la oxidación, lubricidad, etc.

Las normas que describen las especificaciones y los métodos de prueba de biodiesel son: EN
14214 en Europa y ASTM D6751 en Estados Unidos. A continuación se muestra una tabla
comparativa de las propiedades fisicoquímicas del biodiesel vs petrodiesel:

Tabla 1. Tabla comparativa de propiedades fisicoquímicas Biodiesel vs.

Petrodiesel

Propiedad Biodiesel Diesel de Petróleo

Composición C12—C22 FAME-FAEE C10-C21 HC
Alquil éster 95.5 – 98% -
Carbono (% peso) 77 86.5
Azufre (% peso) 0-0.0024 0.05 máx.
Agua (ppm peso) 0.05% máx. 161
Oxígeno (% peso) 11 0
Hidrógeno (% peso) 12 13
Índice de Cetano 48-55 40-55
Poder Calorífico (KJ/Kg) 37,700 41,860
Viscosidad Cinemática 1.9-6.0 1.3-4.1
(@ 40C)
Punto de inflamación (C) 100-170 60-80
Punto de ebullición (C) 182-338 188-343
Gravedad Específica 0.88 0.85
(Kg/l @ 15.55 C)
Relación aire/combustible 13.8 15

Los acrónimos FAME Y FAEE corresponden a Ésteres Metílicos de Ácidos

Grasos y Ésteres Etílicos de Ácidos Grasos (Fatty Acid Methyl Esters y Fatty
Acid Ethyl Esters).

15
Además existen numerosas ventajas y desventajas del biodiesel frente al petrodiesel, desde el
punto de vista de medioambiental, técnico, económico y social las cuales se enlistan en la Tabla 2.

Tabla 2. Ventajas y desventajas del biodiesel vs petrodiesel

Ventajas Desventajas

Es superior en términos de emisiones Las emisiones de nitrógeno son

netas de CO, SOx e hidrocarburos a la superiores en comparación con el
atmósfera y bajo ciertas condiciones diesel de petróleo
también de NOx. Permitiendo ahorrar
de 2.4-3.2 Kg de CO2 / Kg combustible

No contiene compuestos aromáticos

Medioambientales ni azufre.

No es tóxico.

Es Biodegradable

Proviene de fuentes renovables

Tiene mayor punto de inflamación, lo Uso limitado a bajas temperaturas

cual lo hace más seguro para su
almacenamiento.
Se puede mezclar con petrodiesel en
cualquier proporción, considerándose
las mezclas menores al 20% como
aditivo lubricante de combustible
Técnicas favoreciendo el circuito de
alimentación y la bomba de inyección.
Contiene oxígeno lo cual permite una
adecuada combustión con menor
relación aire/combustible
por su punto de escurrimiento
En lugares fríos pueden presentarse
problemas de arranque del motor
debido a su mayor punto de fusión.
Pérdida de un 5% de potencia en
motores.
Deterioro de elementos de caucho y
disuelve pinturas por lo que deben
utilizarse elementos de poliuretano.
Presenta degradación por oxidación.

Puede ayudar a mejorar la economía Alto costo/precio.

de las zonas donde hay generación de
materias primas

Económicas Fortalecimiento de la industria

agroalimentaria.

Reducción de la dependencia del

petróleo.

Existen Incentivos legislativos y Existe polémica por el uso de aceites

Sociales regulatorios para su promover su destinados al consumo humano para
producción y uso. la producción de biocombustibles.

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Comercialmente se le denomina B-100 al biodiesel puro, es decir, que no se encuentra mezclado
en alguna proporción con petrodiesel. El contenido mínimo de alquil ésteres, para cumplir las
especificaciones del biodiesel, debe ser  al 96.5% de acuerdo a la norma EN 14214.

Cuando biodiesel se encuentra mezclado con petrodiesel en distintas proporciones se

denominará B-80, B-50, B-20, etc. de acuerdo al porcentaje en la mezcla.

1.2. Historia del biodiesel

El uso de aceites como combustibles tuvo su inicio a finales del siglo XIX cuando Rudolf Diesel, en
Augsburg, Alemania, inventó el motor de combustión interna, el cual lleva su nombre. La
motivación de realizar este prototipo mecánico fue su búsqueda por desarrollar un ciclo
termodinámico de Carnot donde pudiese aprovechar el máximo de energía durante el cambio
isotérmico de un gas convirtiendo el calor en trabajo, tal como lo describe en su trabajo titulado:
“Die Entstehung des Dieselmotors” traducido como “El Desarrollo o La Creación del Motor Diesel”
(Knothe, 2010). En el modelo original, Diesel propuso que la máquina podría funcionar con aceites
vegetales como combustible, lo cual fue confirmado durante la exposición universal de París en
1900. El motor de Diesel, fabricado por la compañía French Otto Company, fue probado y puesto
en marcha en su presentación utilizando aceite de cacahuate (compuesto principalmente por
ácido graso araquídico) mostrando por primera vez la posibilidad de utilizar aceites vegetales en
un motor de combustión interna (Knothe, 2010).

Diesel también hizo una publicación llamada “Combustibles líquidos” en donde profundizó en su
estudio del uso de aceites vegetales como combustibles. En 1912 él afirmaba que en el futuro el
uso de aceites como combustibles sería de gran importancia en el mundo. Sin embargo, en el
corto plazo no fue así, ya que los aceites originan problemas de operación con los inyectores,
depósitos de carbón, adherencia en anillos, espesamiento, gelificación, etc. (Christopher et al.,
2014). Aunado a ello, el menor coste de petróleo hizo que sus derivados combustibles
prevalecieran comercialmente durante el desarrollo de la industria automotriz, el transporte, la
industria energética y el uso doméstico (Lin and Li, 2009a).

Durante la II Guerra Mundial, debido a la necesidad de encontrar fuentes alternativas de

combustibles no fósiles, se llevaron a cabo pruebas para el uso de aceites vegetales en motores
de combustión interna, pero sus altas viscosidades generaban problemas técnicos, por lo que se
llegaron a implementar modificaciones a los aceites para la mejora de sus propiedades, por

17
ejemplo el mezclado con petrodiesel, calentamiento, procesos de pirolisis y craqueo, etc. (Knothe,
2010).

En 1937 surgió la primera patente de producción de biodiesel en la Universidad de Bruselas,

Bélgica, donde se hablaba sobre la transesterificación de aceite de palma con etanol. En 1983 el
proceso industrial de producción de biodiesel como combustible fue publicado
internacionalmente. Después en 1989 se instaló la primera planta de producción industrial en
Austria con una capacidad de 30,000 ton/año de aceite de canola. En 1994, 21 países en Europa
contaban ya con proyectos de producción con disponibilidad de biodiesel en estaciones de
servicio. En 2005 en Minnesota, EUA se promulgo que todo el diesel comercial debía contener un
mínimo de 2% de biodiesel en su formulación (Knothe, 2010).

Figura 1. El motor Diesel original de 1897, en el Deutsches Museum en

Múnich, Alemania

18
 1.3. Situación actual del biodiesel

Los requerimientos de producción de biodiesel en el mundo actualmente están definidos por

objetivos gubernamentales, directivas energéticas y la industria misma. El Parlamento Europeo
por medio de la Directiva 2009/28/CE establece un marco común para el fomento de la energía
procedente de fuentes renovables. Esta directiva fija los objetivos nacionales obligatorios en
relación con la cuota de energía procedente de fuentes renovables incluida en el consumo final
bruto de energía y su cuota en su uso para transporte. La directiva define también criterios de
sostenibilidad para biocarburantes y biolíquidos en de los estados miembros de la Unión Europea
(“Resumen del plan de energías renovables 2011-2020”).

De acuerdo a esta directiva, el plan europeo para el año 2020, conocido como 20/20 establece
que la energía total consumida en la Unión Europea deberá ser en un 20% proveniente de fuentes
renovables. En el caso de combustibles de fuentes renovables como el biodiesel, para el año 2020
en Europa, su aportación deberá ser mínimo del 10% del total de combustible para transporte.

La producción y el consumo mundial de biodiesel de los años 2005 a 2012 se indican en las tablas
3 y 4 respectivamente. Como se puede observar, la región con mayor producción y consumo de
biodiesel en el mundo es Europa, ello debido en gran medida a las directivas energéticas
implementadas y la contribución de prácticamente todos los países miembros de la Comunidad
Europea en el desarrollo y políticas locales que promueven el uso de biocombustibles.

En cuanto a la estimación de costes de cualquier biocombustible en particular resulta compleja ya

que los precios varían con el tipo de materia prima, el volumen de producción, proceso de
producción, incentivos gubernamentales, precios de los alimentos, entre otros. Sin embargo, está
claro que el precio por litro de combustible deberá ser igual o menor a su contrapartida derivada
del petróleo para poder ser competitivo comercialmente. Se estima que la materia prima implica
un 70% del coste total de producción. Por esto, existe la necesidad de encontrar materias primas
de bajo coste.

En 2012 la producción total de biodiesel en Europa fue de 170,920 Barriles por día (27,176 m 3),
mientras que en los Estados Unidos fue de 64,000 Barriles por día (10,176 m3).

19
 Tabla 3. Producción Mundial de Biodiesel (Miles de Barriles*/Día) por
continentes con países de mayor aportación. *1 Barril = 159 litros.

2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

North America 6.12 17.14 33.65 45.91 36.20 24.50 65.80 67.70
Canada 0.20 0.80 1.60 1.70 2.10 2.40 2.70 3.60
Greenland 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Mexico 0.00 0.00 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
United States 5.92 16.34 31.95 44.11 34.00 22.00 63.00 64.00
Central & South America 0.54 2.25 11.25 35.83 56.94 85.15 103.25 103.82
Argentina 0.20 0.60 3.60 13.90 23.10 36.00 47.34 47.90
Brazil 0.01 1.19 6.97 20.06 27.71 41.12 46.06 46.70
Colom bia 0.00 0.00 0.10 1.40 5.70 7.20 9.00 8.50
Peru 0.30 0.40 0.40 0.20 0.20 0.50 0.60 0.60
Uruguay 0.03 0.04 0.06 0.05 0.10 0.20 0.20 0.10
Europe 62.06 96.52 122.39 150.69 172.87 183.14 181.23 170.92
Albania 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Austria 1.60 2.40 5.20 4.20 6.10 5.70 6.20 7.00
Belgium 0.02 0.49 3.20 5.40 8.10 8.50 8.70 8.70
Czech Republic 2.48 2.20 1.60 1.50 3.00 3.90 4.10 3.00
Denm ark 1.40 1.40 1.40 1.80 1.70 1.70 2.70 1.80
Finland 0.00 0.00 0.80 1.60 4.30 5.60 4.00 5.20
France 8.40 11.60 18.70 34.40 41.00 37.00 34.00 32.70
Germ any 33.00 52.00 57.00 55.00 45.00 49.00 57.24 54.70
Ireland 0.02 0.02 0.30 0.40 1.20 1.10 0.90 0.90
Italy 7.70 11.60 9.20 13.10 15.60 14.50 11.20 9.80
Latvia 0.10 0.10 0.20 0.60 0.90 0.80 0.90 1.16
Lithuania 0.10 0.20 0.50 1.30 1.90 1.70 1.60 1.70
Netherlands 0.00 0.35 1.70 2.00 5.40 7.50 9.60 6.40
Norw ay 0.10 0.10 0.10 1.00 1.00 0.00 0.00 0.00
Poland 1.20 2.00 0.90 5.00 6.00 7.00 6.80 9.70
Portugal 0.02 1.60 3.50 3.30 4.90 6.00 5.50 5.20
Rom ania 0.00 0.20 0.70 1.30 0.60 1.40 1.60 1.50
Spain 3.20 1.20 3.50 4.30 13.00 16.00 11.00 8.70
Sw eden 0.20 1.00 2.20 2.80 3.50 4.00 5.00 5.20
United Kingdom 0.90 5.00 8.00 5.50 4.00 4.00 4.00 1.50
Eurasia 0.30 0.32 0.72 2.50 3.80 3.26 3.25 3.41
Russia 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Middle East 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.10 0.10 0.10
Africa 0.00 0.00 0.00 0.05 0.09 0.17 0.17 0.07
Asia & Oceania 2.22 8.40 10.82 27.12 41.82 49.05 71.49 85.24
Australia 0.20 0.40 0.70 0.90 0.86 1.46 1.46 1.38
China 0.80 4.00 2.00 5.00 10.18 9.79 14.68 15.66
India 0.20 0.40 0.20 0.20 1.29 1.55 1.75 1.98
Indonesia 0.20 0.40 1.00 2.00 5.69 12.75 31.02 37.91
Japan 0.00 0.10 0.10 0.10 0.16 0.17 0.21 0.24
Thailand 0.40 0.40 1.20 7.70 10.51 11.37 10.86 15.51
World 71.25 124.63 178.83 262.10 311.72 345.38 425.28 431.26

Fuente:www.eia.gov/cfapps/ipdbproject/iedindex3.cfm?tid=79&pid=81&aid=
1&cid=regions&syid=2000&eyid=2012&unit=TBP

20
 Tabla 4. Consumo Mundial de Biodiesel (Miles de Barriles*/Día) por
continentes con países de mayor participación. *1 Barril = 159 Litros

2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

North America 6.12 17.80 25.06 22.34 23.14 20.30 62.10 62.36
Canada 0.20 0.80 1.60 1.70 1.81 2.20 5.00 2.26
Greenland 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Mexico 0.00 0.00 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
United States 5.92 17.00 23.36 20.54 21.23 18.00 57.00 60.00
Central & South America 0.39 1.45 7.36 21.57 35.19 61.96 72.79 78.63
Argentina 0.30 0.30 0.30 0.30 0.50 9.90 14.65 15.70
Brazil 0.06 1.10 6.38 19.10 26.97 42.43 45.00 48.10
Colombia 0.00 0.00 0.10 1.40 5.70 7.20 9.00 10.42
Paraguay 0.00 0.00 0.10 0.20 0.10 0.20 0.02 0.20
Peru 0.00 0.00 0.40 0.50 1.80 2.00 3.90 4.00
Uruguay 0.03 0.04 0.06 0.05 0.10 0.20 0.20 0.20
Europe 52.79 91.86 133.37 176.61 214.84 232.84 239.54 218.44
Austria 1.70 6.40 7.20 7.90 10.20 10.30 9.50 9.80
Belgium 0.00 0.02 2.00 1.90 6.20 6.40 6.20 6.40
Czech Republic 0.10 0.40 0.70 1.70 3.00 3.80 5.30 4.70
Denmark 0.00 0.00 0.00 0.01 0.10 0.10 0.50 0.70
Finland 0.00 0.00 0.00 0.20 1.30 2.00 2.00 6.00
France 7.12 13.50 25.30 40.60 45.00 40.00 40.50 43.00
Germany 35.00 56.00 64.00 53.00 49.00 50.50 47.40 48.50
Ireland 0.02 0.02 0.40 0.80 1.20 1.30 1.50 1.50
Italy 3.90 4.40 4.00 14.00 23.30 30.00 31.00 13.10
Netherlands 0.05 0.49 4.90 3.97 5.20 2.10 3.60 3.57
Norw ay 0.10 0.10 0.68 1.78 2.10 2.50 2.30 5.30
Poland 0.30 0.60 0.50 7.00 8.00 12.00 15.00 14.60
Portugal 0.00 1.60 3.00 2.80 5.00 7.00 7.00 6.40
Spain 3.20 1.20 5.90 11.00 20.00 26.00 32.00 27.30
Sw eden 0.20 1.00 2.20 2.80 3.50 4.00 5.00 5.40
United Kingdom 0.60 2.90 6.00 15.30 18.00 18.00 16.00 8.80
Eurasia 0.20 0.35 0.97 1.31 1.38 1.90 2.40 2.54
Russia 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Middle East 0.00 0.00 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10
Africa 0.00 0.00 0.00 0.05 0.08 0.17 0.17 0.17
Asia & Oceania 1.84 6.42 7.82 20.20 32.83 38.25 44.81 56.98
Australia 0.30 0.40 0.80 1.00 1.65 1.62 1.81 1.07
China 0.80 4.00 2.00 5.00 10.18 9.79 14.68 15.66
Hong Kong 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.10 0.10 0.10
India 0.20 0.40 0.20 0.20 1.00 0.90 1.03 1.21
Indonesia 0.04 0.20 0.40 1.00 1.03 3.79 6.17 11.55
Japan 0.20 0.20 0.20 0.20 0.16 0.17 0.21 0.20
Korea, South 0.20 0.90 1.70 3.20 5.00 6.50 6.30 6.30
Philippines 0.00 0.02 0.60 1.10 2.26 2.15 2.12 2.15
Thailand 0.10 0.10 1.10 7.70 10.49 11.13 11.03 15.34
World 61.34 117.87 174.68 242.17 307.55 355.52 421.91 419.23

Fuente:www.eia.gov/cfapps/ipdbproject/iedindex3.cfm?tid=79&pid=81&aid=
1&cid=regions&syid=2000&eyid=2012&unit=TBPD

21
 1.4. Química del biodiesel

Los principales componentes del biodiesel son mono-alquil (metil o etil) ésteres de ácidos grasos
de cadena larga (Fatty Acid Methyl Esters o Fatty Acid Ethyl Esters; FAME´s o FAEE´s) y se
producen a partir de la reacción química de transesterificación entre aceites o grasas de origen
vegetal o animal, (compuestos químicamente por triglicéridos) y un alcohol, comúnmente
metanol o etanol, aunque se han utilizado alcoholes de cadena más larga, como isopropanol o n-
butanol. La reacción produce los ésteres (biodiesel) y glicerol o glicerina como subproducto. La
reacción de transesterificación se muestra en la Figura 2.

