Carmen Piñols PDF

Estudio de los cambios en la mucosa colónica de rata y
cinética celular durante la carcinogénesis experimental

inducida con 1,2-Dimetilhidracina
Carme Piñols Felis
I S B N: 84-89727-64-3
Depósito Legal: S. 54-98
Servei de Publicacions
Universitat de Lleida
TESITEX, S.L.
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Fax 923 - 25 87 03
37007 SALAMANCA
1
Als meus pares.
A Iñaki
2
AGRADECIMIENTOS
Al prof. Joan Viñas i Salas, por asumir la dirección de esta Tesis Doctoral, por su
constante estímulo, amistad y apoyo, sin los que no se hubiera podido realizar este trabajo.
Al Dr. Xavier Gómez i Arbonés, por su introducción y ayuda en las técnicas e
interpretación de la citometría de flujo y del análisis estadístico.
Al Dr. Ramón Egido, del Servicio de Anatomía Patológica del Hospital Arnau de
Vilanova, por su dedicación en la revisión histopatológica de las muestras.
Als Serveis Cientifico-Tècnics de la Universitat de Barcelona, y a su personal por su
amabilidad y su inestimable ayuda en la realización del estudio de microscopía electrónica
A los compañeros del laboratorio del Departament de Ciències Mèdiques Bàsiques,
que han hecho más agradable el trabajo diario.
Al sr. Xavier Calomarde por su colaboración en la realización de las microfotografías.
A la Dra. Pilar Biendicho por su ayuda en la microtomía y por brindarme su amistad
en las largas horas compartidas en el laboratorio.
A los srs. Manolo Santiago y Emilià Vicente por el cuidado y manejo de los animales.
A Azucena, Ana, Gloria y Carlos de la Biblioteca del Complexo Hospitalario Juan
Canalejo por su ayuda en la búsqueda bibliográfica.
A todos los compañeros y amigos del Departament de Medicina i Cirurgia que me han
dado su aliento y consejo en los momentos difíciles.
A mis padres, por su estímulo constante y por soportar pacientemente los momentos
de desánimo.
A Iñaki... Gracias por todo.
3
ÍNDICE GENERAL
ABREVIATURAS
I. INTRODUCCIÓN
I. 1. CÁNCER DE COLON EN EL HOMBRE
I. 1. 1. EPIDEMIOLOGÍA
1. 1. 1. Patología geográfica
1. 1. 2. Relación entre el colon y el recto
1. 1. 3. diferencias de riesgo entre las poblaciones urbanas y rurales
1. 1. 4. Distribución por edad y sexo
I. 1. 2. FACTORES DE RIESGO DEL CÁNCER COLORRECTAL
1. 2. 1. Razas
1. 2. 2. Nivel socioeconómico
1. 2. 3. Religión
1. 2. 4. Factores ambientales
1. 2. 5. Factores genéticos
1. 2. 6. Antecedentes patológicos y grupos de riesgo
I. 1. 3. DIAGNÓSTICO
1. 3. 1. Manifestaciones clínicas
1. 3. 2. Diagnóstico en el paciente asintomático
1. 3. 3. Diagnóstico en el paciente sintomático
I. 1. 4. ANATOMÍA PATOLÓGICA
1. 4. 1. Características macroscópicas
1. 4. 2. Tipos histológicos
1. 4. 3. Mucosa transicional
I. 1. 5. LOCALIZACIÓN
I. 1. 6. DISEMINACIÓN TUMORAL
I. 1. 7. CLASIFICACIÓN
I. 1. 8. FACTORES PRONÓSTICOS DEL CANCER COLORRECTAL
1. 8. 1. Factores pronósticos clínicos
1. 8. 2. Factores pronósticos anatomopatológicos
1. 8. 3. Otras variables pronosticas
I. 2. CARCINOGÉNESIS COLÓNICA EXPERIMENTAL
I. 2. 1. RAZONES PARA EL USO DE MODELOS EXPERIMENTALES
CARCINÓGENOS ANIMALES
I. 2. 2. PRINCIPALES CARCINÓGENOS CONOCIDOS
2. 2. 1. Compuestos relacionados con la cicasina
2. 2. 2. Otros carcinógenos químicos
I. 2. 3. 1,2 -DIMETILHIDRACINA DIHIDROCLORATO (1,2 - DMH)
2. 3. 1. Organotropismo, vías de administración y dosificación
2. 3. 2. Acciones de la DMH
2. 3. 3. teorías carcinogénicas del cáncer de colon inducido por DMH.
Mecanismo de acción
2. 3. 4. Factores constitucionales y regulación
2. 3. 5. Influencia de factores ambientales
2. 3. 6. Expresión de oncogenes
I. 3. MUCOSA COLÓNICA DE RATA NORMAL Y TUMORAL
I. 3. 1. MORFOLOGÍA DE LA MUCOSA COLÓNICA DE RATA
3. 1. 1. Descripción macroscópica
4
3. 1. 2. Descripción microscópica
3. 1. 3. Microscopía electrónica de scanning (MES)
I. 3. 2. CINÉTICA CELULAR
I. 3. 3. DESCRIPCIÓN DE LAS LESIONES INDUCIDAS CON DMH
3. 3. 1. Categorías macroscópicas
3. 3. 2. Categorías microscópicas
I. 4. GLICOCONJUGADOS
I. 4. 1. GLICOCONJUGADOS CELULARES. PAPEL BIOLÓGICO
4. 1. 1. Glicoproteínas
4. 1. 2. Glicolípidos
I. 4. 2. OLIGOSACÁRIDOS DE LOS GLICOCONJUGADOS
RELACIONADOS CON LOS GRUPOS SANGUÍNEOS
4. 2. 1. Biosíntesis del sistema ABH, Ii y Lewis
4. 2. 2. Expresión de glicoconjugados y de antígenos de grupo
sanguíneo en el epitelio colónico
I. 4. 3. TINCIONES HABITUALES DE LOS GLICOCONJUGADOS
I. 4. 4. MÉTODOS ESPECÍFICOS DE TINCIÓN
I. 5. LECTINAS
I. 5. 1. DEFINICIÓN
I. 5. 2. CLASIFICACIÓN DE LAS LECTINAS
I. 5. 3. PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LAS LECTINAS
I. 5. 4. PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS LECTINAS
I. 5. 5. PRINCIPALES APLICACIONES DE LAS LECTINAS
5. 5. 1. Lectinas como reactivos en anatomía
5. 5. 2. Lectinas en patología
I. 5. 6. MICROSCOPÍA DE LAS LECTINAS
5. 6. 1. Métodos de marcaje de lectinas
5. 6. 2. Lectinas conjugadas con oro coloidal
I. 5. 7. LECTINAS USADAS EN EL ESTUDIO
5. 7. 1. Glycine max (SBA)
5. 7. 2. Griffonia simplicifolia -II
5. 7. 3. Arachis hypogaea (PNA)
5. 7. 4. Ulex europaeus (UEA-I)
I. 5. 8. HISTOQUÍMICA CON LECTINAS DEL COLON NORMAL
HUMANO
5. 8. 1. Glycine max
5. 8. 2. Griffonia simplicifolia-II
5. 8. 3. Arachis hypogaea
5. 8. 4. Ulex europaeus
I. 5. 9. VALOR CLÍNICO DE LAS LECTINAS EN EL CÁNCER
COLORRECTAL EN HUMANOS
5. 9. 4. Ulex europaeus-I
I. 5. 10. LECTINAS Y MUCOSA COLÓNICA DE RATA
I. 6. CITOMETRÍA DE FLUJO
I. 6. 1. CICLO CELULAR
5
I. 6. 2. INTRODUCCIÓN. ASPECTOS HISTÓRICOS
I. 6. 3. FUNDAMENTOS TÉCNICOS
6. 3. 1. Fuentes de luz
6. 3. 2. Suspensión celular
6. 3. 3. Colorantes
I. 6. 4. PARÁMETROS DE MEDICIÓN
I. 6. 5. APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO
6. 5. 1. Estudio del contenido en ADN y fases del ciclo celular por
citometría de flujo
6. 5. 2. Aplicaciones de la cmf en diagnóstico tumoral
6. 5. 3. Pronóstico
6. 5. 4. Tratamiento
I. 6. 6. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CMF
I. 6. 7. VALOR CLÍNICO Y PRONÓSTICO DE LA CMF EN EL CÁNCER
COLORRECTAL HUMANO
II. HIPÓTESIS DEL ESTUDIO
II. 1. JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
II. 2. HIPÓTESIS DEL ESTUDIO
II. 3. OBJETIVOS DEL ESTUDIO
III. MATERIAL Y MÉTODO
III. 1. ANIMALES
III. 1. 1. ANIMALES, ESTABULACIÓN Y DIETA
III. 1. 2. GRUPOS DE ESTUDIO
III. 1. 3. INDUCCIÓN DE TUMORES CON 1,-2-DIMETILHIDRACINA
III. 1. 4. SACRIFICIO
III. 1. 5. RECOGIDA DE MUESTRAS
1. 5. 1. Recogida de muestras para microscopía óptica
1. 5. 2. Recogida de muestras para microscopía electrónica de scanning
(MES)
III. 2. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS
III. 2. 1. FIJACIÓN
2. 1. 1. Fijación para microscopía óptica
2. 1. 2. Fijación para microscopía electrónica
III. 2. 2. PROTOCOLO DE INCLUSIÓN DE LAS MUESTRAS EN
PARAFINA
III. 2. 3. PROCESADO DE MUESTRAS PARA MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA CONVENCIONAL
2. 3. 1. Protocolo de deshidratación para MES
2. 3. 2. Montaje y recubrimiento
III. 3. MÉTODOS CONVENCIONALES DE TINCIÓN
III. 3. 1. TINCIÓN CON HEMATOXILINA-EOSINA
III. 3. 2. TINCIÓN PAS-AB
III. 4. LECTINAS
III. 4. 1. LECTINAS Y AZÚCARES INHIBIDORES USADOS
III. 4. 2. MÉTODO DE CONJUGACIÓN DE LAS LECTINAS
4. 2. 1. Preparación de las partículas de oro coloidal
4. 2. 2. Conjugación lectina-oro. Incubación con el complejo
III. 4. 3. METODOLOGÍA HISTOQUÍMICA CON LECTINAS
6
CONJUGADAS
4. 3. 1. Procedimiento de incubación para MO
4. 3. 2. Procedimiento de incubación para MES
III. 4. 4. CONTROLES DE ESPECIFICIDAD
III. 5. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
III. 5. 1. MICROSCOPÍA
III. 5. 2. MATERIAL FOTOGRÁFICO
III. 6. CITOMETRÍA DE FLUJO
III. 6. 1. PROCESADO DE LAS MUESTRAS PARA CMF
III. 6. 2. ANÁLISIS POR CITOMETRÍA DE FLUJO DEL CONTENIDO EN
DNA Y CICLO CELULAR
6. 2. 1. Citómetro de flujo
6. 2. 2. Alineamiento del citómetro
6. 2. 3. Lectura por el citómetro de flujo
6. 2. 4. Interpretación de los resultados de la lectura por citometría de
flujo
6. 2. 5. Análisis de los histogramas del contenido en ADN mediante el
programa informático
III. 7. VARIABLES DEL ESTUDIO
III. 7. 1. IDENTIFICACIÓN DE LOS CASOS
III. 7. 2. VARIABLES CLÍNICAS
III. 7. 3. VARIABLES ANATOMOPATOLÓGICAS
III. 7. 4. VARIABLES HISTOQUÍMICAS CON LECTINAS EN
MICROSCOPÍA ÓPTICA
III. 7. 5. VARIABLES HISTOQUÍMICAS CON LECTINAS EN
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
III. 7. 6. VARIABLES HISTOQUÍMICAS CON LA TINCIÓN AB-PAS
III. 7. 7. VARIABLES CONSIDERADAS EN EL ESTUDIO DE
CITOMETRÍA DE FLUJO
III. 8. BASE DE DATOS. TRATAMIENTO DE LA BASE DE DATOS
III. 9. ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS
III. 9. 1. COMPARACIÓN DE VARIABLES CUALITATIVAS
III. 9. 2. COMPARACIÓN DE VARIABLES CUALITATIVAS Y
CUANTITATIVAS
III. 9. 3. COMPARACIÓN DE VARIABLES CUANTITATIVAS
IV. RESULTADOS
IV. A. ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA UNIVARIANTE
IV. A. 1. GRUPO A
IV. 1. 1. CARACTERÍSTICAS MACRO Y MICROSCÓPICAS DE
LA MUCOSA NORMAL DE RATA
1. 1. 2. Características microscópicas
IV. 1. 2. VARIABLES HISTOQUÍMICAS CON LECTINAS EN
MICROSCOPÍA ÓPTICA DE MUCOSA NORMAL
7
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
1. 3. 2. GSA-II
IV. 1. 4. VARIABLES HISTOQUÍMICAS CON LA TINCIÓN AB-
PAS
IV. 1. 5. CITOMETRÍA DE FLUJO:
IV. 2. GRUPO B
IV. 2. 1. CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS
2. 1. 1. Características de la mucosa normal de rata inyectada
con DMH, microscopía óptica
con DMH, microscopía electrónica de scanning
2. 1. 3. Descripción de las lesiones neoplásicas con microscopía
electrónica de scanning
IV. 2. 2. VARIABLES CLÍNICAS
2. 2. 1. Sexo
2. 2. 2. Localización tumoral
2. 2. 3. Aspecto macroscópico tumoral
2. 2. 4. Tamaño tumoral
IV. 2. 3. VARIABLES ANATOMOPATOLÓGICAS
2. 3. 1. Tipo histológico
2. 3. 2. Grado de diferenciación
2. 3. 3. Estadio tumoral (Dukes)
2. 3. 4. Presencia de otros tumores sincrónicos colorrectales
2. 3. 5. Presencia de tumores sincrónicos de intestino delgado
2. 3. 6. Presencia de metástasis
2. 3. 7. Asociación a placa linfoide
2. 4. 1. Marcaje de la mucosa macroscópicamente normal
2. 4. 2. Marcaje de los tumores
2. 4. 3. Marcaje de la mucosa transicional (MT)
PAS
2. 5. 1. Tinción de la mucosa normal
2. 5. 2. Tinción de la mucosa tumoral
2. 5. 3. Tinción de la mucosa transicional
IV. 2. 6. CITOMETRÍA DE FLUJO
2. 6. 1. Citometría de flujo de la mucosa macroscópicamente
normal
2. 6. 2. Citometría de flujo de los tumores
IV. 3. GRUPO C
IV. 3. 1. CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DE LA
MUCOSA NORMAL DE RATA INYECTADA CON DMH EN
ETAPAS PRENEOPLÁSICAS
8
3. 2. 1. Sexo
3. 3. 4. Presencia de tumores sincrónicos colorrectales
3. 4. 1. Marcaje de la mucosa macroscópicamente normal en
etapas pre y neoplásicas
3. 4. 2. Marcaje de la mucosa tumoral
3. 5. 2. Marcaje de las lesiones tumorales con lectinas en
microscopía electrónica
PAS
3. 6. 1. Tinción de la mucosa macroscópicamente normal en
IV. 4. GRUPO D
IV. 4. 1. CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS
con DMH, microscopía óptica
con DMH, microscopía electrónica de scanning (MES)
4. 1. 3. Descripción de las lesiones neoplásicas (MES)
4. 2. 1. Sexo
4. 2. 3. Aspecto macroscópico
9
4. 4. 3. Marcaje de la mucosa transicional
PAS
IV. 5. GRUPO E
IV. 5. 1. ASPECTO MICROSCÓPICO
IV. 5. 2. VARIABLES HISTOQUÍMICAS CON LECTINAS
PAS
IV. 6. DESCRIPCIÓN DE LAS LESIONES TUMORALES
6. 1. 1. Sexo
6. 1. 2. Localización del tumor
6. 2. 2. Grado de diferenciación tumoral
6. 2. 3. Grado de invasión de la pared (Estadio de Dukes)
6. 2. 5. Presencia de tumores sincrónicos en intestino delgado
6. 2. 7. Tumores colorrectales que asientan sobre placas
linfoides
6. 3. 1. Marcaje de la mucosa normal
6. 4. 2. Marcaje de las lesiones tumorales con lectinas en
microscopía electrónica
IV. 6. 5. TINCIÓN DE LA MUCOSA TUMORAL CON TÉCNICAS
HISTOQUÍMICAS CONVENCIONALES (tinción de AB-PAS)
10
IV. B. ESTUDIO ESTADÍSTICO
IV. B. 1. VARIABLES TUMORALES
IV. 1. 1. COMPARACIÓN DE LAS VARIABLES CLÍNICAS Y EL
RESTO DE VARIABLES
1. 1. 1. Sexo
1. 1. 2. Localización
IV. 1. 2. COMPARACIÓN DE LAS VARIABLES ANATOMO-
PATOLÓGICAS Y EL RESTO DE VARIABLES
1. 2. 1. Comparación de las variables anatomo-patológicas
entre sí
1. 2. 2. Comparación de las variables anatomopatológicas e
histoquímicas
1. 2. 3. Comparación entre las variables anatomopatológicas y
el resultado por citometría de flujo
IV. 1. 3. COMPARACIÓN DE LAS VARIABLES
HISTOQUÍMICAS Y EL RESTO DE VARIABLES
IV. 1. 4. COMPARACIÓN DEL RESULTADO DEL ANÁLISIS POR
CITOMETRÍA DE FLUJO CON EL RESTO DE VARIABLES
1. 4. 1. Comparación entre las semanas de tratamiento y el
resultado por citometría de flujo
1. 4. 2. Comparación entre el resultado por citometría de flujo y
el resto de variables anatomo-patológicas
IV. 2. COMPARACIÓN ENTRE LOS GRUPOS
2. 1. 1. Sexo
IV. 2. 2. VARIABLES ANATOMO-PATOLÓGICAS:
2. 2. 3. Estadio de Dukes
2. 2. 7. Presencia de placa linfoide
IV. 2. 3. VARIABLES HISTOQUÍMICAS
2. 4. 1. Comparación entre los grupos de estudio y el resultado
por citometría de flujo
V. DISCUSIÓN
V. 1. ASPECTOS MORFOLÓGICOS
V. 1. 1. CARACTERÍSTICAS DEL CÁNCER COLORRECTAL INDUCIDO
CON DMH
V. 1. 2. CARACTERÍSTICAS DE LAS LESIONES BENIGNAS
11
INDUCIDAS CON DMH
V. 1. 3. FOCOS Y LESIONES DE PREDISPLASIA
V. 1. 4. MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE SCANNING
V. 2. EXPRESIÓN DE GLICOCONJUGADOS
V. 2. 1. MICROSCOPÍA ÓPTICA
2. 1. 1. Mucosa normal
2. 1. 2. Lesiones neoplásicas
2. 1. 3. Mucosa macroscópicamente normal de ratas inyectadas con
DMH
V. 2. 2. GLICOCONJUGADOS DE LA SUPERFICIE EPITELIAL
2. 2. 2. Mucosa tumoral
2. 2. 3. Mucosa macroscópicamente normal de ratas inyectadas con
DMH
V. 3. CITOMETRÍA DE FLUJO
V. 3. 1. VALOR DEL ESTUDIO DEL CONTENIDO EN ADN DE LAS
NEOPLASIAS COLÓNICAS INDUCIDAS EXPERIMENTALMENTE CON
1,2-DIMETILHIDRACINA EN LA RATA
V. 3. 2. VALOR DEL ESTUDIO DE LA PROLIFERACIÓN CELULAR
POR CITOMETRÍA DE FLUJO
VI. CONCLUSIONES
VII. RESUMEN
VIII. BIBLIOGRAFIA
IX. ANEXO
12
Abreviaturas
AB: tinción de azul alcian

ABH: sistema de grupos sanguíneos ABH (O)
ABO: sistema de grupos sanguíneos ABO
Ac: anticuerpo
ACS: American Cancer Society
ADN: ácido desoxirribonucleico
Ag: antígeno
AINE: antinflamatorio no esteroide
AM: azoximetano
AOM: azoximetanol
APC: poliposis colónica adenomatosa (ing. adenomatous polyposis coli)
ARN: ácido ribonucleico
ARNasa: ribonucleasa
ARNm: ARN mensajero
BGA: antígenos de grupo sanguíneo (ing. blood group antigens)
BPA: lectina Bauhinia purpurea
BSE: electrones retrodispersados (ing. backscattered electrons)
CCHNP: cáncer colorrectal hereditario no polipósico
CEA: antígeno carcinoembrionario
CMF: citometría de flujo
Con-A: concanavalina A
CV: coeficiente de variación
DBA: lectina Dolichos biflorus
DMAB: 2'3 dimetil-4-aminobifenil
DMH: 1,2-Dimetilhidracina clorhidrato
DI: índice de DNA
DS: desviación standard
EDTA: ácido etilendiaminotetracético
FITC: isotiocianato de fluoresceína
Fuc: L-Fucosa
Gal: galactosa
GalNAc: N-acetilgalactosamina
Glc: glucosa
GlcNAc: N-acetilglucosamina
GSA-I: lectina Griffonia simplicifolia-I
GSA-II: lectina Griffonia simplicifolia-II
HE: coloración de hematoxilina-eosina
HPA: lectina Helix pomatia
Ig: imnunoglobulina
IL-2: interleuquina 2
IP: índice de proliferación
LBA: lectina Phaseolus lunatus
LCA: lectina Lens culinaris
LOH: pérdida de heterocogosidad (ing. loss of heterozygosity)
MAM: metilazoximetanol
Man: manosa
13
ME: microscopía electrónica
MET: microscopía electrónica de transmisión
MES: microscopía electrónica de scanning
MH: metilhidracina
MNNG: N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina
MNU: N-metilnitrosourea
MO: microscopía óptica
MPA: lectina Maclura pomifera
NeuAc: ácido siálico
OD: densidad óptica
PAS: reacción del ácido periódico de Schiff.
PBS: amortiguador (buffer) fosfato salino
PEA: lectina Pisum sativum
PEG: Polietilenglicol p.m. 20.000
PIE: punto isoeléctrico
PI: ioduro de propidio
PNA: lectina Arachis hypogaea
QFIA: anális de imagen cuantitativa fluorescencia.
SBA: lectina Glycine max
SBH: proteínas hemaglutinantes de soja.
s.c.: subcutáneo
SJA: lectina Sophora japonica
SNC: sistema nervioso central
STA: lectina Solanum tuberosum
TC: tomografía computarizada
TAg: antígeno de Thomsen-Friedenreich
Tk: linfocitos T agresores (ing. Killer)
TNM: tumor-adenopatía-metástasis (ing. tumor, node, metastasis)
UEA-I: lectina Ulex europaeus-I
UEA-II: lectina Ulex europaeus-II
WGA: lectina Triticum vulgares
14
I. Introducción
I.1. Cáncer de colon en el hombre
I. 1. 1. Epidemiología
El cáncer colorrectal es, según estimaciones recientes, la tercera neoplasia en orden de

frecuencia en la población mundial y supone casi el 15% de todos los nuevos cánceres (1). La
incidencia es más elevada en los países occidentales y, en Europa, es la tercera neoplasia más
frecuente, después del cáncer de pulmón y próstata en los hombres y la segunda después del
de mama en mujeres (2).
En España la incidencia global es de 10 por 100.000 personas (3). En cuanto a la
mortalidad, en nuestro medio representa la segunda o tercera causa de muerte por cáncer
según los diferentes registros. En Cataluña se observa un aumento de la mortalidad por
cáncer de colon en la última década, permaneciendo estable la de recto (4).
Una persona a los 50 años presenta un riesgo de un 5% de padecer un cáncer de colon
antes de los 80 años y un riesgo de 2,5% de morir de él (5). Esto implica que sea actualmente
uno de los problemas de salud pública más importante en cancerología.
1. 1. 1. Patología geográfica
La comparación internacional de las tasas de incidencia muestra variaciones

importantes en el riesgo de padecer cáncer según las diferentes zonas geográficas. Las tasas
de incidencia más elevadas corresponden a las áreas económicamente más desarrolladas del
mundo occidental. Para el cáncer de colon, las zonas con incidencia más elevada son América
del Norte, Canadá, Australia, Nueva Zelanda y el noroeste de Europa (6). Las diferencias más
notables son la baja tasa observada en Japón (7) y en poblaciones negras subsaharianas
africanas. Los emigrantes japoneses en Estados Unidos adquieren dentro de la misma
generación tasas mucho más elevadas que las de su país de origen. Además los hijos de
emigrantes de países europeos de bajo riesgo tienen tasas igual de elevadas que otros blancos
estadounidenses. Estos datos sustentan que las causas de diferencias internacionales son
ambientales y no genéticas (8).
1. 1. 2. Relación entre el colon y el recto
Al parecer existe un acusado paralelismo entre las incidencias del cáncer de colon y
de recto en las diferentes poblaciones. En la década de los 70 quedó claro que la incidencia de
los cánceres de colon y de recto se fue desviando desde un predominio del cáncer de recto a
un predominio del cáncer de colon. La causa de este cambio de incidencia es desconocida.
Alrededor del 10% de los casos y el 80% de los fallecimientos por cáncer de intestino grueso
son debidos al cáncer de colon, el resto se localizan el recto. Estudios recientes han
demostrado un desplazamiento proximal altamente significativo en la localización del cáncer
colorrectal en las dos últimas décadas (9).
No ha habido cambios destacados en la incidencia o mortalidad del cáncer colorrectal
en los últimos 50 años (8).
1. 1. 3. diferencias de riesgo entre las poblaciones urbanas y rurales
15
Una de las características más importantes de la epidemiología del cáncer colorrectal
es el elevado riesgo que presentan las poblaciones urbanas. En las zonas de riesgo elevado las
diferencias no son tan evidentes como en las zonas de bajo riesgo, por el incremento más
rápido de la incidencia en las zonas rurales (10).
1. 1. 4. Distribución por edad y sexo
En el cáncer colorrectal la incidencia aumenta exponencialmente con la edad. En las

áreas de riesgo elevado, se observa un predominio del cáncer de colon en el sexo femenino
antes de los 60 años. En la mayoría de los registros de cáncer, el cáncer de recto es más
frecuente en el sexo masculino en todas las edades. Ajustado por edades y localizaciones la
proporción de carcinomas es similiar en ambos sexos (11). En España, la incidencia por sexos
es similar, con afectación máxima a partir de los 65 años (3).
I. 1. 2. Factores de riesgo del cáncer colorrectal
1. 2. 1. Razas
Hasta el año 1950 las incidencias sobre personas de color fueron sensiblemente más
bajas que sobre blancos, pero posteriormente los primeros han ido aumentando mientras que
los segundos han permanecido constantes
de modo que actualmente la incidencia es aproximadamente la misma en ambas razas (8). El
aumento de la incidencia del cáncer de colon entre los negros constituye un argumento en
contra del posible papel de la raza en la génesis del cáncer colorrectal (10).
1. 2. 2. Nivel socioeconómico
Se ha mencionado que las clases sociales altas tienen un riesgo más elevado de
padecer cáncer de colon en relación con las clases sociales bajas, especialmente en el sexo
masculino. Sin embargo, los estudios en que se ha encontrado esta relación provienen
fundamentalmente de poblaciones de bajo riesgo. Se ha comprobado también que en las
poblaciones de riesgo elevado del mundo occidental existen pocas diferencias entre los
diversos grupos socioeconómicos. Monnet et al. (12) han descrito que los pacientes que viven
en casas no confortables tienen un riesgo 2 veces más alto de morir durante el periodo de
seguimiento que aquellos pacientes que viven en casas confortables siendo el riesgo relativo
de 1,5 para la categoría de confort medio. Este efecto fue más remarcable en pacientes con
estadios precoces que en pacientes con estadios avanzados.
1. 2. 3. Religión
Otro indicador del papel de los factores ambientales en la etiología del cáncer
colorrectal proviene de las publicaciones sobre diferentes estudios religiosos, basados en sus
costumbres alimenticias y consumo de tabaco y alcohol (13), (14).
1. 2. 4. Factores ambientales
a. Grasa dietética
Varios estudios epidemiológicos han demostrado que dietas ricas en grasa total y
animal están generalmente asociadas con riesgo incrementado para cáncer de colon en el
hombre (15), (6) , aunque un reciente estudio prospectivo no confirma el papel de la grasa
16
dietética total en la etiología del cáncer de colon (16).
Las dietas ricas en grasas contienen cantidades mayores de aminas heterocíclicas (a
partir de las proteínas de la carne) y de facilitadores como consecuencia de la cocción a una
temperatura más elevada (el hecho de cocinar con grasa produce una temperatura más
elevada que cuando se cocina con agua) (17).
Específicamente, la grasa incrementa la producción de ácido biliar, y en último
término aumenta la exposición de la mucosa del intestino a los efectos tóxicos, tróficos y
facilitadores de los ácidos biliares (especialmente, secundarios) (18).
Las dietas con aceites de pescado parecen tener efecto protector sobre el cáncer de
colon (19).
b. Fibra dietética
El papel de la fibra dietética en la carcinogénesis del colon fue propuesto por primera
vez por Burkitt (20) en 1969. La idea surgió de su observación clínica de que el cáncer de
colon (y otras alteraciones) era raro en los africanos, cuyas dietas eran ricas en alimentos no
procesados.
Posteriormente, diversos estudios epidemiológicos analíticos han demostrado la
asociación de la fibra con un menor riesgo de padecer cáncer colorrectal (21) -(22). En
estudios recientes se ha descrito que la más consistente e impresionante disminución del
riesgo se ha asociado con el consumo de verduras (23) -(24), para algunos autores, superior al
de fibra, cereales o fruta; siendo un hallazgo no limitado a verduras específicas o a grupos de
verduras (17). Además, independientemente del efecto de la fibra, las verduras contienen un
gran número de sustancias, tanto micronutrientes
como carotenoides y ascorbato, como no nutrientes, caso de los fenoles, los flavonoides, los
isocianatos y los indoles, con una diversidad de potentes propiedades anticarcinógenas.
La fibra se une a los ácidos biliares, disminuye el tiempo de tránsito, aumenta el
volumen de las heces y fermenta los ácidos grasos volátiles que pueden ser directamente
anticarcinógenos (25) y que, disminuyendo el pH, pueden reducir la conversión de los ácidos
biliares primarios en secundarios (26) -(28).
c. pH fecal
Thornton (29) propuso que un pH colónico alto promueve la formación de
cocarcinógenos a partir de ácidos biliares degradados por bacterias o colesterol, un proceso
inhibido a pH fecal inferior a 6,5.
De los estudios de Walker et al.(30) se desprende que las personas que son
familiarmente proclives y son pH fecal alto deberían ser aconsejadas a comer más fibra
vegetal para disminuir el valor de su pH fecal.
d. Consumo de alcohol
Desde finales de los años 60, son muchos los trabajos que describen una relación
entre el carcinoma rectal y el consumo de alcohol(31), sobre todo cerveza; sin embargo, el
colon en sí parece afectarse en menor medida. Un consumo de alcohol relativamente bajo, de
un litro de cerveza al día, duplica o triplica el riesgo de desarrollar un carcinoma colorrectal.
Estudios de experimentación animal parecen demostrar que aunque el alcohol no es
un carcinógeno en sí mismo, posee un efecto favorecedor del desarrollo de cáncer, es decir
co-carcinogénico(32). El alcohol actuaría desplazando los inhibidores de la dieta(33).
e. Calcio
17
Se ha propuesto que el calcio disminuye el riesgo de cáncer de colon a través de su
unión a los ácidos biliares y ácidos grasos, reduciendo así la exposición a estas sustancias
potencialmente tóxicas y carcinógenas (34) -(35). Además el calcio puede disminuir
directamente la proliferación celular(17), (36) -(38). Estudios realizados por Newmark et
al.(39), sugieren un efecto protector con dosis de 1500 a 1800 mg/día.
f. Metales trazadores
En los últimos años el papel de los metales trazadores se ha hecho más importante, en
estudios de laboratorio y clínicos en oncología. Estudios clínicos sostienen que la deficiencia
de selenio puede jugar un papel en la oncogénesis(40) y que la abundancia geográfica del Se
está relacionada indirectamente con tasas más bajas de mortalidad de cáncer(41) -(43).
g. Vitaminas
Se ha descrito una asociación negativa entre consumo de vitamina C y riesgo de
cáncer de colon(33),(44) ,(45). El consumo de vitamina A y sus precursores dietéticos se
asocia con una reducción del cáncer de colon(46). La vitamina A actuaría bloqueando la
formación de radicales libres(47). Shibata et al.(48) en un estudio prospectivo encuentran que
el riesgo disminuido de padecer cáncer de colon con suplementos de vitaminas A y C sólo es
significativamente estadístico en mujeres.
También los suplementos de vitaminas A, C y E se ha descrito que son efectivos para
reducir las alteraciones de la cinética celular que indican una condición preneoplásica(49).
h. Grado de actividad física

Diversos estudios indican que el riesgo relativo de padecer cáncer de colon aumenta
en relación con la disminución del grado de actividad física desarrollado durante el
trabajo(10),(50). La actividad ocupacional vigorosa muestra una reducción del riesgo de
cáncer de colon en hombres(51).
1. 2. 5. Factores genéticos
Diversos estudios sugieren que los factores genéticos juegan un papel importante en la
etiología del cáncer colorrectal(52).
En la población general, la mayoría de los casos de cáncer colorrectal se presenta de
forma esporádica. Sin embargo, se calcula que aproximadamente un 5-6% de los casos
aparecen en familias con predisposición genética a padecer este tipo de neoplasia. El
prototipo de estos cánceres sería la poliposis adenomatosa colónica familiar (APC, del inglés,
adenomatous polyposis coli), una enfermedad de herencia autosómica dominante que se
caracteriza por el desarrollo de numerosos pólipos colorrectales benignos, de los cuales,
algunos acaban malignizándose casi inevitablemente. Aunque gran parte de las características
esenciales de esta enfermedad se conocen desde hace más de 100 años, su base patogenética
es un descubrimiento reciente que fue posible sólo gracias a las técnicas de biología
molecular. En efecto en 1987, se localizó el gen responsable de la poliposis adenomatosa
colónica familiar en el brazo largo del cromosoma 5, a nivel de 5q21 ó 5q22(53) -(58).
Aunque la poliposis adenomatosa colónica familiar es responsable de menos del 1% de todos
los cánceres colorrectales, hoy en día se sabe que su gen tiene trascendencia clínica mucho
mayor, ya que participa también en las fases iniciales del cáncer colorrectal esporádico (no
familiar), aunque en algunas familias con poliposis no ha podido detectarse la presencia de
este gen defectivo (59).
18
También se han descrito mutaciones germinales del gen APC en pacientes que tenían
el síndrome de Gardner, una variante de la poliposis familiar en la que, además de los
adenomas colorrectales, se desarrollan tumores desmoides, osteomas y otras neoplasias.
Pueden definirse 3 tipos de cáncer colorrectal, en base a historia familiar de cáncer e
información fenotípica. El tipo esporádico se produce en ausencia de historia familiar de
cáncer de colon en familiares de primer grado. El tipo familiar se produce si existen
familiares de primer grado con neoplasia. Aunque estas categorías requieren la exclusión de
cáncer colorrectal hereditario. En este caso, se define como historia familiar de cáncer
colorrectal en un patrón con herencia autosómica dominante, que también implica ciertos
signos fenotípicos, como por ejemplo, adenomatosis colónica florida, lesiones benignas y
malignas extracolónicas, neoplasias primarias múltiples; particularmente, cáncer colorrectal
sincrónico y metacrónico(60).
El síndrome de Lynch tipo I presenta una predisposición hereditaria al cáncer de
colon y edad de comienzo temprana (alrededor de los 44 años), con una propensión (70%) a
la afectación del colon proximal, y un exceso de cáncer de colon sincrónicos y metacrónicos.
Mientras que el síndrome de Lynch tipo II, presenta un fenotipo de colon similar junto con
alto riesgo de carcinoma de endometrio. También se presentan en algunas familias el
carcinoma de células transicionales del uréter y pelvis renal, y carcinoma de estómago, ovario
y páncreas. Las estimaciones actuales indican que el cáncer colorrectal polipósico no
hereditario (CCHNP) puede suponer hasta un 6% del total de los cánceres colorrectales. No
existe ningún signo fenotípico premonitorio conocido o biomarcadores de la propensión al
carcinoma en los síndromes de Lynch(61). Sin embargo, recientemente se han descubierto
dos genes responsables del CCHNP, que son genes reparadores de ADN. El gen hMSH2,
situado en el cromosoma 2, es responsable del 60% de los tumores de este tipo. El otro gen,
el hMLH1, está localizado en el cromosoma 3 y es responsable del 20-30% de los casos(62).
Figura 1-1,(67)
Se conocen además cuatro tipos de alteraciones genéticas relacionadas con el cáncer

colorrectal:
1. Cambio en el contenido en ADN y errores en la replicación del mismo en secuencias
nucleótidas repetidas(63).
2. Pérdida completa del cromosoma 18(64), reordenación estructural del 17, conduciendo a
menudo a la pérdida de un brazo corto, y pérdida del brazo largo del cromosoma 5.
3. Activación por mutación puntual de los oncogenes celulares ras. Esta activación se
produce más frecuentemente para el c-Ki-ras y más raramente para el N-ras. Se han descrito
mutaciones puntuales en los codones 12 y 13 y 61(65) -(68).
4. Sobreexpresiones de determinados oncogenes como c-myc, c-myb o c-erbB2/neu o
proteína p53(7).
1. 2. 6. Antecedentes patológicos y grupos de riesgo
En la tabla siguiente se indican los grupos de riesgo más elevado para el cáncer
colorrectal. Algunos aspectos han sido comentados previamente en los factores genéticos o
ambientales, por lo que no se insistirá en ellos.
19
Riesgo medio
Edad
50 años o más, asintomático
Alto riesgo
Enfermedad inflamatoria intestinal
Colitis ulcerosa
Colitis granulomatosa
Poliposis adenomatosa familiar
Poliposis familiar
Síndrome de Gardner
Síndrome de Turcot
Síndrome de Oldfield
Poliposis juvenil
Cáncer colorrectal hereditario no polipoide
Síndrome del cáncer familiar
Cáncer colorrectal no hereditario sitio-específico
Historia familiar
Adenoma colorrectal
Cáncer colorrectal
Historia previa
Adenomas colorrectales
Cáncer colorrectal
Cáncer de mama, ovario y útero
Tabla 1-1
Factores de riesgo para cáncer colorrectal
20
a. Antecedentes de pólipos
La secuencia adenoma-carcinoma ha sido generalmente aceptada, y es una de las
bases fundamentales de los recientes estudios genéticos moleculares así como de screening y
prevención.
El riesgo de presentar cáncer de colon dependen del tipo histológico, tamaño y
número de adenomas. Los adenomas con componente velloso o de tamaño superior a 1 cm.
tienen un riesgo aumentado de 3,6 veces, y los que presentan adenomas múltiples grandes
tienen un riesgo de 6,6 veces más. En contraste un adenoma tubular o pequeños adenomas
múltiples sin displasia severa no aumentan el riesgo de cáncer de colon(1).
En un estudio multicéntrico llevado a cabo por Eddy et al.(68) se puso de manifiesto
que el 93% de los cánceres colorrectales aparecían sobre pólipos adenomatosos. También
describieron que los cánceres sobre pólipos adenomatosos tenían un tiempo de crecimiento
desde 1 cm. a cáncer invasivo de 7 años, con un rango de 0-14 años y que cerca del 5% de los
adenomas que alcanzan 5 mm. desarrollarán un cáncer invasivo. También que un cáncer
invasivo alcanza el estadio Dukes A en dos años, el B en 1 año y el C en otro año.
La distribución anatómica de los adenomas apoya además la idea de su potencial
maligno. Los adenomas del colon descendente distal y del sigma tienen una frecuencia más
elevada de malignización que los que aparecen en otros puntos del colon; esto se correlaciona
muy bien con la distribución del cáncer de intestino grueso(10).
Los familiares en primer grado de pacientes con poliposis colónica familiar presentan
una incidencia considerablemente aumentada de cáncer colorrectal, iniciándose alrededor de
los 20 años(70).
b. Enfermedad inflamatoria intestinal