Figura 2. Reacción de transesterificación entre un triacilglicerol (aceite) y un

alcohol.

La reacción de transesterificación se lleva a cabo mediante catálisis química o enzimática. En la

química se utilizan catalizadores ácidos o alcalinos de carácter homogéneo o heterogéneo (Gog et
al., 2012). En la catálisis enzimática se utilizan lipasas también en solución o soportadas (Nielsen
et al., 2008).

1.4.1. Ácidos grasos y glicéridos

Los aceites vegetales y animales están químicamente compuestos por acilgliceroles o glicéridos,
que en su mayor parte son triacilgliceroles (TAG), también conocidos como triglicéridos y en
menor proporción se encuentran otras especies como: diacilglicéroles o diglicéridos (DAG),
monoacilgliceroles o monoglicéridos (MAG), ácidos grasos libres (FFA´s), además de productos de
oxidación y trazas de otros compuestos. A continuación se muestra una tabla con los contenidos
típicos de glicéridos en distintos aceites y grasas usados para transesterificación. La composición
del aceite de pescado se refiere al aceite usado durante este proyecto.

22
 Tabla 5. Composición típica de algunos aceites vegetales y animales

Destilado
Aceite Aceite Aceite Aceite
Aceite de ácidos
de de Sebo de de
de Soja grasos de
Canola Palma fritura Pescado
palma

Triglicéridos 96.0 98.6 87.0 74.0 8.0 62.0 86.60

Diglicéridos 2.0 0.8 6.0 12.0 5.0 16.0 2.22

Monoglicéridos 0.5 0.1 2.0 4.0 2.0 7.0 6.89

Ácidos grasos 1.5 0.5 5.0 10.0 85.0 15.0 4.29

libres

Los glicéridos son ésteres formados por la unión de cadenas de ácidos grasos (FA´s) a una
molécula de glicerol o glicerina, a través de la transesterificación entre el enlace carboxilo del
ácido graso y alguno de los grupos hidroxilo (-OH) del glicerol. Cuando los tres grupos –OH del
glicerol están sustituidos por un ácido graso, se forma un TAG; en el caso de que solo dos grupos
sean reemplazados se forma un DAG; cuando solo un grupo hidroxilo del glicerol esta esterificado
la molécula es un MAG. En general se denomina glicéridos a todo el grupo de especies de
acilgliceroles.

Figura 3. Glicerol y glicéridos (MAG, DAG y TAG)

Los ácidos grasos que forman parte de estos glicéridos, son ácidos orgánicos de cadena lineal
larga que pueden ser saturados (Saturated Fatty Acids, SFA), es decir, sin dobles enlaces C=C,
monoinsaturados (Mono Unsaturated Fatty Acids, MUFA), con una insaturación C=C y
polinsaturados (Poly Unsaturated Fatty Acids, PUFA) conteniendo dos o más insaturaciones, y en
su mayoría contienen entre 14 y 24 átomos de carbono (C-14 a C-24) pero el rango completo de
número de carbonos en ácidos grasos es más amplio. Las propiedades físicas y químicas de los

23
glicéridos varían en gran medida por el tipo de ácidos grasos que contengan (SFA, MUFA y PUFA) y
la longitud de su cadena de carbonos, por lo que es de especial interés conocer el contenido y
porcentaje de cada tipo de ácido graso.

Para la nomenclatura de los ácidos grasos se utilizan sus nombres comerciales y/o químicos y el
número lipídico, que se describe a continuación:

Ácidos grasos saturados (SFA´s):

Ejemplo:

Ácido palmítico (hexadecanóico) ---------C16:0

Donde:
Número de carbonos =16
Insaturaciones = 0

Figura 4. Molécula de ácido Palmítico

Ácidos grasos mono y poli insaturados (MUFA´s o PUFA´s)

Ejemplo:

Ácido Eicosapentaeónico (EPA) ------- Número lipídico: C20:5 n-3

Donde:
Número de átomos de carbono = 20
Número de insaturaciones en su cadena = 5
Posición en que se encuentra la primera insaturación (posición ω) = 3
Este ácido graso por consiguiente pertenece al grupo ω-3 (omega-3)

Figura 5. Molécula del ácido eicosapentaeónico (EPA)

24
 1.5. Producción de biodiesel por vía química

La producción de biodiesel por catálisis química, utilizando metanol y etanol ha sido la alternativa
más usada a nivel industrial, principalmente con metanol por el bajo coste y características
químicas de este alcohol. Además, la transesterificación de aceites puede ser llevada a cabo
mediante catálisis ácida a altas temperaturas o alcalina a temperaturas moderadas (Islam and
Taufiq-Yap, 2014). El proceso más usado es el alcalino y sus condiciones de operación normales
son a temperaturas entre 60 y 70 C, presiones entre 1.4 y 4.2 Bar y concentraciones de
catalizador entre 0.5 y 2 % w/w.

A lo largo de la historia en producción de biodiesel, se han probado distintos catalizadores

homogéneos (en solución) y heterogéneos (soportados) ya que de no usarse catálisis se
requerirían altas temperaturas, presiones y tiempos de reacción para lograr las conversiones
deseadas. Convencionalmente, se han usado catalizadores homogéneos alcalinos como
hidróxidos de metales alcalinos en solución (hidróxido potásico o hidróxido sódico), óxidos e
hidróxidos de metales alcalinotérreos, reportándose rendimientos en alquil ésteres de hasta 99%
(Szczęsna Antczak et al., 2009). Respecto a catalizadores heterogéneos, se han puesto a prueba
una gran variedad, tales como sales soportadas en alúmina, zeolitas, hidrotalcitas y algunos ácidos
sólidos con procesos a temperaturas moderadas (Islam and Taufiq-Yap, 2014). La Tabla 6 contiene
algunos ejemplos de catalizadores heterogéneos en diferentes soportes usados en reacciones de
transesterificación:

Tabla 6. Síntesis de biodiesel con distintos catalizadores heterogéneos (60 –

70 C). Fuente: (Islam and Taufiq-Yap, 2014)

Catalizador Metanol/Aceite Aceite TR (C) RMF PMF RF (%)

KNO3/Al2O3 12:1 Jatropha 70 0.016 0.105 84
NaOH/Al2O3 12:1 Girasol 50 0.497 0.036 88
CaO/MgO 12:1 Canola 64.5 0.095 0.4 80
KNO3/CaO 6:1 Canola 60 0.12 0.2 100
LiNO3/CaO 6:1 Canola 60 0.12 0.19 99
Mg/La oxidos mezclados 13:1 Girasol Ambiente 0.047 0.551 95
KOH/Al2O3 15:1 Palma 60 0.017 0.145 87.5
KOH/NaY zeolita 15:1 Palma 60 0.017 0.3 91.07

Rendimiento Máximo de FAME (RMF) = FAME (g) / Aceite (g) * Catalizador (g),
Productividad Máxima de FAME (PMF) = FAME (g) / Aceite (g) * t (h),
Rendimiento de FAME (RF) = FAME (g) / Aceite (g), Temperatura de Reacción
(TR)

25
 1.5.1. Tipos de procesos químicos de biodiesel

La relativa facilidad de llevar a cabo la reacción de transesterificación de aceites y sus condiciones

moderadas de operación, utilizando catalizador de hidróxido sódico en alcohol o con metóxido
sódico (metilato), que es formado por la disolución de sodio metálico en alcohol, ha marcado el
punto de partida de la producción en masa de biodiesel (Knothe, 2010).

El proceso en discontinuo consiste consta típicamente de dos pasos; primero se agregan los
componentes en reactores de tanque agitado a una relación molar alcohol-aceite 6:1, el
catalizador (metilato o hidróxido sódico) y se lleva a temperaturas entre 60 y 65 C, presión
atmosférica y tiempos entre 2 y 4 horas. Idealmente las condiciones deben de ser anhidras para
evitar la hidrólisis de los triglicéridos, aceptando una concentración máxima de agua entre 0.1% –
0.3% (Knothe, 2010).

En el primer paso se obtienen conversiones de 75% del teórico. Terminada la primera

transesterificación, se retira el glicerol formado que contiene catalizador y alcohol sin reaccionar y
se agregan alcohol y catalizador frescos para continuar con una segunda transesterificación donde
se obtienen rendimientos >98%. Después de la reacción de transesterificación el biodiesel lleva un
proceso de lavado con agua, la cual, generará una fase acuosa que por densidad se depositará en
el fondo junto con el glicerol, catalizador y alcohol sin reaccionar que se separan (Knothe, 2010),
adicionalmente se pueden emplear procesos de purificación de biodiesel por ejemplo destilación.

La producción en continuo del biodiesel es más eficiente y económica para operar y se

encuentran en operación plantas de producción de capacidades de millones de litros
anuales(Knothe, 2010). En la Figura 6 se muestran las operaciones unitarias básicas del proceso
de producción de biodiesel en continuo por vía química.

26
 Figura 6. Proceso en continuo de biodiesel con pre tratamiento ácido, seguido
por el proceso catalítico alcalino. A) Reactor, B) Separación (centrífuga o
decantador) D) Purificación del producto y recuperación de alcohol. Fuente
Fjerbaek et al., 2009

Como se ha mencionado, un aspecto clave en la producción de biodiesel es la calidad y el tipo de

materias primas que se usan. En el caso de aceites refinados, compuestos casi en su totalidad de
triglicéridos sin ácidos grasos libres (FFA´s), las conversiones normalmente son elevadas ya que la
reacción es químicamente eficiente. Sin embargo en aceites con altos contenidos de FFA´s como
lo son los aceites de descarte, el proceso debe sufrir modificaciones, especialmente en el proceso
alcalino ya que se presenta saponificación, lo que implica la necesidad de un proceso de
separación y pérdida de catalizador que deberá reponerse (Knothe, 2010). Una de las
modificaciones puede ser el proceso en dos etapas que consta de:

1. Esterificación de los FFA

2. Transesterificación a biodiesel

Llevar a cabo estas dos etapas implica un aumento en consumo energético y posible disminución
de la eficiencia global del proceso. Sin embargo, contenidos inferiores a 0.5% en peso de FFA´s, no
representan un problema significativo para la eficiencia de la reacción. (Knothe, 2010).

Los aceites vegetales refinados presentan ventajas y desventajas contra los aceites de descarte. La
principal ventaja es la calidad del producto obtenido, ya que presentan mejores niveles de
conversión a productos. La principal desventaja es su elevado coste, ya que las materias primas
refinadas son más caras y generalmente destinadas a consumo humano (Knothe, 2010).

27
 1.6. Producción de biodiesel por vía enzimática

La biocatálisis implica el uso de enzimas en lugar de catalizadores químicos para la síntesis en

procesos. Comparado con los catalizadores químicos las enzimas ofrecen ventajas tales como: alta
selectividad de productos deseados, menor número de reacciones secundarias, menor
temperatura de operación, menor reproceso y etapas de purificación, mayor facilidad de
separación de productos, menor contaminación, entre otras (Nielsen et al., 2008).

Las reacciones de transesterificación por vía enzimática son llevadas a cabo a temperaturas entre
20 y 60 C y pueden emplearse diferentes tipos de alcoholes (i.e. Metanol, Etanol, Isopropanol, n-
butanol, etc). El tipo de materias primas usadas pueden ser aceites de origen vegetal y animal
refinados y de descarte.

El uso de lipasas para la transesterificación presenta una ventaja muy importante frente a la
catálisis química que es la capacidad de conversión de acilgliceroles (AG) y ácidos grasos libres
(FFA´s) a alquil ésteres (FAME´s o FAEE´s) prácticamente en su totalidad y en un solo paso. Así, no
solo se evita la formación de jabón por saponificación, sino que permite la transformación de los
FFA’s a sus respectivos esteres alquílicos, y con ello aprovechar materias primas de bajo valor
comercial o de descartes con alto contenido de FFA´s (Lopresto et al., 2015). Otras ventajas de la
catálisis enzimática es la mayor facilidad de separación del glicerol y los ésteres de ácidos grasos,
menor coste energético por ser procesos a bajas temperaturas y el no requerir tratamiento de
aguas de proceso, resultando en un proceso más ecológico (Nielsen et al., 2008).

Las principales limitaciones de la catálisis enzimática en procesos industriales son el alto coste de
las enzimas y altos tiempos de reacción requeridos. Además, se ha observado que el alcohol tiene
un impacto negativo en la estabilidad de las lipasas y aun más con el aumento de la temperatura.
Usando metanol a una temperatura encima de 30 C la enzima sufre desactivación mientras que
en etanol y propanol se han observado mejores resultados (Nielsen et al., 2008). El metanol ha
sido el alcohol más usado como reactivo para producción de biodiesel por ser más barato y
promover velocidades de reacción más elevadas. Se ha estudiado que el uso de metanol en
proporciones 3:1 aumenta la producción de FAME´s pero disminuye a concentraciones de
metanol más elevadas, ya que al exceder los límites de solubilidad la lipasa se desactiva por el
metanol insoluble que está presente en el aceite en forma de gotas, ello debido a que las
proteínas generalmente son inestables en metanol. (Al-Zuhair et al., 2007). El metanol presenta
también desventajas para su manejo, es peligroso a la salud y el medio ambiente y es difícil

28
producir de materias primas renovables ya que se obtiene a partir del petróleo (Mata et al.,
2012).

Por otro lado, el uso de etanol reduce la desactivación de las lipasas, aunque el coste de etanol es
más elevado que el metanol. El etanol puede ser obtenido a partir de fuentes renovables (i.e.
materiales lignocelulósicos o caña de azúcar) por lo que ofrece una ventaja ecológica y no
representa un peligro para la salud y el medio ambiente. En contra, tiene menor reactividad como
agente para transesterificación comparado con el metanol pero es mejor en cuanto a la necesidad
de emplear materiales anhidros y aceites de bajo valor de acidez, además minimiza los problemas
de formación de emulsiones (Mata et al., 2012).

En el caso de la temperatura de proceso se ha correlacionado esta variable la velocidad de

reacción e influye en gran medida. Con la elevación de temperatura se incrementan las
velocidades de reacción ya que se favorece la transferencia de masa de especies, sin embargo al
continuar aumentando la temperatura se llega al punto de desnaturalización de la enzima. Esto se
ha observado en todos los estudios con temperatura en lipasas y se ha encontrado que la
temperatura óptima de operación es de 40 C (Al-Zuhair et al., 2007).