La enfermedad inflamatoria intestinal, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn se
asocian a riesgo elevado de padecer neoplasia de intestino grueso. De 980 pacientes con
enfermedad de Crohn de afectación colónica, 13,5% desarrollaron estenosis. La frecuencia de
cáncer en pacientes con estenosis es de 6,8%(71).
Los pacientes con colitis ulcerosa tipo pancolitis tienen un riesgo aumentado de
desarrollar cáncer de colon. Este riesgo empieza a subir después de 10 años de enfermedad y
aumenta un 2% por año(7),(72).
c. Patología biliar previa

La actividad carcinogénica de algunos componentes de la bilis se ha descrito
previamente al estudiar los factores ambientales.
Se ha supuesto, por lo tanto, que las personas colecistectomizadas podían tener un
riesgo más elevado de desarrollar cáncer de intestino grueso, debido al flujo continuo de bilis
en el tracto digestivo. De hecho una revisión detallada del tema no ha demostrado una
relación evidente entre colecistectomía y riesgo de padecer cáncer de intestino grueso
considerado globalmente, si bien hay indicios a favor de un aumento de riesgo para el cáncer
de colon derecho en las mujeres(73).
I. 1. 3. Diagnóstico
1. 3. 1. Manifestaciones clínicas
El cáncer colorrectal habitualmente es silente durante un largo periodo de tiempo que
21
incluye las fase iniciales de su desarrollo en la pared intestinal(74).
La existencia de un carcinoma colorrectal debe sospecharse en base a datos de una
historia clínica cuidadosa. Los síntomas de alarma son básicamente los cambios inexplicables
en el hábito intestinal, sangre en heces, tenesmo, descarga de moco, síndrome anémico
crónico con microcitosis y ferropenia, y afectación del estado general con pérdida de peso. La
progresión local de la enfermedad puede producir obstrucción, especialmente en el sigma,
hemorragias y perforaciones, que empeoran notablemente el pronóstico. En el caso de
oclusiones o perforación intestinal, se presenta el cuadro de forma aguda y el diagnóstico de
la neoplasia suele hacerse durante el acto quirúrgico.
Los síntomas variarán, obviamente, según la localización del tumor. Los tumores de
colon derecho, que presentan una menor expresión clínica, raramente producen obstrucción
ya que existe un calibre mayor de la luz colónica y las heces son más líquidas, habitualmente
se manifestarán por anemia microcítica ferropénica, pérdida de peso y tumoración palpable
en fosa ilíaca y vacíos derechos, aunque en no pocas ocasiones se manifiestan con dolor no
siempre localizado en el lado derecho, que puede ser agravado o aliviado con las comidas, y
que puede ser confundido con el dolor de la úlcera péptica o de una colelitiasis. Los tumores
sigmoides debutan clínicamente con un cuadro de obstrucción en casi el 30% de los
pacientes. Si existe dolor, es típicamente cólico, suele aliviarse con las deposiciones y se
localiza preferentemente en la parte baja del abdomen. El carcinoma rectal produce
rectorragias en el 60% de los casos y tenesmo en el 75%, y ocasionan dolor con poca
frecuencia, pero cuando la tumoración rectal engloba los nervios pélvicos puede manifestarse
con dolor sacro o ciatalgia, y acompañarse de incontinencia(3).
1. 3. 2. Diagnóstico en el paciente asintomático
Diversos métodos han sido propuestos para ser aplicados en el cribaje del cáncer
colorrectal en las poblaciones de medio o alto riesgo de padecerlo tales como el tacto rectal,
el estudio de la presencia de sangre oculta en heces y diferentes métodos endoscópicos o
radiológicos.
De estos métodos el más simple es el tacto rectal al cual son asequibles los tumores
localizados a menos de 8 cm. del esfínter anal, lo que significa aproximadamente el 10-13%
de los cánceres colorrectales(75). No existe evidencia de que esta técnica reduzca la
mortalidad, pero por su simplicidad es obligada en toda exploración médica.
Los test de hemorragias ocultas en heces se han empleado como método de screening
de población en algunos países. Las ventajas que presenta el estudio de sangre oculta se
centran en que es un método simple, de bajo coste y que permite diagnosticar tumores en
estadios menos avanzados(76) pero aún disponemos de pocos trabajos que demuestren que la
aplicación de éste método de detección descienda la mortalidad por cáncer colorrectal(77).
Sus principales inconvenientes son su relativamente baja sensibilidad y especificidad que
obligan a veces a poner en marcha toda una serie de estudios complementarios para descartar
la existencia de un cáncer(78).
Los estudios endoscópicos tienen una alta sensibilidad (85-95%), el porcentaje de
falsos positivos es despreciable y además aportan la ventaja de que las lesiones observadas
pueden ser biopsiadas confirmando el diagnóstico y en ocasiones pueden ser técnicas
terapéuticas (polipectomías)(79). Sus principales inconvenientes son las molestias para el
paciente y el alto coste que supone cualquier campaña de diagnóstico precoz que asumiera
esta técnica para un amplio grupo de población. Además, existe en el caso de la colonoscopia
el riesgo de perforación de un 0,2%, requiriendo cirugía y con una mortalidad de un
22
7,5%(74). Las técnicas de screening mediante sigmoidoscopia se ha visto que reducen la
mortalidad por cáncer de recto y colon distal(80).
Dentro de las técnicas radiológicas, el enema con doble contraste es el que ofrece una
mayor sensibilidad (85%) con sólo un 3-4% de falsos positivos. Pero tiene el inconveniente
de las molestias para el paciente, alto coste y la desventaja frente a las técnicas endoscópicas
de que no permite un diagnóstico histológico y sus hallazgos deberán ser casi siempre
confirmados con endoscopia-biopsia(81).
La American Cancer Society (ACS) recomienda practicar un screening en los
pacientes asintomáticos que presentan riesgo aumentado de padecer cáncer colorrectal
consistente en un tacto rectal anual, un test de sangre oculta en heces anual y una
sigmoidoscopia cada 5 años(82). Recientes estudios, describen la utilidad de una única
sigmoidoscopia flexible realizada entre los 55 y los 60 años de edad en la prevención del
cáncer colorrectal, con un seguimiento colonoscópico adecuado en el 3-5% de casos que
presentan adenomas de alto riesgo (> 1 cm. o histología vellosa). La sigmoidoscopia como
screening debería identificar a la mayoría de personas con adenomas distales que tienen
probabilidades de desarrollar un cáncer(82). El screening de personas asintomáticas sin
factores de riesgo conocidos no está justificado en la actualidad(5).
1. 3. 3. Diagnóstico en el paciente sintomático

Una vez el paciente ya presenta algunos de los síntomas previamente descritos,
partimos de un diagnóstico clínico de sospecha y ponemos en marcha una serie de pruebas
complementarias para confirmar el diagnóstico.
La mayoría de autores coinciden en que la secuencia más habitual de maniobras
diagnósticas en el paciente sintomático es el tacto rectal, la proctosigmoidoscopia rígida o
flexible, la colonoscopia y el enema de bario simple o de doble contraste. Estas últimas
técnicas radiológicas son muy útiles en tumores inaccesibles, por diferentes motivos con la
colonoscopia y para valorar la existencia de otras lesiones metacrónicas(81),(71) ,(84).
La ecografía y la TC sola o asociada a técnicas de angiorradiolgía como la portografía
se usan como pruebas complementarias en el diagnóstico de extensión(85).
Desde el punto de vista analítico, el antígeno carcinoembrionario (CEA) está
generalmente elevado en el cáncer colorrectal. No se ha demostrado su utilidad en el
diagnóstico precoz, pero es muy útil para la predicción de recidivas antes de que exista
evidencia clínica de éstas, facilitando la eficacia de las intervenciones secundarias(86).
I. 1. 4. Anatomía patológica
Desde el punto de vista macroscópico, los carcinomas colorrectales adoptan

predominantemente dos formas: ulcerada y polipoidea. La forma más frecuente es la de
tumor ulcerado, que suele infiltrar por lo menos hasta la submucosa, es de bordes
sobreelevados y puede perforarse y formar fístulas.
Los tumores polipoides, de crecimiento exofítico, son menos frecuentes y suelen
corresponder a tipos histológicos de bajo grado y menos infiltrantes. Probablemente por estas
últimas razones los tumores polipoideos se asocian a un mejor pronóstico que las formas
ulcerativas. Estos tumores se encuentran preferentemente en el colon derecho(87).
En raras ocasiones los tumores colorrectales adoptan una forma de crecimiento con
engrosamiento difuso y rígido de la pared intestinal, con escasa manifestación en la superficie
23
luminal, similar a la linitis plásica del estómago.
Los carcinomas colorrectales pueden ser múltiples en el 3-6% de los casos, aunque en
algunas series estas cifra se eleva al 18%(88) -(90). Además el 20% de los pacientes con
cáncer colorrectal presentan adenomas sincrónicos(91). Esta cifra aumenta al 66% cuando
existe más de una neoplasia maligna(90).
1. 4. 2. 1. Adenocarcinoma
El tumor más frecuente en el intestino grueso es el adenocarcinoma. Su incidencia
global oscila entre el 75 y el 85% según las series(88),(92).
Histológicamente, se caracteriza por la formación de glándulas con mayor o menor
grado de diferenciación.
Los adenocarcinomas se dividen según el grado de diferenciación en
adenocarcinomas bien diferenciados, moderadamente diferenciados y poco diferenciados.
El grado de diferenciación de los adenocarcinomas se establece fundamentalmente en
base a la arquitectura o la configuración tubular o el grado de polaridad nuclear. Los
adenocarcinomas bien diferenciados presentan túbulos simples o complejos con aspecto
pseudocribiforme, las células suelen mantener cierta polaridad con los núcleos basales y son
de tamaño uniforme(93). Los adenocarcinomas moderadamente diferenciados muestran
túbulos simples, complejos o ligeramente irregulares, cuya polaridad nuclear se pierde o es
difícilmente identificable. Los adenocarcinomas poco diferenciados se caracterizan por la
presencia de glándulas irregulares o ausencia de su formación, con pérdida de polaridad
nuclear. Basándose en estos criterios, el 15-20% de los adenocarcinomas son bien
diferenciados, el 60-70% moderadamente diferenciados y el 15-20% poco diferenciados(94).
1. 4. 2. 2. Carcinoma mucinoso
La producción de material mucoide por los adenocarcinomas intestinales es un hecho
frecuente.
Deben distinguirse dos formas de carcinomas mucosecretores: a) el carcinoma coloide
o mucinoso, caracterizado por grandes cantidades de moco situado preferentemente fuera de
las células, y b) una variante más rara, constituida por células con moco intracitoplasmático y
núcleos localizados periféricamente, dispuestos individualmente o en forma de grupos sueltos
y difusamente extendidos a lo largo de toda la pared, del tipo células en anillo de sello(95).
Histológicamente, la característica de este tumor es la presencia de una gran reacción
desmoplásica que engloba a las células tumorales, las cuales muestran la imagen típica en
anillo de sello. También pueden observarse glándulas abortivas o células pequeñas
indiferenciadas.
El carcinoma mucinoso constituye aproximadamente el 15-16% de los tumores
colorrectales(96).
1. 4. 2. 3. Carcinoma de células pequeñas

El carcinoma de células pequeñas colorrectal es un tumor muy infrecuente que
histológicamente se parece al carcinoma de células pequeñas de pulmón(97). Algunos de
estos casos pueden presentar focos de diferenciación glandular o mucina. También pueden
encontrarse en relación con adenomas (45%). Estudios inmunohistoquímicos y
ultraestructurales han permitido establecer la naturaleza neuroendocrina de estos tumores, ya
que son positivos para marcadores neuroendocrinos como la enolasa neuronal específica y la
cromogranina, entre otros. En la mayoría de los casos se localizan en el colon ascendente(98).
24
1. 4. 2. 4. Otros tipos histológicos
El carcinoma escamoso puro de intestino grueso es un tipo histológico
extremadamente raro. La incidencia de este tumor es poco conocida, pero puede oscilar entre
el 0,25 y el 0,50%(99).
El carcinoma adenoscamoso es un tipo histológico que está constituido por elementos
glandulares y escamosos entremezclados. Su frecuencia es también baja(93).
Se han descrito algunos casos de adenocarcinomas colorrectales con diferenciación a
coriocarcinoma(100). Estos tumores presentan áreas de adenocarcinoma que coexisten con
áreas de diferenciación trofoblástica con presencia de células gigantes multinucleadas de tipo
sincitiotrofoblástico y en las que se puede demostrar la producción de gonadotrofina
coriónica.
Se han descrito casos aislados de otros tipos histológicos raros, como el carcinoma de
células claras o de tipo nefrogénico(88), el carcinoma phisialífero que se caracteriza por una
estructura papilar con presencia de células semejantes al cordoma(101). En estos últimos
años se han publicado casos de tumores intestinales con una diferenciación histológica
multidireccional. Así, se han descrito casos de adenocarcinoma con abundantes células
endocrinas que contenían serotonina, somatostatina, gastrina y otros péptidos, y casos de
carcinoma adenoscamoso con diferenciación carcinoide(102).
En el apéndice, el tumor más frecuente es el carcinoide. El adenocarcinoma de
apéndice puede desarrollarse como mucocele y, en casos excepcionales, producir implantes
peritoneales en forma de pseudomixoma(3).
La mucosa transicional o mucosa adyacente al tumor colónico se ha observado que

muestra alteraciones ultraestructurales e histoquímicas respecto a la mucosa normal alejada
del tumor. Histológicamente, las glándulas de la mucosa transicional (MT) están alargadas y
ramificadas(103). Se observa aumento de las sialomucinas y alteración en las proporciones
relativas de los distintos tipos celulares a lo largo de la cripta con persistencia de células
inmaduras en niveles altos de las criptas. Las células caliciformes están aumentadas en
número y tamaño(104).
El significado biológico de la mucosa transicional no está claro(105). Inicialmente se
pensó que podría ser un respuesta preneoplásica a un estímulo carcinogénico a partir del cual
se desarrollaría la neoplasia, pero algunos estudios inmunohistoquímicos describen un origen
no neoplásico de la mucosa transicional(106).
I. 1. 5. Localización
La localización por orden de frecuencia es, en primer lugar, en el recto (50%),
seguido de sigma (20%), colon derecho y ciego (12%), ascendente (5%), transverso (6%), y
descendente (7%)(3) (Figura 1-2).
I. 1. 6. Diseminación tumoral
Los tumores colorrectales presentan cuatro vías clásicas de crecimiento: la extensión

local, la diseminación por vía linfática, la diseminación hematógena y la implantación. En la
extensión local, el carcinoma crece hacia la luz o bien extramuralmente. Otra forma de
crecimiento local, es la invasión perineural que explica el dolor que refieren algunos
25
pacientes.
La diseminación a través de la vía linfática se produce de forma escalonada y depende
de la localización de la tumoración. Los tumores rectales dan metástasis primariamente a
nivel de los ganglios perirrectales y posteriormente a los hemorroidales. La vía normal de
diseminación de los tumores de colon se realiza de forma escalonada a través de los ganglios
pericólicos, intermedios, y finalmente, de los ganglios principales situados en la raíz de los
vasos mesentéricos, pasando luego a los ganglios periaórticos.
Las metástasis por vía hematógena afectan prácticamente siempre al hígado, siendo la
localización pulmonar la segunda en orden de frecuencia. El recto presenta un drenaje venoso
especial: las venas hemorroidales superiores que drenan al sistema porta y por tanto hacia el
hígado y las venas hemorroidales inferiores que drenan hacia la cava y por tanto la sangre que
proceda de las mismas alcanza los pulmones sin pasar por el filtro hepático.
Existe una tercera vía de drenaje a nivel rectal que se realiza a través de un plexo
venoso vertebral y las metástasis por esta vía se localizan en sacro-coxis, pelvis y columna
vertebral.
La implantación es un sistema de metástasis en el cual existe una liberación de células
tumorales viables que se depositan en otra superficie. Puede ser intraluminal al desprenderse
células de la superficie externa del tumor al interior de la luz y anidar en otro punto de la
superficie intestinal. Si el desprendimiento de células se produce desde la superficie serosa
del tumor la implantación se hará a nivel de la cavidad peritoneal (carcinomatosis peritoneal).
Finalmente pueden desprenderse células tumorales durante la manipulación quirúrgica del
tumor y pueden producirse implantes a nivel de la herida quirúrgica, en los márgenes
mucocutáneos de una colostomía y en cualquier punto de campo operatorio(74).
I. 1. 7. Clasificación
El carcinoma de colon es el tumor digestivo que tiene la relación situación
anatomopatológica/pronóstico mejor establecida.
En 1927, Lockhart-Mummery, al observar una relación entre el pronóstico y la
extensión de los tumores rectales, sugirió una clasificación clínica que posteriormente fue
modificada para incluir en ella datos patológicos(107).
Más tarde, Dukes modificó los criterios y desarrolló un sistema para la clasificación
anatomopatológica del carcinoma rectal. En el sistema de clasificación original propuesto por
Gordon-Watson y Dukes la profundidad de penetración en la pared intestinal era valorada
según el grado de invasión de las capas normales de la pared intestinal. Simpson y Mayo
usaron una modificación de la clasificación de Dukes de 1929-1930 para ayudar a analizar los
factores que influyen en la supervivencia en el carcinoma del colon por encima del recto-
sigma.
No obstante Dukes comprendió que estos sistemas de clasificación eran
excesivamente complicados para los cánceres rectales avanzados que solían verse en el St.
Marks Hospital. En 1932 propuso el sistema de clasificación actualmente vigente:
- Grado A de Dukes: "Los casos A son aquellos en los cuales el carcinoma está
limitado a la pared del recto sin haberse extendido al tejido extrarrectal y sin haber
metástasis en ganglios linfáticos".
- Grado B: "Los casos B son aquellos en los cuales el carcinoma se ha extendido por
continuidad a los tejidos extrarrectales, pero todavía no ha invadido los ganglios
regionales".
- Grado C: "Los casos C son aquellos en los cuales las metástasis están presentes en
los ganglios linfáticos regionales".
26
En 1935 Gabriel, Dukes y Bussey propusieron su única modificación al sistema de
clasificación anteriormente descrito. Los casos en los cuales estaban invadidos únicamente
los ganglios linfáticos regionales o en los que como mínimo la propagación no había
alcanzado los ganglios en el punto de ligadura de los vasos sanguíneos se clasificaron como
C1. Los casos en los que la propagación ganglionar había alcanzado el punto de ligadura de
los vasos sanguíneos se clasificaron como C2.
En 1949 Kirklin, Dockerty y Waugh(108) introdujeron una modificación en la
clasificación de Dukes: las lesiones A estaban limitadas a la mucosa; las lesiones B1 se
extendían a la muscularis propia, pero no la atravesaban; las lesiones B2 penetraban a través
de la muscularis propia, y las lesiones C eran las del tipo B1 ó B2 con invasión ganglionar
linfática.
En 1954 Astler y Coller propusieron una modificación al sistema anterior, las lesiones
C eran aquellas que contenían metástasis ganglionares linfáticas, pero fueron subdivididas en
categorías C1 y C2. Las lesiones C1 estaban limitadas a la pared intestinal con ganglios
positivos.
En 1967 Turbull et al. añadieron un cuarto estadio a la clasificación original de
Dukes(109), el estadio D que define metástasis tumorales en hígado, pulmón, hueso, siembra
de tumor, tumor inextirpable por invasión parietal o invasión a órganos adyacentes. A esta
clasificación puede añadirse dos nuevos tipos: D1 y D2. D1 incluiría tumores que podrían
tener posibilidades quirúrgicas de curación (invasión de órganos adyacentes, metástasis
hepática o pulmonar solitaria) y D2 incluiría las lesiones irresecables (metástasis hepáticas
múltiples o hepáticas más pulmonares, metástasis en médula ósea, etc.)(8).
La última clasificación TNM, es un sistema clinicopatológico, propuesto
conjuntamente por la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC) y el American Joint
Committe on Cancer (AJCC), tiene en cuenta la invasión de estructuras vecinas, además del
número de ganglios positivos: T1, invasión de la submucosa; T2, invasión de la muscularis
propia; T3, invasión de la subserosa o tejido perirrectal no peritonizado; T4, perforación del
peritoneo visceral o invasión directa de otros órganos o estructuras vecinas; N0, sin metástasis
en los ganglios linfáticos regionales; N1, metástasis en 1-3 ganglios regionales; N2, metástasis
en 4 ó más ganglios regionales; N3, metástasis en cualquier ganglio central; M0, sin
metástasis a distancia; y M1, metástasis a distancia. Posteriormente, la clasificación original
fue modificada puesto que la extensión del carcinoma de colon no podía valorarse por
completo clínicamente en el momento de la intervención quirúrgica y se añadieron una serie
de prefijos a la clasificación TNM para relacionarla con la extensión de la enfermedad en
localizaciones y momentos dados. Se relacionan a continuación: cTNM, estadio diagnóstico
clínico; sTNM, estadio de evaluación quirúrgica; pTNM, estadio patológico postquirúrgico;
rTNM, estadio en retratamiento; y aTNM, estadio en autopsia.(107),(110). Esta clasificación
TNM norteamericana ha sido considerada por muchos demasiado compleja para su uso
habitual.
I. 1. 8. Factores pronósticos del cáncer colorrectal
El estudio de los factores pronósticos mejora nuestro conocimiento de la historia

natural de la enfermedad, ayuda a comprender mejor sus mecanismos y a evaluar nuevas
formas de tratamiento(111).
Definiremos dos grandes grupos de factores pronósticos: uno, formado por los
factores pronósticos clínicos, que pueden ser obtenidos a través de la historia clínica o
mediante la exploración del paciente, y una segunda categoría de variables pronósticas
27
anatomopatológicas, que se establecen a partir del estudio de la biopsia o de la pieza de
resección quirúrgica.
1. 8. 1. Factores pronósticos clínicos

a. Sexo
La mujeres tienen una supervivencia más alta que los varones en la mayoría de los
tumores malignos. Las mujeres tienen una mayor esperanza de vida y por tanto una menor
mortalidad por todas las causas.
En relación al cáncer colorrectal, hay algunos estudios que demuestran una mejor
supervivencia de las mujeres(112), mientras otros autores no encuentran diferencias
significativas(113),(114). En análisis multivariantes, el sexo se demuestra como una factor
pronóstico independiente, hallándose siempre el sexo femenino asociado a una mayor
supervivencia(115). Algunos autores han observado que el efecto beneficioso para la
condición femenina sólo se observa en las mujeres que han estado embarazadas(116).
b. Raza
Diversos estudios realizados en Estados Unidos, encuentran un peor pronóstico en los
pacientes de raza negra, diagnosticados de cáncer, en comparación con los de raza
blanca(117). Este efecto de la raza sobre la supervivencia se ha observado en prácticamente
todas las neoplasias, y por tanto, también en el cáncer colorrectal. Los blancos afectados de
un cáncer colorrectal, tienen un riesgo de mortalidad más bajo que los de raza negra a lo largo
de toda la evolución de la enfermedad, y que las diferencias se mantienen dentro de las
distintas categorías del estadio tumoral, sexo, edad y nivel socioeconómico, únicamente la
primera permanece como variable pronóstica significativa(118).
c. Edad
La edad inferior a 30-35 años en el momento del diagnóstico se relaciona con un
pronóstico desfavorable según los autores(119). Este hecho ha sido atribuido a que en estas
edades el 60-80% de los casos son diagnosticados en estadios Dukes C y con metástasis. Las
formas histológicas de mal pronóstico tales como los adenocarcinomas mucinosos y
adenocarcinomas con células en anillo de sello son más frecuentes en los pacientes jóvenes
(hasta un 80%)(94) mientras que en los adultos son raras (5-15%). En un 40-50% de
enfermos jóvenes los tumores son mal diferenciados, y el 50% está localizado en el colon
derecho, lo que comporta un diagnóstico más tardío al presentar síntomas vagos como anemia
o dolor abdominal(120), vómitos, distensión abdominal y aproximadamente un 70% se
diagnostican por obstrucción(121).
También se ha atribuido el mal pronóstico de los jóvenes al predominio del sexo
masculino en este grupo.
Parece ser sin embargo, que si los tumores colorrectales se diagnostican en un estadio
precoz, el pronóstico no es peor que el de los pacientes de mayor edad(110).
La edad avanzada es también un factor que ensombrece el pronóstico del cáncer
colorrectal y de todos los tumores malignos en general, aunque es necesario ajustar la
mortalidad observada por la mortalidad esperada en un grupo de personas de la misma edad y
sexo.
En los pacientes de edad avanzada, el cáncer colorrectal no es más agresivo que en
otras edades, sin embargo, la edad avanzada puede conllevar ciertas limitaciones terapéuticas
puesto que los efectos secundarios de los tratamientos son más frecuentes, produciendo una
disminución de la supervivencia(122). De todos modos estudios recientes han sugerido que la
28
edad en sí no debe ser un factor determinante al considerar la conveniencia de una
intervención en pacientes con cáncer colorrectal.
d. Síntomas
La sintomatología con que se presenta la enfermedad, a menudo está relacionada con
el estadio. La hemorragia o el cambio de ritmo intestinal suelen ser síntomas asociados con
estadios más iniciales y por tanto, con mejor pronóstico, mientras que la anemia, la palpación
de una masa abdominal o una perforación u oclusión intestinal, son síntomas que ocurren en
estadios más avanzados.
Cuando el paciente está totalmente asintomático, como sucede en personas que son
diagnosticadas en un programa de screening, el pronóstico es mucho mejor que en los
pacientes con síntomas, la supervivencia es de un 75% a 80%, mientras que para los
pacientes sintomáticos es del 50% a los cinco años(80).
Hemorragia
La hemorragia es un factor de buen pronóstico en la mayoría de trabajos que han
analizado esta variable, si bien no es un factor pronóstico independiente de estadio(123).
Obstrucción intestinal
La obstrucción intestinal como primera manifestación de un cáncer de colon o recto
es relativamente frecuente, y supone un factor de mal pronóstico.
Las causas que explican este mal pronóstico son, entre otras, el estadio avanzado del
tumor, la gran actividad peristáltica del intestino ocluido que facilita la diseminación tumoral,
y una mortalidad operatoria superior al 15%. La mortalidad operatoria es menor en el colon
izquierdo, pero llega a alcanzar cifras del 29% en el colon derecho(124),(125).
Si el tumor oclusivo está situado en el colon derecho, el pronóstico es peor que en el
colon izquierdo. Por otra parte los tumores obstructivos de colon derecho tienen una
supervivencia tres veces menor que los tumores no obstructivos de la misma
localización(126).
La perforación intestinal, que con frecuencia se asocia a la oclusión, también es una
circunstancia que comporta un pronóstico muy desfavorable incluso independiente del
estadio(127).
e. Intervalo entre el primer síntoma y el diagnóstico

El retraso diagnóstico es un factor que puede condicionar el pronóstico. Se ha
comprobado que los pacientes con un retraso largo (de aproximadamente 5-6 meses), tienen
un mejor pronóstico que los enfermos con menor retraso(128). Este hecho, paradójico a
primera vista, se cree que es debido a que los tumores con sintomatología de menos de 6
meses de evolución tienen una mayor mortalidad operatoria, una tasa de cirugía radical más
baja, y además se asocian con síntomas de mal pronóstico como la obstrucción y perforación
intestinal.
f. Localización del tumor

Los tumores localizados en el colon tienen mejor pronóstico que los tumores rectales.
Dentro de las localizaciones colónicas, algunos estudios muestran un pronóstico más
favorable para el colon derecho en relación al izquierdo(129), sin embargo, otros autores
demuestran lo contrario, con un pronóstico especialmente grave en los tumores de ciego. En
los tumores de colon derecho hay una menor proporción de estadios Dukes A y un mayor
29
número de estadios avanzados que en las otras localizaciones del colon(130), lo que
explicaría su menor supervivencia a los 5 años.
Estos resultados discordantes podrían explicarse por la historia natural más larga de
los tumores de colon izquierdo y sigma, en los que se han descrito recidivas y muertes más
allá de los 5 años del diagnóstico, circunstancia que es más rara en los tumores de colon
derecho y transverso.
g. Variables clínicas preoperatorias

En un estudio del Medical Research Council de Gran Bretaña(131), la movilidad del
tumor al tacto digital o a la exploración endoscópica, fue la variable preoperatoria más
importante en los tumores de recto, seguida del número de cuadrantes afectados y que la
distancia entre el tumor se localizara a menos de 8 cm. del esfínter.
h. Tamaño del tumor

En la mayoría de tumores malignos el tamaño tumoral está relacionado con el
pronóstico y también ocurre así en el cáncer colorrectal, y especialmente en los tumores de
colon existiendo una correlación entre el tamaño y el nivel de penetración tumoral en la pared
del intestino; que como es sabido, tiene un importancia pronóstica considerable(132).
Steinberg et al.(123) en su estudio señalan que existe un incremento del riesgo de mortalidad
del 7% por centímetro de longitud tumoral.
i. Morfología tumoral
Los tumores exofíticos tienen un mejor pronóstico que los tumores anulares,
ulcerados o desmoplásicos(133).
1. 8. 2. Factores pronósticos anatomopatológicos
a. Nivel de penetración del tumor en la pared del intestino

Los pacientes con tumores en grado A de Dukes sobreviven más del 80% (80-95%) a
los 5 años. Los del nivel B, solamente de un 40 a 60%, y el nivel C menos del 40%(134).
b. Número de ganglios positivos

La supervivencia se reduce progresivamente según el mayor número de ganglios
afectados y en algunos estudios es un factor significativo para la supervivencia(135).
c. Invasión de órganos vecinos

La clasificación TNM, citada anteriormente, ha mostrado su utilidad pronóstica, en
los diferentes subgrupos, con supervivencia a los 5 años del 91% para el estadio T1, 84% para
el T2, 63% para los T3-T4, 56% para el N1, 38% para el N2, y 34% para el N3 (136),(137).
Nathanson et al.(138) en un artículo de revisión llegan a la conclusión de que la
clasificación de Dukes continúa siendo válida, si bien para mejorar su sensibilida pronóstica,
deberían incluir el porcentaje de ganglios positivos, la presencia o ausencia de ulceración del
tumor primario y la invasión de las estructuras vecinas. Deans et al.(107) en su estudio de
factores pronósticos en el cáncer colorrectal concluyen que la clasificación de Dukes sigue
siendo el mejor predictor de la supervivencia después de transcurrido más de 60 años.
d. Histología
El adenocarcinoma mucinoso o coloide tiene una tasa de recidivas superiores al
30
adenocarcinoma puro y se diagnostica con mayor frecuencia en estadios Dukes C y con
metástasis. La supervivencia de la variante mucinosa es menor que la del adenocarcinoma no
mucinoso(139),(140) , aunque existen discrepancias al respecto. Los estudios de Halvorsen et
al(96), sugieren que la presencia de componentes mucinosos probablemente no implican un
peor pronóstico excepto cuando se trata de un carcinoma con células en anillo de sello.
e. Grado de diferenciación
Diversos estudios han puesto de manifiesto la importancia del grado histológico como
variable pronóstica independiente en el cáncer colorrectal(107).
f. Invasión vascular
La invasión vascular reduce de forma significativa la supervivencia de los pacientes
con cáncer colorrectal independientemente del estadio y el grado de diferenciación(141). Se
ha observado una correlación entre la invasión vascular y la existencia de metástasis
hepáticas y también con la invasión perineural. Algunos estudios muestran un peor
pronóstico de la invasión intramural de los capilares por el tumor y otros, sin embargo,
recogen que la invasión de las venas próximas al tumor tiene un efecto más ominoso(142).
1. 8. 3. Otras variables pronosticas
a. Contenido de ADN y ploidia del tumor

Esta variable se estudia ampliamente en el apartado 6. 7. de la introducción.
b. Antígeno carcinoembrionario
Un nivel sérico alto de antígeno carcinoembrionario (CEA) en los pacientes que no
han sido operados tiene un significado pronóstico desfavorable, ya que las cifras de CEA
reflejan, de alguna manera el volumen y la extensión del tumor. Los pacientes con valores de
CEA inferiores a 200 ng/ml tienen una supervivencia estimada del 50% a los 5
años(143),(144).
Tomando la cifra de 5 ng/ml como el valor a partir del cual consideramos positivo el
CEA, se ha comprobado que sólo un 26% de pacientes con CEA positivo puede ser
intervenido de forma radical, mientras que si el CEA es negativo el porcentaje de cirugía
radical se eleva al 72%(13).
También se ha demostrado que los pacientes con un CEA positivo tienen tumores en
fases más avanzadas (53% son estadios C cuando el CEA es positivo y 21% cuando es
negativo)(145).
c. Determinantes genéticos:
La pérdida de heterocigosidad (LOH) de los cromosomas 17p, 18q y 22q es detectada
con más frecuencia en carcinomas avanzados que en carcinomas intramucosales, y LOH de
17p está significativamente correlacionado con la invasión vascular y LOH 18q está
correlacionado con la invasión linfática y metastásica(146). La pérdida de un alelo del
cromosoma 18q parece predecir un pobre pronóstico en pacientes con cáncer de colon en
estadio II. La tasa de superviviencia a los 5 años de los pacientes con enfermedad en estadio
II y 18q intacto es del 93%, y en los que presentan pérdida es comparable a los enfermos con
estadio III(147).
Las delecciones alélicas de Nm23-H1, un gen asociado con bajo potencial metastásico
localizado en el brazo largo del cromosoma 17 (17q21.3-22), están significativamente
31
asociadas con comportamiento más agresivo de los carcinomas colorrectales(148).
Las acumulaciones citoplasmáticas de la proteína p53 en los carcinomas colorrectales
es un indicador pronóstico independiente de superviviencia global, pero con un análisis
adicional con ploidia de ADN, el indicador p53 es significativo sólo respecto a la
supervivencia libre de enfermedad(149). Otro estudio confirma estos resultados en cuanto a
la supervivencia a corto plazo(150).
Los errores en la replicación del ADN se asocian a crecimiento exofítico, mayor
tamaño, pobre diferenciación, produción extracelular de mucina, reacción linfoide tipo
Crohn, y mayor expresión del gen p53 por inmunohistoquímica(63).
I. 2. Carcinogénesis colónica experimental