Debido a las ventajas del uso de enzimas y a los inconvenientes que se encuentran en la catálisis
química, alcalina o ácida, actualmente existe mayor interés en usar procesos de producción de
biodiesel enzimático, con retos importantes en la mejora de las tecnologías de proceso,
optimización y reutilización de las enzimas.

El uso de enzimas inmovilizadas presenta ventajas adicionales frente a las enzimas libres (en
solución) ya que permiten una más fácil recuperación de un lote de enzima por simple filtración.
El uso de columnas empacadas con enzimas inmovilizadas permite la configuración de procesos
en continuo, presentan también más estabilidad y hace su manejo más fácil comparado con las
enzimas libres (Nielsen et al., 2008).

Algunos ejemplos de enzimas soportadas que se encuentran comercialmente son:

 Lipozyme® IM, compuesta por la lipasa triacilglicerol hidrolasa (E.C. 3.1.1.3) inmovilizada
por adsorción sobre un resina de intercambio aniónico macro porosa (Novo Nordisk A/S).
Procede de una cepa de Mucor miehei, aunque en su manufactura se ha usado tecnología
de DNA recombinante, transfiriendo el gen que codifica la lipasa de Mucor miehei a
Aspergillus oryzae. Es útil para catalizar inter esterificaciones que implican las posiciones 1
y 3 de la glicerina.

29
  Novozym® 435 compuesta por lipasas inmovilizada en un soporte hidrófobo de resina
acrílica. La lipasa es no específica, originada a partir de la levadura Cándida Antártica B y
se conoce como CALB. De acuerdo a información del fabricante la enzima es estable en un
amplio rango de pH especialmente en la zona alcalina. La enzima también muestra un alto
grado de especificidad de sustrato, tanto en regio- como enantio-selectividad. Ref:
(“Novozyme 435_Biocatalysis-Product-Sheet-Immobilised-Lipases-2.pdf,”)

Existen además otras enzimas comerciales como: Rhizomucor miehei lipase (RM) inmovilizada en
resina de intercambio iónico y Thermomyces lanuginosa lipase (TL) immobilizada en sílica gel (Al-
Zuhair, 2005), entre otras.

Algunas de las ventajas del uso de enzimas soportadas como Novozym® 435, la cual sido probada
en este proyecto se mencionan a continuación:

 Reducción de materia prima de entrada

 Menor equipo, labor y costes energéticos
 Moderados y selectivos sustratos multifuncionales
 Activos en sustancias líquidas y en la presencia de co-solventes orgánicos
 Tiene buen desempeño en condiciones anhidras y con sustratos sensibles a la humedad
 Funcionan en un amplio rango de temperatura (20-110°C)
 Adecuadas para reactores por lotes de tanque agitado como reactores de lecho fijo
 Pueden ser recicladas entre 5-10 veces sin pérdida de actividad, dependiendo de las
condiciones de reacción
 Son usadas a gran escala a nivel industrial
 No existen residuos de proteínas en los productos finales
 Reduce el desperdicio de productos y la generación de aguas residuales

A continuación se muestra una tabla que recoge los datos de rendimiento de FAME´s obtenidos a
partir de distintos aceites y/o grasas por transesterificación con diferentes lipasas y alcoholes:

30
 Tabla 7. Transesterificación de grasas vía enzimática con diferentes alcoholes.
Fuente: Szczęsna Antczak et al., 2009

Rendimiento
Alcohol Grasa Lipasa Sistema Tiempo (h)
(%)
Sebo Mucor miehei IM60 Sin solvente 5 19.4
Hexano 5 73.8
Hexano 8 94.8
Aceite de girasol Pseudomonas Sin Solvente 24 3
fluorescens Éter de Petróleo 24 79
Metanol
Aceite de Algodón Candida antárctica Sin solvente 7 91.5
(Novozym-435)
Ter-butanol 10 90
Aceite de Soja Pseudomonas Sin Solvente 48 93.8
Aceite de Palma Cepacia Sin solvente 8 15
Sebo Mucor Miehei IM60 Sin Solvente 5 65.5
Hexano 5 98
Sin Solvente 5 83
Aceite de Girasol Pseudomonas Sin Solvente 24 82
Etanol
Fluorescens

Aceite de Palma Pseudomonas Sin Solvente 8 72

Aceite de coco Cepacia 8 35
Sebo Candida Antárctica Sin Solvente 16 90.3
SP435
Hexano 16 51.7
Isopropanol
Aceite de Palma Pseudomonas Sin Solvente 8 24
Cepacia
Aceite de Coco 8 16
Sebo Mucor Miehei IM60 Sin Solvente 5 97.4
Hexano 5 98.5
Isobutanol Aceite de Palma Pseudomonas Sin Solvente 8 42
Cepacia
Aceite de coco 8 40
Sebo Candida Antárctica Sin Solvente 16 96.4
2-Butanol SP435 Hexano 16 83.8
Aceite de Palma Pseudomonas Sin Solvente 8 42
1-Butanol Cepacia
Aceite de coco 8 40

31
 1.6.1. Tipos de procesos enzimáticos de biodiesel

Los procesos de biodiesel enzimático en discontinuo operan mediante la adición de todos los
componentes desde el inicio y es el típico proceso empleado en laboratorio por su simple
configuración. Estos procesos son útiles para la recolección de datos para el proceso por ejemplo,
productividad de la enzima. Las desventajas de esta configuración son el gran volumen de tanque
requeridos y los largos tiempos de reacción y la pérdida gradual de la actividad de la enzima,
cuando esto sucede, el tiempo de reacción aumenta para mantener una conversión constante de
producto hasta el punto en que resulta no rentable, teniendo que reemplazar el lote de enzima.
Económicamente será viable operar una planta con un 20% de actividad de enzima mínimo para
llegar a los niveles de productividad necesaria (Nielsen et al., 2008).

Un proceso en continuo ideal consta de las operaciones unitarias mostradas en la Figura 7 y

consta del reactor, etapa de separación mediante centrifugado o decantación, etapa de filtrado
para recuperación de enzima y etapa de separación alcohol/glicerina para recirculación de
metanol y obtención de glicerina purificada. Los procesos más avanzados incluyen purificación
posterior del biodiesel por ejemplo por destilación para la obtención de la máxima calidad
posible.

Figura 7. Diagrama de proceso ideal para producción continua enzimática de

biodiesel. A) Reactor, B) Separación (centrífuga, decantador), c) Filtro o
membrana. Fuente: Fjerbaek et al., 2009

Otros diseños de proceso incluyen tanques agitados y/o columnas empacadas. El primero incluye
una configuración de tanques en serie, que proporciona flexibilidad al proceso posibilitando el
cambio y re uso de enzimas que van perdiendo actividad, lo cual permite tener una capacidad de
producción constante. En esta configuración se pueden también incluir etapas de separación
entre tanques para retirar el glicerol formado. El uso de columnas empacadas con enzimas

32
inmovilizadas que pueden ayudar a mejorar la eficiencia promoviendo un tiempo de residencia y
contacto entre reactivos líquidos y el catalizador. Las ventajas de esta configuración son: la
posibilidad de agregar el alcohol por pasos a la alimentación de cada columna (y con ello resolver
el problema de desactivación de la enzima por exceso de alcohol) y también facilita la separación
de glicerol entre columnas (Nielsen et al., 2008).

Figura 8. Configuración de proceso enzimático en columnas de lecho

empacado. Fuente: Fjerbaek et al., 2009

Como ejemplos de procesos de producción enzimática a escala comercial a nivel mundial se

encuentra la planta de Blue Sun® ubicada en la refinería de St. Joseph, Missouri, EUA la cual
produce 113 millones de litros de biodiesel al año (30 millones de galones) de muy alta calidad y
ha sido optimizada mediante que un sistema de destilación de última generación operando a su
capacidad completa, por lo que es considerada como la planta de producción de biodiesel
enzimático más avanzada del mundo (“Biodiesel 2.0 the next chapter for America’s favorite
advanced biofuel”).

1.7. Biodiesel de Aceite de Pescado

Los alquil ésteres de aceite de pescado (Fish Oil Mehyl o Ethyl Esters, FOME´s o FOEE´s) presentan
mejor fluidez del producto comparados con los ésteres de aceites vegetales, debido al contenido

33
de ácidos grasos altamente insaturados (Highly Unsaturated Fatty Acids, HUFA). A diferencia del
aceite de pescado, los aceites de palma y grasas animales tienen alto contenido en ácidos grasos
saturados que reducen fluidez del biodiesel por su mayor punto de fusión pudiendo ocasionar
problemas en climas fríos. (Knothe, 2010) Sin embargo, el nivel de oxidación del biodiesel de
pescado puede ser afectado con el contenido de HUFA´s. lo cual también debe ser tenido en
cuenta.

Por otro lado, las cadenas de carbono del aceite de pescado normalmente son más largas que la
de los aceites vegetales que están compuestos principalmente de ácido palmítico, ácido oléico,
ácido linoléico y ácido linolénico. Debido a esto, el biodiesel obtenido de aceite de pescado
presenta un incremento en el número de Cetano mejorando el desempeño de la máquina y la
reducción de emisiones contaminantes (Lin and Li, 2009b).

Las características y propiedades del biodiesel derivado de pescado ha sido comparado con
biodiesel comercial de aceite de fritura y diesel ASTM No. 2D. A continuación se muestra una
tabla con los datos comparativos:

Tabla 8. Propiedades de biodiesel de aceite de pescado, biodiesel de aceite de

fritura y diesel ASTM No. 2D. Fuente: Lin and Li, 2009b

Tipo de combustible

Propiedad fisicoquímica del Biodiesel de Biodiesel

aceite de comercial de Diesel ASTM
combustible
pescado aceite de No. 2D
marino fritura

Número ácido (mg KOH/g) 1.17 0.69 -

Gravedad específica 0.86 0.87 0.83
Viscosidad cinemática (cSt) a
40 C 7.2 4.2 3.4
Índice de Cetano 50.9 48.1 53.2
Punto de inflamación (C) 103 141 74
Residuo de carbono (%wt) 0.76 0.26 1.57
Poder calorífico (MJ/kg) 41.37 40.11 46.16
Oxígeno elemental (% wt) 7.19 9.63 0

Los mayores índices de viscosidad cinemática en el biodiesel de pescado, comparados con el

diesel ASTM 2D, podrían disminuir la eficiencia en la inyección y atomización en la cámara de
combustión del motor pero la lubricidad puede mejorar y por lo tanto la protección de las partes
móviles del motor (Lin and Li, 2009b). El biodiesel de aceite de pescado no es neutro en emisiones

34
netas de carbono tal como lo es el biodiesel de aceites vegetales, sin embargo sigue teniendo
claramente ventajas comparado con el petrodiesel (Reyes and Sepúlveda, 2006).

Para comparar con otros estudios se encuentra en la literatura la producción de biodiesel con
diversos tipos de aceite de pescado. Se tiene por ejemplo los siguientes artículos: Carpa (Fadhil et
al., 2015), salmón (El-Mashad et al., 2008), caballa (Wu et al., 2014), especies varias (Lin and Li,
2009c), tilapia (Martins et al., 2015), sardina (Mata et al., 2014), arenque americano (Hong et al.,
2013), y otros (Costa et al., 2013; De et al., 2015; Fadhil and Ali, 2013; P.J. García-Moreno et al.,
2014; Shenbaga et al., 2015).

La mayoría de estos trabajos obtiene biodiesel a partir de la vía química. Por ejemplo, a partir de
aceite de carpa (Fadhil et al., 2015), el máximo rendimiento de ésteres fue en torno al 98.55 %
usando 0.60% KOH w/w como catalizador, relación molar metanol-aceite de 5:1, temperatura de
50 C y 30 minutos de reacción. Sin embargo, a pesar de utilizar un mayor tiempo y cantidad de
catalizador, un estudio con aceite de sardina (Mata et al., 2014) producido a 60 C, a una relación
molar de metanol aceite de 6:1, a un tiempo de 2 horas solo dio lugar un porcentaje del ésteres
de 89.5%, mientras que en el estudio de optimización de biodiesel de aceite de pescado de
García-Moreno et al., 2014, las condiciones óptimas encontradas fueron: relación molar metanol-
aceite, 9:1 y temperatura de 40C dando como resultado un contenido de FAME de 95.39%.

En otros estudios se han usado proporciones más altas de metanol, por ejemploe en la
transesterificación alcalina de aceite de arenque americano (Hong et al., 2013). Ésta se llevo a
cabo 55 C y relación molar metanol-aceite de 12:1 , contenido de catalizador de 2.0%, el
contenido de FAME obtenido fue de 97.2%.

En otro estudio con aceite de salmón (El-Mashad et al., 2008) se realizó la transesterificación en
dos pasos (catálisis ácida y alcalina) a una temperatura de 52C dando un porcentaje de ésteres
del 99% con una relación molar de metanol de 9.2% y 0.5% w/w de KOH.

Existen otros estudios llevados a cabo a distintas condiciones como el de Shenbaga et al., 2015, el
cual realiza la transesterificación de aceite de sardinilla asistida con energía ultrasónica. Dichos
experimentos fueron llevados a cabo a una temperatura de 65 C y distintas condiciones, siendo
las óptimas las siguientes: relación molar metanol-aceite 9.92:1, concentración de catalizador
1.55% w/w de aceite y tiempo de reacción 32.37 minutos para un contenido de FAME de 99.20%.

35
 1.8. Aceite de Pescado

El aceite de pescado ha visto incrementado su consumo debido a la mayor consciencia de sus

beneficios a la salud y alimenticios por el alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA´s)
omega-3 (>20 % w/w) entre ellos los ácidos grasos C-20:5n-3 y C22:6n-3 (Ácido
Eicosapentaeónico, EPA y Acido Docosahexaeónico, DHA). Sin embargo el aceite de pescado de
baja calidad con bajo contenido en estos ácidos grasos y que no es útil para alimentación puede
ser empleado para la producción de biodiesel (Pedro J. García-Moreno et al., 2014).

A manera de introducción, se presenta información sobre la producción mundial de aceite de

pescado y tendencias en precios. La producción pesquera ha ido en aumento en los recientes
años y en las últimas cinco décadas de una forma constante. El suministro de pescado comestible
se ha incrementado en una tasa media anual de 3.2% que es mayor a la tasa de crecimiento de la
población mundial de 1.6% (www.fao.org/3/a-i3720s). La producción total mundial de pescado en
2013 incluyendo pesca y acuicultura fue de 162 millones de toneladas. (www.fao.org/3/a-i4899e)

Además del uso alimenticio para consumo directo que tiene el pescado, también hay la
producción de aceite de pescado y harina de pescado.

Tabla 9. Producción y utilización de la pesca y la acuicultura en el mundo.

(Fuente: www.fao.org)

Las especies marinas de pescado de carne roja tienen mayor contenido lipídico que las variedades
de carne blanca. Adicionalmente el hígado es el que contiene la mayor cantidad de aceite. El
pescado marino como el bacalao, atún, salmón, caballa, arenque, sardina son ricos en PUFA´s. Los

36
procesos de manufactura y purificación de aceite de pescado se muestran en las siguientes
figuras.

Figura 9. Diagrama de flujo de proceso de producción de aceite de pescado

Figura 10. Diagrama de flujo proceso de purificación de aceite de pescado.

Para entender el proceso de producción de aceite de pescado se debe tener en cuenta que la
materia prima está compuesta por tres fracciones principales: sólidos (materia seca libre de grasa)
aceite y agua. Finalmente el aceite puede contener también impurezas como compuestos salinos
y restos de carne (Lin and Li, 2009a) por lo que debe llevarse a tratamientos previos de
acondicionamiento y limpieza para después ser usado en la transesterificación a biodiesel.

37
Existen otros métodos de proceso para la obtención de aceite de pescado como la hidrólisis y
autólisis enzimáticas, cocción, extracción con solventes o procesos químicos (alcalinos o ácidos)
(lipidlibrary.aocs.org). Las principales especies de pescado para la producción de aceite se recogen
en la tabla 10.