I. 2. 1. Razones para el uso de modelos experimentales carcinógenos animales
Es evidente, como en otros campos, que la única respuesta satisfactoria al problema
de la neoplasia maligna es su prevención. Esto necesariamente implica y demanda un cabal
conocimiento de los aspectos básicos de la carcinogénesis.
Se cree que los tumores inducidos químicamente (autóctonos) en los roedores son los
mejores modelos que tenemos a nuestro alcance para obtener resultados transferibles a la
situación clínica.
Una de la razones para su utilización es la gran dificultad en realizar estudios
prospectivos de variaciones ambientales en humanos, puesto que la tasa de crecimiento es
extremadamente lenta y la edad avanzada de aparición de la neoplasia necesitarían de un
periodo muy largo de seguimiento de una población expuesta para establecer cualquier
evidencia epidemiológica de causalidad(18).
También debemos señalar que, aunque los tumores en muchos órganos aparecen de
forma natural o pueden ser producidos fácilmente, las neoplasias de intestino de origen
natural en animales, son extremadamente raras(151). La escasa frecuencia de los tumores de
intestino, fue indicada ya en 1938 por Wells et al.(152), con la demostración de 19 ejemplos
de carcinoma intestinal en 142.000 autopsias de ratón. Tampoco existen cepas de ratas o
hámsters seleccionadas por su susceptibilidad para carcinoma intestinal espontáneo, del
mismo modo que las hay para leucemia o tumores mamarios. Se encuentra una excepción con
el Sanguinus oedipus, un primate nativo de Sudamérica que presenta una enfermedad del
colon genéticamente relacionada; consistente en tumores no polipoides que crecen de novo en
el epitelio mucosal, semejando cáncer colorrectal no polipoide hereditario o cáncer originado
en pacientes no portadores de pólipos con colitis ulcerosa. Los tumores están localizados en
el colon derecho en un 60%. Esta raza en particular está protegida y no está disponible para
investigación de cáncer(153).
De este modo, para un satisfactorio trabajo en el laboratorio son claramente necesarias
las lesiones producidas experimentalmente(154). Estos modelos reproducibles aportan la
oportunidad de estudiar la enfermedad y permiten al investigador manipular ciertas variables
tales como dieta, anatomía del colon, factores microbiológicos y parámetros inmunológicos
que pueden demostrarse como importantes en la etiología del cáncer de colon(155).
Por consiguiente, los modelos animales nos permiten estudiar las influencias que
pueden modificar el inicio y desarrollo del cáncer de colon bajo condiciones estrictamente
controladas y diseñar las analogías apropiadas para aproximarnos al entendimiento de la
etiología y también para conseguir los fines de prevención, diagnóstico y mejor manejo del
cáncer de colon en el hombre.
I. 2. 2. Principales carcinógenos conocidos
32
Los tumores de intestino han sido inducidos por distintos carcinógenos(156), que se
han desarrollado principalmente en estos últimos 40 años.
En la Tabla 1-2 se recogen los principales carcinógenos químicos así como el/los
investigadores que desarrollaron su uso y conocimiento, los animales susceptibles a los
mismos y el órgano diana de la acción carcinogenética.
Isótopo Itrio 91 Rata or Tubo digestivo Lisco, Brues, Finkel, Hansen, 1947
Irradiación por Rx Rata general Mucosa intestinal Brecher, Cronkite Peers, 1953
Irradiación por neutrones rápidos Rata general Mucosa intestinal Nowell, Cole, y Ellis, 1956
1,2-Dibezantreno Rata or Intestino Lorenz y Stewart, 1941
20-Metilcolantreno Rata or Intestino Stewars, 1953
Aceite lubricante Rata or Intestino Lushsbaugh y Hackett, 1948
20-Metilcolantreno Rata ir I. G. Rack, Kaufman, Simeone, 1955
Alcohol Rata ir I. G. Krebs, 1928
20-Metilcolantreno Rata sc I. G. Millers, Pybus, 1955
33
Cox, 1937. Bielschowsky 1944. Dunn y
Kessel 1945. Simeonides, 1954.
2- Acetamidofluoreno Rata Intestino Morris, 1955
Oído, hígado,
Bencidina (4,4-Diaminofenil) Rata intestino Spitz, Magninan, Dobriner, 1950
N-N-Dimetil-aminodifenil Rata Intestino Miller, Miller, Sandin y Brown, 1947
3,2-Dimetil-4-aninodifenil Rata sc, or I. D. e I. G. Walpole y Williams, 1958
Cicasina Rata or I. G. Laqueur, 1963
Rata, ratón, or, sc, ip,

1,2-Dimetilhidracina hamster ir I. D. e I. G. Druckrey, 1967
Azoximetano Rata, ratón or, sc, ir I. D. el. I. G. Druckrey, 1970
or, sc, ip,

Metilazoximetano Rata ir I. D. el. I. G. Druckrey, 1970
Rata, ratón,
N-metil-N’-nitro-N- conejo de
nitrosoguanidina indias ir I. G. distal Narisawa, 1971
Rata, ratón,
conejo de
3- Metil- N-nitrosourea indias ir I. G. distal Narisawa, 1971
3-Metil-2-aminonaftaleno Rata or, sc I. D. e I. G.
3-Metilcolantreno Hamster or I.G.

or= oral sc=subcutáneo ip=intraperitoneal ir=intrarrectal I. D.=intestino delgado I.G.=intestino grueso
Tabla 1-2
Principales carcinógenos conocidos.
Los tumores animales producidos por carcinógenos deben seguir unos criterios para
su utilización como modelos para estudios epidemiológicos y quimioterapéuticos(157).
1. Aparición unilocular del tumor.
2. Período de incubación tumoral relativamente corto, bien definido y con pequeña
desviación tumoral.
3. Tumor diagnosticable en el tiempo.
4. Biología tumoral paralela a su equivalente humano.
5. Quimiosensibilidad paralela a su equivalente humano(164) -(166).
Los carcinógenos químicos colónicos pueden ser clasificados en 7 grupos en base a su
estructura química, tal como se muestra en la tabla siguiente:
FAMILIA QUÍMICA CARCINÓGENO
Hidracinas 1, 1 - Dimetilhidracina (1,1-DMH)
1,2 - Dimetilhidracina dihidrocloruro (1,2-DMH)
Metilhidracina (MH)
Acido fórmico 2-4-(5-nitro-2-furil)-2-tiazolilhidracida
(FAH)
l-Metil-2-butilhidracina dihidrocloruro (MBH)
34
Trimetilhidracina hidrocloruro (TMH)
Compuestos azoxi Azoximetano (AM)
ONN-Metilazoxibutano (MAB)
Metilazoximetanol (MAM)
Metilazoximetanol glucósido, cicasina (MAMG)
Compuestos N-Nitroso N-Metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG)
N-Metilnitrosourea (NMU)
N-Nitrosobis (2-hidroxipropil) amina (BHP)
N-Nitrosobis (2-oxopropil) amina (BOP)
Dextrano sulfato y polisacáridos Asbestos
relacionados
Aflatoxina
Aminas ariles y heterocíclicas 3,2'-Dimetil-4-aminobifenil (DMAB)
2-Amino-3-Metilimidazolquinolina
Hidrocarburos aromáticos policíclicos 3-Metilcolantreno
Tabla 1-3
Familias químicas de carcinógenos (modificado de Green et al. 1987).
2. 2. 1. Compuestos relacionados con la cicasina
A continuación se comentan brevemente el grupo de carcinógenos relacionados con la

cicasina, comenzando con este compuesto natural y sus homólogos químicos a excepción de
la 1,2-Dimetilhidracina que merece un apartado propio al ser el carcinógeno utilizado en este
estudio.
2. 2. 1. 1. CICASINA
Procede de las nueces cycad, obtenidas de Cycas Circinalis, proveniente de la isla
Guam. Laqueur et al.(160) observaron en 1963; de forma casual, cuando buscaban una
posible causa dietética de la incidencia inusualmente alta de esclerosis lateral amiotrófica en
Guam, que las nueces de cycad desarrollaban tumores benignos y malignos, principalmente
en hígado y riñones y también en menor cantidad en pulmón e intestino en roedores.
Observaron las semejanzas entre los cambios patológicos existentes en ratas alimentadas con
comida de nuez cycad tóxica y las alteraciones publicadas en la literatura, que son producidas
por el compuesto carcinógeno dimetilnitrosamina en animales, sugiriendo la posibilidad de
que un glucósido aislado en las cycads, llamado cicasina diese lugar en su rotura metabólica a
un compuesto carcinogénico para ratas semejante al que se sugiere que da la
dimetilnitrosamina. Este supuesto, es hoy en día ampliamente aceptado. La cicasina es el
glucósido soluble en agua del metilazoximetanol.
Se abandonó su uso posteriormente, sin embargo, ya que las nueces de cycad no eran
fácilmente accesibles y la cicasina era químicamente inestable(167).
Laqueur et al. mostraron que la cicasina produjo cáncer de colon en ratas tras administración
35
oral y no parenteral.
La carcinogenicidad de la harina de cycad para el hombre es desconocida.
2. 2. 1. 2. 1,1-DIMETILHIDRACINA (CH3)2-N-NH2
La 1,1-dimetilhidracina, es un compuesto de síntesis que administrado en el agua de
bebida, produce tumores en ciego, riñón, pulmón, hígado y vasos sanguíneos
(angiosarcomas)(168).
Ha sido hallada en el tabaco, a razón de 147 ng/g de planta, así como en el
humo(169). En consecuencia, un gran segmento de la población está expuesto a ella, además
de a otros carcinógenos humanos. De todas formas, no se ha encontrado correlación clara
entre el hábito de fumar y la neoplasia colónica.
La 1,1-dimetilhidracina está presente también en el combustible de cohete(170).
2. 2. 1. 3. METILHIDRACINA (MH) CH3-NH-NH2

Un champiñón salvaje comestible Gyromita Esculenta contiene cantidades
importantes de acetaldehído de formilhidrazona y N-metil-N-forlhilhidrazina. Este último
compuesto produce MH bajo ciertas condiciones que mimetizan el medio del estómago
humano. Se ha estimado que anualmente, aproximadamente 1 millón de personas en todo el
mundo comen este hongo.
La MH también se usa como propelente de cohetes.
Produce pólipos adenomatosos y adenocarcinomas administrado en el agua de bebida
de hámsters(171).
2. 2. 1. 4. AZOXIMETANO (AM)
El azoximetano en inyección subcutánea o infusión rectal produce alta incidencia de
adenomas y adenocarcinomas en intestino grueso y delgado(169).
2. 2. 1. 5. AZOXIMETANOL (AOM)
El azoximetanol es esencialmente igual a la 1,2-DMH en términos de especificidad
para el colon, pero requiere menos reacciones de activación y está más próximo al
carcinógeno final.
Fiala(172) en sus estudios considera al AOM más adecuado que la DMH como
posible carcinógeno químico implicado en el cáncer de colon humano. La formación
endógena de AOM a partir de precursores accesibles, como la metilamina por la flora
bacteriana intestinal y por otros órganos tales como el hígado o el intestino parece bastante
fiable.
El azoximetano a una dosis de 8-15 mg/kg produce carcinoma intestinal en el 100%
de ratas por vía subcutánea o intramuscular(172). Ratas inyectadas con una dosis
relativamente alta de AOM desarrollan más tumores en el colon distal y en duodeno, y
aquellas inyectadas con dosis bajas tienen más tumores en colon proximal y ciego(154). En
ratones son más frecuentes las lesiones rectales. El AOM produce una toxicidad hepática de
hasta un 20% y los animales fallecen durante el periodo de inducción debido a necrosis
hepática(173).
2. 2. 1. 6. METILAZOXIMETANOL (MAM)
Es una aglicona de la cicasina. Fue descrita por Laqueur et al.(174) en 1966. Induce
neoplasias en hígado, riñones y tracto intestinal.
El MAM administrado por vía oral, subcutánea o intraperitoneal desarrolla adenomas
36
y carcinomas de colon(168).
2. 2. 2. Otros carcinógenos químicos
2. 2. 2. 1 COLANTRENOS
Lorenz y Stewart(157) publicaron el primer artículo de inducción química de tumores
intestinales en ratas en 1941. Alimentaron con dibenzantraceno y metilcolantreno a dos cepas
de ratones y documentaron carcinomas intestinales altos al igual que tumores de pulmón.
También producen un modelo de cáncer mamario en roedores(175).
No se vieron tumores colónicos en estos experimentos(166).
Posteriormente, se publicó que la alimentación con 3-metilcolantreno produjo cáncer
de colon en machos pero no en hembras de varias cepas de hámsters(176).
2. 2. 2. 2 N- METILNITROSOUREA (MNU)
La MNU induce tumores por alquilación. Su metabolismo da lugar al compuesto
Azometano.
El MNU es una sustancia inestable con vida media biológica muy corta.
En rata, hámster, ratón y conejillo de indias, la infusión intrarrectal de MNU induce
carcinoma invasivo y bien diferenciado, con una incidencia del 100%(163),(177).
Tras su aplicación endovenosa, los tumores se localizan en distintos órganos, tales
como hueso, estómago, intestino delgado, colon, páncreas, riñón, mama y SNC.
Histopatológicamente son adenocarcinomas con alto grado de invasión y baja
diseminación(178).
Su desventaja es el largo periodo de dosificación preciso para la inducción tumoral.
2. 2. 2. 3. N-METIL-N-NITRO-N-NITROSOGUANIDINA (MNNG)
En 1971, Narisawa et al.(163) mostraron que la N-Metil-N-Nitro-N-Nitrosoguanidina
instilada directamente vía rectal tiene un efecto carcinogenético directo(179),(180) , siendo
utilizada para estudios in vitro(167). Actúa directamente en el ADN y ARN de las células
diana, modificando la síntesis proteica(153) y precisa del efecto promotor del contenido
intestinal(181), en concreto de la acción de las bacterias intestinales.
Se degrada en medio alcalino al carcinógeno diazometano, sin necesidad de acción
enzimática. Esta degradación rápida es la responsable del cáncer.
Su administración intrarrectal tiene como resultado la inducción de pólipos adenomatosos y
cánceres colónicos en ratas(167),(182). Su desventaja son sus largos periodos de inducción y
de latencia (40 a 60 semanas)(153).
Por vía oral, produce una alta incidencia de adenocarcinomas gástricos y de intestino
delgado.
Cuando se inyecta subcutáneamente, produce sarcomas en el punto de la
inyección(176).
2. 2. 2. 4. N - NITROSO-ACETOXIMETIL-METILAMINA
Como otras nitrosaminas, no es per se un carcinógeno, pero se degrada al carcinógeno
Diazohidróxido.
Se administra intrarrectalmente. El tiempo de latencia es de aproximadamente 252
días y puede producir metástasis(153).
2. 2. 2. 5. BENCIDINA
37
La bencidina es carcinogénica para las ratas, produce hepatomas y adenocarcinomas
de recto en una pequeña proporción de animales, sobre todo machos.
Es más potente administrada subcutáneamente(183).
2. 2. 2. 6 AFLATOXINA
En los años 60 Newberne et al(184) describieron que la aflatoxina B1, un metabolito
del moho Aspergillus flavus, causa tumores de colon en ratas vitamino A deficientes cuando
se añade al agua de bebida, aunque la carcinogénesis colónica por aflatoxina no ha sido
estudiada y es desconocida(185),(186). La aflatoxina se usa principalmente como
carcinógeno hepático(187).
2. 2. 2. 7. 2'3 DIMETIL-4-AMINOBIFENIL (DMAB)

El primer producto que se conoció que inducía cáncer colónico fue el 2'3dimetil-4-
aminobifenil. Por administración oral o subcutánea en la rata el DMAB induce carcinoma de
colon y una mayoría de pólipos en 4 a 12 meses(153) con igual morfología, tipo histológico y
localización que el cáncer humano(159),(182).
El DMAB es secretado activamente en la bilis y transportado a las células diana vía
corriente fecal(176),(188). De este modo, la diversión de la corriente fecal mediante
colostomías previene el desarrollo de neoplasias colónicas(189), aunque aparecen neoplasias
extraintestinales.
I. 2. 3. 1,2 -Dimetilhidracina dihidroclorato (1,2 - DMH)

La 1,2 -DMH es el carcinógeno intestinal más usado.
En 1967, Druckrey et al.(161) pusieron de manifiesto que la DMH era
estructuralmente semejante al compuesto natural cicasina, describiendo que posee una
específica y real capacidad de producir tumores de colon en diversas especies de
roedores(190). La DMH es la mitad activa de la comida de nuez de cycad(167).
Es un compuesto de síntesis. Hoy en día, no se sabe que este compuesto aparezca en
la naturaleza. Es sintetizado para uso de laboratorio en cantidades limitadas.
La potencia y organoespecificidad de procarcinógenos químicos vienen en gran
medida determinados por la reactividad química y por la capacidad de que haya suficiente
cantidad de sus formas carcinogenéticas últimas en los tejidos diana. La cantidad del
carcinógeno final está en función de la actividad de las vías metabólicas que conducen a su
formación, de la actividad de las vías de detoxificación y también de las vidas medias
biológicas de todas las especies biológicas implicadas(171).
Druckrey postuló que la DMH sufre una serie de transformaciones químicas in vitro.
La activación metabólica de la DMH se muestra en la Figura 1-3,(161). En un primer paso
implica la oxidación a azometano, un gas a temperatura corporal, que aparece en el aire
espirado de las ratas tratadas con DMH. Una oxidación convierte al azometano en
azoximetano que entonces, mediante un proceso de N-hidroxilación, se convierte en
metilazoximetanol. El metilazoximetanol es químicamente inestable a temperatura corporal e
in vitro se descompone espontáneamente en formaldehído, agua y nitrógeno. Durante esta
descomposición se forma el agente alquilante metildiazonio, llamado carcinógeno final. Este
último es una sustancia altamente reactiva que forma iones metil-carbono, que se cree que
son responsables de las metilaciones de macromoléculas tanto in vivo como in vitro. La
alteración de las propiedades de las macromoléculas críticas como ADN, ARN y otras
proteínas, por alquilación y otras reacciones, es un paso esencial en la carcinogénesis
química.
38
Fiala et al.(191) corroboraron que el supuesto de la figura anterior se producía in vivo,
midiendo la excreción de metabolitos mediante cromatografía de gas y líquidos a alta presión.
Los grupos metilo de la DMH son importantes para determinar su especificidad de
acción. Reemplazando el grupo metil por un grupo etil da como resultado la producción de
tumores de cerebro, bazo, timo, glándula mamaria e hígado en lugar de colon(167). El
marcado de la DMH por deuterio ocasiona un cambio en los órganos diana. Los resultados
indican que la rotura del enlace C-H es cinéticamente importante en la activación del DMH
hasta su forma carcinogénica en órganos diana, y que la deuteración del sustrato permite un
mecanismo de diversión que hace que un efecto isótopo pequeño se haga relativamente más
extenso(192).
La 1,2-dimetilhidracina es un carcinógeno efectivo y selectivo de colon, debido a su
actividad alquilante en los ácidos nucleicos del epitelio intestinal y sus propiedades
mutagénicas(193). Actúa modificando el genoma de la célula, ocasionando eventualmente
alteraciones del fenotipo celular, tales como pérdida de diferenciación, invasividad o
conducta proliferativa anormal. La N-metilguanina y la O-6-metilguanina han sido aisladas
del ADN de la mucosa colónica de ratas inyectadas con(14) C-DMH y en colon de rata
cultivado tras incubación con DMH marcado. Los niveles iniciales de O-6-metilguanina son
más altos en algunos órganos no diana que en el colon, pero ya que la tasa de reparación del
colon es más lenta, el lapso de descodificación se prolonga por más tiempo.
La potencia y organoespecificidad de procarcinógenos químicos están en gran medida
determinadas por la reactividad química y por la capacidad de que haya suficiente cantidad de
sus formas carcinogenéticas últimas en los tejidos diana. La cantidad del carcinógeno final
está en función de la actividad de las vías metabólicas que conducen a su formación, de la
actividad de las vías de detoxificación y también de las vidas medias biológicas de las
especies implicadas(171).
2. 3. 1. Organotropismo, vías de administración y dosificación
La vía de administración afecta al organotropismo del carcinógeno, mostrando la

importancia de los diferentes tejidos en la activación y detoxificación de la DMH. Las
instilaciones intracolónicas simples o múltiples de DMH en ratones producen adenomas y
adenocarcinomas de los pulmones, angiomas y angiosarcomas de vasos sanguíneos(194) y
fibrosarcomas subcutáneos.
También se ha observado, que dosis bajas diarias de DMH en el agua de bebida
producen hemangioendoteliomas de hígado y no tumores colónicos. Sin embargo, la misma
dosis total administrada una vez por semana produce cáncer de colon en la mayoría de las
ratas(153).
Usualmente, la DMH se administra por vía subcutánea, y en unas dosis que van de 7 a
21 mg/kg de 12 a 20 semanas, ó 40 a 200 mg/kg en una única inyección.
También puede administrase por vía oral, en el pienso, a razón de 21 mg/kg/semana
durante 12 semanas(153) o en el agua de bebida.
El órgano de manifestación y la distribución tumoral depende de la dosis del
carcinógeno. Se considera que la dosificación óptima para la inducción selectiva de tumores
de colon es de 10 mg/kg durante 25 semanas (dosis total de 250 mg). Este tiempo de
inducción idóneo de 180-240 días proporciona una tasa tumoral del 90%, incluso algunos
autores hablan de un 100%(166),(195) , en todas la localizaciones. El periodo de latencia,
definido como el intervalo de tiempo entre la primera inyección de carcinógeno y la aparición
de tumores, es aproximadamente de 6 meses a dosis de 10-20 mg/kg/semana. Con una
39
dosificación más alta de DMH, la incidencia de tumores extracolónicos aumenta. Al
disminuir la dosis, aumenta el periodo de latencia y los animales desarrollan menos tumores
colónicos y extracolónicos(166) así como metástasis(196).
Incluso una dosis simple de DMH producirá tumores, con un periodo de latencia
estimado de 15-20 meses(166), aunque estudios más recientes describen un alta incidencia
tumoral con un periodo de latencia de 9 meses(197).
Los componentes de la corriente fecal no son capaces de activar la DMH administrada
intrarrectalmente, ya que no aparecen tumores localmente por esta vía.
Sin embargo, experimentos de transposición de colon a yeyuno y viceversa han
demostrado susceptibilidad específica de colon, en comparación con mucosa de intestino
delgado, en la que no aparecen tumores; a la carcinogenicidad de la DMH(198). Rubio et
al.(199) describieron que se producen tumores en los segmentos desfuncionalizados de colon,
aunque en menor proporción que en los segmentos funcionantes, sugiriendo que factores
endógenos del contenido intestinal facilitan la carcinogénesis químicamente inducida(200).
Se ha demostrado que el trauma quirúrgico aumenta la carcinogénesis de colon en la rata. Las
reacciones locales vasculares e inflamatorias probablemente desempeñan un papel en este
fenómeno. También se ha descrito la importancia de la técnica de sutura y material
usado(201) en la anastomosis como promotoras de carcinogénesis. Las suturas
seromusculares, que no atraviesan la mucosa del colon, inducen menor proporción de
neoplasias perianastomóticas que las transmurales(202). Se ha descrito que tras el daño
quirúrgico se produce proliferación de las células de las criptas del colon y entran más células
en ciclo mitótico, etapa en las que parecen ser más receptivas a las influencias
carcinogenéticas(203),(204). También la producción química de colitis puede predisponer a
las células colónicas epiteliales de la rata al efecto carcinogenético de la DMH(205).
2. 3. 2. Acciones de la DMH
La DMH induce proliferación celular en la cripta colónica, previo al desarrollo de

atipias focales.
La mayoría de tumores inducidos están localizados en el intestino grueso.
Como ya hemos dicho la especificidad colónica está ligada a la dosis y el momento de
observación.
Los tumores son generalmente múltiples, con semejanza próxima a los tumores
humanos(206). Se acompañan de anorexia, pérdida de peso, heces sanguinolentas,
obstrucción intestinal y, ocasionalmente, invaginación(207).
En la rata hay pocos pólipos adenomatosos benignos y una mayoría de
adenocarcinomas aparecen de novo sobre mucosa plana(208),(209) , aunque estudios tiempo-
dependientes demuestran que no de forma excluyente(210). Estos adenocarcinomas más o
menos diferenciados se localizan en la mitad distal del colon izquierdo y generalmente, no
son muco-secretores(211). Los carcinomas mucinosos y de células en anillo de sello
prevalecen en el colon proximal y ciego; siendo a menudo más metastásicos que los del colon
izquierdo. Las metástasis son locales, peritoneales, en los ganglios linfáticos regionales o a
distancia(153). Las metástasis hepáticas son excepcionales, en contraste con lo que ocurre en
los tumores colónicos humanos, en los que supone una causa muy importante de
muerte(166),(212); sin embargo, líneas celulares obtenidas a partir de adenocarcinomas de
colon de rata transplantable que fue inducido por administración subcutánea de DMH,
desarrollan metástasis de hígado y pulmón(213).
En los ratones se encuentran pocos adenocarcinomas y prevalece una mayoría de
40
pólipos.
Se ha descrito que 4 semanas es el intervalo necesario para que la mucosa del colon
vuelva a su estado normal tras los efectos tóxicos agudos de una inyección de DMH.
El modelo de DMH nos lleva a una diseminación tumoral (en el 93% de los casos) en
contraste con otros modelos.
Su desventaja es la alta incidencia de tumores primarios en otros órganos. Por ruta
subcutánea, inyecciones de DMH simples o repetidas inducen tumores de intestino, riñones,
hígado, glándulas de Zymbal de la oreja en la rata(214); e intestino grueso, ano, pulmones
(predominantemente de crecimiento alveolar)(215), hígado, riñones y vasos sanguíneos en
ratones(216). También produce megalocitosis hepática y aparición de úlceras gástricas(217).
Otra desventaja es la localización tumoral en todo el colon que dificulta el control del
tamaño y crecimiento tumoral.
La DMH induce cambios en los lípidos plasmáticos, aumenta el colesterol libre y
diminuye los niveles de fosfolípidos en los animales tratados(217).
La DMH es diurética a dosis de 21 mg/kg de peso(169).
2. 3. 3. teorías carcinogénicas del cáncer de colon inducido por DMH. Mecanismo de acción
La carcinogénesis como un largo proceso multietapas fue descrito por primera vez por
Blerenblum(218) en 1941 para explicar cómo hidrocarburos policíclicos inducían cáncer
epidérmico en ratones. Este autor encontró que la aplicación de benzopreno en la piel de los
animales no causó cáncer, excepto cuando se aplicó repetidamente aceite de crotona. El
aceite de crotona solo o aplicado antes del carcinógeno no produjo neoplasias. De tales
experimentos dedujo que el cáncer se produce lentamente en dos etapas separadas: una
primera etapa de iniciación y una segunda de promoción. Esta teoría se extendió
posteriormente al cáncer de todos los órganos, incluyendo las neoplasias de colon.
La aceptación de la carcinogénesis como un modelo multietapas era unánime, hasta
que en 1981 A. Maskens(193), publicó un revolucionario trabajo en el que utilizando la
lógica matemática, la estadística y el cálculo de probabilidades demostró fehacientemente que
la carcinogénesis es un fenómeno en dos etapas, que además no se corresponderían con los
experimentos clásicos de iniciación-promoción.
La carcinogénesis por DMH en el colon de la rata es un proceso en 2 etapas y el
producto de las tasas a las que cada paso aparece es de alrededor de 2x10-8/célula en
riesgo/dosis de DMH/año.
El tratamiento con DMH es capaz de inducir directamente un cambio estable y
transmisible en un número de células epiteliales que por consiguiente estarían en riesgo
respecto a un segundo suceso capaz de iniciar el crecimiento tumoral.
Este cambio es transmisible dentro de la mucosa, que se renueva por períodos
prolongados. Las células afectadas no tienen expresión fenotípica en términos de ventaja
proliferativa.
El segundo cambio no requiere exposición al carcinógeno (aunque la presencia
continuada del carcinógeno puede probablemente contribuir a ello) y afecta aleatoriamente a
las células expuestas al carcinógeno a una tasa que es constante, al menos dentro del tejido
considerado(219).
La suposición más razonable es que el primer paso representa una mutación somática.
Las propiedades químicas y biológicas de la DMH, sus propiedades mutagénicas así como la
naturaleza transmisible y estable de sus efectos en el epitelio intestinal apoyan este
mecanismo. Cada inyección de DMH entra en interacciones inespecíficas diseminadas con el
41
ADN y otros constituyentes macromoleculares celulares y es probablemente capaz de inducir,
sobre una base aleatoria, una primera mutación específica en una proporción dada de células
del colon.
Esta células estarían en riesgo para el segundo cambio, que permitiría la expresión del
fenotipo cáncer. En tal sistema, el umbral teórico de la dosis de carcinógeno sería la dosis
más pequeña capaz de inducir la primera mutación específica en al menos una célula. En este
momento, existe un mecanismo en el epitelio del colon que puede aparecer
independientemente de la exposición al carcinógeno y es capaz ya de producir un efecto
mutacional específico en las células.
El cáncer en este ejemplo es el resultado de una mutación somática recesiva inducida
por DMH, seguida de una conversión del mutante recesivo a un estado homocigótico, siendo
la tasa de conversión una propiedad intrínseca del tejido cólico. Durante una exposición
prolongada la DMH puede, en consecuencia, incrementar también la incidencia de cáncer
afectando al segundo gen homólogo en las células heterocigóticas.
La organoespecificidad de la DMH depende de reacciones de oxidación catalizadas
por reacciones enzimáticas no identificables en los tejidos diana. Estudios autorradiográficos
utilizando DMH marcada con(14) C muestran que este agente es captado por el hígado
aproximadamente 1 hora después de la inyección y en las células epiteliales del colon 3 horas
después de la misma. La DMH es excretada primariamente por el pulmón y riñones que
eliminan del animal aproximadamente un 50% de la dosis inyectada. Los principales
metabolitos en aire espirado son CO2 y azometano(220); la orina contiene, DMH inalterada,
azoximetano, azometano y metilazoximetanol. Se presume que el hígado es el lugar primario
de oxidación de DMH a metilazoximetanol (MAM), que es entonces transportado vía sangre
y /o corriente fecal al colon y otros órganos, aunque otros estudios indican que el colon en sí
mismo contiene tipos celulares epiteliales o enzimas capaces de convertir la DMH en
productos mutagénicos sin implicar necesariamente metabolismo intermediario por
hepatocitos(221),(222) , de hecho la mucosa colorrectal implantada en el estómago es
sensible a la tumorigénesis causada por DMH(223). También se ha observado que el tránsito
intestinal enlentecido induce un número aumentado de neoplasias colónicas en relación con el
contacto prolongado con la mucosa del carcinógeno o debido a una mayor concentración en
la luz colónica(224). Los estudios de Stralka et al.(225) usando anticuerpos policlonales anti
P450, IIB1 y IIA1 postulan un sistema de metabolización de la droga P450-dependiente en el
colon capaz de activar y metabolizar el modelo de carcinógeno colon-específico 1,2-DMH.
Algunos inhibidores metabólicos pueden interrumpir la activación del DMH y prevenir la
inducción tumoral. Algunos antioxidantes como el disulfiram y otros compuestos
relacionados como el carbón disulfuro o el bis (etilxantógeno) son capaces de inhibir la
carcinogénesis inducida por DMH y azometano (AOM) inhibiendo la N-oxidación en vivo de
azometano a azoximetano y la C-oxidación del AOM in vivo(226) -(229).
Los estudios de Davies et al.(230) demuestran que aparecen alteraciones en la bomba
de Na -K+ en la mucosa premaligna de animales tratados con DMH meses antes de que se
+
desarrollen tumores visibles y estos cambios pueden explicar parcialmente los niveles
alterados de Na+ y K+ en el citoplasma y membrana basal de colonocitos premalignos y
malignos(231),(232). La despolarización epitelial se produce tras la inyección del
carcinógeno(233).
2. 3. 4. Factores constitucionales y regulación
Especies, raza, sexo y edad influyen en la inducción de carcinoma intestinal.
42
Las especies y las razas dentro de las especies muestran grandes diferencias en
susceptibilidad al carcinógeno. Los conejillos de indias son resistentes a la carcinogénesis
inducida por DMH. Los hámsters son extremadamente susceptibles a DMH y son necesarias
dosis muy bajas para evitar toxicidad hepática(153).
Las ratas y los ratones responden bien a carcinogénos pero con grandes variaciones
entre las diferentes razas(212),(234) , mostrando incluso distinta susceptibilidad para los
diferentes segmentos anatómicos del colon(235). Las razas más sensibles a la DMH son
Fisher, Sprague-Dawley y BD-IX.
Las susceptibilidades genéticas encontradas en diferentes razas de ratón podrían
explicar las diferencias en la capacidad de metabolizar el carcinógeno a su forma activa, pero
no se encontró ningún sistema enzimático principal deficiente que sustente esta hipótesis.
Estudios genéticos más recientes mostraron una falta de herencia dominante y la acción o
presencia de genes supresores. Dos factores genéticos, al menos, podrían influir en la
resistencia a DMH, uno gobernado por el metabolismo del carcinógeno y el otro controlado
por el género.
Los roedores hembras son ligeramente menos susceptibles que los machos a la acción
carcinogenética de la DMH(192). La administración de andrógenos a ratas macho BD-IX
castradas incrementa la incidencia de cáncer de colon(236).
La edad es importante en la organoespecificidad del carcinógeno. El tratamiento
prenatal de monos con DMH induce nefroma embriológico, similar al tumor de Wilms(237).
Experimentos con una inyección de DMH a ratas de 1, 10 ó 30 días mostró que el
carcinoma de colon apareció sólo en las ratas tratadas de 30 días. Los machos neonatalmente
androgenizados y tratados con DMH desarrollan una mayor proporción de tumores colónicos
que sus controles(238).
Otros factores autocrinos potenciales, como factor de crecimiento insulínico,
transferrina y gastrina podrían tener gran valor en la regulación de los tumores colónicos.
Además de la secreción de factores estimuladores del crecimiento, las células colónicas
tumorales secretan y responden a factores inhibidores del crecimiento(153).
Se ha observado que la esplenectomía aumenta la incidencia de tumores malignos sin
alterar la presencia de tumoraciones benignas. Se cree que la capacidad del bazo de proteger
los animales de la inducción de tumores colónicos es probablemente debida a la preservación
de la vigilancia inmunológica en el huesped(239).
2. 3. 5. Influencia de factores ambientales
Dieta, ácidos biliares y bacterias, tienen influencias por sí mismas y por su acción
sobre el metabolismo de la DMH.
Estudios experimentales en animales sostienen la hipótesis de que la composición cualitativa
de los ácidos grasos es uno de los factores determinantes en la carcinogénesis colónica. El
tipo y cantidad de grasa dietética afecta al metabolismo microsomal de los carcinógenos,
reforzando la iniciación tumoral(240) -(247), modificando la respuesta del tejido colónico al
desafío genotóxico(248), incluso alterando el sistema inmune(249). Se ha observado que
restricciones calóricas severas en la dieta pueden inhibir el crecimiento de los tumores de
colon inducidos por DMH(250),(251). Otros autores demuestran que ni una reducción
moderada en la toma de grasas ni un aumento en los carbohidratos en la dieta ni una dieta
vegetariana es probable que den como resultado una reducción sustancial en la incidencia de
cáncer de colon(252).
El papel de las proteínas es controvertido, sin efecto en algunos experimentos o con
43
un efecto de refuerzo en la aparición tumoral en animales alimentados con un alto contenido
en proteínas comparado con animales que reciben un bajo contenido, independientemente del
tipo de proteínas(190). Igualmente se ha descrito el papel de las proteínas de la leche en el
desarrollo de tumores inducidos químicamente y en el tiempo de supervivencia de las
ratas(253).
Ratas con pH ácido en las heces producido por consumo de lactulosa, sulfato sódico o
ambos tienen significativamente menos tumores colónicos tras inyecciones con DMH que las
ratas tratadas con DMH solo(254).
La fibra dietética es un buen candidato para el papel protector en cáncer de colon y
está sostenida por datos epidemiológicos, pero los modelos experimentales animales aportan
resultados aparentemente contradictorios de acuerdo con la naturaleza de las fibras
estudiadas. El efecto protector de la fibra dietética consistiría en un aumento en la masa fecal
y dilución de ácidos biliares y otros carcinógenos fecales. Los suplementos de celulosa en la
dieta (5-15%) producen una supresión de la actividad mitótica reforzada por la DMH en las
criptas del colon descendente durante el estadio de iniciación de la carcinogénesis(255). Este
hallazgo se correlaciona con una reducción del número de animales que presentan tumores
colónicos y una incidencia significativamente más baja de adenocarcinomas en ratas
mantenidas con suplemento de celulosa a lo largo de las etapas de iniciación y de
promoción(256),(257). En ratas a las que se alimentó con dietas ricas en frutas y vegetales se
observó una baja incidencia de adenomas; si además tomaban una dieta con fritos y asados de
tipo humano, frutas y verduras no mostraron protección total, pero sí disminuyeron la
incidencia de carcinomas(258). Una dieta alta en proteína animal y grasa, correlacionada con
alto riesgo de cáncer de colon, se asocia con un aumento en enzimas bacterianas capaces de
generar carcinógenos en el intestino. Hay una correlación entre actividad enzimática
bacteriana aumentada y conversión creciente de procarcinógenos a carcinógenos proximales
en la corriente fecal. La DMH se ha visto que induce alteración en la actividad de las enzimas
bacterianas colónicas(259). Animales libres de gérmenes tratados con DMH tienen menor
incidencia de tumores de colon en comparación con las ratas convencionales. La microflora
intestinal interfiere con el metabolismo de los ácidos biliares y con la grasa dietética, factores
todos que ejercen gran importancia en la activación de la carcinogénesis por DMH(260) -
(262). Los ácidos biliares secundarios, deoxicólico y litocólico son estructuralmente
semejantes a compuestos que se sabe que son carcinógenos(263), como los colantrenos.
Morvay et al.(264) mostraron un aumento de la incidencia de tumores colónicos en ratas con
niveles diarios totales de ácidos biliares y concentración de ácido biliar en el lado izquierdo
del colon aumentados(265). Otros autores, consideran que los ácidos biliares no desempeñan
un papel en los tumores colónicos inducidos por DMH(266).
La carcinogénesis química en animales de experimentación ha sido inhibida por gran
número de compuestos con diversas estructuras químicas. Un posible efecto protector del
selenio ha sido encontrado en carcinomas inducidos por DMH(267). La inhibición de la
carcinogénesis colónica por antioxidantes como el selenio es multifacética. Los niveles de
fosfolípidos poliinsaturados (componentes de las membranas biológicas) son muy sensibles a
la peroxidación. Los radicales libres generados pueden romper la estructura y la integridad
funcional de las membranas, alterar las propiedades de transporte, y causa daño potencial en
el ADN, ARN y proteínas diana. La enzima superóxido dismutasa proporciona una defensa
fisiológica normal al potencial daño de estos radicales(268).
Otro oligoelemento como el germanio orgánico previene el cáncer intestinal en este
modelo(269). Los resultados más prometedores conciernen al efecto protector del calcio
dietético en la carcinogénesis colónica(270),(271). Los estudios de Sitrin et al.(272)
44
mostraron que el calcio disminuye significativamente el número de ratas con tumores
múltiples y el tamaño tumoral, y que estos efectos estaban abolidos por el déficit de vitamina
D; postulando, por lo tanto, que la DMH aumenta los niveles de poliamina en la mucosa
colónica premaligna en ratas, efecto que se anula con calcio dietético alto. El calcio
suplementario se ha mostrado que inhibe el aumento de proliferación inducida por sales
biliares y ácidos grasos en animales de experimentación(273),(274), probablemente
enlazándose a los mismos e inhibiendo su acción tóxica(275) y disminuyendo sus niveles
totales en heces(276). Otros estudios han demostrado que los suplementos de calcio dietético
son capaces de inhibir las mutaciones K-ras observadas en los tumores inducidos por
DMH(277). Diversos estudios han confirmado el papel de los -carotenos en la prevención de
cáncer de colon inducido por DMH en ratas y ratones(278),(279) , entre un 60-100%(280).
También se ha descrito que la vitamina A podría tener efecto antiproliferativo y
anticarcinogenético directo y que ratas deficientes en vitamina A y expuestas a DMH
presentan una incidencia aumentada de carcinoma de colon(185),(281) , sobre todo en
animales a los que se administró alto contenido de grasa en la dieta(282). Igualmente, algunos
investigadores han descrito que suplementos de vitamina E reducen la incidencia tumoral en
ratones(283), si bien experimentos de otros autores refieren resultados contrarios, en los que
la deficiencia de vitamina E no promovió la incidencia tumoral(284),(285). La administración
subcutánea de 1,25-dihidroxivitamina D3 previo a la agresión carcinogénica reduce
significativamente la incidencia de tumores colónicos, presumiblemente actuando como
antiproliferativo(286). Se ha descrito que la vitamina C presenta un efecto protector sobre la
carcinogénesis inducida por DMH, probablemente por su capacidad de reaccionar
directamente con el carcinógeno(268). A pesar de todo, otros autores sugieren que niveles no
tóxicos de vitaminas es improbable que inhiban específicamente el proceso de
carcinogénesis(252).
Los suplementos de potasio en el agua de bebida muestran de forma significativa
prevención parcial de la inducción de tumores en intestino delgado de ratas Sprague-Dawley
tratadas con DMH, y también se observó disminución en la incidencia de tumores colónicos y
de glándulas de Zymbal, aunque no con significación estadística(287).
Wargovich y Newmark(288), evaluaron la capacidad de los flavonoides para proteger
frente al daño en el ADN colónico inducido por DMH. No producen abolición de núcleos
aberrantes lo que sugiere que son inactivos en las fases de iniciación de la carcinogénesis.
Los estudios de Caderni et al.(289) sugieren que el almidón tiene un efecto protector
contra la carcinogénesis colónica en ratas tratadas con DMH y alimentadas con dietas ricas en
grasa, baja en calcio y celulosa.
Estudios epidemiológicos describen que altos niveles de legumbres dietarios han sido
asociados con bajas tasas de cáncer en general, y se correlacionan inversamente con las
incidencias de cáncer de mama, colon y próstata. Las legumbres se sabe que contienen altas
concentraciones de inhibidores de proteasa, al igual que otros agentes como lectinas que
pueden modificar la carcinogénesis. Los inhibidores de la proteasa se ha visto tienen
actividad anticarcinogenética tanto in vivo como in vitro. Billings et al.(290) publicaron que
un derivado de la alubia de soja que contiene el inhibidor de Bowman-Birk, suprime la
carcinogénesis de hígado y colon en ratones inducida por DMH cuando está presente en la
dieta.
Otros agentes, como los antiinflamatorios y en concreto el ácido acetilsalicílico
reducen al 60% la cantidad de tumores inducidos por DMH(291). El sulindac también se ha
descrito que inhibe las tasas de desarrollo y de crecimiento de los tumores colónicos de la
rata(292), en las etapas de displasia y microadenoma(293). La salazopirina, fármaco
45
empleado en el tratamiento de la colitis ulcerosa, cuando se administra a ratas tratadas con el
carcinógeno, no altera la incidencia tumoral, pero sí las características tumorales, son más
pequeños, sesiles y microinvasivos(294).
Los estudios de Daniel et al.(295) sugieren que el cloroformo inhibe de forma dosis
dependiente la inducción de daño nuclear y/o ADN por DMH en células epiteliales colónicas
del ratón.
La ruta de administración de la dieta tiene una significativa influencia en la
proliferación epitelial del epitelio colónico en ratas tratadas con DMH. Ratas alimentadas con
nutrición parenteral no presentaron aumento en la proliferación celular epitelial(296),
mostrando disminución importante de las figuras de metafase por cripta y altura de la
cripta(297).
La actividad física aumentada en las ratas reduce la incidencia tumoral, posiblemente
por una bajada del pH fecal, disminuyendo el flujo sanguíneo al colon y aumentando las
enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa, catalasa y la glutatión
peroxidasa(298). Los estudios de Andrianopoulos et al.(299) describen la acción del stress
sobre la carcinogénesis colónica por DMH. Cuando ambos aparecen simultáneamente existe
una reducción del número de tumores comparado con los controles y cuando el stress sigue al
tratamiento, este efecto es similar pero en menor grado.
Asimismo, se ha descrito un sinergismo entre la radiación en el abdomen y el
carcinógeno(300).
2. 3. 6. Expresión de oncogenes
Yander et al. han mostrado amplificación del oncogen myc al igual que expresión
elevada del RNAm myc en los tumores de colon de ratón. Tulchin et al., usaron azoximetano,
un metabolito de la DMH, para inducir cáncer de colon en ratas en un estudio llevado a cabo
para investigar la distribución de la proteína c-myc respecto a los cambios histopatológicos.
Estos investigadores demostraron una expresión aumentada de c-myc en las células tumorales
de rata en comparación con las normales(166).
Llor et al. describen mutaciones K-ras de G a A en aproximadamente 1/3 de los
carcinomas inducidos por DMH y, en líneas celulares de tumores de colon de rata derivados
de tumores inducidos por la misma DMH(166), mientras que no observaron mutaciones H-
ras(277),(301). Estas mutaciones se produjeron en el segundo nucleótido de los codones 12 ó
13 o en el primer nucleótido del codon 59 del gen K-ras.
Las mutaciones k-ras fueron observadas en mucosa colónica premaligna a las 15
semanas de la inyección de DMH, en zonas sin displasia, adenoma o carcinomas, sugiriendo
que la mutación ras es un evento precoz en la carcinogénesis colónica(301).
En tumores colónicos de ratones tratados con DMH se observa una ausencia de
pérdida alélica en el locus p53, lo que sugiere que las pérdidas alélicas del locus p53 no
intervienen en la carcinogénesis inducida por DMH o que la alteración de los productos del
gen podría tener un efecto de abolición de la función normal del p53(302).
I. 3. Mucosa colónica de rata normal y tumoral
I. 3. 1. Morfología de la mucosa colónica de rata
3. 1. 1. Descripción macroscópica
46
El intestino grueso de la rata está dividido con propósitos descriptivos en las
siguientes partes: ciego, colon ascendente, colon transverso, colon descendente y recto(303)
Figura 1-4.
Aunque diversos autores consideran solamente tres segmentos: ciego, colon
ascendente o proximal y colon descendente-recto o distal(304),(305).
Macroscópicamente, el ciego, el colon ascendente y el colon distal pueden
distinguirse con facilidad. El ciego es un órgano ancho en forma de coma, de paredes
delgadas y distendidas; móvil y sin apéndice. Los pliegues de la mucosa cecal están
dispuestos aleatoriamente(304).
El colon proximal o ascendente, de aspecto más tubular, presenta unos pliegues
ordenados oblicuamente, en forma de V. Uno o dos de estos pliegues muestra un área de
engrosamiento nodular representando placas linfoides. Su porción más proximal es similar al
ciego y distalmente incrementa su espesor por aumento de la submucosa y de la muscular
externa(305). El colon ascendente describe una larga curva hasta la flexura esplénica.
El colon descendente de la rata presenta una mucosa más lisa y está plegado en 4 a 6
elevaciones paralelas longitudinales; estos pliegues se interrumpen por áreas aplanadas en
número y tamaño variables(305). Se extiende desde la flexura esplénica, pasa hacia abajo y
medialmente para cruzar el eje pélvico donde se hace retroperitoneal para formar el recto, sin
un colon sigmoide interpuesto y termina en el ano justo en la raíz de la cola. La pared del
recto es similar a la de la porción terminal del colon(304).
Cuando el colon se distiende por las masas fecales la superficie mucosal se hace lisa.
La ausencia de taenia coli y haustras es una peculiaridad anatómica del colon de la rata.
El ciego mide de 6 a 9 cm. y el resto del colon mide de 16 a 20(303).
3. 1. 2. Descripción microscópica
En el epitelio del intestino grueso de la rata se han podido identificar varios tipos
celulares:
3. 1. 2. 1. Células caliciformes:
Las células caliciformes son el tipo celular más frecuente del intestino grueso de la
rata.
Las células caliciformes presentan generalmente, un núcleo redondeado, con un
nucleolo pequeño y regular. El núcleo se dispone en la base celular, al quedar rechazado por
las vacuolas de moco que ocupan el citoplasma(306).
La morfología de estas células varía en relación al segmento estudiado(307) -(309).
En el ciego y colon proximal, las células caliciformes localizadas en la base y en el tercio
inferior de la cripta se muestran bien formadas, numerosas y llenas de moco; contrariamente,
en la porción superior de las criptas, estas células se muestran más bien escasas, pero más
grandes y de forma alargada u oval. En el colon distal, en el tercio inferior de la cripta son
más pequeñas, mientras que la situadas en los dos tercios superiores de las criptas son más
numerosas y voluminosas(209).
En la mucosa colónica normal, las células caliciformes secretan sialomucinas a lo
largo del total o 2/3 inferiores de las criptas, mientras que en la parte superior de las criptas y
la superficie epitelial se producen ambas sulfo y sialomucinas. El patrón normal mucoso
puede variar, con ambos tipos de mucinas ácidas sulfo y sialomucinas secretadas en igual
proporción a lo largo del epitelio criptal o sialomucinas predominando en la mitad superior de
la cripta (patrón mixto) (306).
47
3. 1. 2. 2. Células columnares:
Son el tipo celular más abundante en la superficie luminal y en el tercio superior de
las criptas. La superficie luminal está formada por una capa simple de células epiteliales en
continuidad con el epitelio de recubrimiento recto de las glándulas intestinales
tubulares(305).
Al microscopio óptico se muestran como células altas con un citoplasma eosinófilo y núcleo
ovoide. Carecen de vacuolas de moco(309).
Este tipo celular es más evidente en el colon ascendente y presenta
microvellosidades(209).
3. 1. 2. 3. Células endocrinas:
Estas células se sitúan principalmente en las porciones inferiores de las criptas y,
ocasionalmente en el epitelio superficial. Presentan gránulos de secreción oscuros (células de
Kulchitsky)(308).
3. 1. 2. 4. Células indiferenciadas:
Las células indiferenciadas se localizan en la base de las criptas y se reconocen
fácilmente por su núcleo voluminoso y escaso citoplasma.
Son células alargadas y delgadas en el colon proximal y, poligonales y redondeadas
en los segmentos distales. Presentan un núcleo grande, redondeado u oval, con algunas
invaginaciones y un nucleolo pequeño y redondeado(308),(310).
3. 1. 2. 5. Células vacuoladas:
Este tipo celular, denominado así por su aspecto, se ha identificado en la porción más
distal del intestino grueso de la rata. De predominio en los segmentos inferiores y medios de
las criptas(311).
Contienen numerosas vacuolas de moco, más dispersas y más pequeñas que las de las
células caliciformes.
3. 1. 2. 6. Células secretoras del fondo de la cripta:

Un tipo morfológicamente especial de células con capacidad secretora de moco fue
descrito por Altmann(311) en 1983 en el colon de la rata. Reciben este nombre por su
localización y por su aparente función principal. Estas células se localizan en el fondo de las
criptas del colon proximal, no observándose en el resto de segmentos de intestino grueso.
Al microscopio óptico muestran una forma piramidal, con un citoplasma repleto de
vacuolas. El núcleo es basal, ovoide o aplanado.
El microscopio óptico revela agregados de linfocitos bajo las áreas aplanadas de
mucosa.
3. 1. 2. 7. Células caveoladas:
Se localizan a nivel del colon distal de la rata y representan un tipo celular
relativamente infrecuente. Se identifican exclusivamente por microscopía electrónica(312).
Presentan grandes microvellosidades, con haces de filamentos que se extienden al interior del
citoplasma; así como numerosas vesículas que se sitúan en el citoplasma apical.
Microscópicamente, las criptas experimentan un incremento progresivo de su longitud
desde el ciego al colon distal. En el ciego, la mucosa es delgada y las criptas cortas, en alguna
ocasión pueden ramificarse en su base. En el colon descendente, las criptas son más alargadas
48
y delgadas, rectas y sin ramificaciones.
El número de células por cripta es aproximadamente 625, con 33 células por columna
y 19 columnas por circunferencia de cripta(304).
3. 1. 3. Microscopía electrónica de scanning (MES)
El aspecto del colon normal de rata varía para cada región también con MES. Aunque
generalmente está cubierto por una densa y homogénea capa de moco, que cubre por
completo el epitelio subyacente(313),(314).
La superficie del ciego es plana, y las criptas están rodeadas por surcos irregulares,
similares a la corteza cerebral.
En el colon ascendente las criptas son poco abundantes y se encuentran ordenadas en lo alto
de los marcados pliegues de la mucosa.
En el colon transverso el epitelio es aplanado y está cubierto de moco, y presentan
criptas regularmente dispuestas y de forma circular(315).
La mucosa del colon distal está ordenada en pliegues longitudinales, los orificios de
las criptas tienen forma estrellada(315). La superficie luminal del colon descendente está
formada por repetición de grupos de unidades celulares rodeando el orificio de una glándula
intestinal. Estas unidades glandulares muestran pequeñas variaciones en el tamaño, aunque
los límites entre glándulas adyacentes no es obvio.
Se identifican tres tipos de células distintos en la superficie luminal:
1. Las células absortivas: presentan un contorno plano o suavemente convexo, cubierto por
una densa y uniforme capa de microvilli alargados.
2. Las células mucosas: son elementos simples que sobresalen entre las células absortivas y
muestran una superficie convexa cubierta de microvilli cortos y escasos.
3. Se observa otro tipo de células en áreas cercanas a la periferia de las unidades glandulares.
Estas células redondeadas parecen estar dispuestas sobre la superficie de la mucosa más que
formando parte de ella, y su localización y aspecto sugieren que son el efecto de la
exfoliación que sufren las células absortivas y mucosas(305).
I. 3. 2. Cinética celular
La proporción de producción celular varía de región en región en todo el colon, los

valores más bajos se obtienen en el colon distal, mientras los más altos se observan en el
ciego(315).
En el colon normal la zona proliferativa se encuentra localizada en la porción inferior
de las criptas, estás células son mitóticamente activas y están implicadas en la síntesis de
ADN(316). Existe una región de lenta proliferación celular situada en la porción más basal de
la cripta, y una región de más rápida proliferación en segundo quinto de la cripta(317). Estas
células criptales son inmaduras y van migrando lentamente a la superficie sufriendo la
maduración durante esta migración(318) (Figura 1-5,(316))
En un periodo que oscila entre 60 y 72 horas una célula emigra desde la zona
proliferativa de la cripta a la superficie luminal(305).
Este proceso normal, está dificultado en ciertos estados patológicos. Así en el cáncer,
adenoma, mucosa de aspecto normal en pacientes con poliposis y roedores tratados con
DMH, las células sintetizan ADN en toda la longitud de la cripta(211),(315).
I. 3. 3. Descripción de las lesiones inducidas con DMH
49
Los tumores y lesiones benignas inducidos con DMH pueden ser asignados a alguna
de estas categorías macroscópicas y microscópicas:
3. 3. 1. Categorías macroscópicas
Los tumores inducidos con 1,2-dimetilhidracina pueden agruparse en las siguientes

categorías macroscópicas (Figura 1-6):
Tumores sesiles: Son masas que protruyen sobre la superficie mucosal y con un
diámetro máximo mayor que el de su unión a la mucosa y muy cercanos a la misma(319).
Tumores pedunculados: son pólipos con un tallo claramente visible(320).
Tumores exofíticos: son tumores usualmente polipoides protruyendo hacia la luz.
Presentan un margen elevado con cavitación central y una masa subyacente lobulada que
generalmente, distiende la serosa subyacente(315).
Tumores endofíticos: son tumores en forma de meseta o ulcerativos con tendencia
ligera o nula a abultar hacia la luz. A menudo son tumores constrictivos(321). Han sido
denominados también tumores fungoides(319).
Placas: son lesiones con una superficie relativamente plana, ligeramente por encima
del nivel de la mucosa.
3. 3. 2. Categorías microscópicas
Diversos autores han realizado clasificaciones microscópicas de los tumores

inducidos por DMH en la rata. Lindström et al. (319) propusieron unas definiciones de los
tumores adenomatosos benignos y malignos:
Adenoma: es un tumor benigno que aparece a partir de epitelio glandular y con
desarrollo de formaciones tubulares o acinares o intercaladas con estructuras vellosas o
papilares(322). El adenoma puede tener un grado variable de atipia epitelial, desde leve,
moderada y severa, hasta atipia con posible pero no confirmada malignidad.
Adenocarcinoma in situ: este término se usa para atipia marcada intraepitelial o
intraglandular, justificando un diagnóstico de malignidad. No muestran invasión de la
muscularis mucosa o más allá, por los elementos epiteliales.
Se corresponde a la categoría de adenocarcinoma intramucosal de otros autores(319).
Adenocarcinoma infiltrante: A este grupo se refiere en todos los casos con
infiltración en la lámina propia o capas de tejido más profundas como la submucosa,
muscularis mucosae, etc.
Los adenocarcinomas se clasifican según su grado de diferenciación en:
1. Bien diferenciado: con estructuras organoides bien diferenciadas de tipo acínico o
tubular y una atipia celular moderada y mitosis en el epitelio, con los núcleos basales y de
tamaño regular(323).
2. Moderadamente diferenciado: son adenocarcinomas con estructuras organoides no
bien desarrolladas, presentan criptas epiteliales o túbulos con ramificación y dilatación
compleja e irregular(319). Se asocian a atipia epitelial más marcada y alta frecuencia
mitótica.
3. Pobremente diferenciado: se caracterizan por la presencia de células epiteliales que
carecen de una disposición uniforme. Son adenocarcinomas con parte del tumor con
estructura adenomatosa ligera o nula, pero con producción mucosa conservada.
Los tumores productores de moco en anillo de sello, se clasifican según los autores
50
como un grupo aparte(209) y se les denomina, adenocarcinomas mucinosos; o como
adenocarcinomas poco diferenciados(321). Otros autores realizan una clasificación en dos
tipos: no mucinosos y productores de mucina(309).
El carcinoma anaplásico ha sido definido como un tumor maligno con atipia celular
extrema y sin características celulares de diferenciación.
Otros tipos histológicos descritos por Pozharisski(303) son:
Carcinoma sólido: Este en un tumor pobremente diferenciado en el que las células
tienden a una solidificación secundaria.
Carcinoma escirro: Es un tumor pobremente diferenciado en el que las células
tienden a separarse, formándose tejido conectivo alrededor de los pequeños complejos
separados y se parece al carcinoma escirro clásico.
I. 4. Glicoconjugados
I. 4. 1. Glicoconjugados celulares. Papel biológico
Los glicoconjugados (glicoproteínas y glicolípidos) forman parte de la membrana

plasmática de esencialmente todos los mamíferos; y participan en la mayoría de las funciones
biológicas de la superficie celular.
Los carbohidratos de los glicoconjugados se comportan como lugares de
reconocimiento de una gran variedad de moléculas extracelulares, como hormonas,
antígenos, factores de crecimiento, fármacos, etc. Sirven como enlaces, moléculas de
transporte y son marcadores de individualidad de la célula.
Los carbohidratos participan directamente en las reacciones de reconocimiento
intercelular y de interacción con el sustrato.
Confieren a la célula propiedades inmunológicas al actuar como antígenos(324),(325).
Debido a que confieren estabilidad y grupos de reconocimiento se encuentran
predominantemente en las superficie de células normales, particularmente en la superficie
luminal de las células epiteliales y en sus secreciones. Sin embargo, en las células implicadas
en secreción activa, en células indiferenciadas y en células que están experimentando cambio
neoplásico y displásico hay una acumulación de glicoconjugados en el citoplasma(326),(327).
4. 1. 1. Glicoproteínas
Las glicoproteínas pueden encontrarse como componentes de la membrana plasmática

y formando parte de los productos de secreción celulares. Son los principales componentes de
las mucinas secretadas al igual que de las membranas de las células mucosas
gastrointestinales(328),(329).
Son proteínas que tienen una cadena oligosacárida unida covalentemente a la porción
peptídica.
La unidad carbohidrato de las glicoproteínas animales contiene un número limitado de
monosacáridos; estos son básicamente: D-galactosa, D-manosa, L-fucosa, N-acetil-D-
galactosamina y ácido siálico.
Las glicoproteínas han sido clasificadas según la naturaleza de unión entre las cadenas
oligosacáridas y las polipeptídicas. Las dos principales familias son aquellas que tienen
cadenas oligosacáridas enlazadas N-glicosídicamente con N-acetil-D-glucosamina al
nitrógeno de la amida aspargina y, aquellas que tienen cadenas oligosacáridas unidas O-
glicosídicamente con N-acetil-D-galactosamina (GalNAc) a los grupos hidroxil de serina y/o
51
treonina, y ocasionalmente hidroxilisina o hidroxiprolina; este segundo grupo también puede
unirse a la D-galactosa y a la D-xilosa(330),(331).
4. 1. 1. 1. Biosíntesis de las glicoproteínas

La biosíntesis de la porción carbohidrato de las glicoproteínas está precedida por la
biosíntesis de las cadenas polipeptídicas en el ribosoma. En la actualidad se cree que los
polisacáridos unidos a las cadenas polipeptídicas por medio de grupos hidroxil de los
residuos serina, treonina, hidroxiprolina o hidroxilisina son sintetizados por residuos azúcar
añadidos a la cadena oligosacárida naciente.
La biosíntesis de glicoproteínas N-enlazadas es considerada como una vía simple, que
implica la unión de un oligosacárido enlazado a lípido, el oligosacárido dolicol-difosfato; la
transferencia en bloque del oligosacárido por su transportador lipídico a la cadena
polipeptídica naciente, el procesamiento de las cadenas oligosacáridas por glicosidasas, y la
adición de un azúcar terminal por glicosiltransferasas(331).
El establecimiento del carbohidrato unido a la proteína en N-glicosilación parece ser
un proceso cotranslacional localizado en el retículo endoplasmático rugoso (RER) y
posteriores pasos del ensamblaje se piensa que ocurren fundamentalmente en el aparato de
Golgi(331),(332).
Mucha menos información es obtenida a partir de la unión de las cadenas
oligosacáridas de glicoproteínas O-enlazadas y su topología. La reacción de glicosilación
inicial en la síntesis de proteínas O-enlazadas implica la transferencia directa de GalNAc
desde uridina difosfato (UDP)-GalNAc al polipéptido por una UDP-GalNAc: transferasa
polipeptídica y no requiere preunión a oligosacáridos ni intermediarios lipídicos(331),(333)
(Figura 1-7). Diversos autores, contemplan la localización subcelular del lugar de inicio de la
reacción de glicosilación. Otros evidencian que los microsomas lisos son la principal
localización submicrosomal de la enzima responsable de la transferencia de GalNAc al
polipéptido y además, más distal, localización de las cadenas oligosacáridas(333). Estudios
posteriores demuestran que la O-glicosilación se produce en las cisternas del aparato de Golgi
y no en el RER(331).
4. 1. 2. Glicolípidos
Los glicolípidos son componentes estructurales de las membranas plasmáticas, que se

encuentran localizados en su monocapa externa.
Los glicolípidos son lípidos complejos, en los cuales las cadenas de carbohidratos
están unidos a la ceramida (esfingosina N-acilada y un ácido graso). La estructura así
constituida presenta una región altamente hidrofóbica y otra hidrofílica.
Pueden ser galactosilceramidas, ceramidas que contienen residuos D-galactosa en el
grupo hidroxil terminal; o glucosilceramidas, ceramidas que contiene D-glucosa.
Según sus cadenas oligosacáridas centrales, los glicolípidos se pueden dividir en
cuatro tipos principales, que se denominan series: ganglio, globo, lacto y neolacto. Las
diversas sustituciones de los azúcares de estas estructuras determinan una amplia variedad de
glicolípidos. Los globósidos y los gangliósidos contienen N-acetilgalactosamina. Los
glicolípidos más complejos conocidos son los gangliósidos, que resultan de la adición de
ácido siálico a las series ganglio de los glicolípidos(334).
I. 4. 2. Oligosacáridos de los glicoconjugados relacionados con los grupos sanguíneos
52
Los antígenos del sistema de grupos sanguíneos ABO son sintetizados además de en
los eritrocitos y el endotelio vascular, por las células epiteliales secretoras del
organismo(335). Los inmunodeterminantes de los antígenos ABH son estructuras
carbohidrato específicas que residen en las terminaciones no reductoras de las cadenas
laterales de oligosacárido de los glicolípidos y glicoproteínas(336). La proporción de
carbohidratos de las sustancias de grupo sanguíneo son aproximadamente de un 80%(337).
La síntesis de esta estructura se produce por adición progresiva de monosacáridos en
uniones anoméricas y glicosídicas, este procedimiento ocurre por la acción secuencial de
genes-codificados a enzimas glicosiltransferasas(336).
Del fenotipo A se pueden distinguir dos subgrupos principales: A1 y A2 que
corresponden a los dos productos de dos alelos. Entre ellos existen diferencias en cuanto al
número de lugares antigénicos (los hematíes A1 tienen más antígenos A que los hematíes A2),
además de alguna diferencia cualitativa. El comportamiento frente al reactivo anti-A es
similar para los dos subgrupos.
El subgrupo A3, mucho más raro que los dos anteriores, presenta como características
que algunos hematíes son aglutinados por el reactivo anti-A y otros no. Otros subgrupos
débiles de A son: Ax, Am, Aend, Ael...
El grupo B también presenta subgrupos, pero con mucha menos frecuencia que el A.
Se denominan B3, Bx, Bm y Bel.
Para que puedan expresarse los genes A y B debe existir otro gen llamado H. Está
situado en un locus aparte de los anteriores y define el sistema de grupo sanguíneo Hh.
El sistema Lewis se diferencia de los sistemas de grupo sanguíneo, ya que para la
síntesis de sus antígenos es necesaria la segregación independiente de los genes Hh, Sese, y
Lele, pudiendo el fenotipo ABO modificar el fenotipo Lewis.
Este sistema está formado por un par de genes alelos, Le y le, este segundo
silente(337).
4. 2. 1. Biosíntesis del sistema ABH, Ii y Lewis
Con respecto a los antígenos ABH y Lewis se ha observado que tienen idéntica
estructura básica. La especificidad de cada antígeno viene determinada por el azúcar terminal
de la molécula.
La síntesis de las sustancias ABH y Lewis se efectúa por la adición secuencial de
unidades glucídicas simples en el extremo terminal no reductor de las cadenas glucídicas
unidas covalentemente a un precursor de naturaleza proteica o lipídica (Figura 1-8).
Actualmente se distinguen 4 tipos de sustancia según la estructura del disacárido
terminal aceptor:
- Tipo 1: Galβ 1-3 GlcNAcβ 1-R
- Tipo 3: Galβ 1-3 GlcNAcα 1-R
Las sustancias de tipo 1 y 2 son abundantes en los tejidos y secreciones de las células
epiteliales y glandulares de origen endodérmico. Al contrario, los constituyentes
membranosos (glicoproteínas, glicolípidos) de las células de origen ectodérmico y
mesodérmico (glóbulos rojos, piel, endotelio vascular, etc.) contienen principalmente
sustancias del tipo 2.
Las cadenas de tipo 3 representan estructuras glicánicas fijadas por la unión O-
53
glicosídica sobre los residuos serina o treonina de las glicoproteínas.
Las cadenas de tipo 4 están caracterizados por glicolípidos derivados de globósidos, el
glicolípido mayor de los eritrocitos humanos que lleva el antígeno P. Los antígenos H y A de
tipo 4 (globo-H y globo A) se han identificado en tejido renal, meconio y eritrocitos A1(337).
La secuencia Galβ (1-3) GalNAc constituye el antígeno T (de Thomsen-
Friedenreich), que es el precursor de los antígenos de grupo sanguíneo M y N.
El antígeno H está formado por la acción de una 1, 2 fucosiltransferasa que enlaza
fucosa a la galactosa de tipo 1 (Galβ1, 3GlcNAc) o tipo 2 (Galβ1, 4GlcNAc) de las cadenas
laterales oligosacárido. En individuos con grupo sanguíneo tipo O, la síntesis de antígenos
está detenida por la sustancia H. Sin embargo, en individuos con tipo sanguíneo A, B, o AB,
la sustancia H sirve de precursor inmediato para los antígenos A y B. Es más, en individuos
con grupo tipo A, una α1, 3 N-acetilgalactosaminiltransferasa (transferasa α1,3 GalNAc)
cataliza la transferencia de GalNAc a la sustancia H, mientras que en individuos con tipo B el
antígeno B es sintetizado como resultado de una 1,3 galactosiltransferasa (transferasa α1, 3
Gal) que transfiere galactosa al precursor H(338).
El antígeno Lewis (Lea) está formado por la adición de 4αL-Fucosa sobre la N-
acetilglucosamina de las cadenas tipo 1. El antígeno X resulta de la unión de 3αL-Fucosa
sobre la N-acetilglucosamina de las cadenas tipo 2. La presencia simultánea de las dos
fucosas (sobre la galactosa y la N-acetilglucosamina) de las cadenas de tipo 1 y 2 conduce a
los antígenos Leb e Y(339).
Los antígenos o sustancias Lewis que existen en el plasma son glicoesfingolípidos; en
cambio, los antígenos Lewis de las secreciones son glicoproteínas.
Los antígenos Lewis no están bien desarrollados al nacer; todos los recién nacidos son
Le (a-b-); si poseen el gen Le, al cabo de pocos días aparece el antígeno Lea, estableciéndose
el fenotipo definitivo años después.
Las cadenas sialosil tipo 1 actúan como precursor inmediato para el antígeno tumor-
asociado sialosil-Lea, definido por el anticuerpo monoclonal CA 19.9(340) -(342).
El sistema Ii, que algunos autores no lo consideran como tal, está formado por dos
antígenos principales, I e i, cuyo gen puede interaccionar con los del sistema ABO. Los
determinantes I e i son caracterizados por una estructura tipo 2 en su extremidad terminal no
reductora, y pueden ser considerados los precursores bioquímicos de los determinantes
antigénicos lineales o ramificados.
El determinante i es una secuencia oligosacárida lineal hecha de unidades Galβ 1-4
GlcNAc repetitivas.
Determinante i Galβ 1-4 GlcNAcβ 1-3 Gal

β 1-4 GlcNAcβ 1-3 Gal-R
Este antígeno es sintetizado por la acción de dos glicosiltransferasas, la transferasa

β1-4 Gal y la β 1-3 GlcNAc.
El determinante I es una secuencia oligosacárida ramificada (polilactosaminoglicano),
identificada por primera vez en la fracción gangliósida de los eritrocitos.
Determinante I
Gal β 1-4 GlcNAc
β 1-6
54
Gal β 1-4 GlcNAcβ 1-3 Gal-R
β 1-3
Gal β 1-4 GlcNAc
Su biosíntesis se efectúa por la acción secuencial de tres glicosiltransferasas: las dos

enzimas responsables de la síntesis de las estructuras lineales, β 1-4 galactosiltransferasa y β
1-3 GlcNAc transferasa; y la enzima que puede formar los puentes de ramificación, la β 1-6
GlcNAc transferasa.
El antígeno I procede del i por un proceso de ramificación que añade una secuencia
Gal β 1-4 GlcNAc a una galactosa interna de la estructura del antígeno i(343).
4. 2. 2. Expresión de glicoconjugados y de antígenos de grupo sanguíneo en el epitelio

colónico
Una de las principales funciones de las células del epitelio gastrointestinal es la

producción de moco protector y lubricante. El moco se ha mostrado que es una entidad
bioquímicamente heteróloga compuesta de glicoproteínas de alto p.m. con varios aspectos
estructurales que portan incluso especificidades de grupo sanguíneo del individuo(344).
La expresión de antígenos ABH por las células epiteliales muestran ciertos cambios
regionales asociados con el desarrollo y la transformación neoplásica(338),(345). En los
fetos, los antígenos A, B o H que corresponden a los tipos sanguíneos individuales son
expresados por los colonocitos en toda la longitud del colon(346),(347). Sin embargo, en el
nacimiento y persistiendo en el adulto, la expresión de los grupos sanguíneos por los
colonocitos desaparece en el colon distal, resultando en un gradiente de expresión proximal-
distal(348) -(350).
Con el desarrollo de carcinoma, pueden aparecer tres alteraciones en la expresión
ABH. La más frecuente es la reaparición del fenotipo fetal en el colon distal(349),(351)
,(352).En el colon distal los antígenos ABH se comportan como antígenos oncodesarrollados.
La segunda alteración más frecuente es la delección de la esperada sustancia de grupo
sanguíneo en el colon proximal(347),(349). Por último, las células del cáncer de colon de la
proximidad del colon proximal y distal pueden expresar sustancias de grupo sanguíneo que
son incompatibles con las de su tipo sanguíneo(347),(353). A pesar de que estas tres
alteraciones ocurren en el cáncer de colon y no en la mucosa normal, han sido observadas en
lesiones asociadas con el cáncer, como pólipos adenomatosos colónicos, que presentan
positividad variable para la sustancia H, y la expresión del antígeno aparece correlacionada
con el grado de displasia observado en el examen microscópico, los pólipos no adenomatosos
y las neoplasias no epiteliales no presentan expresión de sustancia H(354).
Los mecanismos por los que existe una alteración de los antígenos ABH en el
desarrollo y en la transformación neoplásica son desconocidos. Aunque han sido postuladas
varias teorías: 1. Insuficiente actividad de las glicosiltransferasas para la adición de un azúcar
inmunodeterminante. 2. Los antígenos ABH son sintetizados normalmente pero son divididos
por glicosidasas específicas de grupo. 3. Los antígenos ABH son sintetizados normalmente
pero quedan enmascarados por la adición de otros carbohidratos. 4. Las glicosidasas A, B, y
H son normalmente activas, pero la sustancia H o un primer precursor no son eficaces,
resultando en una baja expresión de los antígenos ABH(338).
Diversos estudios han examinado la actividad de las glicosiltransferasas ABH en
55
tejidos de cáncer de colon humano. Kim et al.(355) describen que la actividad de la
transferasa de grupo sanguíneo A es más baja en los tejidos neoplásicos que en los normales,
correspondiéndose a una disminución del contenido total de GalNAc de la membrana
glicopéptida. Asimismo, la actividad transferasa de grupo B es baja, pero se corresponde en
una disminución del contenido de galactosa en el citoplasma, no en la membrana(356). Sin
embargo, otros autores no han hallado diferencias significativas entre el colon proximal ni el
distal ni disminución significativa de actividad transferasa A o B(357). Kuhns y
Schoentag(358) observan que la mucosa colónica normal muestra un gradiente de
disminución de la actividad transferasa A y H proximal-distal y que la actividad de ambas
transferasas es más baja en el cáncer que en la mucosa normal adyacente en el colon
proximal, pero que distalmente los niveles normales son ya bajos y no existe disminución
asociada al cáncer. Otros estudios demuestran disminución de la actividad de las transferasas
A y B en el cáncer, pero no de la H(338).
En el colon derecho se expresan los ya citados antígenos de grupo sanguíneo (BGA)
A y B, y Leb y Ley (359).
En todo el colon están presentes los antígenos Lea, Ley y H-tipo 2.
En el colon distal y recto normal del adulto se expresan los BGA, sialosil-Lea, Lea,
Le , Le , en varios compartimentos celulares epiteliales de las criptas(360),(361). Lex y x-like
x y
se expresan ocasionalmente. El antígeno sializado Lea muestra diferentes patrones según el

anticuerpo empleado, siendo más intenso para el CO 29.11 que para el CA 19.9(360).
El antígeno Leb está ausente normalmente del colon distal y recto, pero está presente
en el colon fetal, neoplasias y adenomas, y puede ser considerado junto a los antígenos A, B y
H como antígenos oncofetales tumor-asociados(360),(352).
El Ley es un marcador de células indiferenciadas en la base de las criptas(346) y no se
encuentra en la mucosa colónica normal(345).
La mucina de las células caliciformes de la mucosa transicional muestran disminución
de los antígenos A y B, y aumento de H(362).
I. 4. 3. Tinciones habituales de los glicoconjugados
Para la visualización de los glicoconjugados celulares y extracelulares a nivel de MO

y ME están a nuestro alcance varias reacciones de tinción. Estas técnicas están basadas
fundamentalmente en la detección de grupos sulfato y carboxil o configuraciones reactivas de
ácido periódico(363). Las tinciones histoquímicas habitualmente usadas para la detección de
glicoconjugados son:
1. Acido periódico de Schiff(364) y sus combinaciones con azul alzian (AB), potasio
hidróxido alcohólico (KOH), borohidrido periodado (PBT), o PAS preparado con
tionina(365), la enzima D-galactosa oxidadasa (GO)(366).
2. Azul Alzian(367)
3. Diamina rica en hierro
4. Diamina- azul Alzian rica en hierro (HID-AB) (369)
Los problemas intrínsecos en estas técnicas son las limitaciones en su especificidad
para residuos sacáridos particulares y resolución espacial al igual que sólo uno de ellos puede
ser usado a nivel de ME para la detección de carbohidratos en compartimentos intracelulares
y en tejidos compactos(369).
I. 4. 4. Métodos específicos de tinción