Tabla 10. Principales especies de pescado usadas para producción de Aceite

de pescado. Fuente: lipidlibrary.aocs.org

Especie País
Anchoa Perú, Chile, Sudáfrica, Namibia, México, Marruecos
Caballa Perú, Chile, China, Vanuatú
Capelán Noruega, Islandia, Federación Rusa
Arenque americano (menhaden) Estados Unidos: Atlántico y Golfo de México
Bacaladilla (blue whiting) Noruega, Reino Unido, Federación Rusa, Irlanda
Lanzón Dinamarca, Noruega, Islas Faroe
Faneca noruega Dinamarca, Noruega, Islas Faroe
Espadín Dinamarca, Federación Rusa

1.8.1. Mercado mundial aceite de pescado

El mercado de aceite de pescado mundial que estuvo alrededor de los $US 1.1 mil millones en
2011 (unos €1.0 mil millones), se espera que llegue a los $US 1.7 mil millones en 2018 (€1.56 mil
millones) (“Global Fish Oil Market - Industry Analysis, Size, Share, Growth, Trends and Forecast,”).
En 2011, el mercado global de aceite de pescado vendió aproximadamente 1,035,000 toneladas
de aceite y se espera que las ventas aumenten a 1,130,000 toneladas para 2018.

Recientemente, hechos climáticos como “El Niño” constituyen un problema disminuyendo la

producción en países como Perú y Chile que son los mayores exportadores mundiales de aceite y
harina de pescado proveniente de la anchoa. Esto puede afectar directamente elevando el precio
global del aceite de pescado. La evolución de los precios del aceite y la harina de pescado se
puede ver en las siguientes figuras:

38
 Figura 11. Precios en $ US por tonelada de harina de pescado y aceite de
pescado. Fuente: (Tacon and Metian, 2008)

Los índices históricos y estimados de precios de aceite de pescado y otros alimentos al año 2022
se puede observar en la Figura 12.

Figura 12. Índices de precios años 1990 a 2022 de granos, harina de pescado y
aceite de pescado. Fuente: FAO, Reporte HLPE No. 7, 2014

1.8.2. Aceite de pescado de descarte

El uso de aceites de pescado provenientes de materiales de descarte puede proveer una fuente
abundante, barata y estable para producción de biodiesel y que puede ayudar a países marítimos
a elevar sus ingresos y reducir emisiones contaminantes. Mediante este proyecto se busca
encontrar datos para la producción de biodiesel con estas materias primas, elaborar análisis del
biodiesel de aceite de pescado y con ello aportar información de laboratorio que pueda servir de
base para posterior investigación.

39
Como consecuencia directa de la industria de la pesca se producen considerables cantidades de
desechos de pescado como son vísceras, aletas, cabezas, etc. las cuales son clasificadas de la
siguiente forma: descartes, desperdicios a bordo de embarcaciones y, desperdicios y
subproductos en tierra (Pérez-Gálvez et al., 2009). Los descartes de pescado son generados
principalmente por la captura no intencionada de especies y que no son el objeto de la pesca, son
de valor económico bajo y se utilizan para preparaciones de alimentos para ganado o acuicultura.
El producto de interés se retiene para su proceso o venta mientras que los otros se tiran de nuevo
al mar por tener bajo valor económico o por requerimientos legales (Blanco et al., 2007).

Con el propósito de vigilar y conservar las reservas de pescado mundiales la actividades pesquera,
la generación de estadísticas se ha realizado desde los años 1960 a través de la división de
Recursos Pesqueros de la FAO (FAO, 2015). Existen también instrumentos internacionales que
destacan la necesidad de reducir o minimizar descartes, entre ellos se incluyen resoluciones de la
ONU como la Declaración de Kioto de la FAO o el Código Europeo de Sostenibilidad y
Responsabilidad de las prácticas pesqueras. La Comisión Europea ha aceptado las guías y ha
introducido la prohibición del descarte marino y se deben adoptar soluciones técnicas para el uso
de estas materias para consumo humano, reducción a harina de pescado o producción de aceite
de pescado. (Pérez-Gálvez et al., 2009). Un uso que se puede dar a los descartes es la producción
aceite de pescado, lo cual puede constituir una materia prima económica para la producción de
biodiesel en los países productores de aceite de pescado.

Las cantidades de descarte de pescado por compañías pesqueras varían de ser casi despreciable
en compañías de pequeña escala, por ejemplo en pesqueras de arenque atlántico, hasta un 70-90
por ciento en algunas compañías de pesca de redes de arrastre de fondo. (“FAO HLPE-Report3
Sustainable fisheries and aquaculture 2014”).En 2005 se estimó que la cantidad de desperdicio de
pescado fue de 7.3 millones de toneladas/año que representaron un 8% de la pesca total global
(Pérez-Gálvez et al., 2009). Recientemente, la Comisión Europea ha establecido la obligación de
llevar a tierra todos los descartes generados (European Commission, 2014), por lo que se hace
necesario su aprovechamiento, por ejemplo, en la producción de biodiesel.

40
 1.9. Objetivos

Debido a la necesidad de encontrar materias primas más económicas a las convencionales para la
producción de biodiesel se ha considerado el aceite de pescado como una opción viable debido a
las cantidades potencialmente disponibles y también a las necesidades regulatorias para
aprovechar eficientemente la generación de descartes de la industria del pescado en países
productores. Debido a ello, el uso de esta materia prima puede contribuir a la reducción de costes
de la producción de biodiesel.

El uso de aceite de pescado directamente como combustible es técnicamente posible pero resulta
inadecuado en el largo plazo, ya que su alta viscosidad causa problemas al motor con el uso
continuo. Su transformación a biodiesel es una alternativa técnica para resolver este problema.
Un aspecto importante del biodiesel de pescado es que, al poseer un alto contenido de ácidos
grasos poliinsaturados (PUFA´s), aumenta la susceptibilidad a la oxidación. Además, el contenido
de ácidos grasos libres puede derivar en un alto valor ácido, por lo cual mediante el proceso
químico, se ve reducido el rendimiento y complica los procesos de separación y purificación. Una
alternativa actualmente probada e implementada industrialmente para resolver este problema es
el uso de procesos enzimáticos el cual tiene mejores rendimientos sin importar la cantidad de
ácidos grasos libres presentes en el aceite. Por ello, este tipo de proceso resulta ventajoso para
convertir el aceite de pescado de descarte a biodiesel.

En la literatura existe poca información sobre procesos enzimáticos para producción de biodiesel
de aceite de pescado de descarte. Por ello el objeto de este estudio es de proveer información
que pueda servir de base para proporcionar datos de laboratorio que puedan aportar en
posteriores trabajos de investigación en este tema.

Los objetivos principales de este proyecto de investigación son:

 Determinar las condiciones de reacción óptimas de estudio que son: Cantidad de

enzima y tiempo de reacción.
 Investigar los efectos que estas variables tienen en la cantidad obtenida en porcentaje
de FAEE´s en la reacción de transesterificación.
 Determinar el perfil lipídico de ácidos grasos del biodiesel.

41
42
2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Materiales

2.1.1. Aceite de pescado

Para este proyecto se ha utilizado aceite de pescado de salmón suministrado por Industrias
Afines, S.L. (Pontevedra, España). Este aceite ha sido almacenado por largo tiempo a -80 C y fue
utilizado en proyectos de investigación anteriores (Pedro J. García-Moreno et al., 2014). El aceite
se ha usado para la reacción de transesterificación y obtención de biodiesel. Las propiedades de
este aceite son olor característico, color marrón anaranjado. La caracterización del aceite se
realizó mediante cromatografía en capa fina y cromatografía de gases (ver apartados 2.3.1. y
2.3.3.). Los análisis muestran el perfil de ácidos grasos del aceite los cuales se muestran en la
Tabla 11.

Tabla 11. Composición de ácidos grasos del aceite de pescado usado en las
pruebas

Ácido Graso % masa

C14:0(mirístico) 3.14
C16:0 (palmítico) 12.34
C16:1n-7 (palmitoléico) 3.93
C16:2n-4 (hexadecadienóico) 0.41
C16:3n-4 (hexadecatrienóico) 0.42
C18:0 (esteárico) 3.11
C18:1n-9 (oléico) 39.67
C18:2n-6 (linoléico) 11.64
C18:3n-3 (linoléico-ALA) 3.47
C18:4n-3 (estearidónico SDA) 0.95
C20:1n-9 (eicosaenóico) 4.52
C20:3n-6 (dihomo-gama-linolénico) - DGLA) 0.84
C20:4n-3 (eicosatetraeónico - ETA) 0.58
C20:4n-6 (arquidónico - AA) 0.34
C20:5n-3 (eicosapentaeónico - EPA) 3.03
C22:1n-9 (erúcico) 3.90
C22:5n-3 (docosapentaeónico - DPA) 1.69
C22:6n-3 (docosahexaeónico - DHA) 4.68
Otros 1.34
Total 100.00

43
El contenido de de PUFA´s en el aceite de pescado para producción de biodiesel debe ser bajo, de
lo contrario el aceite debería ser destinado para otros usos, tales como consumo humano.
Además, un alto número de instauraciones darían lugar a una baja estabilidad oxidativa,
haciéndolo poco recomendable para su uso como biodiesel. El aceite usado en este proyecto
tiene un bajo contenido de EPA y DHA (< 8%) ya que se trata de un desecho industrial, en
consecuencia es apto para la producción de biodiesel.

Tabla 12. Composición de grupos de ácidos grasos en el aceite de

pescado

Grupos de Ácidos
% peso
Grasos

Saturados 18.59

Mono insaturados 52.02

Poli insaturados 28.05

n-6 12.82

 n-3 14.40

EPA + DHA 7.71

La Tabla 13 muestra el contenido de especies de glicéridos presentes en el aceite de pescado

utilizado en este proyecto.

Tabla 13. Contenido de glicéridos en el aceite de pescado

Grupo de Glicéridos % molar

MAG -

FFA 13.73

DAG 3.57

TAG 82.70

44
 2.1.2. Enzima

La enzima utilizada para las pruebas es la Novozyme ® 435. Sus características técnicas se recogen
en el apartado Producción de biodiesel por vía enzimática. El fabricante de la enzima es
Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dinamarca y algunas de sus características técnicas se indican en la
Tabla 14:

Tabla 14. Especificaciones Novozym 435®

Temperatura Especificidad de
Nombre del Producto Actividad * pH Óptimo
Óptima sustratos

Novozym® 435 10000 PLU/g 5-9 30-60°C Ésteres y alcoholes

*PLU = Unidad de propil laureato. 1 PLU es la cantidad de actividad de enzima

la cual genera 1 mol de propil laureato por minuto bajo condiciones
estándar.

Como precauciones se debe evitar el contacto o la inhalación de la enzima. En caso de contacto

con la piel se debe lavar la piel con abundante agua y jabón. En caso de contacto con los ojos se
debe lavar con abundante agua por al menos 15 minutos. Debe ser almacenada en refrigeración
entre 2 – 8 C.

2.1.3. Etanol

Se usó etanol seco (anhidro) marca Fluka® para la reacción de transesterificación con aceite de
pescado para la producción de biodiesel.

El etanol es un líquido incoloro, volátil, con un olor característico y sabor picante. Sus vapores son
más pesados que el aire. Se utiliza industrialmente para la obtención de acetaldehído, vinagre,
butadieno, cloruro de etilo y nitrocelulosa, entre otros. Es muy utilizado como disolvente en
síntesis química. También se utiliza en mezclas anticongelantes, como combustible, como materia
prima en síntesis y en la preservación de especímenes fisiológicos y patológicos. (“Hoja de
Seguridad Etanol,”)

 Punto de ebullición: 78.3 C

 Temperatura de ignición: 363 C
 Densidad: 0.7893 a 20 C

45
  Solubilidad: Miscible con agua en todas proporciones, éter, metanol, cloroformo y
acetona.
 Peso molecular 46.07 g/mol

2.1.4. Metanol

Se uso metanol de pureza 99.5% marca PanReac Applichem® en la preparación de la fase móvil en
la cámara de elución en el análisis por cromatografía en capa fina (TLC) y posterior análisis en el
cromatógrafo de gases (CG). Se usa también para la reacción de metilación de muestras.

Es un líquido incoloro, venenoso, con olor a etanol y cuando está puro puede tener un olor
repulsivo. Arde con flama no luminosa (“Hoja de seguridad metanol”).

 Punto de ebullición: 64.7 C

 Temperatura de ignición: 470 C
 Densidad: 0.7915 a 20 C
 Peso molecular: 32.04 g/mol

2.1.5. Cloroformo

Se usó cloroformo marca Scharlau® en la preparación de la fase móvil en la cámara de elución en

el análisis por cromatografía en capa fina (TLC) y posterior análisis en el cromatógrafo de gases
(CG).

El cloroformo es un líquido incoloro con olor dulce característico y muy volátil. Generalmente
contiene pequeños porcentajes (1-5 %) de etanol como estabilizador. Es ligeramente soluble en
agua y con densidad mayor que ésta. Es no inflamable, pero los productos de su oxidación, como
el fosgeno, son muy peligrosos. Es peligroso por inhalación e ingestión. El uso de este producto
debe hacerse en un área bien ventilada, evitando respirar los vapores y el contacto con la piel.
(“Hoja de Seguridad Cloroformo”)

 Densidad: 1.484 a 20 C
 Punto de ebullición: 61.26 C (760 mm de Hg)
 Temperatura de auto ignición: mayor de 1000 C
 Solubilidad: miscible con etanol, benceno, éter dietílico, éter de petróleo,
tetracloruro de carbono, disulfuro de carbono y acetona.
 Peso molecular: 119.38 g/mol

46
 2.1.6. Acetona

Se usó acetona grado técnico marca VMR Chemicals ® para la preparación de la fase móvil en la
cámara de elución del la cromatografía en capa fina (TLC) y posterior análisis en cromatografía de
gases (CG). También se utilizó acetona para lavado de material de laboratorio. Es un líquido
incoloro de olor característico. El vapor es más denso que el aire y puede extenderse a ras del
suelo y existe posible ignición en punto distante, (“Hoja de Seguridad Acetona”).

 Punto de ebullición: 56 °C
 Densidad: 0.8 a 20 °C
 Solubilidad: Es miscible en benceno, dietil éter, metanol, cloroformo y etanol
 Temperatura de auto ignición: 465°C
 Peso molecular: 58.08 g/mol

2.1.7. Cloruro de Acetilo

Se usó cloruro de acetilo marca J.T. Baker® para la preparación de mezcla metilante para el
proceso de metilación de las muestras de aceite de pescado y biodiesel para su análisis en el
cromatógrafo de gases. Es un líquido incoloro, humeante, de olor característico. Reacciona
violentamente con agua, alcoholes, ácidos, bases, sulfóxido de dimetilo, ciertos metales en forma
de polvo y muchos otros compuestos, originando peligro de incendio y explosión.

Durante el uso de Cloruro de Acetilo se debe tener mucha precaución cuando se mezcla con
metanol mezclando muy lentamente ya que produce una reacción exotérmica y un burbujeo
explosivo. (“Hoja de Seguridad Cloruro de Acetilo”)

 Punto de ebullición: 51C

 Densidad : 1.11 a 20 C
 Solubilidad en agua: Reacciona.
 Temperatura de auto ignición: 390 °C
 Peso molecular: 78.5 g/mol

47
 2.1.8. Hexano

Hexano con pureza >99% marca J.T. Baker® fue usado en distintos procesos en el laboratorio
como análisis por cromatografía de gases y separación de enzima del producto por filtración y
vacío durante el paro de la reacción de transesterificación.

El hexano es un líquido incoloro con un olor parecido al del petróleo. Es menos denso que el agua
e insoluble en ella, sus vapores son más densos que el aire. Se obtiene del petróleo por
destilación de fracciones de las que se obtienen gasolinas o a través de reformados catalíticos, por
medio de los que se obtienen compuestos aromáticos. Se utiliza ampliamente como solvente en
laboratorio y para síntesis química.

Es un compuesto altamente inflamable, cuyos vapores pueden viajar a una fuente de ignición y
regresar con fuego al lugar que los originó, pueden explotar en un área cerrada y generar mezclas
explosivas con aire. Debe trabajarse en campana de extracción y evitar respirar los vapores (“Hoja
de Seguridad Hexano”).

 Punto de ebullición: 69 C
 Densidad: 0.66 a 20 C
 Temperatura de auto ignición: 223 C
 Peso molecular: 86.18 g/mol

2.1.9. Metil Heptadecanoato

Se usó de metil heptadecanoato de la marca Sigma Aldrich® como patrón analítico para la
determinación del contenido de ésteres etílicos en las muestras de biodiesel de pescado
mediante cromatografía de gases El heptadecanoato de metilo es un sólido en polvo blanco. No
es una sustancia clasificada como peligrosa. Es irritante para la piel y ojos. (“Hoja de Seguridad C-
17 Me”)

 No. CAS: 1731-92-6

 Fórmula: C18H36O2
 Peso molecular: 284.48 g/mol

48
 2.1.10. Ácido Nonadecanóico

El ácido nonadecanóico fue usado como patrón analítico para la determinación de esteres etílicos
en las muestras de biodiesel de pescado y aceite de pescado mediante cromatografía de gases. Es
un sólido en forma de escamas, color blanco con punto de fusión de 68-70 C. puede provocar
irritación cutánea, ocular y de vías respiratorias (“Hoja de Seguridad C-19”).

 No. CAS : 646-30-0

 Fórmula : C19H38O2
 Peso molecular : 298,50 g/mol

2.1.11. Detergente alcalino

Se utilizó un detergente alcalino DERQUIM LA 15 marca PanReac Applichem® para el lavado del
equipo de laboratorio que haya estado contacto con aceite y/o biodiesel durante todos los
experimentos. Se prepara una solución al 2% con agua caliente, se introduce el material en la
solución, se enjuaga con agua y acetona y se mete a cámara de secado a 100 C por 1 hora.

Precauciones: Debe tenerse mucho cuidado en su manejo utilizando guantes ya que provoca
quemaduras en la piel y lesiones oculares graves.

 Densidad: 1.425
 Almacenamiento: Temperatura ambiente
 pH sol 2%: 12-13

2.1.12. Precauciones y Seguridad

Se debe utilizar equipo de protección personal en todo momento durante los experimentos
incluyendo: bata de laboratorio, guantes, gafas, mascarilla de polvos, para prevenir el contacto en
piel y ojos y exposición con los reactivos.

 Utilizar siempre la campana de extracción para evitar respirar vapores, si no es

posible trabajar en la campana se debe asegurar que el lugar se encuentre bien
ventilado.
 No tener cerca fuentes de calor suficientes que puedan generar ignición.
 Mantener el área de trabajo siempre limpia y ordenada a fin de minimizar riesgos de
accidentes.

49
  Cuando se trabaja en cromatografía de capa fina, deberá usarse siempre mascarilla
contra polvos que son generados durante el raspado de la sílica gel de las placas.

2.2. Métodos

2.2.1. Reacción de transesterificación enzimática

2.2.1.1. Fundamentos del proceso

La transesterificación se conoce también como alcohólisis es el reemplazo de alcohol de un éster

por otro. La transesterificación de triglicéridos es una reacción reversible donde se forman
compuestos intermedios que son diglicéridos y monoglicéridos. El mecanismo se puede ver en las
siguientes ecuaciones:

Triglicérido + R1OH  Diglicérido + RCOOR1

Diglicérido + R1OH  Monoglicérido + RCOOR1

Monoglicérido + R1OH  Glicerol + RCOOR1

Debido a que se ha usado etanol en exceso el equilibrio de las reacciones se promueve a la

derecha, es decir a la formación de ésteres.

2.2.1.2. Materiales

1. Matraces de reacción Erlenmeyer (50 mL) color marrón con tapones y sello
2. Balanza analítica
3. Incubadora a 35 C con agitación
4. Matraz Kitasato de 250 ml
5. Embudo de separación con filtro polimérico para lavado de enzima
6. Bomba de vacío
7. Matraz aforado de 25 ml
8. Frascos topacio

Las reacciones de transesterificación enzimática del aceite de pescado fueron llevadas a cabo en
una sola etapa donde se han pesado y colocado los reactivos y enzima de acuerdo a las
cantidades calculadas. La cantidad de aceite usada fue de 0.750 g con una cantidad en exceso de
alcohol de 3 g (3.802 ml) por lo que la relación Etanol-Aceite fue de 4:1 en masa y 70:1 en mol, en

50
base a las condiciones propuestas por Shimada et al., 2002 y Esteban et al., 2009, en su estudio de
la regioespecificidad de la lipasa.

Las variables de estudio fueron:

a) Cantidad de enzima: utilizándose tres distintas cantidades que fueron: 0.375 g

(50% w/w respecto al aceite), 0.1875 g (25% w/w) y 0.09375 g (12.5% w/w)
b) Tiempo: reacciones a 1, 2, 4 y 8 horas.

Las cantidades teóricas de los reactivos para las reacciones y la relación molar de alcohol:aceite se
muestran en la Tabla 15:

Tabla 15. Cantidades y relaciones de reactivos

Enzima (50% Enzima (25% Enzima (12.5%

Reactivo
w/w) w/w) w/w)

Aceite (g) 0.750 0.750 0.750

Enzima (g) 0.375 0.188 0.094

Etanol (g) 3.000 3.000 3.000

Relación molar Etanol:Aceite 70:1 70:1 70:1

La concentración de aceite en etanol se calcula de la siguiente forma, considerando que la

densidad relativa del etanol es: 0.7893, por lo tanto 3g de EtOH = 3.802 ml

2.2.1.3. Procedimiento

Las reacciones de transesterificación se llevaron a cabo de acuerdo a las cantidades señaladas en

la Tabla 15 a tiempos de: 1, 2, 4 y 8 horas. El aceite de pescado fue obtenido de un recipiente de
10 litros almacenado en congelación a -80 C, del cual, primeramente descongelado, se separó
una cantidad de 25 ml en un frasco topacio de color marrón identificado para almacenamiento a -
18 C y uso en todas las pruebas.

El alcohol fue tomado de un envase de 5L utilizándose cantidades pequeñas trasvasadas a

recipientes menores para su manejo seguro y fácil. La enzima se encuentra almacenada en

51
refrigeración en un recipiente de plástico de 1L del fabricante, la cual se llevaba al laboratorio
para pesado llevándose de vuelta al frigorífico inmediatamente.

Las cantidades de reactivos fueron pesadas en balanza analítica Metler Toledo® de cuatro
decimales. Para el pesado de la enzima se prepararon e identificaron recipientes de papel
aluminio que facilitan colocar la enzima con la espátula metálica sin tirarla durante su
manipulación al momento de añadir la enzima al matraz de reacción.

La secuencia de pesado se llevó de la siguiente manera. En el pesado del aceite se colocó el

matraz de reacción en la balanza tarando a cero. Se agregó el aceite al matraz usando pipetas
desechables de plástico de 3 ml para dosificación. Seguido de esto se añadió el etanol, tarando
primero a cero el peso del matraz y dosificando con pipeta hasta obtener el peso deseado. Por
último se agregó la enzima previamente pesada en los recipientes de aluminio.

Para asegurar una atmósfera inerte en el matraz de reacción se introduce nitrógeno y se cierra
con el tapón roscado, verificando siempre que tenga el empaque de plástico para un cierre
hermético y evitar pérdidas por evaporación. Posteriormente, se lleva el matraz de reacción a la
incubadora marca Heidolph Inkubator 1000® que mediante su módulo de calentamiento gradual,
ha sido previamente llevada a una temperatura de 35 C (308.15 K) y donde se ha fijado el
accesorio (bandeja) para recipientes para sujetar los matraces de reacción durante la agitación.

Figura 13. Incubadora usada para reacciones de transesterificación

Una vez colocados los matraces en la incubadora se inicia la agitación a 300 rpm para mejorar la
transferencia de masa y en ese momento inicia el tiempo de reacción.

52
Entre cada preparación de reacciones, se dejó un espacio de 15 minutos con el fin de no solapar
tiempo de finalización y con ello tener tiempo suficiente para el proceso de paro de reacción.
Dicho proceso de paro se debe realizar inmediatamente una vez transcurrido el tiempo de
reacción y se realizaba mediante el siguiente procedimiento:

1. Se debe apagar la agitación de la incubadora y el calentamiento.

2. Los matraces se retiran de la incubadora y se llevan a la campana de extracción donde se
realiza la separación y lavado de la enzima con hexano y filtración al vacío. Durante el
proceso de filtrado del producto, se debe enjuagar la enzima el número de veces
necesario hasta conseguir que la enzima quede de color blanco, el color del producto es
amarillo en diversas tonalidades lo cual facilita observar la diferencia entre la enzima
con producto y lavada.
3. El producto filtrado (biodiesel + hexano) se lleva a un matraz aforado de 25 ml con la
ayuda de un embudo de vidrio para su trasvase del matraz Kitasato y se añade el
volumen de hexano necesario hasta el aforo.
4. La disolución obtenida es agitada y se observa a contra luz viéndose que tiene un color
ligeramente amarillo (de color menos intenso comparado con el producto sin diluir). En
este paso se observó la presencia de pequeñas partículas en algunas reacciones
suponiendo ser impurezas sólidas que traía el aceite de pescado ya que no tuvo ningún
tratamiento previo de filtrado o limpieza.
5. El producto se trasvasa a frascos tipo topacio color marrón, etiquetados con los
siguientes datos: Biodiesel Pescado, cantidad de enzima, tiempo de reacción, solvente,
fecha, nombre de la persona que realizó la prueba.

Cuando se tiene el producto lavado y en solución con hexano, se separan muestras en viales de
cromatografía de 2 ml para el análisis en CG por inyección directa (ID) (ver el apartado
Determinación de % FAEE´s por método de Inyección Directa (ID)). Finalmente el producto se
almacena en el frigorífico a -18 C para posteriores pruebas y análisis. Los pesos y las cantidades
exactas de todas las reacciones llevadas a cabo se recogen en la Tabla 16:

53
 Tabla 16. Cantidades de reactivos de todas las reacciones

No. Reacción ID Tiempo, h Aceite, mg Alcohol, g Enzima, mg

1 1.0E, 1hA 1 755.3 3.0033 376.4

2 1.0E, 2hA 2 764.4 3.0000 375.8

3 1.0E, 4hA 4 749.1 3.0150 375.4

4 1.0E, 8hA 8 753.3 3.0145 375.6

5 0.5E, 1hA 1 758.5 3.0090 189.2

6 0.5E, 2hA 2 750.0 3.0079 187.9

7 0.5E, 4hA 4 754.7 3.0100 188.0

8 0.5E, 8hA 8 752.2 3.0060 187.8

9 0.25E, 1hA 1 752.9 3.0100 93.7

10 0.25E, 2hA 2 752.4 3.0213 93.0

11 0.25E, 4hA 4 756.3 3.0080 93.9

12 0.25E, 8hA 8 756.6 3.0015 93.7

2.2.1.4. Limpieza de material

Una vez que se ha hecho uso del equipo se procede a su lavado y limpieza. El material de vidrio se
sumerge en una solución diluida de Derquim® en agua caliente donde se deja por un tiempo para
después ser enjuagado con agua y acetona. Una vez escurrido el material se mete al equipo de
secado a temperatura de 100 C por una hora mínimo para asegurar el secado completo.

2.3. Métodos Analíticos

Existen varias técnicas para el análisis del producto de biodiesel, las principales son la
cromatografía de gases y la espectroscopía. El producto contiene no solamente alquil ésteres
(FAEE´s) sino también productos intermedios como glicéridos MAG y DAG y trazas de materiales
iniciales como TAG y Etanol sin reaccionar, catalizador, glicerina sin separar y FFA´s, los cuales
deben ser cuantificados para control de calidad. Existen otras propiedades que deben analizarse
del biodiesel como viscosidad cinemática, estabilidad oxidativa, etc., las cuales están fuera del
alcance de este estudio.

54
Las especificaciones de calidad están establecidas en la norma europea EN 14214 establece el
contenido mínimo de ésteres en el biodiesel y la americana ASTM D6751 que establece los límites
de impurezas en el biodiesel así como los métodos oficiales de análisis.

2.3.1. Cromatografía de gases (GC)

2.3.1.1. Fundamentos del método

Debido a su alta precisión, la cromatografía de gases es el método más utilizado para biodiesel y
es utilizado por el método oficial (UNE 14103:2003). La CG permite identificar y cuantificar ésteres
de ácidos grasos de modo que ha sido usada en este trabajo para determinar el contenido de
FAEE´s presentes en el biodiesel así como, tras unas reacción previa de separación y metilación,
los mono-, di-, y triglicéridos y ácidos grasos libres. El método consiste en inyectar una muestra
para análisis en un extremo de una columna capilar y evaporarla a través de una fase estacionaria
por donde fluye una fase móvil gaseosa inerte que separa térmicamente los compuestos volátiles
estables de la muestra bajo un gradiente controlado de temperatura. Los esteres etílicos de los
diferentes ácidos grasos de la muestra presentan un tiempo de retención específico en la columna
debido a su peso molecular, punto de ebullición (volatilidad) y polaridad. Esto hace que cuando
lleguen al detector de ionización puedan ser identificados según su tiempo de retención, y
cuantificados en función del área de pico, todo esto mediante el cromatograma generado por el
software (James N. BeMiller, et. al.). A continuación se muestra en orden de elución de los
diferentes ácidos grasos presentes en el aceite de pescado y biodiesel.

55
 Tabla 17. Orden de elución de ácidos grasos en CG

Ácido Orden de
Graso elución

C14:0 1

C16:0 2

C16:1n-7 3

C16:2n-4 4

C16:3n-4 5

C16:4n-1 6

C18:0 7

C18:1n-9 8

C18:1n-7 9

C18:2n-6 10

C18:2n-4 11

C18:3n-4 12

C18:3n-3 13

C18:4n-3 14

C20:1n-9 15

C20:4n-6 16

C20:4n-3 17

C20:5n-3 18

C22:1n-9 19

A continuación de muestran los cromatogramas con los tiempos de retención que fueron
obtenidos a partir de un patrón comercial de mezcla de esteres metílicos (Matreya LLC). Se puede
observar como el estándar comer de esteres metílicos (FAME) presenta la misma forma que el de

56
esteres etílicos (FAEE), simplemente adelantando en tiempo, de modo que sirvió para identificar y
cuantificar los esteres etílicos presentes en el biodiesel.

Figura 14. Cromatograma de patrones para FAME (azul) Y FAEE (rojo)

En este proyecto se ha utilizado la CG como método analítico para la caracterización y

determinación de:

a) Contenido total de FAEE´s en biodiesel

b) Contenido de especies MAG, FFA, DAG y TAG en el aceite de pescado

El equipo que se utilizó fue el cromatógrafo de gases del Departamento de Ingeniería Química
marca Agilent 7890®, conectado a una columna capilar de 0.25 mm X 30 m con película de sílice
fundida Omegawax de 0.25 m de espesor (Supelco, Bellefonte, PA) y con detector de ionización
en llama. Como fase móvil gaseosa el equipo utiliza nitrógeno a un caudal total en la columna de
44 mLmin-1.