La mejor comprensión actual de los complejos glicoconjugados está basada en el
56
desarrollo de aproximaciones técnicas que han permitido una mejor caracterización,
purificación y análisis estructural de los componentes carbohidratos. Entre estos métodos
nuevos y/o mejorados debe hacerse mención especial de los anticuerpos monoclonales y de
las lectinas como las principales herramientas analíticas para el estudio de glicoconjugados
tanto solubles como celulares:
1. Lectinas: El uso de lectinas proporciona una aproximación más diferenciada y específica.
Puesto que las lectinas se enlazan a secuencias definidas de azúcar de cadena de
oligosacáridos de glicoconjugados(367), en cortes congelados, parafinados, embebidos en
Lowicryl, etc.
Las lectinas tienen 2 ventajas principales sobre cualquier otro método histoquímico
para demostrar carbohidratos; pueden ser extremadamente sensibles y específicas. Debido a
esta especificidad, sólo una pequeña proporción de los carbohidratos actualmente pueden ser
identificados salvo que usemos combinaciones de lectinas.
2. Anticuerpos contra epitopos de carbohidrato, en cortes congelados y parafinados.
Otros métodos usados en la caracterización de glicoconjugados son:
3. Algunas toxinas
4. Glicosiltransferasas: su uso basado en estrictas especifidades de aceptor se han mostrado
como reactivos valiosos en la comprensión bioquímica de estructuras de oligosacáridos(370).
Usualmente requieren cortes congelados no fijados(371) y su principal inconveniente es que
su cuantificación depende de la cantidad de tejido(372).
5. Ligands, que se enlazan con sus receptores específicos, requieren cortes sin fijar
congelados.
I. 5. Lectinas
I. 5. 1. Definición
Las lectinas son proteínas o glicoproteínas, obtenidas fundamentalmente de plantas,
que tienen la propiedad de unirse específicamente a carbohidratos. La primera descripción de
estas sustancias la realizó Hermann Stillmark(373) en el año 1888, al observar que los
extractos de las semillas de ricino (Ricinus communis) provocaban una aglutinación de los
eritrocitos humanos y de algunos animales de experimentación(370). Con el tiempo se fueron
descubriendo nuevos extractos proteicos de semillas de otras plantas que también mostraban
la capacidad de aglutinar eritrocitos. Ello indujo a denominar a estas sustancias
hemaglutininas vegetales, y más adelante fitoaglutininas o fitohemaglutininas, resaltando su
origen y su capacidad aglutinadora de eritrocitos(374). No obstante, la terminología utilizada
para designarlas se fue modificando paralelamente al desarrollo de nuevos conocimientos
sobre estos agentes. Con los años se identificaron, purificaron y caracterizaron nuevas
sustancias con propiedades similares de orígenes muy diversos, plantas inferiores, bacterias,
hongos, animales invertebrados y vertebrados. Además, se observó que no sólo aglutinaban
eritrocitos, sino que también podían estimular la división de los linfocitos(375),(376) y
aglutinar células neoplásicas. Por esta razón se utilizaron nuevos términos genéricos para
denominarlas: aglutininas naturales, heteroaglutininas o anticuerpos naturales.
El término actual lectina, del verbo latino lego, legi, lectum, que significa elegir,
escoger y seleccionar, fue acuñado por W. C. Boyd y E. Shaplieigh en 1954(377) como un
nombre genérico para designar unas sustancias que presentaban la capacidad de unirse
selectivamente a moléculas de carbohidratos, de manera similar a como lo hacían los
anticuerpos, pero que no eran inducidas como parte de la respuesta inmune a la estimulación
antigénica.
57
Este término bastante amplio e impreciso fue usado bastante intuitivamente y diversos
autores le dieron significados distintos hasta que se llegó a un consenso por el Comité de
Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica recomendando la aceptación de la
definición propuesta por Goldstein et al. en 1981(378). De acuerdo con esta definición, las
lectinas son proteínas o glicoproteínas de enlace con carbohidratos que aglutinan células y/o
precipitan glicoconjugados. Esta definición incluye, además, los siguientes aspectos: a) las
lectinas tienen por lo menos dos lugares de unión a los carbohidratos específicos de las
células que aglutinan y/o los polisacáridos, glicoproteínas o glicolípidos que precipitan; b) la
especificidad de la lectina se define, habitualmente, en función de los monosacáridos u
oligosacáridos que inhiben las reacciones de aglutinación, precipitación o agregación
inducidas por la lectina; c) las lectinas no desarrollan ninguna actividad metabólica sobre el
azúcar al cual se unen.
La clasificación de Goldstein no distingue las lectinas de enzimas con lugares
específicos de enlace con azúcar(370), por esto, Franz y Ziska(379) en 1981 propusieron el
término "afinitinas" como una denominación colectiva para lectinas, enzimas y anticuerpos
con una alta afinidad para estructuras químicas específicas(370). También se ha propuesto el
término proteínas-receptor específicas por Gold y Balding en 1975. Sin embargo, el término
lectina es actualmente el mejor conocido para cubrir estas entidades no inmunes(370).
Las lectinas han sido detectadas en un amplio rango de organismos, especialmente
vegetales y una exhaustiva lista de fuentes fue publicada por Gold y Balding en 1975(380).
Ya que todas las lectinas poseen al menos 2 localizaciones de enlace de carbohidratos pueden
aglutinar células portadoras de glicoconjugados de superficie.
La mayoría de los trabajos sobre las lectinas han sido dirigidos hacia el hallazgo de
reactivos específicos de grupo sanguíneo; por todo ello, la mayoría de las lectinas han sido
identificadas por su capacidad de aglutinar glóbulos rojos, ya sean no tratados o bien
enzimáticamente modificados, por ejemplo con neuraminidasa. Las lectinas son generalmente
seguidas durante su purificación por su propiedad de hemaglutinación pero pueden aglutinar
otras células en suspensión dependiendo de la expresión de los oligosacáridos en la superficie
celular. La retirada de grupos terminales tales como ácidos siálicos mediante enzimas (por
ejemplo tripsina y neuraminidasa) revela frecuentemente carbohidratos no expuestos. Aunque
tales carbohidratos pueden estar normalmente secuestrados por grupos terminales, los
cambios en la conducta celular y función pueden ser reflejados por la incapacidad de formar
los grupos azúcar terminales típicos. Durante los cambios en el ciclo celular, transformación,
desarrollo tumoral, potencial metastásico, así como en la diferenciación celular normal hay
cambios de superficie en los azúcares detectables por las lectinas. Aunque actualmente no
hay lectinas que sean célula-especificas o tumor específicas hay un gran interés por usar las
lectinas como una ayuda en la determinación de la diferenciación, potencial metastásico y
funcional en oposición a la simple transformación morfológica. Más recientemente los
oligosacáridos citoplasmáticos han sido identificados por lectinas en cortes de tejidos y esto
aporta una herramienta nueva y potencialmente enormemente útil para confirmar la
diferenciación celular y la función en cortes en parafina fijados en formalina normales e
histopatológicos.
I. 5. 2. Clasificación de las lectinas

Se han realizado numerosos intentos con la finalidad de unificar criterios para una
mejor clasificación de las lectinas. Gallagher(381) propuso una clasificación basada en los
carbohidratos que son capaces de inhibir las reacciones inducidas por las lectinas. Esta
clasificación dividía a las diferentes lectinas en dos grandes grupos: 1. Lectinas de la clase I,
58
que pueden ser inhibidas con bajas concentraciones de monosacáridos y, 2. Lectinas de la
clase II, cuyas reacciones son inhibidas exclusivamente por oligosacáridos (lineales o
ramificados) y no por monosacáridos.
A pesar de esta clasificación, la mayoría de los autores prefieren agrupar las lectinas
en función de su especificidad de unión a los azúcares terminales en las cadenas de
carbohidratos. Así, la mayoría de las lectinas empleadas en los laboratorios pueden
clasificarse en cinco grupos: a) lectinas que se unen a la glucosa/manosa, b) lectinas que se
unen a la N-acetilglucosamina, c) lectinas que se unen a la galactosa/N-acetilgalactosamina,
d) lectinas que se unen a la L-fucosa y e) lectinas que se unen al ácido siálico. Las lectinas
más usadas y su especificidad se han resumido en la tabla siguiente:
GRUPO DE ENLACE ABREVIATURA LECTINA CARBOHIDRATO ESPECÍFICO
Canavalia
Glucosa/Manosa Con A ensiformis ?Man > ?Glc > GlcNAc
?Man > ?Glc = GlcNAc
LCA Lens culinaris ?Man > ?Glc > GlcNAc
PEA Pisum sativum ?Man > Glc = NAc
Datura GlcNAc(A1,4GlcNAc)1-3=GalA
N-acetilglucosamina DSA stramonium 1,4GlcNAc
Griffonia
GSA-II simplicifolia y A GlcNAc
Phytolacca GlcNAc(A 1,4GLcNAc)1-5=(GalA

PWM americana 1,4GlcNAc)2-5
Solanum
STA tuberosum GlcNAc(A 1.4GlcNAc)1-4
Ulex europaeus L-Fuc1,2GalA 1,4GlcNAc > GlcNAc(A

UEA-II II 1,4GlcNAc)1-3
Triticum GlcNAc(A 1,4GlcNAc)1-2 > A GlcNAc >

WGA vulgare Neu5Ac
Bauhinia
N-acetilgalactosamina/galactosa BPA purpurea ? y A GalNAc > ? y A Gal
Dolichos
DBA biflorus GalNac? 1,3GalNAc >> ?GalNAc
Grifflonia
simplicifolia -I-
GSA-I A4 ?GalNAc > ?Gal
Grifflonia
simplicifolia I-
GSA-1 B4 ?Gal
HPA Helix pomatia GalNAc? 1,3GalNAc > ?GalNAc

Phaseolus
LBA lunatus GalNAc?, 1,3GalNAc > ?GalNAc
59
Maclura
MPA pomifera ?GaINAc > ?Gal
Arachis
PNA hypogaea GalA 1,3GalNAc > ? y AGal
Ricinus
RCA-I communis AGal > ? Gal >> GalNAc
Glycine
SBA maximus ? y AGalNAc > ? y AGal
Sophora
SJA japonica ? y AGalNAc > ? y AGal
VVA Vicia villosa GalNAc? 1,3Gal = ?GalNAc?GalNAc
Wistaria
WFA floribunda GaNAc? 1,6Gal > aGalNAc > AGalNAc
Aleuria
L-Fucosa AAA aurantia ?L-Fuc
Lotus ?L-Fuc > L-Fuc? 1,2GalA 1,4GlcNAc

LTA tetragonolobus >> L-Fuc? 1,2GalA
1,3GlcNAc
UEA-I Ulex europaeus ?L-Fuc
Ácido siálico LFA Limax flavus ?Neu5Ac > ?Neu5Gc
Limulus
LPA polyphemus Neu5Ac(oGc)?2,6GalNAc > Neu5Ac
Tabla 1-4
I. 5. 3. Propiedades biológicas de las lectinas

Las lectinas pueden aparecer en cualquier tipo de organismos, pueden ser solubles o
estar enlazadas con membranas, pueden ser glicoproteínas u otros derivados proteicos post-
translacionalmente modificados(378).
Las lectinas ejercen importantes funciones en los organimos donde se encuentran,
algunas de las cuales no se conocen todavía con precisión. En líneas generales las lectinas
pueden estar relacionadas con fenómenos de reconocimiento y de adhesión celular(382),
intervienen en la regulación de los tejidos durante la ontogenia, en la adhesión de bacterias y
en la eliminación de glicoproteínas circulantes por el hígado(383).
En las plantas, las lectinas juegan un papel importante en los mecanismos de defensa
y protección contra agentes fitopatógenos(374), también favorecen la simbiosis entre éstas y
ciertos microorganismos(382).
La aglutinación es la manifestación más inicialmente detectable de la interacción de la
lectinas con las células(384).
La aglutinación es un fenómeno complejo que depende de las propiedades de las
proteínas, de las células y del medio usado. La aglutinación no representa, al menos en la
gran mayoría de los casos, la auténtica actividad fisiológica de las lectinas. Esto deja a los
criterios de aglutinación como poco prácticos para el uso general y bastante
artefactuosos(378).
60
Las lectinas pueden poseer varias actividades biológicas, pueden ser toxinas,
hormonas, etc. y pueden ser enzimas cuya actividad no esté dirigida hacia las moléculas
azúcar(378).
Las lectinas de legumbres inducen cambios en el metabolismo celular(385).
Las lectinas pueden simular antígenos e inducen mitosis en linfocitos(374). Las
lectinas inducen la producción interleuquina 2 (IL-2) y la aparición de receptores de IL-2 en
células T(375).
I. 5. 4. Propiedades químicas de las lectinas

La mayoría de las lectinas reaccionan con azúcares no reducidos situados en la
posición terminal de los glicoconjugados. Sin embargo, existen lectinas que pueden
reaccionar con componentes internos o ramificados de las cadenas de los carbohidratos(382).
La especificidad nominal a monosacáridos de las lectinas no refleja siempre la
naturaleza exacta del carbohidrato que tiene la mayor afinidad por esa lectina. El azúcar
simple soluble que inhibe el enlace de lectinas y la hemaglutinación pueden no ser el mismo
que el grupo azúcar que se enlace preferentemente con la lectina en el tejido. Esto se debe en
gran parte a que cada localización de enlace puede unirse a una combinación de azúcares más
íntimamente que a un azúcar simple. Es más aunque el polisacárido preferido pueda
componerse de unidades idénticas la especificidades pueden ser diferentes(370).
La especificidad de las lectinas se define convencionalmente en base de un test de
inhibición de haptenos tipo Landsteiner en el que varios azúcares son probados respecto a su
capacidad de inhibir la hemaglutinación de glóbulos rojos(382).
La unión entre los carbohidratos y las lectinas se asemeja en gran manera a la unión
antígeno-anticuerpo. El tipo de enlace que se establece es lábil, no covalente y reversible. En
ocasiones, algunas lectinas requieren la presencia de metales pesados, en particular Ca2+,
Mn2+ y Mg2+ para mantener activos sus lugares de unión; en ausencia de estos la lectina
pierde reactividad y no se produce reacción(382).
Muchas lectinas de la misma especificidad nominal a monosacáridos muestran
diferente afinidad por la misma célula o estructura tisular en preparaciones histoquímicas.
Aunque la mayoría de las lectinas reaccionan preferentemente con los azúcares terminales no
reductores algunas también reaccionan con los componentes internos de las cadenas
carbohidrato(386).
Algunas lectinas exhiben una fuerte especificidad anomérica mientras que otras no
distinguen diferentes formas anoméricas de los azúcares D-piranosa.
Las lectinas también pueden enlazarse con ligands no carbohidratos. El enlace de
lectinas con ligands carbohidrato generalmente no se altera por la adición de biotina, agarosa,
o isotiocianato de fluoresceína (FITC)(387). Las lectinas derivadas pueden tener algunas
ventajas sobre las formas puras. Por ejemplo, encontramos que la Con-A succinilada es más
estable y da resultados más consistentes que la lectina pura, si bien bajo condiciones
correctamente controladas los resultados histoquímicos son comparables.
I. 5. 5. Principales aplicaciones de las lectinas
5. 5. 1. Lectinas como reactivos en anatomía
Los complejos glicoproteicos son marcadores adecuados, y las lectinas que reconocen
estas macromoléculas han sido usadas extensamente como reactivos bioquímicos e
histoquímicos en patología y biología celular(384). A nivel celular las lectinas han sido
61
usadas para estudiar varios orgánulos citoplasmáticos y microdominios de las membranas
celulares. A nivel tisular las lectinas han sido usadas como reactivos específicos para varios
tipos celulares al igual que para los varios estadios de diferenciación o maduración(388). A
nivel de histología de órganos las lectinas han sido usadas como reactivos para delineación de
segmentos funcionales y anatómicos o de microentornos. Las lectinas también han sido
usadas para estudios originales y comparativos para aportar pistas a cerca de la ontogenia y
filogenia de varios órganos o tejidos(389). Los cambios funcionales también han sido
explorados al igual que los cambios asociados con o que conducen a la transformación
maligna, metástasis y heterogeneidad tumoral celular.
5. 5. 1. 1. Componentes celulares
En biología celular, las lectinas han sido mayoritariamente usadas con éxito como
reactivos de orgánulos citoplasmáticos ricos en glicoconjugados tales como superficie de
membrana celular u orgánulos implicados en la síntesis, almacenamiento, o liberación de
carbohidratos complejos(324).
La función o significado biológico de la mayoría de las lectinas que se enlazan con
moléculas de superficie permanece desconocido. Sin embargo, a pesar de esta limitación, los
receptores de lectinas de superficie celular han sido explotados intensamente en el estudio de
la superficie celular. Las lectinas marcadas con FITC aplicadas a células vivas pueden ser
usadas para estudiar la fluidez de la membrana celular y los cambios en la distribución de
localizaciones de receptores bajo la influencia de varios estímulos(390). La endocitosis de
lectinas marcadas con peroxidasa aplicada a la membrana celular de células vivas ha sido
usada como modelo para estudiar la internalización de receptores de superficie en muchos
sistemas celulares.
Las localizaciones de enlace de lectina en la superficie celular pueden servir como
marcadores para el estudio de la polaridad celular. En epitelios polarizados tales como los
que delinean el tracto gastrointestinal algunas lectinas se sabe que reaccionan con la
membrana celular luminal apical pero no con las membranas basolaterales(391).
5. 5. 1. 2. Tráfico intracitoplasmático
Las lectinas han sido usadas como reactivos ultraestructurales para la modificación
postranslacional de las proteínas en los subcompartimentos del aparato de Golgi y del retículo
endoplasmático rugoso(388),(324).
5. 5. 1. 3. Identificación de tipos celulares específicos

Debido a la glicosilación diferencial de las membranas celulares y de componentes
citoplasmáticos en células altamente especializadas las lectinas pueden ser usadas como
reactivos para el estudio e identificación de varios tipos celulares(392).
5. 5. 1. 4. Marcadores de maduración
La diferenciación y maduración de varias células en los tejidos en desarrollo al igual
que los tejidos que sufren constante renovación puede ser eficientemente estudiada usando la
histoquímica con lectinas(324).
5. 5. 1. 5. Cambios funcionales y del desarrollo

En la cavidad uterina, en relación al embarazo y estudios de embriones precoces de
rata han mostrados que los glicoconjugados de superficie
aparecen y desaparecen de la superficie celular de una forma regulada por el
62
desarrollo(393),(394).
5. 5. 1. 6. Diferencias de especie, raza y grupo

La glicosilación de células equivalentes y macromoléculas citoplasmáticas difiere
entre las especies, por todo esto no es una sorpresa que estructuras anatómicas equivalentes
por su localización y función difieran entre sí según las especies en lo que respecta a sus
patrones de enlace de lectinas(392),(395). La histoquímica de las lectinas ha sido usada
ampliamente para explorar sutiles diferencias entre especies. Las diferencias en los patrones
de enlaces de lectinas en segmentos equivalentes de varios órganos han sido publicados
incluyendo testículos, epidídimo, oviducto, útero, glándulas salivales, páncreas, riñones y
linfocitos(324).
5. 5. 1. 7. Matriz extracelular
Muchas lectinas se enlazan intensamente al estroma del tejido conectivo de una
manera inespecífica.
5. 5. 2. Lectinas en patología
Formulando la hipótesis de que algunas condiciones patológicas podían perturbar el

metabolismo de los glicoconjugados celulares, muchos investigadores han obtenido ventaja
de la accesibilidad comercial de las lectinas y las han utilizado como reactivos para estudios
patológicos.
5. 5. 2. 1. Cambios reactivos
Los cambios relacionados con la inflamación en la distribución de glicoconjugados
celulares han sido mejor ilustrados en el intestino grueso y se tratarán posteriormente.
5. 5. 2. 2. Patología tumoral
Los glicoconjugados de superficie celular están a menudo alterados en las células
neoplásicos, globalmente estos cambios pueden ser clasificados como: a) pérdidas de ciertos
componentes normales b) cantidades aumentadas de componentes normales c) distribución
alterada de componentes normales y d) aparición de componentes que no se encuentran en
células adultas normales a partir de las que el tumor ha aparecido.
Las lectinas han sido usadas ampliamente como reactivos histoquímicos para estudiar
glicoconjugados de superficie celular en células tumorales, y globalmente los resultados
complementan los datos obtenidos por inmunohistoquímica con anticuerpos monoclonales y
policlonales. Sin embargo, al contrario de los anticuerpos, muchos de los cuales son
diagnósticos para ciertas lesiones patológicas, los datos histoquímicos de lectinas son
raramente patognomónicos.
Las lectinas han sido aplicadas a tumores animales y humanos de muchos sistemas
orgánicos incluyendo entre otros ojo, diente, pituitaria, tiroides, paratiroides, tracto
respiratorio, tracto gastrointestinal, riñón, mama, órganos genitales masculinos y femeninos,
tejidos hematopoyéticos y linfoides, y tejidos blandos(344),(396) -(404).
Las lectinas han sido usadas como reactivos para estudiar la histogénesis tumoral,
relación de los tumores con situaciones inflamatorias y preneoplásicas, diferenciación de
células tumorales, heterogeneidad de poblaciones celulares tumorales y biología básica de las
células tumorales. Los datos obtenidos en varios laboratorios son a menudo difíciles de
reducir a un común denominador. Todavía no han sido identificados coherentemente
63
marcadores de malignidad, invasividad o tendencia a la metastatización. La mayoría de los
tumores muestran una extensa heterogeneidad celular. Por todo esto, en este momento no
parecen factibles interpretaciones definitivas de estos hallazgos.
I. 5. 6. MICROSCOPÍA DE LAS LECTINAS
Para el uso en estudios de localización microscópica las lectinas deben ser enlazadas
con marcadores apropiados.
5. 6. 1. Métodos de marcaje de lectinas
El marcaje de lectinas de secciones de tejido puede realizarse según dos métodos:

5. 6. 1. 1. Métodos directos
Los métodos directos de marcado usan lectinas covalentemente enlazadas o
adsorbidas a marcadores visuales, generalmente fluorocromos (isotiocianato de fluoresceína o
de tetrametilrodamina) o una enzima (peroxidasa de rábano)(370),(405). También han sido
usados la ferritina y el oro coloidal.
Estos métodos se deben primariamente, a la accesibilidad de las preparaciones puras
de lectina y a la relativa facilidad con la que puede conjugarse a marcadores sin pérdida
significativa en la capacidad de enlace(405).
Los métodos directos muestran mayor sensibilidad particularmente para secciones de
parafina, pero necesita altas concentraciones de lectina(370).
5. 6. 1. 2. Métodos indirectos
Varios métodos indirectos para análisis microscópicos han sido desarrollados.
Los métodos indirectos actúan localizando la lectina enlazada o bien con un
anticuerpo dirigido frente a la lectina por una reacción avidina-biotina o bien aplicando
azúcar marcado a lugares de enlace no ocupados en la lectina(370). Existen 5
aproximaciones:
1. Método de anticuerpo en una etapa: Consiste en un anticuerpo dirigido frente a la lectina,
en una tinción de tipo anticuerpo indirecto. Esto puede usarse con un anticuerpo anti-lectina
conjugado con un marcador.
2. Método de anticuerpo en dos etapas: Por incubación con un anticuerpo anti-lectina tras
incubación con lectina y finalmente incubación con un segundo anticuerpo conjugado al
marcador. Alternativamente, puede usarse un proceso en tres etapas en las que las células son
secuencialmente tratadas con lectina, el anticuerpo anti-lectina y el conjugado anti-Ig-
marcador o proteína-A marcador. Tales métodos inmunológicos, sin embargo, no ofrecen
ventajas significativas sobre el método directo u otros métodos indirectos(406).
3. Método de lectina avidina-biotina: Este sistema avidina-biotina requiere una lectina
biotinada y posteriormente avidina conjugada con un marcador (generalmente peroxidasa).
Esta técnica es también aplicable con anticuerpos biotinados para marcado de localizaciones
antigénicas.
4. Método de lectina ferritina-avidina(406)
5. Método de lectina-oro coloidal.
6. Método del sandwich azúcar-lectina-azúcar. Consiste en un marcador glicosilado añadido a
la muestra incubada con lectina para unirse a las localizaciones de enlace no ocupadas(370).
El análisis más común es el método indirecto de Con-A usado con hemocianina. En
este método las células son previamente tratadas con Con-A, lavadas con tampón y
64
posteriormente tratadas con hemocianina. Ya que la Con-A es multivalente, es decir,
tetramérica bajo condiciones fisiológicas tamponadas puede enlazarse tanto con los
receptores específicos se superficie celular Con-A y con los residuos específicos Con-A en la
hemocianina. También han sido usados para MES otros marcadores como la
peroxidasa de rábano(407) o el hierro dextrano que también se enlazan con Con-A(406).
También se ha usado el oro-ovomucoide para la detección de lectina Wheat germ
(WGA)(408) y fetuína-oro para la lectina Limax flavus(409) y WGA(368). Un método
indirecto semejante puede ser usado con otras lectinas o marcadores derivados con los
correspondientes residuos azúcar.
5. 6. 2. Lectinas conjugadas con oro coloidal
Las partículas de oro coloidal (OC) han demostrado ser particularmente útiles para la
localización microscópica de las lectinas(368),(410).
Aunque el oro coloidal ha sido motivo de atención desde hace más de 400 años(411);
fue introducido en técnicas inmunológicas por Faulk y Taylor(412) en 1971; desde entonces
ha sido un marcador ampliamente utilizado para la detección a nivel de MO, MET y MES de
una variedad de sustancias exógenas y endógenas(413). La aplicación del oro coloidal en
MES fue introducida por Horisberger et al.(414) en 1975. Estudios anteriores llevados a cabo
con complejos lectina-oro han hecho hincapié en la detección de lugares de enlace en la
superficie de células cultivadas o aisladas y aspectos de su estado dinámico. Posteriormente
las aplicaciones se encaminaron a la visualización de residuos de azúcar en tejidos intactos y
dentro de las células(397),(415).
5. 6. 2. 1. Propiedades del oro coloidal

-Los soles monodispersos de oro con partículas de oro de tamaño uniforme y forma
pueden ser preparadas rápida, reproduciblemente y con bajo coste en un rango de partículas
de 2 a 150 nm de diámetro.
-La naturaleza del OC proporciona una fina localización de los lugares de marcado; el
rango de tamaños garantiza alta flexibilidad en la resolución lateral.
-Las partículas de OC están cargadas negativamente y pueden ser cargadas por
adsorción electrostática no-covalente con varias macromoléculas (por ej. proteína A
estafilocócica, inmunoglobulinas, lectinas, toxinas, glicoproteínas, enzimas, estreptavidina,
hormonas, antígenos peptídicos conjugados con albúmina sérica bovina) formando complejos
oro-ligand estables y bioactivos. En condiciones apropiadas de almacenamiento permanece
estable y retiene gran parte de su bioactividad durante varios meses a 4ºC.
-Las partículas de OC presentan alta densidad electrónica debido a su alto número
atómico y son capaces de emitir fuertemente electrones secundarios y retrodispersados: estas
características físicas hacen del oro coloidal un excelente marcador para MET y MES.
-El alto coeficiente de electrones retrodispersados del oro sugiere que el contraste
reforzado de la imagen por electrones retrodispersados proporciona una alternativa superior
para análisis cuantitativo visual o ayudado por ordenador de las moléculas diana. Su alta
electrodensidad hace que no puedan ser confundidas con estructuras biológicas.
-Las señales características de rayos X emitidas por oro pueden ser para iluminar y
cuantificar los marcadores de oro enlazados con las células por aplicación de técnicas
microanalíticas de rayos X y programas de ordenador adecuados.
-El marcado doble o múltiple de las diferentes localizaciones diana es posible por
aplicación de marcas de oro monodisperso de diversos tamaños.
65
-La cuantificación puede conseguirse por contaje directo de las partículas de oro.
-Debido al bajo grado de adsorción inespecífica de las marcas de oro a las superficies
de la muestra, el ratio señal/ruido es muy alto.
-Debido a las altas constantes de enlace de las marcas de oro a las superficies de las
muestras, las muestras biológicas pueden ser procesadas con una pérdida mínima de
partículas de oro.
-Debido a que las partículas de oro adsorben o reflejan la luz y pueden ser
amplificadas por procesos de refuerzo de plata, son aplicables para una variedad de técnicas
de marcado de MO, así como procesos no microscópicos (incluyendo inmunocoagulación e
inmunoprecipitación) y por lo tanto aportan un amplio rango de metodologías
correlativas(416).
-El color del OC en luz transmitida es usualmente rojo si las partículas son esféricas e
inferiores a 80 nm. El OC que se compone de partículas más grandes, no esféricas o
aglomeradas aparece azul a la luz transmitida. Las soluciones rojas presentan un pico simple
de absorción en el espectro visible que va entre 520 y 540 nm(417).
5. 6. 2. 2. Formación de partículas de oro coloidal

El método químico más útil y extendido para la formación de partículas de oro colidal
es la reducción(416),(418).
El oro coloidal se forma a partir de ácido tetracloroáurico, pero se han utilizado gran
cantidad de agentes reductores, como el fósforo blanco desarrollado por Zsigmondy(419) en
1905 y Zsigmondy y Thiessen en 1925; formaldehido (Zsigmondy, 1898), etanol (Vanino,
1905), monóxido de carbono (Donau, 1905), hidroxilamina o hidracina (Gubier, 1903),
peróxido de hidrógeno (Dörinkel, 1905), ácido ascórbico (Stathis y Fabrikanos(420), 1958),
citrato sódico (Frens(421), 1973), con ultrasonidos (Baigent y Müller, 1980), borohidrato
sódico (Tschopp et al., 1982) (416), (418).
En este estudio se ha empleado el método de formación de partículas de 30 nm según
Frens(420). Este procedimiento aporta coloides monodispersos, y dependiendo de la cantidad
de citrato sódico añadido a una cantidad constante de ácido tetracloroáurico, se pueden
obtener soles monodispersos con diámetros de partículas variando entre 15 a 150 nm.
Los procesos de reducción requieren limpieza escrupulosa del material de cristal y el
uso de agua bidestilada y filtrada, ya que la presencia de sustancias orgánicas, polvo, etc,
interfiere en la formación del coloide(417).
Las partículas de oro coloidal de 15 a 40 nm son visualizadas por un equipo
convencional de SEM con un filamento de tungsteno en forma de electrones retrodispersados
(BSE), este método ofrece la ventaja distintiva de ser capaz de correlacionar la organización
en tres dimensiones con las localizaciones citoquímicas o inmunohistoquímicas(396), aunque
también pueden ser observadas en forma de electrones secundarios(422) y las partículas ser
discernidas de otros contaminantes de la superficie mediante el uso de rayos X. Las partículas
de menor tamaño (5-15 nm) requieren equipos SEM de emisión de campo (field emission) o
detectores de BSE de alta sensibilidad(423),(424).
La aplicación de estos reactivos en MO es posible en tejidos fijados e incluidos
rutinariamente. Se obtienen resultados muy satisfactorios con paraformaldehido,
glutaraldehido o mezclas de ambos y formalina al 4%(425). Las incubaciones pueden llevarse
a cabo en cortes desparafinados(426) y rehidratados, o en cortes congelados.
La aplicación de partículas de oro coloidal de pequeño tamaño en MO es posible
gracias a la intensificación con plata de estas partículas. El objetivo de estas técnicas es
aumentar la intensidad de la señal del objeto con baja tinción del fondo(427) -(429).
66
5. 6. 2. 3. Conjugación de lectinas con oro coloidal
Para la preparación de complejos lectina-oro es necesaria a siguente información
básica:
En primer lugar, la conjugación de las lectinas con oro coloidal depende de los puntos
isoeléctricos específicos de cada lectina(416). Es decir, debe ajustarse el pH del oro coloidal
según la lectina que se desea acomplejar. En segundo lugar, la cantidad mínima u óptima de
lectina para estabilizar el coloide, para lo que suele ultilizarse el test de floculación de la sal.
La mezcla de OC y lectina se hace directamente en tubos de centrífuga, tras unos 1-2
minutos se añade una solución acuosa de polietilenglicol.
La purificación del complejo se obtiene por ultracentrifugación en rotor de ángulo
fijo. Las condiciones de centrifugación dependen del tamaño de las partículas del coloide.
Esta centrifugación resulta en la formación de sedimento suelto, intensamente rojo en el
fondo del tubo. Además se forma un punteado oscuro de material densamente comprimido en
la pared del tubo ligeramente por encima del sedimento y consiste en complejos precipitados
agregados o partículas no totalmente estabilizadas y debe ser descartado. El sobrenadante
incoloro que contiene proteína libre se aspira cuidadosamente y se descarta(415).
Debido al bloqueo estérico, el acceso de los marcadores de oro marcado con lectina a
los receptores depende del tamaño de las partículas. Por lo tanto, el que no haya reacción de
enlace no significa necesariamente la ausencia de receptores de superficie celular para
marcadores de oro(430).
Los complejos de lectina-oro pueden aplicarse mediante las dos técnicas previamente
descritas, los más usados son complejos oro-peroxidasa de rábano (HRP)(388). Las técnicas
de marcado indirecto aplicando complejos glicoproteína-oro para demostrar las
localizaciones de enlace con lectinas en la superficie celular fueron investigados por
Geoghegan y Ackerman(408) en 1977.
Las superficies altamente estructuradas de grandes muestras observadas en modo de
imagen de electrones retrodispersados son alteradas por efectos de carga, estos problemas se
obvian optimizando el grosor de la capa de carbono conductora y la intensidad de destello del
electrón(431).
I. 5. 7. LECTINAS USADAS EN EL ESTUDIO
En el presente estudio se han utilizado las lectinas Glycine max, Griffonia

simplicifolia-II, Arachis hypogaea, Ulex europaeus-I.
5. 7. 1. Glycine max (SBA)
La capacidad hemaglutinante de los extractos de comida de soja es conocida desde

hace muchos años. Primero se asociaron con las propiedades tóxicas y de retraso del
crecimiento de la comida de soja sin cocinar, posteriormente se mostró que la actividad
hemaglutinante residía en un único grupo de proteínas conocidas como hemaglutinantes de
soja (SBH), más tarde renombrada como aglutinina de soja (SBA). Posteriormente, muchos
investigadores consiguieron el aislamiento de la aglutinina de soja, con diversas técnicas de
purificación de proteínas.
Parece ser que la aglutinina de soja existe en formas múltiples y altamente semejantes.
Las isolectinas tienen composiciones y especificidad hemaglutinante muy similares, y eran
inmunoquímicamente indistinguibles. Aunque está presente en las semillas de la mayoría de
especies de soja, unas pocas carecen de esta lectina.
67
La SBA tiene un p. m. de 120.000 determinado por filtración de gel.
La aglutinina de soja es una glicoproteína tetramérica compuesta de iguales
cantidades de 2 subunidades ligeramente diferentes de p.m. 30000, conteniendo cada una de
ellas alanina N-terminal. Al igual que muchas otras lectinas, la SBA es comparativamente
rica en aminoácidos acídicos e hidroxílicos y está desprovista de cisteína. En común con otras
lectinas de legumbres, la aglutinina de soja posee una gran cantidad de conformaciones en
hoja aplanada (B-estructura)(432).
La glycine max es una glicoproteína que contiene un 7% de su peso en carbohidratos
consistentes en manosa y N-acetilglucosamina en un proporción molar de 9 a 2.
Estudios de enlace de carbohidratos, sobre la lectina de soja mostraron que exhibe una
mayor afinidad por la N-acetilgalactosamina, sus glucósidos y oligosacáridos en los que este
azúcar es la unidad terminal no reductora, la galactosa y sus derivados son menos reactivos.
La sustitución de oligosacáridos activos de grupo A por un grupo L-Fucosil en el
residuo galactosil subterminal disminuyeron grandemente su capacidad de enlace.
La SBA precipitó diversas sustancias purificadas de grupo sanguíneo. La
precipitación máxima fue conseguida con las sustancias tipo A1, mientras que las sustancias
tipo A2 eran considerablemente menos activas. Sin embargo, las sustancias B activas
reaccionaron pobremente a pesar de su contenido de grupos terminales -galactosil. Este
hallazgo fue atribuido al efecto bloqueante de los grupos L-Fucosil enlazados con N-
acetilglucosamina subterminal tal como ya se ha puesto de manifiesto. Las sustancias H
activas eran no reactivas(432).
5. 7. 2. Griffonia simplicifolia -II