2.3.1.2. Equipo

 Cromatógrafo de gases Agilent 7890®

 Detector de ionización de llama (Flame ionization detector, FID).
 Columna capilar de 0.25 mm X 30 m con película de sílice fundida Omegawax de 0.25
m de espesor
 Viales para cromatografía
 Micropipeta automática con precisión de 0.5 L
 Agitador mecánico

57
 2.3.1.3. Procedimiento del cromatógrafo de gases

La secuencia de operación del equipo de cromatografía se describe a continuación

1. Encendido de equipo
2. En el ordenador, ejecutar el software Agilent Chemstation® en modo “online” e
iniciar el método PESCADO.100. El método contiene una serie de pasos y parámetros
que ponen en marcha el equipo y lo prepara para la secuencia de análisis fijada en la
tabla. Dentro de los parámetros se encuentran la temperatura y presión de
operación. El programa de temperatura del horno es el siguiente: 150 C por 3 min,
de 150 C a 185C a 10 C/min, 185 C por 10 min, de 185 C a 240 C a 10 C/min y
finalmente 240 C durante 12 min.
3. Preparación de la tabla de secuencia. El software del equipo requiere definir la
secuencia de inyección viales a analizar indicando: número de vial, nombre, posición
y el número de inyecciones por vial que se quiera realizar.
4. Antes de ejecutar la secuencia se debe verificar que los viales con solventes de
lavado (hexano y cloroformo) sean llenados a sus niveles correctos.
5. Una vez definida la tabla y revisado los niveles se colocan los viales con las muestras
y se ejecuta la secuencia.
6. Terminada la secuencia el equipo debe ser puesto en modo “mantenimiento” y
dejarlo preparado para la siguiente secuencia.

El tiempo aproximado de análisis por muestra es de unos 25 minutos. Una vez terminada la
secuencia se recogen los resultados para realizar la integración numérica de los cromatogramas
con el software Agilent Chemstation® ejecutándolo en modo “offline”. Para la integración es
importante definir en el software parámetros como: área mínima de rechazo, ancho de pico,
entre otros.

Ejemplo de cálculo de masas por cromatografía de gases

Las áreas de los picos se pueden obtener mediante la integración de los cromatogramas, como el
mostrado a continuación:

58
 Figura 15. Cromatograma de análisis MAG por TLC para reacción de 1 hora
con 25% de enzima

De la Figura 15 se obtienen, mediante integración numérica en el ordenador con el software

Agilent Chemstation®, las áreas de los picos de cada ácido graso detectado y con la ecuación 2 se
calcula la masa del ácido graso. Conociendo el total de las masas se calcula la fracción másica de
cada componente.

Ecuación 1

Los cálculos de las masas de cada ácido graso se exponen en la tabla 18.

Tabla 18. Cálculo de masa de ácidos grasos

Datos cromatógrama M Datos finales

Ác graso Área abs TR, min Ác. Graso Área Masa ac. Graso,
% masa
mg
C14:0 4.83331299 C14:0 4.833 0.008 2.71
C16:0 11.6086235 C16:0 11.609 0.019 6.51
C16:1n-7 8.39335728 C16:1n-7 8.393 0.014 4.71
C16:2n-4 0 C16:2n-4 0.000 0.000 0.00
C16:3n-4 0 C16:3n-4 0.000 0.000 0.00
C16:4n-1 0 C16:4n-1 0.000 0.000 0.00
C17:0 0 C17:0 0.000 0.000 0.00
C18:0 0 C18:0 0.000 0.000 0.00
C18:1n-7 0 C18:1n-7 0.000 0.000 0.00
C18:1n-9 71.2313919 C18:1n-9 71.231 0.114 39.82
C18:2n-6 26.0131207 C18:2n-6 26.013 0.042 14.59
C18:3n-3 11.7735968 C18:3n-3 11.774 0.019 6.60
C18:4n-3 4.39273882 C18:4n-3 4.393 0.007 2.46
C19:0 77.6190796 C19:0 77.619 0.125 43.52
C20:1n-9 5.88940096 C20:1n-9 5.889 0.009 3.30
C20:3n-6 0 C20:3n-6 0.000 0.000 0.00
C20:4n-3 0 C20:4n-3 0.000 0.000 0.00
C20:4n-6 0 C20:4n-6 0.000 0.000 0.00
C20:5n-3 4.07516527 C20:5n-3 4.075 0.007 2.48
C22:1n-9 0 C22:1n-9 0.000 0.000 0.00
C22:5n-3 0 C22:5n-3 0.000 0.000 0.00
C22:6n-3 15.629549 C22:6n-3 15.630 0.038 13.14
Otros 6.55720377 Otros 6.557 0.011 3.68

59
Los cálculos mostrados en la tabla 18 son un ejemplo y se realizan de la misma forma para los
distintos análisis (TLC y CGD).

2.3.2. Determinación de % FAEE´s por método de Inyección Directa (ID)

El método de inyección directa en CG es una aproximación del método oficial establecido en la

norma europea EN 14103 con algunas modificaciones con el cual se puede determinar el
contenido de FAEE´s. El biodiesel se encuentra en solución con hexano conteniendo trazas de
acilgliceroles (MAG, FFA, DAG, TAG), etanol sin reaccionar y glicerina (subproducto). Mediante
inyección directa de la mezcla de reacción, el cromatógrafo detectará únicamente los FAEE´s.

Una vez obtenidos los cromatogramas se recogen los datos de integración que proporcionan las
áreas de los picos del cromatograma para determinar el contenido de FAEE´s (%) mediante la
siguiente ecuación:

Ecuación 2

Donde:

C = Contenido de etil ésteres de ácidos grasos (%)

ΣA = Área total de los picos

AEI = Área del pico correspondiente al patrón (metil heptadecanoato o ácido nonadecanóico)

CEI = Concentración de solución del patrón en hexano (mgmL-1)

VEI = Volumen de solución de patrón (mL)

m = masa de la muestra de biodiesel (mg)

El análisis cuantitativo requiere el uso de un patrón de referencia, para ello su utilizó metil
heptadecanoato (C17-Me), siendo adecuado ya que su tiempo de retención en el cromatógrafo es
distinto al de los esteres etílicos, evitando así el solapamiento con los picos en el cromatograma.
Se comprobó el comportamiento del C17-Me respecto su correspondiente éster etílico (etil

60
heptadecanoato, C17-Et) mediante el cálculo del factor de respuesta (ver en la Figura 16. Gráfico
Factor de Respuesta C17-Et). Dado que el factor de respuesta (pendiente) es prácticamente igual
a uno, se decidió utilizar el patrón metilado como patrón de cuantificación de los ésteres etílicos
presentes en el biodiesel.

3.00
Masa C17-Et/Masa C17-Me

2.50
2.00
1.50
1.00
y = 1.0219x + 0.0077
0.50 R² = 0.9997
0.00
0.00 1.00 2.00 3.00
Área C17-Et/Área C17-Me

Figura 16. Gráfico Factor de Respuesta C17-Et

2.3.2.1. Materiales

 Viales de cromatografía
 Micropipeta automática de 1000 L
 Tubos de ensayo

2.3.2.2. Procedimiento

Se preparan viales de cromatografía con 900 L de producto (biodiesel) que se encuentra a una
concentración de 30 mgmL-1 y 100 L de solución de patrón metil heptadecanoato (C-17-Me) en
hexano a una concentración 25 mgmL-1, de modo que se obtiene una muestra con un volumen
total de 1 mL a concentraciones de 27 mgmL-1 de biodiesel y 2.5 mgmL-1 de patrón.

Los viales se llevan al cromatógrafo de gases para su análisis de acuerdo al procedimiento descrito
en el apartado 2.3.1.

61
 2.3.3. Cromatografía en capa fina (TLC)

La cromatografía en capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC) es un método de análisis que
permite evaluar el contenido de ácidos grasos de las especies de glicéridos (MAG, FF, DAG y
TAG+EE) tanto en el biodiesel como en el aceite de pescado.

La TLC consta de una capa delgada de una fase estacionaria o absorbente (aprox. 250 m de
espesor) fijada sobre un soporte inerte en configuración plana (placa de vidrio). La placa se
introduce en una cámara de desarrollo o elución cerrada donde el solvente o fase móvil migra de
forma ascendente por acción capilar y los componentes de la mezcla son separados en base a su
polaridad. Posteriormente cada fracción se revela usando yodo, y tras el raspado de forma
independiente (ver Figura 17), se puede realizar la evaluación cuantitativa de las especies por
cromatografía de gases una vez que han sido metiladas (ver apartado 2.3.3.3 Reacción de
Metilación). La fase móvil para elución está compuesta por Cloroformo (95%) - Acetona (4.5%) -
Metanol (0.5%), la fase estacionaria es sílica gel soportada en una placa de vidrio de 20 cm X 20
cm. Los materiales y procedimiento utilizados se muestran a continuación.

Figura 17. Placa de TLC revelada con yodo

2.3.3.1. Materiales

 Placa para de vidrio con sílica gel

 Horno de secado
 Material para trazo y corte de líneas en placa (lápiz, regleta, formón de raspado)

62
 Cámara de elución
 Tubos de ensaye con tapones y sello identificados
 Micropipeta automática de 10 L
 Yodo y gas nitrógeno para revelado
 Mascarilla contra polvos. Se deberá tener precaución en todo momento de no respirar
polvo de sílica gel.

2.3.3.2. Procedimiento

1. Se prepara la placa de sílica gel para dibujo y corte. Sacándola de la cámara de secado justo
en el momento de usarla teniendo cuidado de nunca dejarla expuesta a contaminación. Se
dibujan seis columnas para muestras y se identifican en la parte superior escribiendo con
lápiz el nombre de la muestra.
2. Se prepara cámara de revelado con fase móvil. Volumen = 100 ml, Concentraciones:
Cloroformo 95%, Acetona 4.5%, Metanol 0.5%.
3. Se prepara un espacio para trabajar en la siembra de muestra dentro de la campana de
extracción.
4. La cantidad de muestra a sembrar en placa debe ser de 2 a 5 mg para estas cantidades se
requieren 90 L de biodiesel (C = 30 mgml-1) y 30 L para el aceite (C= 100 mgml-1) para
obtener estas cantidades se coge la micropipeta de 10 L y se hacen nueve inyecciones en
la línea de sembrado para el biodiesel y tres inyecciones de para el aceite.
5. Terminada la siembra se coloca la placa en la cámara de elución, teniendo cuidado que la
fase móvil no rebase la línea de siembra.
6. Mientras la elución de la placa se lleva a cabo, se preparan los tubos de ensayo
debidamente identificados.
7. Al término de la elución (1 hora aproximadamente) se saca la placa de la cámara de elución
y se realiza el proceso de revelado con yodo. Para ello se utiliza una micropipeta desechable
con perlas de yodo soportadas en una microfibra y se conecta a la toma de nitrógeno,
haciendo fluir el gas moderadamente a través de la pipeta.
8. Se apunta la pipeta con yodo a la placa para el revelado una columna a la vez, comenzando
por la línea de siembra y de forma ascendente. Al notar el cambio de color del área a
amarillo se debe delinear la figura que describe buscando los límites de posición de las
especies separadas (MAG, FFA, DAG, TAG+EE)
9. Una vez dibujada la posición de cada especie se prepara la placa para separar cada sección
de sílica gel del vidrio por raspado.

63
 10. Se coloca el polvo de sílica gel raspada de cada sección en tubos de ensayo
11. Se agrega 1 ml de hexano a todos los tubos con sílica gel.

Los tubos de ensayo se preparan para el proceso de metilación (ver apartado Reacción de
Metilación) y posterior análisis en CG.

2.3.4. Cromatografía de Gases Directa (CGD)

El procedimiento de CGD se usa como método para determinar el contenido de ácidos grasos
metilados agrupados por especies (MAG, FFA, DAG y TAG). Este método es empleado para la
corroboración de los resultados obtenidos por TLC donde se cuantifican las mismas especies por
separado.

2.3.4.1. Materiales

 Todas las muestras de biodiesel y aceite de pescado

 Tubos de ensayo
 Termoblock para tubos de ensayo

2.3.4.2. Procedimiento

Se colocan en tubos de ensayo muestras de 50 L de producto biodiesel y 950 L de hexano. Para

el aceite las cantidades son: 10 L de muestra y 990 L de hexano. Las muestras se llevan a
proceso de metilación (apartado 2.3.3.3 Reacción de metilación). Una vez realizado el proceso de
metilación se llevan las muestras al cromatógrafo de gases.

2.3.5. Reacción de Metilación

La metilación es un proceso de transesterificación directa que convierte los ácidos grasos de los
glicéridos a ésteres metílicos utilizando una solución de mezcla metilante: cloruro de
acetilo/metanol 1:20, llevando la reacción a 90 C por una hora. El objetivo de la metilación es
trasformar las diferentes especies (TAG, DAG, MAG y FFA) en sus correspondientes ésteres
metílicos para poder ser detectados en el cromatógrafo y por tanto cuantificar los ácidos grasos
agrupados por especies (MAG, FFA, DAG, TAG). El proceso de metilación es necesario para
analizar el aceite de pescado y el biodiesel por TLC y CGD. Para este proyecto se ha utilizado una
modificación del método descrito por Lepage and Roy, (1986).

64
 2.3.5.1. Materiales

 Tubos de ensayo con tapón y sello para todas las muestras identificados
 Termostato en block para tubos de ensayo a 90 C
 Agitador mecánico de tubos de ensayo
 Centrifugadora

2.3.5.2. Procedimiento

1. Se agregan en tubos de ensayo las muestras para análisis de acuerdo a las siguientes
cantidades:

TLC

I. Muestras: cantidad de sílice obtenido por tubo + 1 ml de hexano

II. Patrón = 50 L de patrón de C-19 en hexano, Concentración = 25 mg/ml
III. Mezcla metilante = 2 ml, solución de cloruro de acetilo:metanol (1:20)

CGD

I. Volumen de muestra aceite = 1 ml, Concentración =1 mg/ml

Patrón = 1 ml, Concentración = 0.125 mg/ml
II. Volumen de muestra biodiesel = 1 ml, Concentración = 1.5 mg/ml
Patrón = 1 ml, Concentración = 0.125 mg/ml
III. Mezcla metilante (para ambos) = 1 ml, solución de cloruro de acetilo:metanol
(1:20)
2. Se colocan los tubos en el termoblock precalentado a 90 C por una hora agitando cada
15 minutos con agitador mecánico marca Heidolph®.
3. Al término de la reacción de metilación se enfrían los tubos con agua corriente.
4. Se agregar a cada tubo 1 ml de agua destilada.
5. Para la TLC los tubos deberán someterse a centrifugado en equipo Sigma Laboratory
Centriuge® con los siguientes parámetros:
 RPM = 3500
 Tiempo = 4 min
 Programa/Rotor = 11150/13350
6. En los tubos de ensayo (TLC y CGD) se forma una fase orgánica (sobrenadante) que
contiene hexano y el producto metilado y una fase acuosa compuesta por agua, etanol,

65
 glicerina y de restos de metilación. Se recoge el sobrenadante con micro pipeta de vidrio
y se coloca en un vial para cromatografía debidamente identificado.
7. Se llevan las muestras a análisis en el cromatógrafo de gases

2.4. Diseño experimental

Con el objetivo de determinar la cantidad de enzima y el tiempo que optimiza el porcentaje de

FAEE´s en el biodiesel, se llevó a cabo un diseño factorial con 12 experimentos. Las variables se
han pasado a forma logarítmica para su ajuste lineal. La tabla con el plan de experimentos se
muestra a continuación:

Tabla 19. Diseño experimental

% E (w/w) log E Tiempo, h log t

12.50 3.64385619 1 0
12.50 3.64385619 2 1
12.50 3.64385619 4 2
12.50 3.64385619 8 3
25.00 4.64385619 1 0
25.00 4.64385619 2 1
25.00 4.64385619 4 2
25.00 4.64385619 8 3
50.00 5.64385619 1 0
50.00 5.64385619 2 1
50.00 5.64385619 4 2
50.00 5.64385619 8 3

El ajuste experimental se elaboró con el software Statgraphics Centurion XVI, usando un modelo
cuadrático que permite predecir el valor de la variable de salida (y) a partir de las variables de
estudio (enzima y tiempo) según la ecuación 4:

+ + 

Ecuación 3

Donde:

y: Variable de salida (según sea: % de FAEE´s, % MAG, % FFA, % DAG, % TAG_EE )

66
 0, 1, 2, 3, 4 y 5: Coeficientes de regresión

E: Cantidad de enzima

t: Tiempo

Una vez determinados los coeficientes de la ecuación, se pueden predecir valores de porcentaje
de conversión de ésteres etílicos para cualquier cantidad de enzima y tiempo dentro de los
intervalos estudiados. Para la evaluación estadística de cada parámetro se ha utilizado el análisis
de varianza (ANOVA), fijando como valor de confianza 95%, esto quiere decir que el análisis es
significativo si p-valor < 0.05.

El análisis ANOVA divide la variabilidad del contenido de especies (ya sean EE, MAG, FFA, DAG y
TAG_EE) de cada efectos y permite conocer la significancia estadística de cada efecto. En este
caso, se eligió un nivel de confianza del 95%, de modo que los efectos son significativos si tienen
una valor-P menor que 0.05.

Como parámetros de validez del modelo también se usó el estadístico R-Cuadrada, que indica qué
porcentaje total de la variabilidad en cada contenido de especies es capaz de explicar el modelo
generado, así como el estadístico R-cuadrada ajustado, que es más adecuado para comparar
modelos con diferente número de variables independientes.

Se comprobó la independencia de los valores. Mediante el estadístico de Durbin-Watson (DW),

que prueba los residuos para determinar si hay alguna correlación significativa basada en el orden
en que se presentan los datos en el archivo.

Por último para visualizar mejor los resultados obtenidos se dibujaron las gráficas de contorno de
la superficie de respuesta generada por el modelo, así que la gráfica de valores predichos frente a
valores observados.

Los objetivos de la optimización de la superficie de respuesta son:

- Maximizar %EE y TAG_EE

- Minimizar %MAG, %FFA y %DAG.

67
68
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Contenido de FAEE´s en biodiesel

El cálculo del contenido de FAEE´s se realizó mediante el procedimiento descrito en el apartado

2.3.2. En la tabla siguiente se podrán observar los resultados de los valores de contenido de: EE´s
(% w/w) para cada contenido de enzima (%) y tiempo (h).

Tabla 20. Porcentaje de ésteres etílicos en el biodiesel

Exp. % Enzima (w/w) Tiempo, h % EE (w/w)

12.50 0 0.00
1 1 27.68
2 2 43.94
3 4 58.24
4 8 72.48
25.00 0 0.00
5 1 47.64
6 2 61.39
7 4 76.64
8 8 80.01
50.00 0 0.00
9 1 65.99
10 2 69.67
11 4 80.34
12 8 86.91

En la tabla anterior se puede observar que la conversión a ésteres etílicos máxima alcanzada fue
de 86.91% con una cantidad de enzima de 50% (w/w) a 8 horas de reacción (Exp. 12). Los mayores
porcentajes de FAEE´s fueron obtenidos en los experimentos 8, 11 y 12 con concentración de
esteres etílicos del 80.01%, 80.34% y 86.91% respectivamente.

Los trabajos encontrados en bibliografía requieren tiempos largos de reacción para obtener
conversiones superiores al 80%. La mayoría de ellos usan concentraciones estequiométricas de
sustratos; por ejemplo (Szczęsna Antczak et al., 2009) obtiene para relación molar metanol:aceite
vegetal 3:1 (en hexano), un grado de conversión del 72% en 24 horas, todo ello catalizado por la
lipasa inmovilizada P. fluorescens. En las mismas condiciones, reacciones catalizadas con lipasas
Rhizopus miehei, T. Lanuginosa y P. cepacia estuvieron cerca del 80% en 48 horas.

En otro proceso de un solo paso de 4 horas, 40 C y sin disolvente, catalizado con lipasa T.
lanuginosa dio resultados del 75%, 92% y 80% en FAEE’s para relaciones molares alcohol:TAG´s de

69
3:1, 4:1 y 5:1 respectivamente. Sin embargo, a estas condiciones se presenta desactivación de la
enzima, haciendo necesario un proceso de dos y tres pasos con un tiempo de reacción total de 48
horas para llegar a valores de 95% y hasta 54 ciclos (108 días) de uso de enzima (Shimada et al.,
2002). En nuestro caso, la relación molar etanol:aceite implementada en los experimentos fue en
exceso (70:1) dar lugar a una conversión alta en relativamente corto tiempo: 86.91% en 8 horas
para 50% w/w de lipasa. Aunque no se ha comprado la desactivación de la enzima, otro trabajo de
etanolisis de aceite pescado sugiere que esta enzima se mantiene estable al menos durante 300 h
para modo discontinuo (Esteban et al., 2009).

En la Figura 18 se muestran gráficamente los resultados de conversión a EE a distintos tiempos y

cantidad de enzima.

100

75
EE, %

50
E = 50.0 %
25 E = 25.0 %
E = 12.5 %
0
0 2 4 6 8
Tiempo, h

Figura 18. Porcentaje de conversión a EE a diferentes cantidades de enzima y

tiempos de reacción.

En la Figura 18 se observa que para todas las concentraciones de enzima estudiadas el porcentaje
de ésteres etílicos formados aumenta con el tiempo. Además, como es lógico, para un mismo
tiempo, al aumentar la cantidad de enzima también existe un aumento de porcentaje de ésteres
producidos. La conversión máxima alcanzada fue para el 50 % de enzima a las 8 horas, dando
lugar a un contenido de FAEE´s de 86.91%. Para ese mismo tiempo el resto de enzimas alcanzan
un contenido de FAEE´s de 72.48 % y 80.01% para 12.5 % y 25 % de enzima respectivamente. Se
observa también que dentro de la primera hora se tiene la mayor velocidad de reacción y a partir
de ahí la velocidad comienza a disminuir. Los resultados encontrados son similares a los obtenidos
por otros autores en la producción enzimática de biodiesel a partir de aceite de pescado usando la

70
enzima Carica papaya y metanol como agente transesterificante. Para una cantidad de enzima del
25%, el rendimiento en esteres metílicos alcanzado fue cercano al 70% tras más de 25 horas de
reacción. En nuestro caso esta concentración de EE en la mezcla final del 72.48% cuando se usa la
misma proporción de lipasa Cándida antartica, pero tras solamente 8 h de reacción.

3.2. Contenido de glicéridos en biodiesel

Como parte de la caracterización del biodiesel y del aceite de pescado, se realizó mediante TLC y
corroborado con CGD, el análisis del perfil de especies lipídicas (ácidos grasos) agrupadas en los
tipos de glicéridos que son: Monoacilgliceroles (MAG), Diacilgliceroles (DAG), Triacilgliceroles +
Ésteres etílicos (TAG + EE) y ácidos grados libres (FFA). Los métodos se describen en los apartados
Cromatografía en Capa Fina y CGD. Los resultados de estos análisis en el biodiesel se muestran en
la Tabla 21.

Tabla 21. Contenido de MAG (% w/w), FFA (% w/w), DAG (% w/w), EE+TAG (%
w/w) por TLC

% Enzima (w/w) Exp. % MAG (w/w) % FFA (w/w) % DAG (w/w) % EE+TAG (w/w)
12.50 0.00 10.95 2.42 86.62
1 6.64 1.88 18.38 73.10
2 10.14 2.01 16.54 71.31
3 18.52 0.39 13.77 67.32
4 19.38 0.50 3.58 76.54
25.00 0.00 10.95 2.42 86.62
5 11.90 0.50 22.27 65.34
6 19.12 0.34 10.48 70.06
7 16.22 0.30 1.90 81.59
8 11.29 0.30 1.11 87.30
50.00 0.00 10.95 2.42 86.62
9 22.41 0.39 0.39 73.75
10 20.24 0.49 0.49 77.52
11 12.99 0.41 0.41 83.89
12 4.36 0.47 0.47 94.70

En las figuras que se muestran a continuación se muestran gráficamente el contenido de

glicéridos en las muestras de biodiesel que fueron tomadas a todos los tiempos de reacción con
los distintos contenidos de enzima de los experimentos. En el caso de los TAG y EE estos se
encuentran juntos ya que en la cromatografía de capa fina (TLC) no existe separación de estas
especies (ver Figura 17).

71
 25

20

MAG, % 15

10 E = 50.0 %

5 E = 25.0 %
E = 12.5 %
0
0 2 4 6 8
Tiempo, h

Figura 19. Porcentaje de conversión a MAG a diferentes cantidades de enzima

y tiempos de reacción

En la figura 18. Se observa que la mayor concentración de MAG se da al tiempo de reacción de 1

hora a una concentración de enzima de 50%, a 2 horas con 25% de enzima y partir de estos
tiempos se observa la disminución de esta especie, lo cual indica que son convertidas a ésteres
etílicos (EE). Sin embargo, para 12.5% de enzima no se observa una disminución de MAG para
tiempos más largos, no resultando adecuada a priori para la producción de biodiesel, si bien sino
se debería analizar a tiempos mayores.

12

10 E = 50.0 %
E = 25.0 %
8
E = 12.5 %
FFA, %

0
0 2 4 6 8
Tiempo, h

Figura 20. Porcentaje de conversión a FFA a diferentes cantidades de enzima y

tiempos de reacción

72
En la Figura 20 se observa que el contenido de ácidos grasos libres disminuye casi por completo
desde la primera hora de reacción para un contenido de enzima de 50% y 25%, y en el caso de
12.5% de enzima, la disminución total se observa a partir de las 4 horas. Esto es debido a la
conversión directa de los ácidos grasos a ésteres etílicos mediante esterificación. Esta una de las
ventajas de los procesos enzimáticos frente a los químicos donde es necesario realizar un
tratamiento previo para eliminar los ácidos grasos y que estos no formen jabón por
saponificación, (Bonet-Ragel et al., 2015) por lo que se puede concluir que este proceso resulta
conveniente para la producción de biodiesel con este tipo de materias primas, si bien la cantidad
de enzima debe ser ajustada en función del contenido inicial de ácidos grasos libres y tiempo de
reacción.

25
E = 50.0 %
20
E = 25.0 %
15 E = 12.5 %
DAG, %

10

0
0 2 4 6 8
Tiempo, h

Figura 21. Porcentaje de conversión a DAG a diferentes cantidades de enzima

y tiempos de reacción

En la Figura 21 se observa que el porcentaje de diglicéridos aumenta durante la primera hora de

reacción para contenidos de enzima de 25% y 12.5%. Sin embargo, para 50% de enzima no se
observa un incremento en DAG debido a que esta especie es convertida a MAG muy rápidamente.
Esto se confirma si se observa la Figura 19 donde el máximo de MAG se obtiene durante la
primera hora de reacción.

73
 100

90

EE+TAG, % 80

70
E = 50.0 %

60 E = 25.0 %
E = 12.5 %
50
0 2 4 6 8
Tiempo, h

Figura 22. Porcentaje de conversión a TAG + EE a diferentes cantidades de

enzima y tiempos de reacción.

En la Figura 22 se observa que durante la primera hora hay una disminución de TAG ya que como
es lógico, estas especies son convertidas a DAG, MAG y EE secuencialmente. A partir de la primera
hora se observa un aumento de las especies para 25% y 50% de enzima, ya que a partir de ahí se
comienzan a generar EE. Sin embargo, para 12.5% de enzima se observa que sigue habiendo
disminución de TAG hasta las 4 horas de reacción y a partir de ahí se refleja el aumento en EE.
Estas curvas sirven de referencia únicamente ya que al estar juntas las especies EE y TAG no se
puede conocer contenido individual de cada una.

La máxima concentración de FAEE’s se obtiene para los tiempo de reacción de 8 horas y 50% de
enzima. Sin embargo, para la economía del proceso se podría considerar que es mejor usar 25%
de enzima y 4 horas, ya que bajo estas condiciones se obtiene casi la misma cantidad de DAG con
50% de enzima y prácticamente la misma cantidad de FFA. Para estas condiciones, la diferencia en
MAG solo es del (5%) y aunque la cantidad de EE que se obtiene es ligeramente menor EE
(76.64% frente a 80.34%), el ahorro de tiempo y enzima puede ser un factor a tener en cuenta.

3.2.1. Perfil de ácidos grasos en biodiesel

En las siguientes tablas se muestra el perfil de ácidos grasos de ésteres etílicos FAEE´s en el
biodiesel obtenidos a todos los tiempos de reacción y cantidades de enzimas:

74
 Tabla 22. Perfil lipídico de FAEE´s con 12.5% de Enzima

%masa
1h_12.5%E 2h_12.5%E 4h_12.5%E 8h_12.5%E
C14:0 3.94 3.84 3.63 3.45
C16:0 17.10 16.72 15.59 14.18
C16:1n-7 3.12 3.19 3.28 3.47
C16:2n-4 0.00 0.00 0.56 0.57
C18:0 4.73 4.61 4.27 3.74
C18:1n-7 4.76 4.58 4.11 3.55
C18:1n-9 31.09 32.66 33.94 35.35
C18:2n-6 10.86 11.07 11.40 12.12
Linolénico C18:3n-3 3.11 3.07 3.15 3.49
C18:4n-3 1.50 1.10 0.79 1.04
C20:1n-9 6.40 6.22 5.76 4.98
C20:3n-6 0.77 0.68 1.21 1.07
C20:4n-3 0.00 0.35 0.75 0.36
C20:4n-6 0.00 0.37 0.32 0.59
EPA C20:5n-3 6.84 6.15 5.37 4.85
C22:1n-9 0.00 0.00 0.00 0.00
C22:5n-3 1.19 0.57 1.04 1.27
DHA C22:6n-3 4.60 4.81 4.83 5.93

Tabla 23. Perfil lipídico de FAEE´s con 25% de Enzima

%masa
1h_25%E 2h_25%E 4h_25%E 8h_25%E
C14:0 3.81 3.57 3.41 3.34
C16:0 16.64 15.32 13.96 13.27
C16:1n-7 3.14 3.31 3.43 3.49
C16:2n-4 0.00 0.00 0.57 0.57
C18:0 4.57 4.19 3.71 3.41
C18:1n-7 4.56 4.07 3.50 3.22
C18:1n-9 32.19 33.93 35.04 35.45
C18:2n-6 10.90 11.44 12.05 12.39
Linolénico C18:3n-3 3.02 3.19 3.51 3.78
C18:4n-3 1.13 1.07 1.09 1.13
C20:1n-9 6.10 5.64 4.96 4.82
C20:3n-6 1.32 1.18 1.08 1.02
C20:4n-3 0.00 0.76 0.87 0.83
C20:4n-6 0.70 0.71 0.59 0.60
EPA C20:5n-3 6.07 5.27 5.02 4.87
C22:1n-9 0.00 0.00 0.00 0.00
C22:5n-3 1.16 1.17 1.29 1.30
DHA C22:6n-3 4.68 5.18 5.91 6.51

75
 Tabla 24. Perfil lipídico de FAEE´s con 50% de Enzima

%masa
1h_50%E 2h_50%E 4h_50%E 8h_50%E
C14:0 3.39 3.29 3.22 3.14
C16:0 14.61 13.47 12.70 12.31
C16:1n-7 3.17 3.30 3.41 3.45
C16:2n-4 0.55 0.56 0.55 0.54
C18:0 4.05 3.60 3.23 3.12
C18:1n-7 3.92 3.51 3.13 2.85
C18:1n-9 32.46 33.56 34.29 34.52
C18:2n-6 10.96 11.59 12.03 12.26
Linolénico C18:3n-3 3.08 3.41 3.68 3.91
C18:4n-3 1.07 1.10 1.09 1.13
C20:1n-9 5.50 5.01 4.55 4.51
C20:3n-6 1.19 1.09 0.95 0.93
C20:4n-3 0.78 0.86 0.80 0.81
C20:4n-6 0.00 0.62 0.46 0.58
EPA C20:5n-3 5.04 4.87 4.64 4.46
C22:1n-9 4.36 3.53 3.28 2.97
C22:5n-3 1.09 1.20 1.31 1.33
DHA C22:6n-3 4.78 5.44 6.69 7.17

En las tablas anteriores se puede apreciar que el perfil lipídico de ácidos grasos es igual para
todos los tiempos y cantidad de enzima. Así mimo el contenido de ácido linolénico no es superior
a 12% por lo que cumple el estándar para evitar la degradación por oxidación. Sin embargo el
porcentaje del resto de ácidos grasos poliinsaturados es bastante alto, por lo que en estos casos el
biodiesel debería ser usado para mezclas con biodiesels de otros aceites en distintas proporciones
con el fin de mejorar sus características y evitar la oxidación. (de Almeida et al., 2015).