La Griffonia Simplicifolia, una lectina de alta afinidad para los grupos no reductores
α o β N-acetilglucosaminil, fue aislada del extracto de la semilla de la planta con mismo
nombre por cromatografía de afinidad en chitina.
Estas semillas contienen también otra lectina específica α-galactopiranosil
denominada Griffonia Simplicifolia-I (GSA-I).
La GSA-II de enlace con N-acetilglucosamina es un tetrámero de 4 subunidades
aparentemente idénticas de p.m. 30.000.
Una glicoproteína GSA-II (4% de carbohidrato) contiene como muchas otras lectinas
de legumbres una alta proporción de aminoácidos hidroxílicos y acídicos. A diferencia de la
mayoría de lectinas de legumbres contiene 3 residuos de cisteína por subunidad y un puente
disulfuro enlaza las dos subunidades.
La GSA-II posee una localización de enlace carbohidrato por subunidad.
La lectina GSA-II no aglutina los eritrocitos A, B u O, pero sí células poliaglutinables
B-adquiridas T activadas y Tk. La GSA-II dio curvas de precipitina con conjugados de suero
bovino, p-azofenil, N-acetil y  y -glucosaminida. Coherentemente con su conducta de
aglutinina inespecífica de grupo sanguíneo, la lectina GSA-II no precipitó con las sustancias
de grupo sanguíneo A1, A2 o LEa o con la sustancia precursora de grupo sanguíneo con
actividad I e i. De las sustancias humanas B y H sólo aquellas con residuos terminales N-
acetilglucosamina reaccionaron bien(433).
Se ha establecido que la GSA-II interacciona con los mismos determinantes de grupo
N-acetil-β-glucosaminil derivados de sustancias de grupo sanguíneo de líneas celulares de
estómago humano y cerdo al igual que con la Concanavalina A. Las glicoproteínas con
unidades terminales N-acetil--glucosaminil tales como los agalactorosomucoides también
precipitaron estas lectinas. El glucógeno y el dextrano formaron precipitados a altas
68
concentraciones de lectina.
La lectina GSA-II es liberada por una fosfolipasa C fosfatidilinositol específica por
las células de la membrana. Se cree que se ancla a la membrana por la vía de una molécula
glicosil-fosfatidilinositol(433).
La GSA-II es de particular interés y valor porque es la única lectina que interacciona
exclusivamente con los grupos terminales no reductores que terminan en α o β-N-
acetilglucosamina(432).
5. 7. 3. Arachis hypogaea (PNA)
La PNA es una lectina glicoproteica vegetal derivada de las semillas de Arachis

hypogaea. Presenta un extenso lugar de unión, con afinidad para los grupos galactosil y
reconoce el disacárido D-Gal-β (1-3) D-GalNAc(362),(434).
Este se encuentra con frecuencia en posición subterminal, oculto por el ácido siálico,
por lo tanto, es necesaria la extracción del siálico para que el disacárido quede al descubierto
y la lectina pueda tener acceso. Así, los eritrocitos se enlazan con PNA sólo tras desialación
por neuraminidasa. Esto altera el Ag de grupo sanguíneo MN al exponer el Ag normalmente
críptico de Thomsen-Friedenreich (TAg). Este Ag, descubierto en 1927, se cree que es el
lugar de enlace de tejido con PNA en una variedad de localizaciones(324).
La PNA es una lectina tetramérica libre de carbohidratos compuesta de 4 subunidades
idénticas. Las estimaciones del p.m. agregado de la lectina purificada por afinidad varían de
98.000 y 106.500 hasta 110.000; el tamaño de las subunidades ha sido variablemente
publicado en 27.000, 28.000 y 24.500.
La PNA contiene un átomo de calcio y otro de magnesio por subunidad. Es rica en
aminoácidos acídicos e hidroxílicos y está desprovista de cisteína. Lotan et al(435),
publicaron 2 residuos triptófano por subunidad, mientras que Miller publicó la presencia de 3
triptófanos. Los estudios de cristalización y cristalográficos revelaron que contenía un 50%
de agua(432).
La PNA parece ser un marcador adecuado para macrófagos, histiocitos y células de
Reed-Sternberg.
5. 7. 4. Ulex europaeus (UEA-I)

La lectina UEA-I se une específicamente con la α-L-fucosa, el azúcar terminal de las
sustancias de grupo sanguíneo H2 y Ley cuya expresión está confinada principalmente en el
colon proximal(436).
Cazal y Lalaurie(437) mostraron que las semillas de UEA-I contienen una proteína
que reacciona con el antígeno de grupo sanguíneo H (O); los extractos de UEA-I han sido
usados para el estudio de la sustancia de grupo sanguíneo H(O) en tejidos humanos. El
Antígeno H(O) se considera que es una sustancia precursora de los antígenos ABO y está
presente no sólo en el grupo sanguíneo humano O, sino también en los grupos sanguíneos no
O.
Esta aglutinación se inhibe específicamente por sustancia H en saliva humana y esta
reacción se usa en los bancos de sangre para detectar secretores de sustancia A, B y H.
Esta lectina también precipitó con las sustancias humanas A2, por una sustancia con
actividad A, y con sustancias B de origen animal(438).
La lectina UEA-I no precipitó con las sustancias de grupo sanguíneo A1, con las
sustancias Lea o con la substancia precursora de grupo sanguíneo con actividad I o con las
69
fracciones P1 obtenidas por hidrólisis ácida de las sustancias de grupo sanguíneo B(438).
Los extractos de Ulex contienen dos lectinas denominadas I y II, que pueden ser
separadas por precipitación fraccional por sulfato de amonio; la actividad hemaglutinante de
la lectina UEA-I precipitada con sulfato de amonio al 40%, se inhibe mejor por L-fucosa,
mientras que la UEA -II, precipitada con sulfato amónico entre un 40 y un 70%, no se inhibe
por la L-fucosa y se inhibe bastante pobremente N,N'-diacetilchitiobiosa. La lectina UEA-I
ha sido purificada por cromatografía de afinidad, adsorbiéndose con gel de α-L-Fucosil-O-
poliacrilamida o con columna de Fucosil sefarosa 4B y eluyéndolo con L-Fucosa. La lectina
también ha sido purificada por métodos convencionales de filtración de gel y cromatografía
de intercambio iónico. La lectina Ulex purificada es una glicoproteína de p.m. 46.000,
constituida por cadenas polipeptídicas unidas por fuerzas no covalentes. Presenta un punto
isoeléctrico de pH 6,0-6,1 conteniendo un 7,2% de azúcar neutro(432).
I. 5. 8. Histoquímica con lectinas del colon normal humano
La histoquímica de las lectinas ha revelado patrones específicos de tinción para

epitelio colorrectal normal y neoplásico, indicando un cambio en la estructura de los
carbohidratos de las lectinas(434).
El colon proximal y distal tanto en el hombre como en los animales difieren tanto en
origen embriológico, función fisiológica, morfología e histología detallada. También se han
descrito diferencias en la epidemiología, patogenia y conducta de los tumores que se
desarrollan en colon proximal respecto al distal. Diversos autores han descrito diferencias
regionales en la distribución de glicoconjugados en mucosa colónica normal(439),(440).
La histoquímica de las lectinas ha revelado patrones específicos de tinción para
epitelio colorrectal normal(434).
Un enlace de SBA máximo se observa en células epiteliales colónicas normales bien

diferenciadas. La SBA ha sido usada como biomarcador de diferenciación celular(441).
La lectina GSA-II se enlaza exclusivamente a nivel supranuclear de las células
caliciformes y absortivas normales(442),(443). La GSA-II reacciona con glicoproteínas en el
aparato de Golgi de las células productoras de moco.
Esta lectina detecta mitades específicas de grupos glucosil en glicoconjugados
incompletamente glicosilados de la región del aparato de Golgi.
En el colon normal humano la PNA se enlaza a nivel supranuclear de las células

caliciformes y columnares, en la zona del aparato de Golgi(443) -(445). En la mucosa normal
del adulto, no existe mucina enlazada con PNA(446), en cambio, sí existe unión al colon
neonatal(447).
La detección de un patrón de enlace de PNA supranuclear en el epitelio colónico
representa la detección de oligosacáridos nacientes en el aparato de Golgi, previamente a la
adición de ácido siálico terminal, lo que necesita la acción de la enzima sialiltranferasa. El
ácido siálico sólo es incorporado por las células superficiales caliciformes más maduras y por
70
las células columnares(447). Es decir, que la adición subsiguiente de otros azúcares
terminales enmascara los lugares de enlace y convierte a las glicoproteínas de las gotículas de
mucina en no reactivas con esta lectina. Retirando el ácido siálico terminal con
neuraminidasa se expondrá el penúltimo residuo Gal y hará que la mucina de las células
caliciformes sea reactiva con la PNA(362). Esta secuencia de digestión por enzima-enlace
con lectina puede ser utilizada para definir anormalidades en la producción de moco en varias
situaciones inflamatorias o neoplásicas.
El pretratamiento con neuraminidasa no produce cambios en las criptas que expresan
localizaciones de enlace de PNA en la región Golgi(448).
Estudios recientes demuestran que la PNA actúa aumentando la proliferación celular del
epitelio colónico normal in vitro(449).
La lectina UEA-I muestra diferencias regionales en su distribución a lo largo del
colon.
La mucosa no neoplásica del colon derecho, ciego y colon ascendente, presenta enlace
de esta lectina en la mayoría de las células caliciformes o en algunas, no se observa ningún
caso sin marcaje(351). En el colon izquierdo, colon descendente y colon sigmoide la UEA-I
enlaza ocasionalmente con la mucina del colon descendente normal humano, mientras que el
recto carece de localizaciones de enlace de UEA-I(351),(450) ,(451).
En el colon humano normal se sitúa en el moco de las células caliciformes. En cortes
congelados también se observa unión con los capilares y vesículas sanguíneas y muy débil
con las células de la membrana; estos enlaces no se observan en los tejidos colónicos fijados
con formalina(351).
La UEA-I muestra enlace en la superficie apical de las células columnares,
especialmente en el colon derecho(443).
I. 5. 9. Valor clínico de las lectinas en el cáncer colorrectal en humanos

Una transformación en la composición de los glicoconjugados colónicos ha sido
descrita en adenomas, carcinomas, y condiciones premalignas como la poliposis familiar y
los síndromes de cáncer de colon hereditario no polipósico(452), traduciendo la existencia de
diferencias cualitativas y cuantitativas entre las mucinas de epitelios colónicos benignos y
neoplásicos(448).
Los cambios en las características de enlace de las lectinas reflejan el estado de
diferenciación y la presencia de transformación maligna en las células epiteliales
colónicas(446). Estos cambios en el espectro de glicoconjugados de las células cancerosas o
embrionarias están causados por glicosilación incompleta o por formación de cadenas de
azúcar adicionales(351).
En general la positividad de la tinción de áreas de displasia severa y en carcinomas
colorrectales consiste en una fina reactividad lineal de las membranas de las células apicales
en las criptas severamente displásicas o carcinomatosas y en las secreciones intraluminales.
De forma ocasional, se observa enlace de lectina en áreas focales a nivel citoplasmático
apical.
No se observan diferencias regionales en los patrones de lectinas de cánceres
colónicos proximales y distales(439),(440) , ni ninguna relación detectada entre reactividades
de lectina y estadio de Dukes, tamaño o tipo histológico de los tumores. De modo que los
carcinomas de diferentes regiones colónicas tienen una distribución más uniforme de
carbohidratos que la respectiva mucosa normal(439).
71
El análisis de las glicoproteínas de la membrana del cáncer de colon ha revelado una
marcada reducción en el contenido global de carbohidratos, actividad de grupo sanguíneo
ABO y actividad de glicosiltransferasa en comparación con las del colon normal(446).
La SBA muestra máximo enlace en el colon descendente normal humano y está más
reducido en colon proximal y recto(378).
Bioquímicamente, la reducción del enlace de SBA en la mucina de las células
caliciformes indica que hay menos residuos GalNAc terminales no reductores en las cadenas
de oligosacáridos de la mucina, lo que podría ser debido a la glicosilación incompleta de las
glicoproteínas en las células epiteliales colónicas inmaduras(446).
En la mucosa quiescente de la colitis ulcerosa la SBA se enlaza con N-
acetilgalactosamina expuesta, en la mitad superior de la cripta de las células caliciformes.
Las neoplasias colónicas reaccionan con tinción heterogénea intralesional para la
GSA-II. En general, muestran una fina tinción lineal de las membranas celulares apicales y
ocasionalmente, muestra tinción a nivel citoplasmático con gran especificidad, aunque la
mayoría no se enlazan con dicha lectina(442),(453).
En los adenomas con displasia leve o moderada la lectina GSA-II se enlaza a la región
supranuclear de las células caliciformes en la mayoría de los casos(440), (441).
La PNA marca las mucinas de los carcinomas colorrectales(452).
Cooper(454) describe dos patrones de enlace de la PNA en las neoplasias colónicas
humanas. El primero de localización en la región del glicocálix y el segundo de localización
intracitoplasmática en la porción apical de las células.
Las neoplasias más pobremente diferenciadas expresan localizaciones de enlace de
PNA con menor frecuencia(454). En las neoplasias bien diferenciadas se observa reactividad
a lo largo de las membranas celulares(455). En tumores moderadamente diferenciados
aparece una tinción citoplasmática difusa de las vacuolas citoplasmáticas, en otras áreas se
observa tinción periapical como en los casos pobremente diferenciados en los que se
constituye como patrón primario. La PNA es un marcador no sólo de progresión neoplásica
sino también de diferenciación(455).
La heterogeneidad intralesional consistente en áreas de glándulas carcinomatosas
positivas o negativas se observa frecuentemente en carcinomas colorrectales tras tinción con
PNA.
La mayoría de los carcinomas in situ (áreas de displasia adenomatosa severa)
muestran un enlace fuerte y directo de PNA.
El tratamiento con neuraminidasa muestra que muchos tumores inicialmente no
reactivos expresaron localizaciones de enlace con PNA(440). Estos resultados difieren de los
de Boland et al.(329) que encuentran enlace de PNA localizado en la mucina de las células
caliciformes sin tratamiento previo con neuraminidasa.
El patrón de reactividad de PNA al igual que la expresión de los grupos sanguíneos
ABH, diferenciación de células en caliciformes y producción de glicosiltransferasa son
semejantes en el epitelio colónico carcinomatoso y en el fetal.
La alteración en el patrón normal denota como ya hemos dicho síntesis incompleta de
glicoproteínas, probablemente asociado a deficiencias de ciertas glicosiltransferasas y no es
72
un hecho bioquímico limitado a los tejidos neoplásicos(324). De hecho se ha descrito un
aumento de la reactividad de la PNA en la mucosa transicional de tumores colorrectales(445)
y en lesiones preneoplásicas.
La PNA marcó en la región supranuclear de pólipos hiperplásicos, o pólipos
adenomatosos mostrando displasia ligera o moderada; y no en las células neoplásicas de
adenomas(456). El enlace también depende del tamaño del pólipo(457). Estos resultados han
sido confirmados posteriomente por otros investigadores al observar un número decreciente
de criptas que expresan localizaciones de enlace de PNA en la región Golgi con
desdiferenciación creciente conduciendo a una completa ausencia de localizaciones de enlace
de PNA en adenomas grado IV(449). Mientras que otros autores describen un patrón
aumentado relacionado con el grado de displasia(435),(329), y por consiguiente consideran el
enlace de PNA como indicador de riesgo aumentado de desarrollar cáncer de colon en la
poliposis colónica(329).
El marcado de adenomas tubulares y vellosos fue semejante con excepción de la
tinción lineal apical en áreas focales de células no mucinosas columnares que se ven
frecuentemente en los adenomas vellosos(455). El tratamiento con neuraminidasa no cambió
significativamente el enlace de PNA.
En la displasia la PNA se enlaza a la mucina de las células caliciformes y también a
nivel supranuclear(446), así como a nivel de las células columnares no mucinosas(362). En
ocasiones las muestras displásicas presentan una reactividad intracitoplasmática finamente
granular(455).
El enlace de PNA es constantemente positivo en presencia de displasia en la colitis
ulcerosa(434) tanto en agudización como en su ausencia(458),(459) , aunque algunos autores
describen exclusivamente reactividad a nivel supranuclear(434), (446) o presencia de un
patrón normal en la colitis ulcerosa ligera e inactiva(362).
Existe una asociación global significativa entre la positividad de PNA y la presencia
de carcinoma en pacientes con colitis ulcerosa, pero la alta tasa de falsos positivos (62%)
parece limitar su valor en la confirmación de riesgo de cáncer en un paciente individual(459).
En la colitis ulcerosa la sialidación terminal no tiene lugar en la membrana
celular dejando de esta manera el receptor accesible para enlace con lectina. La síntesis de
glicoproteínas incompletas es probablemente un hecho reversible y revierte cuando la
inflamación es quiescente. En la displasia se observa una alteración similar, pero es más
probablemente irreversible(362).
Tras el tratamiento con neuraminidasa de mucosa hiperplásica de pacientes con colitis
ulcerosa, la reactividad con PNA se encuentra fundamentalmente en la mucina de las células
caliciformes y a todos los niveles de la cripta(442).
En la enfermedad de Crohn se registra la pérdida de residuos Fuc en el colon
izquierdo y de residuos GalNAc en el colon descendente, indicando que el moco colorrectal
está anormalmente glicosilado.
La PNA actúa como un mitógeno en líneas celulares de cáncer de colon(447).
5. 9. 4. Ulex europaeus-I
En el colon neoplásico el enlace de UEA-I se sitúa en los ápices celulares, en los
bordes apicales luminales y en las secreciones luminales(351),(453).
Yonezawa et al. (351), describen diversidad de unión de la lectina UEA-I según la
localización tumoral; mientras en el colon derecho no todos los tumores se enlazan con esta
lectina, en el colon izquierdo y en el recto, la mayoría de las lesiones neoplásicas muestran
enlace con esta lectina(473).
73
La extensión de las lesiones cancerosas no está correlacionada con el grado de enlace
de UEA-I(351).
Las sustancias UEA-I reactivas tinen una distribución similar al CEA en los
tejidos(460).
En los adenomas se observa también enlace de lectina. En el punto de contacto de
adenomas y mucosa no neoplásica, la UEA-I marcó el epitelio no neoplásico pero no el
neoplásico. La presencia de adenomas marcados sugiere tres posibilidades: 1. Presencia de
sustancias de grupo sanguíneo H (O), 2. Alteración de la estructura terminal de carbohidratos
o, 3. La producción de glicoproteínas neoplásicas(351).
En biopsias de mucosa de colon proximal de pacientes con colitis ulcerosa y
enfermedad de Crohn se observa una tasa disminuida en la presencia de localizaciones de
enlace de UEA-I. La alteración en la disposición normal, parece ser debida a una capacidad
disminuida de disponibilidad de residuos Fucosil en el colon proximal en estos pacientes: Se
produce una reducción significativa de los residuos Fucosil frente a los galactosil(450). Otros
autores no consideran la UEA-I un buen método diagnóstico de los cambios premalignos
asociados a la colitis ulcerosa(458).
Jass et al.(436) describen una expresión aumentada de L-fucosa en algunos adenomas,
mostrando un patrón en mosaico; en carcinomas, con patrón difuso y en pólipos
hiperplásicos, a nivel de la base de la cripta, no mostrando reactividad la mucosa normal ni la
adyacente al tumor de pacientes con cáncer de colon.
La UEA-I ha sido usada para identificar en biopsias rectales grupos de alto riesgo para
cáncer colorrectal, puesto que los individuos genéticamente con alto riesgo de cáncer de
colon y recto y los pacientes con poliposis adenomatosa familiar muestran una reactividad
similar en la mucosa aparentemente normal(461). La mucosa normal de pacientes con
poliposis familiar muestran una intensidad de enlace superior a los controles con esta
lectina(452).
I. 5. 10. Lectinas y mucosa colónica de rata
Freeman et al.(462) usaron lectinas para detectar las diferencias en los

glicoconjugados de las células caliciformes del colon proximal y distal, observando
diferencias de enlace con la Con-A y Lens Culinaris, en la mucina de las células caliciformes.
Otros autores han confirmado, las diferencias regionales en la mucosa normal de ratas usando
otras lectinas.
En ratas Wistar, la lectina SBA, muestra un patrón distinto para la localización
proximal y distal. La mucina de las células caliciformes reacciona más intensamente en la
superficie epitelial que en las células de la base de la mucosa, que muestran reacción débil.
También muestran reactividad las células epiteliales a nivel de la superficie luminal y
basolateral(394).
En el colon proximal la UEA-I marca la mucina de las células caliciformes(392). Es
más intenso en la región basal de la cripta comparado con el epitelio superficial. En el colon
distal el enlace es negativo o muestra una reactividad muy ligera. Se obtiene marcaje en la
superficie luminal de las células epiteliales a nivel basal(392).
La PNA muestra un patrón de marcaje en la mucosa de rata normal similar al colon
humano. Se localiza en la región supranuclear, correspondiente a la región del aparato de
Golgi, en forma de patrón granular; y está ausente a nivel de la mucina de las células
caliciformes(464), siendo más evidente en el epitelio más superficial,(463). Algunos autores
describen que su localización se limita al colon proximal(463).
74
Usando lectinas marcadas con peroxidasa Kotake(465) estudió los carbohidratos de la
membrana celular y citoplasma de tumores de rata inducidos con DMH, observando patrones
distintos de marcaje para las lectinas PNA, WGA y UEA-I entre la mucosa normal y
neoplásica. Las células cancerosas mostraban un alto grado de enlace, superior a las no
neoplásicas. La PNA y la UEA-I mostraron altos índices de marcaje en el citoplasma de la
mucosa transicional.
La lectina PNA muestra enlace intenso con la mucina de las células caliciformes
tumorales, así como a nivel de la mucosa transicional(463), (464) , presentando enlace con
mayor frecuencia la mucosa distal y se sitúa también débilmente en la superficie luminal.
También la mucosa macroscópicamente normal de ratas tratadas con DMH muestra
ocasionalmente enlace con PNA(463).
La UEA-I es positiva en todos los carcinomas proximales y distales, mostrando la
mucosa transicional fuerte reacción con esta lectina en la mucina de las células caliciformes y
en la superficie luminal(463),(466) ,(467).
Balzer y cols.(468) no observaron cambios preneoplásicos en el enlace de UEA-I con
respecto a la mucosa control normal en ratas tratadas con DMH. Mientras que Calderó et al.
(463) encuentran diferencias en la mucosa distal de ratas tratadas.
I. 6. Citometría de flujo
I. 6. 1. Ciclo celular
En el ciclo celular se distinguen varias fases: Las células denominadas como fase de
reposo (G0) no están en el ciclo; las células en fase de síntesis proteica (G1a) o síntesis de
ARN (G1b), están colocadas justo después de recuperarse de una división o preparándose para
iniciar otro ciclo. Las células se dice que están en fase S cuando están en proceso de síntesis
de material genético o ADN; las células que están en fase G2, son células que han terminado
la síntesis de ADN y por lo tanto poseen una cantidad doble de la normal de ADN y, por
último, las células en fase M están sufriendo la división celular(469) (Figura 1-9). Según el
tipo y función de la célula, ésta tiene más o menos actividad proliferativa y el ciclo puede
variar según diversas condiciones como fármacos, radiaciones o hipertermia(470).
I. 6. 2. Introducción. Aspectos históricos
Los intentos de abrir espacio a una citología analítica o cuantitativa se remontan a los
trabajos de Caspersson en 1936, desarrollados posteriormente por Pollister y Ris(471). Se
comenzó cuantificando los ácidos nucleicos en células sin teñir mediante
microespectrofotometría, utilizando rayos ultravioletas como fuente de energía; más tarde se
aprovechó al mismo fin la reacción de Feulgen y, posteriormente, sustancias fluorescentes
que se intercalan directamente con los ácidos nucleicos, de forma estequiométrica, es decir la
reacción colorimétrica es proporcional a la cantidad de ADN(472). A pesar del porcentaje
significativo de falsos positivos y negativos, la citometría estática ha ido progresando hasta
nuestros días.
La instrumentación alternativa que parece que ha resuelto la mayor parte de la
problemática que puede plantear la lectura de una preparación citológica estática es la
citometría de flujo, aparentemente inspirada en la afortunada observación de Coulter, un
electrical engineer, que supuso que al pasar células sanguíneas en solución salina por un
orificio muy pequeño se detectarían por los cambios producidos en la impedancia eléctrica en
75
el orificio(473).
La citometría de flujo es una técnica que permite el estudio combinado de distintas
características morfológicas, estructurales y funcionales de las células incluidas en un flujo de
líquido isotónico.
Su empleo ha aportado fundamentalmente rapidez, sensibilidad y objetividad en el
análisis celular, constituyendo actualmente un valioso complemento de las técnicas clásicas
de estudio de la morfología y biología celulares.
En este sentido, puede decirse que las aplicaciones actuales de esta técnica son
innumerables, si bien la cuantificación del ADN es la más conocida y difundida, desde que
Van Dilla et al. obtuvieran el primer histograma de ADN realizado por CMF en 1967(474).
I. 6. 3. Fundamentos técnicos
El principio básico de la citometría de flujo es la medición de características ópticas y

fluorescentes de una célula individual inmersa en un flujo líquido y que interacciona con un
haz de luz monocromática, usualmente producida por un láser.
Un citómetro de flujo (CMF) está integrado por cuatro componentes:
1. Compartimento fluídico
2. Fuente luminosa
3. Sistema óptico
4. Soporte informático para el análisis de datos(475).
En el compartimento fluídico se consigue un patrón de flujo laminar al ser

introducidas las células a medir en el centro de una cámara rodeada por un fluido de arrastre
que tiene mayor volumen y se encuentra a mayor presión. El sistema de fluido es usualmente
un tampón salino isotónico. Después de pasar por el inyector, el chorro de la muestra se
reduce a un grosor de 10 micrones y las células que fluyen en él se separan alrededor de 2
mm. De esta forma se busca que las células incluidas en el centro de ese flujo crucen
ortogonalmente y de una en una la fuente luminosa del instrumento.
Para paliar las posibles desviaciones de la corriente de líquido en el que viajan las
células respecto al punto medio del haz de láser, lo cual provocaría la iluminación de algunas
células con intensidades menores a la máxima, los citómetros disponen de mecanismos que
permiten al observador efectuar pequeñas modificaciones en la posición de la cámara de flujo
y en la trayectoria del haz de luz para ajustar al máximo la intercepción de los mismos.
Cuando la célula pasa a través de la luz del láser, los transductores convierten señales
ópticas y fluorescentes en señales eléctricas. Estos pulsos eléctricos son posteriormente
amplificados, integrados y registrados por medio de un conversor analógico-digital para que
puedan ser analizados por un computador. Cada célula es considerada un evento apropiado
que es proporcional a la intensidad de la señal. En este sentido una intensidad continua de
fluorescencia (o de otros parámetros) es convertida en impulsos digitales discontinuos o
canales, cuyo número está entre 256 y 1024. Cada canal representa un cierto rango de
intensidad de luz, y la señal de una célula se registra en uno u otro canal dependiendo de la
intensidad de la señal. A partir de los datos se genera un histograma de distribución de las
células de la población analizada en función de los diferentes valores del parámetro estudiado
que imprime el número de eventos por canal (intensidad)(476).
Los datos pueden ser mostrados comparando cualquier combinación de parámetros:
forward contra side scatter, fluorescencia uno contra dos, intensidad de fluorescencia, etc...,
tal como se describe posteriormente.
76
6. 3. 1. Fuentes de luz
La iluminación de las partículas a medida que fluyen a través de una fuente de luz es
la responsable de la generación y difusión de las señales fluorescentes en las que el análisis
por citometría de flujo está basado.
Las fuentes de luz primaria usadas más frecuentemente en citometría de flujo son
láseres de argón o kriptón y lámparas de mercurio. El láser es ajustado a la longitud de onda
apropiada para excitar un colorante en particular.
El paso de una célula por delante del haz de rayo láser va a proporcionar información
sobre las distintas características celulares en relación a la dispersión de la luz que provocan y
la emisión de luz por los fluorocromos presentes en las células y excitados por el láser(476).
6. 3. 2. Suspensión celular
Para el estudio por citometría de flujo, en primer lugar es preciso obtener una
suspensión de células o núcleos de la muestra a analizar que sea representativa, de alta
calidad, sin contaminantes y con buen rendimiento(477). Aunque tales células en suspensión
son fácilmente preparadas para especímenes fluidos tales como sangre periférica, o fluidos
serosos, o para tejidos linfoides, los tumores sólidos son disgregados con mayor dificultad. A
este fin se han descrito una gran cantidad de métodos para disgregar tejido sólido y fresco y
convertirlo en una suspensión de células o núcleos, rompiendo los enlaces intercelulares.
Estos métodos se basan en la disgregación mecánica sola, por ejemplo, muestras obtenidas
por aspiración con aguja fina(478) -(480), o combinada con digestión enzimática o con
detergentes dependiendo de las características del tejido a analizar. Todos estos agentes y su
procesado producen variables grados de lesión celular en las células y producción de restos
celulares que dificultan un cálculo preciso de las fases del ciclo celular(471), una de las
principales fuentes de error en la determinación de la ploidia de ADN en tumores sólidos, que
depende de la concentración enzimática y el tiempo de incubación(477).
En 1983 Hedley(481) publicó la técnica de determinación del ADN en piezas
incluidas en parafina modificada posteriormente por otros autores. Este método usa la
digestión con pepsina. La utilización de este material presenta gran número de ventajas para
la realización de estudios clínicos. En primer lugar, pueden investigarse grandes series de
pacientes en los que es posible realizar un seguimiento retrospectivo, conocida ya la
evolución de los enfermos. Además, si se desea estudiar lesiones poco frecuentes el uso de
material archivado nos permite recoger una casuística adecuada.
Desde el punto de vista técnico estos histogramas son más difíciles de interpretar por
la variabilidad de la intensidad de la fluorescencia en cada muestra, la existencia de más
detritus, lo que hace que la deflexión G0/G1 sea más irregular y de base más amplia (con
mayor coeficiente de variación) lo que puede enmascarar algunas aneuploidias y alteraciones
en la fase S(482) -(484). Otra limitación es que sólo pueden estudiarse los parámetros
nucleares, ya que el citoplasma se destruye cuando los cortes gruesos tienen que trocearse
muy finamente y digerirse con enzimas proteolíticas. De forma que el grosor del corte de
tejido afecta la calidad del resultado obtenido(485).
La edad del bloque no influye al menos en periodos inferiores a 10 años(486) aunque
la fluorescencia disminuye con el tiempo(475).
Otros métodos de digestión enzimática han sido desarrollados posteriormente para
obtener suspensiones nucleares de muestras incluidas en parafina, como los de Vindelov(487)
77
y Schutte que usan la digestión con tripsina(488).
También cabe considerar que en algunos casos se produce una autolisis de las
muestras que a menudo no se detecta por microscopía óptica. La autolisis de las muestras es
causante de la aparición de picos falsos de aneuploidia, en su mayoría son picos redondeados
y con gran coeficiente de variación; aunque algunos son estrechos con coeficiente de
variación pequeño e índice de ADN pequeño, fundidos más o menos con el pico diploide G1
y pueden dificultar el análisis por citometría de flujo al interpretarse como picos aneuploides.
La autolisis aparece más pronto en tejidos que contienen enzimas digestivas, y que han sido
fijadas pobremente o muy despacio, por ejemplo con un volumen limitado de fijador. Otro
factor, a tener en cuenta es que las neoplasias se hacen macro y microscópicamente
necróticas in vivo. En los casos de autolisis, la degeneración de la cromatina podría resultar
en un enlace aumentado de los fluorocromos con los cordones de ADN(489),(490).
Aunque en general, la mayoría de los autores comentan que los cortes de parafina
ofrecen información segura, similar a la obtenida con tejido fresco congelado(472),(491).
6. 3. 3. Colorantes
Diversos tipos de tinciones fluorescentes están a nuestro alcance para el análisis de

ADN; sus características los hacen adecuados para diversas aplicaciones (Tabla 1-5). Los
colorantes fluorescentes más frecuentemente utilizados son el isocianato de fluoresceína
(FITC), el naranja de acridina, la ficoeritrina (PE) y el yoduro de propidio (PI), que pueden
ser excitados por una luz láser seleccionada a una longitud de onda de 488 nm, la más usada
en la práctica.
TIPO DE LUZ MEDICIÓN PARÁMETRO
Láser incidente dispersión frontal tamaño celular, estructura externa
dispersión a 90º estructura intracelular (relación

núcleo/citoplasma, vesiculación, etc.)
FLUOROCROMOS
Fluorescencia bromuro de etidio cantidad de ADN

yoduro de propidio
naranja de acridina
mitramicina
4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)
Hoechst 33258
naranja de acridina cantidad de ARN
isocianato de fluoresceína (FITC) cantidad de proteínas
isocianato de tetrametilrodamina (TRIC)
diacetato de fluoresceína (FDA) esterasas enzimas
78
dibutirato de fluoresceína
flavona-3-difosfato triamónico fosfatasa ácida
7-Br-3-hidroxi-2-nafto--anisidina fosfatasa alcalina
fosfato
lisil-alanil-4-metoxi-2-naftilidina proteasas
E-glutamil-4-metoxi-2-naftilamida
7-Br-3-hidroxi-2-nafto-?-anisidina-A-D- A-glucuronidasa
glucurónico
anticuerpos marcados con FITC antígenos de membrana

anticuerpos marcados con TRIC
NADPH, NADH autofluorescencia
diacetato de fluoresceína (FDA) permeabilidad Membrana
yoduro de propidio celular
3,3'-dihexilosacarbicianida potencial
rodamina 120 cadena respiratoria

mitocondrial
Tabla 1-5
Algunos de los parámetros y fluorocromos que se pueden
determinar y utilizar en CMF.
El yoduro de propidio, el fluorocromo utilizado en este estudio, es del tipo

intercalante que se une al material genético de doble cadena intercalándose entre las dos
bases, presenta especificidad por el ADN y ARN de doble cadena, de modo, que la muestra
requiere de tratamiento previo con ARNasa si sólo se desea medir ADN, además células con
nucleolos prominentes y citoplasmas ricos en ribosomas producen contajes anormales con
fases S altas(484). El espectro de excitación se encuentra en el azul/verde-rojo. Precisa de
células muertas y fijadas puesto que no atraviesa las membranas íntegras, lo que sirve para
discriminar células viables de no viables. El PI no es fluorescente a menos que esté enlazado
a ácido nucleico de doble cordón, y por lo tanto, no es útil enlazado a anticuerpos para la
tinción de superficies celulares.
I. 6. 4. Parámetros de medición
Los tipos de parámetros celulares que se pueden determinar por esta técnica, pueden
agruparse en función del tipo de luz detectada, tal como se resume en la Tabla 1-5.
Cuando una luz de láser incide sobre una célula se obtiene simultáneamente tres
parámetros, según los grados de deflexión o dispersión de la luz:
1. Forward scatter -(FSC) o Low-angle light scatter a 0º. La luz dispersada hacia
delante en ángulos cercanos a 0º es recogida por un fotodetector colocado frontalmente
respecto al láser justo al otro lado de la cámara de flujo. En el centro del detector hay
79
colocada una barra de oscurecimiento para evitar que la luz incida directamente sobre el
mismo. Su magnitud se correlaciona con el tamaño celular principalmente, aunque puede
venir influida por la estructura y composición intracelular (vesículas, concentración de
ribosomas, etc.) y puede ser empleada para la resolución de distintas poblaciones
celulares(486).
2. La cantidad de luz dispersada lateralmente - side scatter - (SSC) y recogida en
ángulos cercanos a 90 º depende de la composición físico-química de la célula en lo que hace
referencia entre otras características a la granularidad y las membranas.
3. Fluorescencia a 90º. Las fluorescencias emitidas por las propias células
(autofluorescencia) o por colorantes unidos a las mismas, al igual que el SSC son recogidas
lateralmente, lo que hace imprescindible disponer también de un sistema óptico integrado por
una combinación adecuada de espejos dicroicos (provistos de dos líneas de paso de luz),
filtros y lentes que permitan separar la luz del láser que ha sido dispersada lateralmente de la
luz emitida por cada uno de los fluorocromos presentes en la célula con el fin de que cada una
vaya al detector correspondiente(492).
Si las células sometidas a examen son unidas con dos o tres fluorocromos distintos,
podemos entonces obtener varias medidas simultáneas de una misma célula.
I. 6. 5. Aplicaciones de la citometría de flujo