76
 3.3. Optimización y análisis de la varianza

Contenido en esteres etílicos (%EE)

A continuación se despliega la ecuación de regresión que ajusta a los datos de % EE en función del
tiempo y la cantidad de enzima según el diseño factorial empleado.

Ecuación 4

La Tabla 25 recoge el Análisis de la Varianza (ANOVA) para el modelo anterior, donde se puede
comprobar los efectos significativos, aquello con un p-valor menor de 0.05.

Tabla 25. Resultados ANOVA para EE

Suma de Cuadrado
Fuente Gl Razón-F Valor-P
Cuadrados Medio

A:log2 E 1264.3 1 1264.3 200.45 0.0000*

B:log2 t 1864.73 1 1864.73 295.64 0.0000*
AA 28.4055 1 28.4055 4.50 0.0781
AB 141.639 1 141.639 22.46 0.0032*
BB 7.53668 1 7.53668 1.19 0.3163
Error total 37.8446 6 6.30743
Total (corr.) 3344.44 11

R-cuadrada = 98.8684 porciento

R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 97.9255 porciento
Estadístico Durbin-Watson = 3.1547 (P=0.8073)

En este caso, tanto la variable cantidad de enzima (A) como tiempo (B) y su interacción (AB)
presentan un efecto significativo sobre la % de EE.

En la Figura 23 se representan los valores predichos frente a los observados, concluyendo que
ambos coinciden y como ya indica el R-cuadrada del 98.8684%, el modelo es capaz de explicar
adecuadamente los datos experimentales.

77
 Figura 23. Datos observados vs predichos para el contenido de EE en %

Por tanto, el modelo es adecuado para optimizar la respuesta. Se obtiene así el gráfico de
contorno de la superficie de respuesta de acuerdo a la ecuación 3, donde se puede comprobar
que el máximo % de EE se obtiene para cantidades crecientes de tiempo y enzima.
Contornos de la Superficie de Respuesta Estimada

3 EE
26.0
2.5 36.0
46.0
2 56.0
log2 t

66.0
1.5
76.0
86.0
1
96.0

0.5

0
3.6 4 4.4 4.8 5.2 5.6 6
log2 E

Figura 24. Gráfico de contorno de % EE

La optimización realizada por el Software STATHGRAPHICS con el objetivo de maximizar % EE, da

los siguientes resultados:

Tabla 26. Valores de optimización de EE

Factor Óptimo
log2 E 5.64386
log2 t 3.0
Max %EE 86.01

78
Esta optimización sitúa al máximo en los límites superiores de la superficie de respuesta, como ya
se observaba en la gráfica de contorno y en los resultados mostrados anteriormente. Deshaciendo
el logaritmo base 2 de las variables obtenemos el máximo para 8 horas y 50% de enzima.

Contenido en monoglicéridos (MAG)

A continuación se despliega la ecuación de regresión que se ha ajustado a los datos. La ecuación

del modelo ajustado es:

Ecuación 5

En la Tabla 27 se muestran los resultados de análisis de varianza para MAG

Tabla 27. Resultados ANOVA para MAG

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

A:log2 E 3.53782 1 3.53782 0.91 0.3770
B:log2 t 6.35661 1 6.35661 1.63 0.2483
AA 0.236017 1 0.236017 0.06 0.8136
AB 291.6 1 291.6 74.98 0.0001*
BB 37.6302 1 37.6302 9.68 0.0208*
Error total 23.3333 6 3.88888
Total (corr.) 362.694 11

R-cuadrada = 93.5667 porciento

R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 88.2056 porciento
Estadístico Durbin-Watson = 2.95022 (P=0.6668)

Al contrario que para el % en EE, el tiempo y la cantidad de enzima no tiene un efecto significativo
aunque si lo tienen en gran medida sus interaccion AB y BB. En cualquier caso todos estos
términos son necesiarios para explicar el 93.5667 de los datos, tal como muestra R-cuadrada.

79
 Figura 25. . Datos observados vs predichos para el contenido de MAG %

De la Figura 25 se puede concluir que los valores predichos coinciden con los valores observados
para el contenido de MAG, siendo el modelo fiable para predecir valores y optimizar la respuesta.

Se obtiene el gráfico de contorno de la superficie de respuesta de acuerdo a la ecuación 4, donde

se puede comprobar que el mínimo % de MAG se obtiene para cantidades crecientes de tiempo y
enzima.

Figura 26. Gráfico de contorno de % MAG

La optimización realizada por el Software STATHGRAPHICS con el objetivo de minimizar % MAG,

sitúa al mínimo en los límites superiores de la superficie de respuesta, como ya se observaba en la
gráfica de contorno, para 8 horas y 50% de enzima.

80
 Tabla 28 Datos de optimización MAG

Factor Bajo Alto Óptimo

log2 E 3.64386 5.64386 5.64386
log2 t 0.0 3.0 3.0

Contenido en ácidos grasos libres (FFA)

A continuación se muestra la ecuación de regresión que se ha ajustado a los datos:

Ecuación 6

En la Tabla 29 se muestran los resultados de análisis de varianza para FFA

Tabla 29. Resultados ANOVA para FFA

Suma de
Fuente Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Cuadrados
A:log2 E 1.14007 1 1.14007 8.85 0.0248*
B:log2 t 0.648967 1 0.648967 5.04 0.0659
AA 0.55815 1 0.55815 4.33 0.0825
AB 0.87616 1 0.87616 6.80 0.0402*
BB 0.000833333 1 0.000833333 0.01 0.9385
Error total 0.772547 6 0.128758
Total (corr.) 3.9967 11

R-cuadrada = 80.6704 porciento

R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 64.5624 porciento
Estadístico Durbin-Watson = 2.85921 (P=0.5986)

81
 Figura 27. Datos observados vs predichos para el contenido de FFA %

De la figura 28 se puede concluir que los valores predichos coinciden con los valores observados
para el contenido de FFA en porcentaje

Se obtiene el gráfico de contorno de la superficie de respuesta de acuerdo a la ecuación 5, donde

se puede comprobar que el mínimo % de FFA se obtiene para cantidades intermedias de tiempo y
enzima.

Figura 28. Gráfico de contorno de % FFA

La optimización realizada por el Software STATHGRAPHICS con el objetivo de minimizar % FFA, da

los siguientes resultados:

82
 Tabla 30. Datos de optimización FFA

Factor Bajo Alto Óptimo

log2 E 3.64386 5.64386 4.57121
log2 t 0.0 3.0 3.0

Esta optimización sitúa al mínimo en 8 horas y 23.77 % de enzima, en región central de la

superficie de respuesta, como ya se observaba en la gráfica de contorno.

Contenido en diglicéridos (DAG)

A continuación se despliega la ecuación de regresión que se ha ajustado a los datos. La ecuación

del modelo ajustado es:

Ecuación 7

En la Tabla 31 se muestran los resultados de análisis de varianza para DAG

Tabla 31. Resultados ANOVA para DAG

Suma de
Fuente Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Cuadrados
A:log2 E 318.906 1 318.906 14.85 0.0084*
B:log2 t 236.295 1 236.295 11.00 0.0161*
AA 12.7458 1 12.7458 0.59 0.4703
AB 56.0032 1 56.0032 2.61 0.1575
BB 0.567675 1 0.567675 0.03 0.8762
Error total 128.86 6 21.4766
Total (corr.) 753.378 11

R-cuadrada = 82.8958 porciento

R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 68.6422 porciento
Estadístico Durbin-Watson = 1.56507 (P=0.0200)

83
 Figura 29. Datos observados vs predichos para el contenido de DAG %

De la figura 30 se puede concluir que los valores predichos coinciden con los valores observados
para el contenido de DAG en porcentaje, si bien existe una mayor dispersión de los puntos que el
resto de modelos. Esto ya se veía reflejado en el R-cuadrada que solamente es del 89.6728 %, en
comparación con las otras variables donde superaba el 95%.

Se obtiene el gráfico de contorno de la superficie de respuesta de acuerdo a la ecuación 6, donde

se puede comprobar que el mínimo % de DAG se obtiene para cantidades crecientes de tiempo y
enzima.

Figura 30. Gráfico de contorno de % DAG

La optimización realizada por el Software STATHGRAPHICS con el objetivo de minimizar % DAG, da

los siguientes resultados:

84
 Tabla 32. Datos de optimización DAG

Factor Bajo Alto Óptimo

log2 E 3.64386 5.64386 5.64386
log2 t 0.0 3.0 3.0

Esta optimización sitúa al mínimo en los límites superiores de la superficie de respuesta, es decir
para 8 horas y 50 % de enzima.

Contenido en triglicéridos y ésteres etílicos (TAG y EE)

A continuación se muestra la ecuación de regresión que se ha ajustado a los datos.

Ecuación 8

En la Tabla 33 se muestran los resultados de análisis de varianza para TAG + EE

Tabla 33. Resultados ANOVA para TAG_EE

Suma de Cuadrado
Fuente Gl Razón-F Valor-P
Cuadrados Medio

A:log2 E 216.215 1 216.215 15.24 0.0079*

B:log2 t 389.944 1 389.944 27.49 0.0019*
AA 3.8001 1 3.8001 0.27 0.6233
AB 98.8788 1 98.8788 6.97 0.0385*
BB 30.2101 1 30.2101 2.13 0.1948
Error total 85.1133 6 14.1855
Total (corr.) 824.164 11

R-cuadrada = 89.6728 porciento

R-cuadrada (ajustada por g.l.) = 81.0668 porciento
Estadístico Durbin-Watson = 1.58744 (P=0.0220)

85
 Figura 31. Datos observados vs predichos para el contenido de TAG + EE %

De la figura 32 se puede concluir que los valores predichos coinciden con los valores observados
para el contenido de DAG en porcentaje.

Se obtiene el gráfico de contorno de la superficie de respuesta de acuerdo a la ecuación 6, donde

se puede comprobar que el mínimo % de DAG se obtiene para cantidades crecientes de tiempo y
enzima.

Figura 32. Gráfico de contorno de % TAG + EE

La optimización realizada por el Software STATHGRAPHICS con el objetivo de maximizar % TAG +

EE, da los siguientes resultados:

86
 Tabla 34. Datos optimización TAG_EE

Factor Bajo Alto Óptimo

log2 E 3.64386 5.64386 5.64386
log2 t 0.0 3.0 3.0

Esta optimización sitúa al máximo en los límites superiores de la superficie de respuesta, de nuevo
para 8 horas y 50 % de enzima.

De este modo comprobamos que el óptimo para todas las variables, excepto FFA, se encuentra en
los límites superiores de la superficie de respuesta, siendo necesarios tiempo largos y gran
cantidad de enzima. El óptimo (mínimo) de FFA se encuentra en una región intermedia de la
superficie, pero su valor no cambiar a tiempo o concentración de enzima mayores.

87
88
4. CONCLUSIONES

El alto coste del biodiesel producido de materias primas de aceites vegetales comestibles así
como la discusión ética que genera el uso de estas fuentes, deriva en la necesidad de encontrar
materias primas de bajo coste para la producción de biodiesel. El aceite de pescado de descarte
presenta una alternativa viable para resolver este problema. El presente trabajo sirve de base
para concluir que el biodiesel producido a partir de aceite de pescado por vía enzimática es una
alternativa viable para contribuir con la producción de biodiesel en los países donde se generen
residuos de pescado.

En este proyecto de investigación se estudiaron dos variables para la reacción de

transesterificación las cuales fueron tiempo y contenido de enzima. Se observó que la mayor
conversión del aceite de pescado a FAEE´s fue de 86.91% a 8 horas de reacción y 50% w/w de
enzima en aceite. Fue observado también que el contenido de ácidos grasos libres pasó de
10.95% en el aceite de partida a 0.47% al mismo tiempo de reacción contenido de enzima, lo cual
confirma que la enzima Cándida antartica B convierte prácticamente todos los ácidos grasos a
ésteres etílicos. Se concluye también que el tiempo óptimo de reacción se da a partir de las 8
horas de reacción ya que antes de esto, se encuentran presentes mono – di- y tri- glicéridos en
mayor proporción en el producto lo cual son consideradas como impurezas.

El biodiesel de pescado presenta también un contenido alto en ácidos grasos poliinsaturados por
lo que en estos casos, el uso de mezclas en distintas proporciones con biodiesel, por ejemplo de
aceites vegetales, fritura u otras fuentes, puede mejorar características como la resistencia a la
oxidación.

Asimismo, se concluye que dados los resultados de contenido de FAEE´s sería factible realizar
futuras pruebas a mayor tiempo de reacción para lograr el contenido mínimo de alquil ésteres
establecido por la norma EN 14214 de la Comunidad Europea y ASTM D6751 internacionalmente
que debe ser de 96.5%, así como estudiar el número de usos de la enzima.

89
90
5. BIBLIOGRAFÍA

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95
96
 ANEXOS

Anexo 1. Cromatogramas

Figura 33. TLC ACEITE DE PESCADO 1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 34. CGD AC PESC

97
 Figura 35. ID BD PESC 50%Enzima, 1 hora

Figura 36. TLC BD PESC 50%Enzima, 1 hora (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 37. CGD BD PESC 50%Enzima, 1 hora

98
 Figura 38. ID BD PESC 50%Enzima, 2 horas

Figura 39. TLC BD PESC 50%Enzima, 2 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 40. CGD BD PESC 50%Enzima, 2 horas

99
 Figura 41. ID BD PESC 50%Enzima, 4 horas

Figura 42. TLC BD PESC 50%Enzima, 4 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 43. CGD BD PESC 50%Enzima, 4 horas

100
 Figura 44. ID BD PESC 50%Enzima, 8 horas

Figura 45. TLC BD PESC 50%Enzima, 8 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 46. CGD BD PESC 50%Enzima, 8 horas

101
 Figura 47. ID BD PESC 25%Enzima, 1 hora

Figura 48. TLC BD PESC 25%Enzima, 1 hora (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figure 49. CGD BD PESC 25%Enzima, 1 hora

102
 Figura 50. ID BD PESC 25%Enzima, 2 horas

Figura 51. TLC BD PESC 25%Enzima, 2 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 52. CGD BD PESC 25%Enzima, 2 horas

103
 Figura 53. ID BD PESC 25%Enzima, 4 horas

Figura 54. TLC BD PESC 25%Enzima, 4 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 55. CGD BD PESC 25%Enzima, 4 horas

104
 Figura 56. ID BD PESC 25%Enzima, 8 horas

Figura 57. TLC BD PESC 25%Enzima, 8 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 58. CGD BD PESC 25%Enzima, 8 horas

105
 Figura 59. ID BD PESC 12.5%Enzima, 1 hora

Figura 60. TLC BD PESC 12.5%Enzima, 1 hora (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 61. CGD BD PESC 12.5%Enzima, 1 hora

106
 Figura 62. ID BD PESC 12.5%Enzima, 2 horas

Figura 63. TLC BD PESC 12.5%Enzima, 2 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 64. CGD BD PESC 12.5%Enzima, 2 horas

107
 Figura 65. ID BD PESC 12.5%Enzima, 4 horas

Figura 66. TLC BD PESC 12.5%Enzima, 4 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 67. CGD BD PESC 12.5%Enzima, 4 horas

108
 Figura 68. ID BD PESC 12.5%Enzima, 8 horas

Figura 69. TLC BD PESC 12.5%Enzima, 8 horas (1: MAG, 2: FFA, 3: DAG, 4: TAG)

Figura 70. CGD BD PESC 12.5%Enzima, 8 horas

109