Por medio de la citometría de flujo podemos determinar dos tipos de propiedades
celulares. Las llamadas intrínsecas son aquellas que podemos medir sin necesidad de añadir
reactivos exógenos, como pueden ser el tamaño o la granularidad. En cambio, las extrínsecas,
como el contenido de ADN, para poder ser medidas necesitan la adición de un reactivo.
Tanto las propiedades intrínsecas como las extrínsecas pueden ser a su vez estructurales
como el tamaño o el contenido de ADN, o funcionales como el estado redox o la actividad
enzimática. Por lo general, las propiedades intrínsecas y estructurales son las que se suelen
usar como filtro en los estudios multiparamétricos para poder determinar las propiedades
extrínsecas en la población en estudio(493).
Una de las aplicaciones más conocidas de la citometría de flujo es la diferenciación de
poblaciones celulares en una muestra heterogénea(485),(494). La heterogeneidad tumoral
continúa siendo un aspecto de interés para el clínico, puesto que entre un 20 y 30% de los
tumores colorrectales son heterogéneos(495). Parece que el cáncer es un proceso de
enfermedad dinámico con crecimiento incontrolable por diversos clones tumorales. La
biología de estos clones tumorales puede alterarse con el tiempo como resultado de
interacciones continuas huesped-tumor, interacciones entre oncogenes y genes supresores y
presión ambiental tal como tratamientos citotóxicos(496).
La detección de antígenos de superficie celular es otra de las grandes aplicaciones de
la citometría de flujo. Para su detección se usan anticuerpos monoclonales conjugados con
distintos fluorocromos que emiten una determinada fluorescencia pudiéndose usar varios
anticuerpos monoclonales conjugados con distintos fluorocromos o con partículas de oro
coloidal(497), para realizar un análisis multiparamétrico. Esta técnica ha sido ampliamente
usada para el estudio de subpoblaciones linfocitarias(493),(498).
6. 5. 1. Estudio del contenido en ADN y fases del ciclo celular por citometría de flujo
Desde el punto de vista práctico la cuantificación del ADN celular proporciona dos
tipos de información:
1. por un lado permite conocer la distribución de una población celular a lo largo de
80
las distintas fases del ciclo celular, y
2. por otra determinar la existencia o no de aneuploidias.
La cuantificación del ADN mediante citometría de flujo está en estrecha correlación
con el número de cromosomas, con una correlación de aproximadamente un 10% cuando se
calcula en base al contenido individual cromosómico. Conocer así si un tumor es aneuploide
o en qué proporción lo es, es operativamente más sencillo que obtener un cariotipo, puesto
que se pueden utilizar todas las células independientemente de su fase en el ciclo celular.
Un histograma de flujo de ADN aporta la instantánea de la distribución de los
diferentes tipos de núcleos presentes en un momento en particular.
El análisis del contenido del ADN se basa en: 1) las células en diferentes estadios del
ciclo celular tienen diferente contenido de ADN y esto es predecible, 2) los fluorocromos se
unen de forma estequiométrica, es decir, la intensidad de fluorescencia es proporcional a la
cantidad de fluorocromo que es proporcional a la cantidad de ADN de la célula y 3) las
células normales son euploides mientras que las malignas tienden a ser aneuploides.
En la Figura 1-10 A se representa el esquema de un histograma correspondiente a la
cantidad de ADN de células de la pared de colon normal utilizando yoduro de propidio. Se
observa la existencia de una disposición bimodal con un primer pico (contenido de ADN en
el eje de abscisas y número de células en el de ordenadas) que engloba a la mayoría de las
células y que corresponde a las fases de reposo G0 y G1 del ciclo celular (cantidad 2c de
ADN) y un segundo pico constituido por una pequeña proporción de células con doble
cantidad de ADN (4c) que las anteriores que correspondería a las fases G2 y mitosis (M) del
ciclo celular y algunas células con diversas cantidades de ADN que ensanchan el rango entre
estas poblaciones 2c y 4c.
Las células con cantidad de ADN intermedio entre ambos picos son las que se
encuentran en fase de síntesis (S), con una cantidad de ADN entre 2c y 4c.
La base de la primera deflexión de la curva G0/G1 es el coeficiente de variación que
nos indica la pureza de la técnica.
El rango de la cantidad de ADN se obtiene de forma relativa en la relación entre clase
del pico G0/G1 y del pico G2/M.
La existencia de una población celular con cantidad de ADN distinta a las células
normales en la misma fase del ciclo celular es lo que se conoce como aneuploidia que se
traduce en histogramas como el representado en la Figura 1-10 B, correspondiente a un caso
de cáncer de colon humano.
La proporción de células que están en las distintas fases del ciclo celular medidas por
CMF se correlaciona sensiblemente con la captación de timidina tritiada en los estudios de
autorradiografía. Los valores de la fase S medidos por citometría de flujo son
aproximadamente dos veces más altos que los valores del índice de marcado de timidina
estimados por autorradiografía(472),(499).
Hay cierta variación entre el resultado teórico y el obtenido debido a la variación
biológica en la tinción y en la lectura, por ello, se define el coeficiente de variación (CV) que
nos da una idea de la semejanza de los resultados obtenidos a la realidad y que hace necesario
el empleo de programas informáticos para discriminar correctamente el porcentaje de células
en cada una de las fases del ciclo celular.
La medición del ADN ha sido una de las primeras y más empleadas aplicaciones de la
citometría de flujo. El contenido de ADN nuclear es un útil marcador que aporta una visión
del status genotípico de la célula(500). Las células tumorales, a menudo, presentan
alteraciones en el contenido de ADN que pueden ser detectadas por CMF. El estudio del
contenido en ADN y cinética celular son útiles para el estudio de la biología celular y han
81
demostrado una relación pronóstica en determinadas neoplasias humanas(485). En general, la
combinación de un alto índice de ADN y una alta proporción de células en fase S es la de
peor pronóstico(473),(501).
El estudio del ciclo celular también puede tener implicaciones terapéuticas ya que se
ha observado que algunos agentes terapéuticos (quimioterapia y radioterapia) producen
alteraciones en este ciclo que se correlaciona con la respuesta al tratamiento(502) -(505).
6. 5. 2. Aplicaciones de la cmf en diagnóstico tumoral
Los métodos citométricos miden el contenido de ADN y, por tanto, pueden reflejar
anomalías cromosómicas siempre que se traduzcan en un cambio del contenido de ADN que
no escape al poder de resolución del citómetro. Es decir, pequeños cambios del contenido
total del ADN no serán detectados por el citómetro. Este, en cambio, ofrece la ventaja de
realizar la medición sobre un gran contenido de núcleos, de poderse realizar en células en
interfase y de ser independiente de la actividad proliferativa del tumor(506).
En estudios con citometría de flujo se ha documentado que la aneuploidia aparece con
gran frecuencia, hasta un 92%, en tumores sólidos y es un parámetro de gran sensibilidad y
especificidad. El grado de ploidia está correlacionado con el diagnóstico histopatológico,
sexo, edad y actividad proliferativa. Es un marcador que no varía en las distintas
localizaciones del tumor (metástasis) ni a lo largo del seguimiento(507).
En los casos en los que el tumor es diploide y por consiguiente, el contenido de ADN
deja de ser un buen marcador tumoral, resulta útil para discriminar las células malignas de las
benignas el análisis multiparamétrico del ADN, la inmunofluorescencia de superficie, el
ARN o el contenido proteico.
6. 5. 3. Pronóstico
Entre las aplicaciones de la citometría de flujo la más extensamente estudiada es la
correlación entre contenido de ADN y pronóstico. En los estudios pronósticos el contenido de
ADN generalmente se expresa como índice de ADN y es el cociente del contenido de ADN
de las células tumorales en fase G1 y el contenido de ADN de las células euploides en la
misma fase. Por lo tanto, un índice de ADN de 1 será sinónimo de diploide, 1,5 de triploide, 2
de tetraploide y así sucesivamente, si es menor de 1 se consideran hipoploides(508).
La relación entre ploidia y pronóstico, al igual que la curva de distribución del ADN,
es distinta para cada estirpe tumoral. Sin embargo, el índice de ADN sólo mide el contenido
de ADN "medio" de un tumor y no da información acerca de la heterogeneidad del tumor
analizado. En consecuencia, dos tumores que posean dos distribuciones de ADN
completamente distintas pueden exhibir idénticos valores de DNA(509).
6. 5. 4. Tratamiento
Ya hemos comentado que las alteraciones del ciclo celular que producen los
tratamientos oncológicos se correlacionan con la respuesta al tratamiento, al menos en el caso
de la quimioterapia y la radioterapia.
Hasta ahora la valoración de la citotoxicidad producida por un determinado agente
citostático sobre células neoplásicas se realizaba por métodos laboriosos y complicados de
llevar a la práctica como la medición de la incorporación de timidina tritiada, la formación de
colonias en agar, el test de exclusión de contraste y otros. La citometría de flujo permite
acercar los ensayos de citotoxicidad a la práctica clínica por la rapidez y fiabilidad con que se
82
puede realizar.
La toxicidad de los agentes alquilantes y nitrosoureas se puede reconocer en
citometría de flujo por medio de anticuerpos monoclonales, como el F7-26 que se une a los
segmentos desnaturalizados del ADN por el agente alquilante. Así si marcamos el anticuerpo
con un fluorocromo podremos evaluar de una forma fiable el daño celular y predecir los
efectos de la quimioterapia(510).
También se han usado las técnicas fluorocitométricas para valorar la resistencia de
líneas tumorales a los quimioterápicos(511).
Es posible que en un futuro no muy lejano por medio de la citometría de flujo se
pueda disponer del panel de citostáticos a los que es sensible un tumor determinado en un
paciente concreto y así dirigir la terapia de una forma más selectiva.
Otra utilidad terapéutica es el uso de anticuerpos monoclonales citogenéticamente
orientados(498).
I. 6. 6. Ventajas e inconvenientes de la CMF
Las ventajas de la citometría de flujo son:

- Permite medir de forma objetiva y automatizada parámetros celulares(485).
Los resultados obtenidos son reproducibles de un centro a otro, incluso cuando son
interpretados por investigadores distintos, siempre que se utilicen procesos de
standarización(512).
- Rapidez de ejecución, pueden medirse hasta 20.000 células/seg.
- Sensibilidad(475).
- A diferencia del cariotipado mitótico el análisis ploide por CMF de ADN es independiente
de la actividad proliferativa celular.
- Respecto a las técnicas estáticas muestra menor coeficiente de variación para poblaciones
homogéneas(471).
Inconvenientes:
- Necesidad de una suspensión celular monodispersa (lo que aparte de requerir una
preparación, en el caso de tumores sólidos hace perder la arquitectura celular).
- Contaminación con poblaciones celulares no malignas, no permite establecer una
diferenciación clara entre las células euploides tumorales, linfocitos, células infectadas y
epitelio normal.
- No se preserva la arquitectura del tejido.
- Posibilidad de error por pobre discriminación de dobletes (dos núcleos adherentes y
registrados como un solo núcleo en CMF) de las células en fase G2M del ciclo celular.
- Alto costo de estos equipos(513),(514).
I. 6. 7. Valor clínico y pronóstico de la CMF en el cáncer colorrectal humano
Para mejorar la supervivencia de los enfermos con cáncer colorrectal es necesario

encontrar factores adicionales independientes para predecir la evolución en pacientes que
tienen una resección quirúrgica potencialmente curativa(515). El conocimiento de que las
células cancerosas se caracterizan por núcleos grandes y unas líneas originales de ADN o
ploidia anormales, ha hecho que se investigara si las técnicas que permiten identificar estas
variaciones pueden mejorar las deficiencias que tienen las actuales clasificaciones
patológicas. En este sentido, ha habido un considerable interés en el contenido relativo de
83
ADN (ploidia) de los tumores, valorado principalmente por citometría de flujo. Sin embargo,
el valor pronóstico de la diploidia de ADN valorada con esta técnica es incierto.
Wolley et al.(516) realizaron el primer estudio prospectivo del valor pronóstico de la
determinación del ADN por citometría de flujo en carcinoma colorrectal. Estos autores
demostraron que los tumores aneuploides muestran una rápida evolución clínica que consiste
en enfermedad diseminada y muerte.
Desde entonces, diversos investigadores han estudiado la CMF del cáncer de colon,
sin embargo, no existen en la literatura patrones uniformes que definan los modelos de
histogramas correspondientes a tumores colorrectales. Emblad(517) admite tres tipos de
histogramas: 1) aneuploide, 2) diploide y, 3) casi diploide; tomando como modelos las curvas
de ploidia obtenidas con CMF. Estudios recientes relatan la importancia de las poblaciones
aneuploides de ADN casi diploide con índice de ADN entre 0,8-1,2; puesto que pueden
conferir diferente significado pronóstico y conducta biológica que otras categorías de ploidia
de DNA. Aunque, picos artefactuales aneuploides de ADN casi diploides pueden ser
producidos por diferencias en la capacidad de tinción de ADN en subpoblaciones de células
diploides de ADN(518).
Albe et al.(519) describen también tres tipos: 1) diploide, 2) diploide con S alta y, 3)
aneuploide, siguiendo los criterios de la Conference on Analytical Cytology and Cytometry IX
y del VI International Simposium on Flow Cytometry, también basados en citometría de flujo.
Con excepciones(472) los estudios realizados tanto en muestras frescas como en las
incluidas en parafina indican una tendencia de los tumores con un contenido de ADN casi
normal (diploide) a tener un mejor pronóstico que los que tienen una composición de ADN
anormal (aneuploide)(520) -(524). Sin embargo, la significación atribuida a la ploidia como
variable pronóstica independiente en el cáncer colorrectal varía considerablemente. No hay
artículos que demuestren la aneuploidia de ADN como aspecto favorable, pero varias
publicaciones han concluido que la ploidia de ADN no aporta información pronóstica
significativa adicional, particularmente cuando son considerados tras análisis multivariante
que incluye los factores pronósticos tradicionales(525) -(527). Bauer et al.(528), mediante un
análisis de regresión de Cox, demuestra que la existencia de ganglios positivos o metástasis
son factores pronósticos mucho más potentes que cualquier parámetro de actividad del ADN.
Los estudios de Stipa y cols.(529) consideran que la aneuploidia de ADN no es una variable
pronóstica independiente capaz de predecir la supervivencia a largo tiempo en pacientes
sometidos a resección radical. La mayoría de los estudios sugieren una tendencia hacia una
frecuencia creciente de aneuploidia de ADN en los estadios de Dukes altos (estadio
D)(530),(531) y para tumores localizados en el colon izquierdo y recto(518),(530) ,(532)
,(533) , sin embargo otros investigadores no encuentran diferencias significativas en
frecuencia de aneuploidia o índice de ADN, entre los estadios de Dukes (B, C y D) ni para
distintos grados de diferenciación(472),(534). Para Jones et al.(535), los tumores con ADN
aneuploide tienen peor pronóstico que los tumores diploides únicamente en los estadios
Dukes B.
En general la frecuencia de tumor aneuploide no se relaciona con las variables
clínicas como sexo y edad, aunque el hallazgo de aneuploidia se asocia a peor pronóstico en
pacientes jóvenes (< 40 años)(536) y, Kouri(533) encuentra mayor número de aneuploidias
en los hombres, debido a que éstos presentan mayor número de tumores de colon izquierdo.
El porcentaje de carcinomas colorrectales diploides es superior en pacientes con
historia de neoplasia no-colorrectal(533).
La presencia de tumores colorrectales aneuploides varía según el tipo y preparación
de las muestras y oscila entre un 20 y un 80%. Una revisión bibliográfica puede verse en la
84
tabla siguiente. La frecuencia de aneuploidia múltiple de ADN en cáncer colorrectal va de 7 a
40%(518).
INVESTIGADOR Muestra Disgregación Colorante Nº pac. % Aneuploidia
Barlogie et al. (1980)507 Fresca Pepsina BE 11 82
Wolley et al. (1982)516 Fresca Mecánica 33 39

544
Hiddemann et al. (1986) Fresca Mecánica BE 88 82
534
Frankfurt et al. (1986) Fresca Tritón DAPI 91 68
542
Kokal et al. (1986) Parafinada Pepsina IP 77 65
495
Emdin et al. (1987) Parafinada Tripsina IP 37 62
478
Daver et al. (1987) Fresca Mecánica IP 60 73
478
Scott et al. (1987) Parafinada Pepsina IP 264 48
525
Wiggers et al. (1988) Parafinada Tripsina IP 350 54
539
Heimann et al. (1990) Parafinada Pepsina IP 39 48
537
Armitage et al. (1991) Parafinada Colagenasa + elastasa IP 333 57
540
García et al. (1991) Fresca Mecánica IP 74 62
Fresca Mecánica DAPI 62 79

541
Giaretti et al. (1991) Parafinada Pepsina IP 53 41
543
Witzig et al. (1991) Parafinada Pepsina IP 694 62
Pepsina 6 33
488
Tagawa et al.(1992) Parafinada Tripsina 6 66
545
Bianchi et al.(1992) Parafinada Pepsina IP 18 61
Mecánica 25 42
477
Ensley et al. (1993) Fresca Enzimática IP 25 20
546
Bianchi et al. (1993) Parafinada Pepsina IP
536
Kearney et al. (1993) Parafinada Tripsina IP 116 61
BE: Bromuro de etidio. IP: yoduro de propidio. DAPI: 4,6-diamino-2-fenilindol.
Tabla 1-6
Procedimiento de procesado de las muestras de cáncer de
colon, pacientes y % de aneuploidia según distintos autores.
Armitage et al.(537) demostraron que los niveles de ploidia representan un factor

pronóstico independiente no directamente relacionado con el estadio de Dukes. Wersto et
al.(509) confirma estos resultados y además encuentra que los resultados obtenidos por
citometría de flujo son independientes del tipo histológico. Otros autores encuentran
resultados similares(538) -(541) y confirman que pacientes con cáncer colorrectal en estadio
B que tienen tumores que son ADN diploides y/o con bajo índice de proliferación (IP)
muestran un pronóstico comparativamente favorable respecto a pacientes con aneuploidia de
ADN y alto IP 5(544),(539). Los primeros tienen una tasa de supervivencia semejante a
controles normales emparejados por edad; estos pacientes pueden no ser candidatos a terapia
85
coadyuvante.
Otros autores no observan relación entre alta fase S y pronóstico desfavorable(532).
Se ha observado asociación entre el grado de atipia celular y el aumento en la
proporción de aneuploidia en carcinomas colorrectales(547).
Aunque la ploidia de ADN e IP pueden ser pronósticos en pacientes con estadio C, no
ayuda a la hora de decisiones clínicas ya que todos estos pacientes se tratan normalmente de
rutina con terapia adyuvante. Sin embargo, esta información puede ser útil para aconsejar los
pacientes y establecer su pronóstico(518).
Scott et al. (538) relatan una frecuencia significativa superior de aneuploidia en el
colon izquierdo (descendente y sigma) respecto al colon ascendente.
Wersto y colaboradores(509), ponen de manifiesto la gran heterogeneidad
intratumoral de las neoplasias de colon, analizando separadamente 3 muestras de un mismo
tumor sólo encuentran concordancia en la medida del ADN en un 63% de los casos. Estudios
similares de otros autores confirman estos resultados, mostrando subpoblaciones tumorales,
con aneuploidia múltiple(543). La frecuencia de aneuploidia múltiple de ADN en cáncer de
colon va de 7 a 41%(515).
Los tumores aneuploides muestran valores de% de fase S superiores a los
diploides(530). La existencia de una elevada proporción de células en fase S se acompaña en
pacientes con cáncer colorrectal de un mayor grado invasivo (grados avanzados de Dukes), y
mientras para unos autores se asocia con la localización en el recto(540), para otros los
valores altos de fase S se observan en los tumores de localización derecha(530). En el cáncer
de recto hay dos grupos que han referido un mejor pronóstico en tumores diploides con una
baja fase S en comparación a los que presentan una fase S alta(548),(549). En el estudio de
Quirke y cols. (549) la proliferación celular parece aportar una información pronóstica
adicional a la de la ploidia.
Los tumores aneuploides muestran en general altas concentraciones plasmáticas de
CEA(550).
Otra de las utilidades de la citometría de flujo es la identificación de lesiones
premalignas asociadas a ADN anormal, como la colitis ulcerosa o enfermedad polipósica.
Los estudios encaminados a determinar el grado de aneuploidia de ADN y proliferación en
adenomas colorrectales y carcinomas parecen sostener el concepto de que existe una
evolución de la ploidia de ADN a lo largo de la secuencia adenoma-carcinoma(518).
Numerosos estudios han descrito la aneuploidia de ADN en tejidos displásicos de
colitis ulcerosa, incluso en biopsias normales e inflamatorias(551),(552). En la colitis
ulcerosa la aneuploidia es más frecuente en pacientes con displasia o cáncer que en los que no
se observa neoplasia(553).
La CMF puede ayudar a identificar los pacientes con colitis ulcerosa que tienen
mayor necesidad de vigilancia endoscópica, sobre todo en pacientes con displasia con
"cambios indefinidos". Además, dada la subjetividad de los distintos patólogos en la
interpretación de las displasias. La citometría de flujo se confirma como un marcador
objetivo en estos casos(554). Se ha observado que la frecuencia de la aneuploidia aumenta
con la duración de la enfermedad(508). Sin embargo, el significado de aneuploidia de ADN
en ausencia de displasia es desconocido(555). El hallazgo de aneuploidia en una biopsia
colorrectal no tiene valor predictivo en decidir si un paciente tiene o no un carcinoma
concurrente en algún lugar del intestino, sin embargo, podría ser un indicador de futuros
cambios neoplásicos(556). La aneuploidia puede ser usada como marcador del riesgo de
cáncer en pacientes con colitis ulcerosa crónica(553).
La incidencia de ADN aneuploide en enfermedades inflamatorias crónicas es del
86
31%(556).
Sciallero y cols.(557) realizan un estudio de la ploidia de adenomas colorrectales en
pacientes con historia familiar de cáncer colorrectal y describen que ambas informaciones
combinadas tienen gran valor en la identificación de pacientes con alto riesgo de desarrollar
enfermedad maligna.
La incidencia de adenomas aneuploides es muy variables según las series, oscila entre
un 6 a un 27%(558),(559).
La CMF también ha sido usado para determinar el origen común de adenocarcinomas
sincrónicos colorrectales(560).
87
II. Hipótesis del estudio
II. 1. Justificación del proyecto de investigación
El cáncer colorrectal es la tercera neoplasia en orden de frecuencia en la población

mundial y supone casi el 15 % de todos los nuevos cánceres 1. A pesar de los avances en
diagnóstico precoz, en los recientes conocimientos genéticos del cáncer colorrectal
hereditario(56),(61) ,(62) , en los nuevos procesos de screening para individuos de alto riesgo
y aproximaciones quirúrgicas, el pronóstico del cáncer colorrectal casi no ha variado durante
los últimos 50 años y sólo ha mostrado una ligera e insatisfactoria mejoría. Este entorno
desfavorable explica parcialmente la continua búsqueda e intento de identificación de
indicadores pronósticos del curso clínico del cáncer colorrectal. Tales indicadores pronósticos
pueden corresponder por ejemplo a la inmunohistoquímica de las lectinas y al contenido de
ADN y fases del ciclo celular.
La carcinogénesis experimental usando dimetilhidracina (DMH) es un modelo bien
establecido que muestra fuertes paralelismos con la carcinogénesis colónica humana(206).
Los modelos animales aportan pues, medios adicionales para investigar algunas de las
características biológicas de estos tumores.
Diversas evidencias experimentales sugieren que la carcinogénesis incluye una serie
de cambios secuenciales celulares con diferentes propiedades biológicas, bioquímicas y
morfológicas respecto a las células normales.
Estudios bioquímicos(328) e histoquímicos(587), han demostrado que la
transformación neoplásica de la mucosa colónica tratada con DMH está asociada con
importantes cambios en la composición de los glicoconjugados y actividad de las
glicosiltransferasas. Sin embargo, los métodos histoquímicos clásicos no permiten
discriminar los diferentes carbohidratos que componen los glicoconjugados ni los cambios
asociados a la transformación neoplásica.
Si bien la histoquímica de lectinas ha sido aplicada para conocer los cambios en el
metabolismo de los glicoconjugados en la mucosa colónica tumoral tanto humana como
inducida por DMH(463),(468) , son pocos los trabajos que aplican esta técnica en las fases
preneoplásicas de la carcinogénesis y su estudio en lesiones premalignas asociadas al
desarrollo tumoral(569), tal como ha sido vista en pacientes con colitis ulcerosa(551),(552).
Así como las posibles alteraciones secuenciales en la mucosa no tumoral de ratas tratadas con
el carcinógeno, ya puesta de manifiesto con técnicas histoquímicas convencionales(587).
La histoquímica de las lectinas conjugadas con oro coloidal aplicadas en microscopía
electrónica de scanning (MES) permite conocer la distribución de los glicoconjugados de la
superficie mucosa normal y sus cambios en la transformación neoplásica y etapas previas.
Las técnicas de citometría de flujo para determinar la existencia o no de aneuploidias
y la distribución de una población celular a lo largo de las distintas fases del ciclo celular ha
sido usada en patología colorrectal humana para encontrar factores adicionales
independientes para predecir la evolución de estos pacientes. Conocer el comportamiento
citométrico (contenido de ADN y proliferación celular) de los tumores colónicos inducidos
con DMH puede ayudarnos a conocer el patrón biológico de estos tumores experimentales y
valorar su semejanza con los humanos y determinar la existencia de un cambio difuso de la
mucosa expuesta al carcinógeno tal como ha sido observada por otras técnicas.
Los estudios realizados hasta el momento(576), mediante la técnica de citometría de
flujo en ratas no toman en consideración las diferencias regionales en la cinética celular de la
mucosa colónica normal y tumoral. Tampoco hemos encontrado en la literatura un estudio
88
por citometría de flujo de la cinética celular en etapas preneoplásicas de la carcinogénesis
experimental inducida con DMH.
Por todo ello, se plantean las siguientes hipótesis experimentales:
II. 2. Hipótesis del estudio
Las hipótesis que se plantean en el estudio son las que se describen a continuación:
1. Hipótesis primera:
La mucosa colónica macroscópicamente normal exhibe cambios secuenciales en la
expresión de glicoconjugados en las etapas preneoplásicas, precursoras de la aparición
tumoral.
2. Hipótesis segunda:
Los focos de criptas aberrantes y las lesiones asociadas a placa linfoide expresan un
patrón alterado del enlace de lectinas.
3. Hipótesis tercera:
El estudio por citometría de flujo de las fases del ciclo celular de muestras de ratas
tumorales inyectadas con DMH tiene relación con las variables clínicas y
anatomopatológicas.
4. Hipótesis cuarta:
El estudio por citometría de flujo de las fases del ciclo celular en etapas
preneoplásicas de muestras de intestino grueso de aspecto macroscópicamente normal
tratadas con DMH demuestran alteraciones sujestivas de malignidad.
II. 3. Objetivos del estudio
Para corroborar las hipótesis previamente planteadas se ha pretendido:
3. 1. Estudiar las características macro y microscópicas (MO y MES) del intestino grueso
normal y tumoral de rata tratada con distintas dosis y pautas de DMH:
a) dosis de 21 mg/kg/semana durante 20 semanas

b) dosis de 10 mg/kg/semana durante 20 semanas
c) dosis de 21 mg/kg/semana durante las etapas de inducción neoplásica
y, comparar los hallazgos con sendos grupos control:
a) ratas sin tratamiento
b) ratas inyectadas con EDTA
3. 2. Estudiar la localización celular y la distribución de los glicoconjugados en la mucosa del

intestino grueso de ratas Sprague-Dawley de ambos grupos control, mediante lectinas.
Describiendo las posibles diferencias existentes entre los distintos segmentos colónicos y a lo
largo de las criptas.
3. 3. Detectar los cambios en la expresión de los glicoconjugados en la mucosa normal,

tumoral, y mucosa adyacente al tumor de ratas tratadas con DMH con las tres pautas de
89
tratamiento descritas previamente. Así como en los focos de predisplasia y en las lesiones
displásicas asociadas a placa linfoide.
3. 4. Intentar establecer la existencia de alguna posible correlación entre las modificaciones

de los glicoconjugados de los tumores inducidos con DMH en la rata y los parámetros
clínicos: sexo, localización, aspecto macroscópico y tamaño tumoral; y parámetros
anatomopatológicos: tipo histológico, grado de diferenciación, grado de invasión, asociación
a otros tumores intestinales y potencial metastásico.
3. 5. Estudiar la expresión y los cambios que experimentan los glicoconjugados de la mucosa

colónica de la rata en las etapas de inducción de los tumores de intestino grueso por DMH,
mediante microscopía convencional y microscopía electrónica de scanning.
3. 6. Cuantificar por citometría de flujo el contenido de ADN de los tumores colónicos de rata
inducidos por DMH, y comprobar si existe relación con las variable clínicas e histológicas
descritas previamente.
3. 7. Cuantificar por citometría de flujo, el porcentaje de células en proliferación de los
tumores de colon inducidos con DMH, mucosa macroscópicamente normal inyectada con el
carcinógeno durante cortos y largos periodos de induccción, y mucosa control.
90
III. Material y método
III. 1. Animales
III. 1. 1. Animales, estabulación y dieta
Para el estudio se han utilizado 152 ratas Sprague-Dawley, de la misma línea genética
criadas en nuestro Estabulario de la Facultat de Medicina de Lleida, no consanguíneas, de 10
semanas de vida, 76 de ellas eran machos y 76 hembras.
Los animales fueron alimentados con dieta standard de laboratorio (fórmula rata-
ratón, cría ITC-R10 y mantenimiento ITM-R20, LETICA ®, en la tabla siguiente se detalla
sus composiciones) y agua ad libitum.
CRIA ITC-R10 MANTENIMIENTO ITM-R20
Componentes Cereales Cereales
Subproductos de molinería Subproductos de molinería
Proteínas animales y vegetales Proteínas animales y vegetales
Corrector vitamínico/mineral Corrector vitamínico/mineral
Análisis químico Humedad máxima 7,00% 7,00%
Proteína bruta 19,50% 17,00%
Lisina, min. 0,92% 0,70%
Metionina, min. 0,60% 0,50%
Grasa bruta, min. 3,50% 3,00%
Fibra bruta, max. 4,50% 5,00%
Cenizas, max. 5,00% 5,00%
Calcio, min. 0,85% 0,80%
Fósforo, min 0,70% 0,65%
Cloruros, max 0,50% 0,60%
M.E.L.N. 60,50% 63,0%
Vitaminas (por Kg) Vitamina A 18000 U.I. 9000 U.I.
Vitamina D3 2000 U.I. 1000 U.I.
Vitamina E 100 mg. 50 mg.
Vitamina K3 2,4 mg. 1,2 mg.
Vitamina B1 15 mg. 7,5 mg.
Vitamina B2 12 mg. 6 mg.
Vitamina PP 60 mg. 30 mg.
Ac. pantoténico 30 mg. 15 mg

91
Colina 1500 mg. 750 mg
Ofigoelementos (por
Kg) Manganeso 80 mg. 40 mg.
Cinc 60 mg. 30 mg.
Hierro 50 mg. 25 mg.
Cobre 20 mg. 10 mg.
Iodo 1,52 mg. 0,76 mg.
Cobalto 0,88 mg. 0,44 mg.
Análisis bacteriológico Hongos 10 cél/g. 10 cél/g.
Levaduras 10 cél/g. 10 cél/g.
Tabla 3-1
Fórmula y composición de las dietas standard usadas en este
estudio.
Los animales fueron divididos en diversos grupos para llevar a cabo el estudio y
estabulados en jaulas debidamente etiquetadas.
III. 1. 2. Grupos de estudio
Los animales se distribuyeron para su estudio en 5 grupos:
Grupo A:
5 ratas machos y 5 hembras, no recibieron ningún tratamiento y fueron utilizadas
como grupo control y sacrificadas en los mismos periodos de tiempo que el grupo B.
Grupo B:
21 ratas machos y 21 hembras, inyectadas semanalmente con DMH a dosis de 21
mg/kg de peso, durante 20 semanas; y sacrificadas a partir de las 4 semanas de la última
inyección del carcinógeno hasta la semana 34.
Grupo C:
30 ratas machos y 30 hembras inyectadas con DMH como el grupo A y sacrificadas
en las etapas preneoplásicas, de forma que se sacrificaron los animales de 4 en 4, dos machos
y dos hembras, a las 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 y 30 semanas de
inyección del carcinógeno.
Grupo D:
10 ratas machos y 10 hembras inyectadas con DMH a dosis de 10 mg/kg de peso
durante 20 semanas y sacrificadas como el grupo B.
Grupo E:
10 ratas machos y 10 hembras inyectas con EDTA, estabilizante de la solución de
DMH, y a la misma dosis de 37 mg en 100 ml. de agua, es decir a una dosis de 1,94 mg/Kg
de peso y semana. Estos animales fueron considerados un segundo grupo control.
III. 1. 3. Inducción de tumores con 1,-2-Dimetilhidracina
Las ratas fueron inyectadas semanalmente con 1,2-sym-Dimetilhidracina (DMH)

92
(SIGMA®), subcutáneamente (s.c.) en la zona lumbar izquierda.
Se emplearon dos dosis distintas para la inducción tumoral. Como queda reflejado en
el apartado 1. 2. Los animales del grupo B recibieron una dosis de DMH de 21 mg/kg de
peso. La solución utilizada estaba compuesta de 400 mg. de DMH en 100 ml. de agua
destilada que contenía 37 mg. de EDTA, como estabilizador y tamponada a pH 6,5 con
hidróxido sódico(199).
El grupo D recibió una dosis de DMH de 10 mg/kg de peso. En este caso la solución
stock contenía 200 mg del compuesto y se disolvía en agua destilada conteniendo 20 mg de
EDTA y ajustada al mismo pH.
El compuesto se preparaba semanalmente previa a la inyección y se manipulaba en
campana extractora y con protección de guantes y mascarilla para evitar el contacto con la
piel y mucosas así como su posible inhalación.
Semanalmente se elegían al azar 4 ratas de cada uno de los grupos tratados y de los
distintos sexos y se pesaban de una en una con una báscula de laboratorio en una jaula vacía
que previamente se había tarado, para obtener el peso medio de las mismas y poder calcular
la dosis, que era conjunta para todo el grupo.
III. 1. 4. Sacrificio
Los animales se sacrificaron mediante inyección intraperitoneal de una dosis letal de

Hidrato de Cloral al 4.5%, a razón 20 ml/kg de peso(561).
Cada uno de los animales fue pesado en una balanza de laboratorio una vez
sacrificado.
Los animales se inspeccionaron externamente en busca de tumoraciones cutáneas y se
sujetaron con las extremidades en extensión sobre una tabla para facilitar su necropsia.
Se practicó incisión tóraco abdominal media y se exploró cada una de las ratas en
busca de tumores primitivos y metastásicos, a nivel de pulmones, pleura, diafragma, corazón
y pericardio, hígado, bazo, mesenterio, peritoneo, retroperitoneo, genitales, esófago,
estómago e intestino delgado.
También se exploraron los oídos de las ratas con un microscopio de microcirugía
OPMI (ZEISS®) en busca de posibles tumores.
Se disecó el intestino grueso y se extrajo. Posteriormente se procedió a su apertura
longitudinal por el borde antimesentérico y limpieza suave de la superficie mucosa con agua
para eliminar los restos de heces.
Se midieron las diferentes porciones del colon que según la estructura macroscópica
de los pliegues colónicos se dividieron en ciego, colon ascendente, colon transverso y colon
descendente-recto.
Se observó la presencia de lesiones tumorales, que también se midieron y se anotaron
sus características macroscópicas.
Todos los hallazgos anteriormente descritos se anotaron en protocolos de recogida de
datos para cada una de las ratas.
III. 1. 5. Recogida de muestras
1. 5. 1. Recogida de muestras para microscopía óptica
Para MO se obtuvieron fragmentos con ayuda de un bisturí de ciego, colon

ascendente, colon transverso y colon descendente de todas las ratas control (grupos A y E). El
93
tamaño de las muestras era de aproximadamente 1 cm2
de superficie para el ciego y en el resto de colon se tomó la anchura total del intestino y
aproximadamente también 1 cm de longitud.
Se recogieron las muestras de ratas tratadas con DMH (grupos B, C y D) de las
distintas zonas del colon de aspecto macroscópicamente sano situado a distancia de las
lesiones neoplásicas, como en los grupos control así como de los tumores, de manera que en
la misma pieza se incluyera la mucosa transicional.
Las lesiones neoplásicas se dividieron por la mitad, uno de los fragmentos se usó para
estudio histológico y el otro para estudio ultraestructural.
Las muestras se colocaron sobre un fragmento de papel de filtro, con la mucosa
expuesta, a fin de evitar al máximo la retracción durante la fijación posterior.
1. 5. 2. Recogida de muestras para microscopía electrónica de scanning (MES)
Se recogieron muestras de las mismas zonas citadas en el apartado anterior para

microscopía electrónica, procurando obtener fragmentos de 0,5 cm2 de superficie. En total se
tomaron 8 muestras de cada uno de los segmentos de colon.
Cuando las lesiones neoplásicas alcanzaban un tamaño superior a 0,2 cm2, la mitad
del tumor destinado a microscopía electrónica se dividía junto a su mucosa transicional y
normal para obtener más muestras para estudio histoquímico.
Las piezas obtenidas se colocaban sobre papel de filtro para evitar la retracción y
sobre todo para facilitar su orientación para MES.
III. 2. Procesamiento de las muestras
III. 2. 1. Fijación
2. 1. 1. Fijación para microscopía óptica
Para las muestras de microscopía óptica, los fragmentos de intestino grueso se fijaron
por inmersión en una solución de formalina al 4%.
El tiempo de fijación fue de unas 24 horas a temperatura ambiente.
Posteriormente se iniciaron los pasos correspondientes para su inclusión en parafina.
2. 1. 2. Fijación para microscopía electrónica
La fijación del material para estudios ultraestructurales e histoquímicos se realizó

exclusivamente con una solución de paraformaldehido al 4% y glutaraldehido al 1% (0,1 M)
en tampón fosfato monosódico/bisódico 0,2 M a pH 7,4 durante 24 horas en nevera a 4ºC.
Una vez fijado el material se realizaron lavados con el mismo tampón usado para el
fijador y posteriormente se realizó un tratamiento de la muestra con cloruro amónico 50 mM
en tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,4, en tabletas SIGMA®) durante 1 hora para bloquear
los grupos aldehídicos producidos por el glutaraldehido durante al fijación, y finalmente se
realizaron diversos lavados con tampón fosfato para eliminar los restos de cloruro
amónico(562) -(563).
III. 2. 2. Protocolo de inclusión de las muestras en parafina
94
Las muestras destinadas a microscopía óptica se han incluido en parafina.
La inclusión en parafina se ha iniciado con la deshidratación de las piezas en
alcoholes de gradación creciente (50, 70, 80, 90%) y finalmente se han hecho 3 cambios en
alcohol absoluto.
Una vez bien deshidratadas las muestras, se aclaran mediante pasos sucesivos en xilol
para extraer el agente deshidratante.
Finalmente se hacen los bloques siguiendo el procedimiento habitual, procurando que
los fragmentos queden bien orientados en los moldes.
Se realizan secciones con el microtomo de 5 µm de espesor.
III. 2. 3. Procesado de muestras para microscopía electrónica convencional
2. 3. 1. Protocolo de deshidratación para MES
La deshidratación se realizó por inmersión del material en una serie de

concentraciones crecientes de etanol al 50, 60, 70 y 90%, durante intervalos de 10 minutos a
temperatura ambiente, seguido de 3 cambios también de 10 minutos en alcohol al 96% y 3
cambios más en alcohol absoluto de 15 minutos. Seguidamente las muestras se sumergieron
en una mezcla de etanol/acetato de amilo. Gradualmente, durante 30 minutos a temperatura
ambiente se aumenta la concentración de éste último pasándose a una proporción de 3:1, de
1:1 y luego de 1:3. A continuación se introdujeron en acetato de amilo puro, donde pueden
permanecer varios días, posibilitando el traslado de las muestras.
Por último, las muestras se desecaron mediante la técnica del punto crítico en un
aparato POLARON® modelo E 2000, utilizando dióxido de carbono, que solubiliza en el
acetato de amilo con el que están impregnadas.
2. 3. 2. Montaje y recubrimiento
Una vez procesadas las muestras se fijaron en stubs de aluminio mediante una gota de
plata coloidal (Electrodog 1415, ACHESON®) de forma convencional, teniendo cuidado de
mantener expuesta a la observación la superficie luminal. A continuación se procede al
recubrimiento de las muestras. Para el estudio con MES convencional las muestras se
recubren con una fina capa de oro, de unos 30 nm, en un diodo de "sputtering" POLARON®
E 5000(564),(565).
III. 3. Métodos convencionales de tinción
III. 3. 1. Tinción con hematoxilina-eosina
La tinción de hematoxilina-eosina se ha utilizado como tinción de rutina para observar

el aspecto morfológico de las secciones de parafina y el estado del tejido a estudiar.
Preparación de los colorantes:

- Hematoxilina de Harris
Cristales de Hematoxilina........... 5,0 g.
Alcohol 100%............................. 50,0 ml.
95
Alumbre potásico........................ 100,0 g.
Agua destilada............................ 1000,0 ml.
Óxido de mercurio...................... 2,5 g.
Se disuelve la hematoxilina en el alcohol, el alumbre en el agua y se mezcla con la

ayuda del calor. Se retira menos de 1 minuto y se agita. A continuación se añade lentamente
el óxido de mercurio. Se recalienta lentamente hasta que la solución adquiere un color
púrpura oscuro, retirándola rápidamente del calor y sumergiéndola en un recipiente con agua
fría. La tinción estará lista para su uso tan pronto como se enfríe. Se añaden 2-4 ml. de ácido
acético glacial por cada 100 ml de solución a fin de mejorar la tinción de los núcleos
celulares. Se filtra la hematoxilina antes de ser usada.
- Eosina alcohólica
Se prepara la solución stock
Eosina Y, soluble en agua.................... 1,0 g.
Agua destilada...................................... 20 ml.
Se disuelve y añade:
Alcohol 95%......................................... 80 ml.
La solución de trabajo se prepara como sigue:

Solución stock de eosina...................... 1 parte
Alcohol 80%......................................... 3 partes
Justo antes de su uso se añaden 0,5 ml de ácido acético glacial por cada 100 ml.
Protocolo de tinción
Los portas se colocaron en cestillas de tinción y se desparafinaron sumergiéndolos en

xilol durante 15 minutos, repitiendo este paso 2 veces más. Posteriormente las muestras se
rehidratan con concentraciones decrecientes de alcohol hasta llegar a agua destilada,
procediéndose seguidamente a la tinción:
Hematoxilina Harris............................... 15 minutos
Lavado en agua corriente....................... 5 minutos
Aclarado con HCl (4 ml en 250 ml de alcohol 96%)
Lavado en agua corriente....................... 10 minutos
Eosina alcohólica................................... 5 minutos

Se deshidrató con concentraciones crecientes de alcohol y xilol y se montaron con
DPX.
III. 3. 2. Tinción PAS-AB
La tinción combinada con azul alcian (pH 2,5)/ácido periódico-reactivo de Schiff

96
(PAS-AB) se realizó para la caracterización de las diferentes mucosustancias. El PAS marca
los carbohidratos que contienen 1, 2 grupos glicol: glucógeno, glucolípidos, mucosustancias
neutras y algunas mucosustancias no sulfatadas. El PAS-AB marca mucosustancias neutras y
ácido reactivas periodadas. El AB marca mucosustancias ácidas(566).
Preparación de los colorantes
-Azul alcian. Se disuelven:

Azul alcian.............................................. 1 g.
Agua destilada......................................... 97 ml.
Acido acético glacial............................... 3 ml.
-Ácido periódico. Se disuelven:

Acido periódico....................................... 1 g.
-Metabisulfito sódico
Se prepara la solución stock, disolviendo:
Metabisulfito sódico............................... 10 g.
Agua destilada........................................ 100 ml.
La solución de trabajo se prepara con una mezcla de:

Solución stock......................................... 30 ml.
-Solución de Schiff
Fuschina básica....................................... 4 g.
Metabisulfito sódico................................ 7,6 g.
ClH 0,25 N.............................................. 400 ml.
Se agita la solución a intervalos durante 2 horas, hasta que queda clara y amarillenta o
ligeramente pardusca clara. Se añaden 0,5 g.-1 g. de carbón activado, agitando 1-2 minutos.
Se filtra en una probeta, lavando el residuo del filtro con agua destilada hasta recuperar el
volumen de 400 ml.
La solución debe guardarse a 4º C.
Protocolo de tinción
Se desparafinó hasta agua destilada al igual que en el protocolo para hematoxilina-

eosina.
Azul alcian....................................................... 5 minutos
Lavado con agua destilada
97
Oxidación con ácido periódico........................ 15 minutos
Lavado en agua destilada
Solución de Schiff........................................... 25 minutos
3 baños sucesivos de metabisulfito sódico...... 6 minutos
(de 2 en 2
minutos)lavando
entre ellos
Lavado en agua corriente................................. 5 minutos
Hematoxilina Harris........................................ 2 minutos
Posteriormente se deshidrataba y montaba con DPX.
III. 4. Lectinas
III. 4. 1. Lectinas y azúcares inhibidores usados
Todas las lectinas utilizadas en este estudio tienen como marcador para su
visualización el oro coloidal de 30 nm de diámetro(413). Este sistema presenta la ventaja de
poder ser visualizado tanto a nivel de microscopía óptica como electrónica. Además, la
tinción obtenida es permanente y no necesita de microscopio especial para su observación.
III. 4. 2. Método de conjugación de las lectinas
4. 2. 1. Preparación de las partículas de oro coloidal
En el presente estudio, el oro coloidal ha sido preparado a partir de ácido

tetracloroáurico, usando como agente reductor el citrato trisódico, según el método de
Frens(421).
Preparación de las soluciones
Para obtener 250 ml de oro coloidal, es necesario preparar 2 soluciones:

A. Solución de cloruro de oro:
El ácido tetracloroáurico es una sustancia cristalina altamente hidrófila, por este
motivo se preparó una solución madre acuosa al 1% con la totalidad de la ampolla sellada.
Esta solución puede ser almacenada durante varios meses a temperatura ambiente en un vial
bien cerrado.
Todas las soluciones deben ser preparadas con agua bidestilada y filtrada, (filtro
MILLIPORE®, tamaño de poro 0,45 Wm, ya que la presencia de sustancias orgánicas,
partículas de polvo, etc., interfieren la formación del coloide y pueden causar variación en el
tamaño de las partículas o turbiedad del coloide. Por la misma razón, el material usado en la
preparación debe ser limpiado escrupulosamente, sumergido en agua bidestilada y
siliconizado (Sigmacote, SIGMA®).
B. Mezcla reductora.
98
El citrato trisódico se prepara como solución acuosa al 1% y es estable para
almacenar.
Formación de oro coloidal. Método
El tamaño de las partículas de oro coloidal considerado óptimo para el microscopio de

scanning del que se dispone fue de 30 nm. Para conseguir este diámetro de las partículas se
tomaron 246,25 ml de la solución de cloruro de oro diluida al 0,01% (solución A) y 3,75 ml
de citrato trisódico (solución B) para un volumen total de 250 ml.
Ambas soluciones se calientan hasta 60ºC, entonces se añade B rápidamente sobre A,
agitando. Una vez formado el coloide, evidente por su color rojo burdeos característico, se
calienta la solución hasta hervir durante 5 minutos. Cuando la solución presenta este color, se
deja enfriar a temperatura ambiente.
4. 2. 2. Conjugación lectina-oro. Incubación con el complejo
Preparación de las soluciones
El polietilenglicol (PEG) (Pm. 20.000) se preparó como solución acuosa al 1%.

El carbonato potásico (K2CO3 anhidro) se preparó como solución acuosa 0,2 M. Esta
solución no es muy estable y se preparó en fresco previamente a su uso.
Las lectinas del estudio fueron diluidas 1:1 con agua bidestilada.
Conjugación lectina-oro. Método
La formación de complejos de proteínas con oro coloidal es pH dependiente(408) y es

óptimo a un pH próximo o ligeramente por encima del punto isoeléctrico (PIE)(565). En la
tabla siguiente se muestran los valores de pH para la formación de complejos de las lectinas
usadas en el presente estudio.
LECTINA pH
Glycine max 6,1
Bandeirae simplicifolia 6,2
Arachis hypogaea 6,3
Ulex europaeus I 6,3
Tabla 3-2 (566)

Valores de pH para la formación de complejos de lectina-oro
coloidal (Roth 1987).
El ajuste del pH se ha realizado a partir de un pequeño volumen de oro coloidal (6

ml). Dado que las partículas de oro pueden taponar el poro del electrodo y estropearlo, se
añaden al coloide 3 ml de polietilenglicol (p.m. 20.000) que actúa como estabilizador y
permite ajustar el pH de la alícuota sin peligro para el electrodo. La cantidad de K2CO3
añadida para ajustar el pH a este volumen de 5 ml, se extrapoló al volumen total de la
solución(566).
99
La medida del tamaño de las partículas de oro coloidal se comprobó mediante la
medición sobre microfotografías obtenidas por microscopía electrónica de transmisión
colocando una gota de la solución sobre una rejilla recubierta de formvar.
Se ha estimado con el test de floculación de sal la cantidad óptima de lectina necesaria
para la estabilización de un cierto volumen de oro coloidal(567). El banco de diluciones se
realizó, como se demuestra en la tabla siguiente, con un volumen constante de oro coloidal de
250 Wl, se agitó en un vórtex 15 segundos y se esperó de 2 a 5 minutos a fin de que se
conjugaran bien y finalmente se añadió 25 Wl de ClNa al 10%. La cantidad mínima de lectina
que no vira a color azul se considera adecuada. Estos datos pueden mostrar variación
dependiendo de la fuerza y pureza de las lectinas y necesitan ser estimados
individualmente(568).
1 2 3 4 5
Oro 250 Wl 250 Wl 250 Wl 250 Wl 250 Wl
Agua 25 Wl 24 Wl 23 Wl 20 Wl 10 Wl
Lectina 0 Wl 1 Wl 20 Wl 5 Wl 10 Wl
Tabla 3-3
Banco de diluciones para encontrar la cantidad óptima de lectina.
Una vez conocida la cantidad mínima de lectina para estabilizar el coloide, se

preparan 100 ml de oro (ajustado al punto isoeléctrico (PIE) de la lectina) y se añade la
cantidad de lectina correspondiente. Pasados unos 2-5 minutos se añaden a esta mezcla 10-20
Wl de PEG, como estabilizador.
Seguidamente, se realizó una primera centrifugación (L.7-55 Ultracentrifuge
BECKMAN®) a 45.000 r.p.m. durante 45 minutos a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante
(conteniendo la lectina libre) hasta llegar por debajo del spot (oro no acomplejado) y
seguidamente se extrajo el pellet o complejo proteína-oro.
Este pellet fue resuspendido en otros tubos de centrífuga con una solución de PBS
(0,01 WM) y PEG (10-20 Wl) hasta obtener el volumen de la solución inicial. Se realizó una
segunda centrifugación a 25.000 r.p.m. durante 45 minutos a 4ºC. Se vuelve a extraer el pellet
y se resuspende con PBS, realizándose un banco de diluciones (PBS y complejo lectina-oro)
1000: 2, 1000: 5, 1000: 10, 1000: 20 en cubetas especiales (Halb-Mikro, GREINER®). Se
midió con un espectrofotómetro (UV-150-02 SHIMADZU®). Se considera una
concentración óptima para partículas de 30 nm de diámetro, aquélla que conduce a una
absorbancia de 0,40-0,42 medida por convenio a una densidad óptica de 520 nm
(OD520)(497).
Los complejos de lectina-oro son muy estables y retienen su bioactividad específica
durante largos periodos de tiempo(567), de forma que las alícuotas se conservaron
congeladas a -80º C con glicerol al 20% y 0,2 mg/ml de PEG 20000(497).
III. 4. 3. Metodología histoquímica con lectinas conjugadas
El procedimiento de tinción utilizado ha sido el denominado "método directo". Es un

método sencillo, ya que sólo es necesario realizar una única incubación de la muestra. El
principal inconveniente en relación a los métodos indirectos es que la menor sensibilidad
100
hace necesarias concentraciones más altas de lectina y tiempo de incubación más prolongado.
(Figura 3-1 A y B).
Mediante este método, sólo es necesario incubar el tejido con la lectina
correspondiente, previa conjugación de ésta con el marcador.
Preparación de las lectinas
Los complejos lectina-oro en PBS se descongelan y centrifugan a temperatura

ambiente en una centrífuga para eppendorfs (Biofuge A, HEREUS®) a 800 r.p.m. durante 15
minutos. Se extrae el sobrenadante y se suplementa con 1 mM de Cloruro Cálcico (CaCl2) y 1
nM de Cloruro Magnésico (MgCl2) más 0,5% de albúmina bovina (SIGMA®) puesto que
algunas lectinas necesitan de la presencia de estos metales pesados para mantener una
localización de enlace activa; y 0,05% de TWEEN 20 (Polioxietileno-Sorbitan Monolaurato,
SIGMA®). Este último producto se añade para inhibir la interacción del enlace de lectina con
carbohidratos a través de enlaces hidrofóbicos(400).
4. 3. 1. Procedimiento de incubación para MO
Los portas se desparafinan e hidratan como en el protocolo para hematoxilina-eosina

(apartado III. 3. 1.).
Las preparaciones se secan sin tocar la muestra y se realiza un círculo alrededor de la
misma con esmalte de uñas para evitar la diseminación de los reactivos.
Una vez seco se realizan 3 lavados de 10 minutos con PBS.
Se incuban las muestras con lectina a temperatura ambiente durante 45 minutos y
posteriormente se lavan las muestras con agua destilada durante 2 minutos.
Amplificación de la señal
Seguidamente se ha realizado una amplificación del oro coloidal mediante el producto
Silver Enhacing Kit, BIOCELL®.
El producto provoca un precipitado de plata metálica sobre las partículas de oro que
tenemos en la muestra amplificando su señal. Figura 3-1 C
El Kit contiene dos soluciones: una solución amplificadora y otra iniciadora, las
cuales es necesario mantener en nevera a 4º C y pueden congelarse y descongelarse unas 10
veces sin alterar las propiedades del producto.
El proceso de amplificación es dependiente del tiempo. En el primer periodo de
actuación la reacción es muy específica para oro coloidal. Pequeñas partículas de 5 nm de
diámetro pueden crecer de forma rápida durante este primer periodo de tiempo, que estará en
relación con la temperatura de trabajo. Se pueden producir precipitados de plata de forma
espontánea por un fenómeno denominado de nucleación que dará lugar a un ruido de fondo
indeseable.
Se prepara la solución final del producto y se deposita una gota sobre la preparación,
de forma que esta quede cubierta por completo.
El proceso tiene lugar a temperatura ambiente (22º C) durante un tiempo comprendido
entre 12 y 16 minutos, observando la muestra bajo el microscopio a baja intensidad de luz, y
valorando el marcaje que se va produciendo.
Seguidamente se realizan diversos lavados en agua corriente y se contrasta con una
tinción suave de hematoxilina de Harris (durante 3 minutos) y se realiza el montaje con DPX.
101
4. 3. 2. Procedimiento de incubación para MES
- Se realizaron 3 lavados de 10 minutos con tampón fosfato de los tejidos previamente

fijados.
- Se tratan con Cloruro amónico (NH4Cl) 0,15 M durante 30 minutos a temperatura
ambiente para bloquear los grupos aldehído(410).
- Se realizan lavados con PBS (3 durante 10 minutos).
- Se procede a la incubación de cada una de los complejos lectina-oro con la muestra
durante 45 minutos a temperatura ambiente en tubos Eppendorf.
- Lavados en PBS (3 durante 10 minutos).
Montaje y recubrimiento
El montaje de las muestras se realiza según el apartado 2. 3. 2.
Para el estudio con retrodispersados en MES, las muestras se recubren con una capa
de carbón mediante un evaporador EDWARDS 12E6® de alto vacío.
III. 4. 4. Controles de especificidad
Los controles nos permiten evaluar si el marcaje o la reactividad que hemos obtenido
es específica o no. Por esto, paralelamente con las incubaciones para cada una de las lectinas,
se han realizado incubaciones control con los azúcares inhibidores correspondientes para
cada lectina en particular. Los azúcares utilizados han sido siempre de la marca SIGMA®.
Paralelamente, se han realizado las soluciones de los azúcares inhibidores (0,2 M)
correspondientes para cada lectina; mezclándose v/v con la solución del complejo lectina-oro.
La solución final se ha mantenido durante 45 minutos a temperatura ambiente a fin de que se
produjera la unión del azúcar con la lectina. Seguidamente se ha procedido a la incubación
del tejido y se ha valorado posteriormente el marcaje.
Con estos controles se pretende evitar la unión de la lectina con el tejido, dado que el
punto de anclaje de la lectina será ocupado por el azúcar correspondiente (Figura 3-1 D). En
caso de observar marcaje, cabría pensar en la presencia de posibles interacciones hidrofóbicas
entre la lectina y el tejido y por tanto el resultado de un marcaje inespecífico que invalidaría
los resultados obtenidos en la incubación del complejo lectina-oro.
III. 5. Observación microscópica
III. 5. 1. Microscopía
Los estudios de MES para detección de retrodispersados se realizó con dos

microscopios según la disponibilidad de los mismos: JSM 840 (JEOL®) y S2300
(HITACHI®) este último provisto de un detector ROBINSON® modelo RBH-2300 M,
usando en ambos potenciales de aceleración entre 15-25 kv.
Los estudios de SEM convencional se realizaron con los mismos microscopios, a un
potencial de aceleración de 15 Kv. estudiándose las muestras a 50, 100, 300, 1000 y 8000
aumentos.
Para los estudios de MO y microfotografía se usó el microscopio BX 50
(OLIMPUS®).
III. 5. 2. Material fotográfico
102
La película fotográfica utilizada para la MES tanto convencional como para estudio
de retrodispersados fue de la marca KODAK® tipo Tmax. Para microscopía óptica se usó
película Agfachrome 100 de AGFA.
III. 6. Citometría de flujo
III. 6. 1. Procesado de las muestras para cmf
Para el procesado de las muestras parafinadas de colon de rata para CMF se usó una
modificación de la técnica de Hedley, tal como se describe seguidamente:
1.Se obtuvieron secciones de tejido parafinado de 50 Wm con la ayuda de un microtomo y se

colocaron unos 5-6 cortes en tubos separados y debidamente etiquetados.
2. Se desparafinan sumergiendo las secciones de tejido en tubos de cristal con 5 ml de xilol
durante 10 minutos.
Decantar y repetir este paso con otros 10 ml de xilol.
Decantar y eliminar los restos de xilol mediante lavados con alcohol absoluto.
3. Rehidratar, sumergiendo sucesivamente las secciones en:
Etanol 100%............................................ 5 min
Etanol 95%.............................................. 5 min
Etanol 96%.............................................. 5 min
Etanol 70%.............................................. 5 min
Etanol 50%.............................................. 10 min
Agua destilada......................................... 10 min

4. Se decanta el agua y se disgregan mecánicamente las piezas con ayuda de un bisturí.
5. Se tratan con 4 ml de disolución de pepsina (Pepsin, SIGMA®) al 0,5% en cloruro sódico
al 0,9% en agua destilada y ajustando el pH a 1,5. Se colocan los tubos en un baño María a
37º C durante 40 minutos, con agitaciones intermitentes en vórtex.
6. Se centrifugan 10 minutos a 2000 r.p.m. a temperatura ambiente en una centrífuga clínica.
Se decanta y resuspende el tejido en PBS y se agita nuevamente en el vórtex para liberar los
núcleos celulares de los fragmentos de tejido.
7. Se filtra la suspensión con malla de nylon de 50 Wm de poro. El filtrado se realiza para
remover agregados celulares y tejido insuficientemente disgregado que pudiera obstruír la
cámara de flujo del citómetro.
8. Se determina la concentración de la suspensión de núcleos con un contador celular o
hemocitómetro. Si es necesario, puede añadirse PBS o centrifugar y resuspender en tampón
hasta que la concentración final de núcleos esté en el rango de 3-10 x105 células /ml.
9. Se decanta y resuspende con 2 ml de solución de yoduro de propidio y RNAsa (DNA prep
Reagent, COULTER®), dejando actuar 20 minutos a temperatura ambiente y en lugar
oscuro.
10. Se pasa la suspensión a través de una jeringa de aguja fina, para separar los núcleos y
evitar la formación de dobletes.
103
III. 6. 2. Análisis por citometría de flujo del contenido en DNA y ciclo celular
Las muestras teñidas con yoduro de propidio, tal como se describe en el apartado
anterior, han adquirido una determinada cantidad de fluorocromo en proporción a su
contenido en ADN. Con el citométro de flujo pretendemos medir de una manera rápida y
objetiva la fluorescencia emitida por los núcleos. A partir de los datos obtenidos se realiza el
análisis de la ploidia y de las fases del ciclo celular.
6. 2. 1. Citómetro de flujo
Para el análisis se ha empleado un citómetro de flujo EPICS PROFILE I

(COULTER®), de cámara cerrada sin sorter.
Se ha creado un test específico para la lectura de las muestras de colon de rata. Los
valores por defecto del test son los siguientes:
- Volumen de muestra aspirada: 190 W1.
- Velocidad de inyección de la muestra: 100 Wl/minuto.
- Presión de fluido de arrastre: 7,50 psi.
- Potencia de láser: 15 mW.
- Voltaje de los fotomultiplicadores: SS: 400 V, FL3: 750 V.
- No hay compensación del color al trabajar con una única fluorescencia.
- Parámetros seleccionados: LFS, FL3, FL3P, LSS.
- Ventanas de adquisición: No activadas; LFS: 204-1023, FL3: 198-1023. El resto: 0-1023.
- Ganancias: FL3: 2, FL3P: 1.
- Discriminadores: para FL3 en el canal 50.
- Parada a los 50.000 eventos.
- Regiones amorfas (bitmap) de adquisición: FL3-FL3P, para discriminación de dobletes.
- Histogramas: Se estudiaron 4 histogramas: 2 monoparamétricos: FL3 (uno sin bitmaps
activados y el otro activando bitmap de FL3-FL3P. Histograma biparamétrico de FL3 y LFS
para comprobar la calidad de la tinción (independencia del canal de FL3 y tamaño nuclear).
- Los resultados se almacenaron en forma de histogramas y en modo lista en un diskette.
6. 2. 2. Alineamiento del citómetro
Previamente a la lectura de las muestras, se calibró la alineación del sistema, con

bolas fluorescentes de látex (DNA-check, EPICS®)
6. 2. 3. Lectura por el citómetro de flujo
Las muestras fueron analizadas por citometría de flujo según el test definido. La
adquisición de los datos se realizó tras 60 segundos de inicio de paso de muestra para que se
estabilizara el flujo. Para cada histograma se adquirieron un total de 50.000 eventos.
Se usaron como controles para las muestras tumorales las propias células normales del
tejido, obviamente tratadas simultáneamente y en las mismas condiciones.
6. 2. 4. Interpretación de los resultados de la lectura por citometría de flujo
Como resultado de la lectura por citometría de flujo de las muestras de colon teñidas
con yoduro de propidio se obtienen histogramas monoparamétricos con la distribución de la
104
fluorescencia proporcional al contenido de ADN de los núcleos analizados.
Para la correcta cuantificación de la cinética celular se ha empleado un programa
informático específico para la interpretación del ciclo celular (MULTICYCLE®, Phoenix
Flow Systems). Este programa emplea procedimientos matemáticos capaces de sustraer la
señal debida a núcleos cortados y otros detritus.
6. 2. 5. Análisis de los histogramas del contenido en ADN mediante el programa informático
Para cada uno de los histogramas seleccionados se identificó la presencia de uno o

más picos correspondientes a células en fase G0G1. La presencia de un único pico se
considera como un histograma diploide y si aparecen más de uno, un histograma aneuploide.
En nuestro caso todos los histogramas fueron diploides como se comentará posteriormente,
por lo que, las explicaciones ulteriores se refieren exclusivamente al análisis de histogramas
diploides.
El programa informático obtiene los valores mejor ajustados al histograma y con
menor error calculando el porcentaje de células en cada fase del ciclo celular.
Para el análisis por CMF se obtuvieron para cada histograma un mínimo de 25.000
células.
Se excluyeron del estudio aquellos histogramas en los que el coeficiente de variación
del pico G0-G1 fue A 10, no se obtuvo un pico reconocible de G0-G1, existía una pobre
discriminación entre el ruido de fondo y el ciclo celular o el número de núcleos adquiridos
era inferior a 25.000.
III. 7. Variables del estudio
Para el estudio estadístico se resumen y agrupan los resultados en una hoja de

recogida de datos precodificada, registrando las siguientes variables:
III. 7. 1. Identificación de los casos
- Número de rata: es una variable cuantitativa asignada en el momento del sacrificio que
identifica los animales en estudio.
- Grupo de estudio: variable cualitativa con 5 categorías (1) grupo A, (2) grupo B, (3) grupo
C, (4) grupo D, (5) grupo E.
III. 7. 2. Variables clínicas

- Sexo: variable cualitativa que puede tener dos categorías: macho y hembra.
- Semanas de tratamiento: variable cuantitativa que recoge las semanas de tratamiento desde
la primera inyección con DMH o EDTA.
- Localización: variable cualitativa que recoge la localización de la muestra tanto normal
como tumoral según cuatro categorías: ciego, colon ascendente, colon transverso, colon
descendente-recto.
- Tamaño tumoral: Se consideró como una variable cualitativa, reduciéndose a dos
categorías: pequeño < 0,8 cm. de diámetro y grande A 0,8 cm.
III. 7. 3. Variables anatomopatológicas
- Tipo histológico: variable cualitativa con 8 categorías:

105
(1) adenocarcinoma,
(2) carcinoma mucinoso,
(3) carcinoma in situ,
(4) adenoma,
(5) displasia severa,
(6) displasia moderada,
(7) displasia leve,
(8) normal.
Si la muestra había sido descrita anatomopatológicamente como neoplásica, se valoró
también el:
- grado de diferenciación: variable cualitativa que recoge el grado de diferenciación celular
tumoral según tres categorías:
(1) bien,
(2) moderado,
(3) pobremente diferenciado.
- estadio según la clasificación de Dukes: El estadio patológico de invasión tumoral fue
definido de acuerdo al sistema original de Dukes en 3 variables:
(1) Dukes A: tumor limitado a la muscularis mucosa
(2) Dukes B: tumor que sobrepasa la muscularis mucosa
(3) Dukes C: invasión local o distal de los ganglios linfáticos.
No se aceptó el estadio Dukes D como tal, puesto que la existencia de varios tumores
sincrónicos colorrectales dificultaba conocer cuál de estos tumores era el causante de la
invasión tumoral. Por este motivo se recogió para cada una de las ratas la existencia de
metástasis independientemente de los tumores primarios.
- presencia de metástasis: variable cualitativa que recoge la presencia de metástasis a
distancia, estratificándose en dos categorías: 1) presencia, ó 2) ausencia de metástasis. Como
ya se ha comentado previamente, dada la dificultad para reconocer el primario siempre que
existía un adenocarcinoma con invasión a serosa y otras metástasis a distancias, se le
adjudicaba esta existencia es decir, si dos tumores sincrónicos presentaban metástasis se
apuntaba esta variable para ambos.
- presencia de otros tumores sincrónicos colorrectales: variable cualitativa que recoge si la
muestra estudiada se asocia (categoría 1) o no (categoría 2) a la presencia de otros tumores
colorrectales.
- presencia de otros tumores sincrónicos de intestino delgado: se consideraron 2 categorías
para esta variable cualitativa:
(1) presencia,
(2) ausencia.
- presencia de placa linfoide: variable con 2 categorías:
(1) asociación de la lesión a placa linfoide,
(2) no asociación.
III. 7. 4. Variables histoquímicas con lectinas en microscopía óptica
- Marcaje de los tumores con lectinas en microscopía óptica: Para las cuatro lectinas
empleadas en el estudio se consideró 3 categorías en cuanto al marcado de lectinas:
(1) Todo: cuando el tumor se marcaba por completo o casi por completo.
(2) Areas: cuando el tumor presentaba áreas de marcaje y otras con marcaje ausente.
(3) No: cuando el tumor no presentaba marcaje de lectinas o era muy escaso.
106
- Marcaje de la mucosa transicional con lectinas en microscopía óptica: Para las cuatro
lectinas usadas en el estudio, se consideraron dos categorías en cuanto al marcaje:
(1) Presencia de marcaje.
(2) Ausencia de marcaje.
- Marcaje de la mucosa normal alejada del tumor: Variable cualitativa para cada una de las
lectinas con dos categorías:
III. 7. 5. Variables histoquímicas con lectinas en microscopía electrónica
La afinidad de la mucosa del colon, tanto normal como neoplásica, a las lectinas se
consideró como una variable cualitativa con 2 categorías:
III. 7. 6. Variables histoquímicas con la tinción ab-pas
La tinción con AB-PAS es una variable cualitativa con 5 categorías que recoge el
predominio de marcado en las células caliciformes normales y tumorales de: AB, PAS,
PAS/AB, AB-PAS y ausencia de tinción.
III. 7. 7. Variables consideradas en el estudio de citometría de flujo
Para cada una de las muestras analizadas y puesto que no se ha reconocido en ningún
caso aneuploidia, se han recogido las siguientes variables cuantitativas:
- porcentaje de células en fase G0G1
- porcentaje de células en G2M:
- porcentaje de células en fase S
III. 8. Base de datos. Tratamiento de la base de datos
Con todos los parámetros recogidos de los casos se construyó una base de datos
matricial e informatizada. Se ha empleado un sistema de filas y columnas capaz de ser leído
por el programa informático SPSS. Todos los datos se introdujeron como dígitos
alfanuméricos que en las variables cuantitativas representaban el valor de la variable y en las
cualitativas una determinada categoría de las mismas.
Se calculó el índice de proliferación (IP) que es igual a la suma de la proporción de
células en fase S y en G2M y determina la proporción de células que están en fase
proliferativa(545).
III. 9. Estudio estadístico de los resultados
El estudio estadístico de los resultados se ha realizado con la ayuda del programa

informático SPSS para Windows (SPSS Inc, 1989-1992, MICROSOFT®). En cada caso, y de
acuerdo con las características específicas de las hipótesis formuladas, el tipo de variables
estudiadas y del cumplimiento de determinadas condiciones de aplicación se ha utilizado
distintas técnicas estadísticas. El grado de significación se ha establecido para una p @ 0,05.
107
Los métodos estadísticos utilizados en el estudio son los siguientes:
III. 9. 1. Comparación de variables cualitativas
Para el estudio estadístico de la relación de variables cualitativas se ha empleado una

prueba de independencia de m2. Cuando los efectivos calculados eran cercanos a 5 y alguna
de las variables tenía más de dos categorías se ha utilizado la prueba de m2 con la corrección
de Yates. Si los efectivos calculados eran inferiores a 5 ó el número total de casos inferior a
20 en una tabla de 2x2, se ha empleado la prueba exacta de Fischer.
III. 9. 2. Comparación de variables cualitativas y cuantitativas
Para el estudio de relación entre variables cualitativas y cuantitativas se ha empleado

la prueba de Kruskal-Wallis, prueba no paramétrica para la comparación de dos o más
medias. En el caso de que se cumplieran las condiciones de aplicación, se ha utilizado el
análisis de la varianza.
III. 9. 3. Comparación de variables cuantitativas
Para el estudio de relación entre variables cuantitativas se han empleado modelos de

regresión lineal simple. Para el estudio multivariante se han aplicado modelos de regresión
múltiple(569),(570).
108
IV. Resultados
IV. A. Estadística descriptiva univariante
IV. A. 1. Grupo A
El grupo control A no presentó ningún tipo de lesión tumoral en ninguna localización

tanto colónica como extracolónica.
IV. 1. 1. Características macro y microscópicas de la mucosa normal de rata
Abierto el colon por el borde antimesentérico distinguimos macroscópicamente los

diversos segmentos del colon:
El ciego se muestra como una bolsa en forma de coma, de paredes delgadas y
distendidas, y ausencia de pliegues o de disposición desordenada. La longitud media del
ciego es de 4,26 cm, con DS de 0,70, máximo de 6,00 y mínimo de 3,00 cm.
El colon ascendente, ya de forma tubular presenta 8 pliegues, de 0,4 mm. de grosor,
separados por surcos de 0,2 a 0,3 mm. Estos pliegues están ordenados de forma oblicua,
formando ángulo entre ellos en dirección proximal. La longitud media del colon ascendente
es de 4,41 cm, con DS de 0,59. El valor máximo es de 6,00 y el mínimo de 3,00 cm.
Los pliegues del colon transverso muestran una disposición oblicua como los del
colon ascendente, pero sus pliegues son más gruesos (0,6 mm), en número de 6. A menos de
1 cm. de iniciado el colon transverso se observa generalmente, la presencia de un gran
folículo linfoide, que produce una protrusión en la superficie mucosa sin distorsionar los
pliegues. La longitud media del colon transverso es de 4,83 cm, con DS de 0,70, valor
máximo de 6,60 y mínimo de 3,50 cm.
En el colon descendente-recto la superficie mucosa es más lisa, y los pliegues en
número de 6 adquieren una disposición longitudinal. Miden unos 0,6 mm y están separados
por surcos de 0,2 a 0,3 mm, excepto el central que mide 0,4 mm. Se observa la presencia
ocasional de folículos linfoides, situados con mayor frecuencia en la mucosa rectal. En el
recto los pliegues aumentan de grosor, siendo de 0,85 mm La longitud media del colon
descendente-recto es de 10,95 cm; con DS de 1,59. El valor máximo es de 15,00 y el mínimo
de 7,00 cm (Figura 4-1)
1. 1. 2. Características microscópicas
A. Microscopía óptica:
Microscópicamente, las criptas experimentan un incremento progresivo de su longitud
desde el ciego al colon descendente-recto. En el ciego, la mucosa es delgada y las criptas más
cortas y anchas. En el colon ascendente y transverso las criptas son más alargadas y se
ramifican en la base. En el colon descendente, las criptas son alargadas y estrechas, rectas y
sin ramificaciones (Figura 4-2)
Al microscopio óptico se pueden distinguir 3 tipos de células en la mucosa de las ratas
Sprague-Dawley adultas: a) las caliciformes, b) las columnares, y c) las endocrinas.
La distribución de las células caliciformes en las criptas muestra diferencias según el
segmento del colon analizado. En el ciego, predominan en la base de las criptas mientras,
109
mientras que en el resto de las zonas son más numerosas y de mayor tamaño en los 2 tercios
superiores de las criptas.
Las células columnares se localizan principalmente en el tercio superior de las criptas
y en el epitelio de la superficie.
Las células endocrinas se reconocen por sus gránulos de secreción oscuros y
predominan en la base.
B. Microscopía electrónica de scanning:

La observación con MES muestra también claras diferencias regionales en el aspecto
de la mucosa normal de la rata. Aunque en general está cubierta por una densa capa de moco
que impide ver las estructuras subyacentes.
A poco aumento, se observa en el ciego una superficie plana, con criptas abundantes
de aspecto circular, separadas por hendiduras irregulares.
En el colon ascendente se observa la disposición de pliegues descrita previamente,
siendo estos de tamaño regular, y con formaciones reticulares de moco entre ellos. Los
pliegues muestran hendiduras perpendiculares al eje mayor, entre los que se observan las
bocas de las criptas de aspecto fusiforme. A mayor aumento el epitelio del colon ascendente
muestra unas criptas abultadas, que sobresalen de la superficie con abundantes grumos de
moco sobre ellas (Figura 4-3 B).
El colon transverso muestra pliegues ordenados oblicuamente, similares al
ascendente, de disposición uniforme, y con moco entre ellos. A 300 y 1000 aumentos se
observa una superficie recubierta de células absortivas poligonales recubiertas de
microvellosidades y escasos orificios criptales (Figura 4-3 C).
El colon descendente-recto muestra pliegues paralelos al eje mayor del intestino
grueso, de tamaño variable. Los orificios de las criptas están ordenadas en formación
paralela, rodeados por células absortivas en forma de polígono regular. La mucina se
distribuye como borlas de material amorfo sobre estas células. A mayor aumento el epitelio
forma circunvoluciones, que le confieren aspecto cerebroide (Figura 4-3 D).
En general, a 50 aumentos, en los cuatro segmentos descritos las criptas están
regularmente ordenadas y son de tamaño similar.
A 300 aumentos, se observan los orificios de las criptas uniformes, y el aspecto
simétrico de las células absortivas. Se observan hilos de mucina sobre la superficie.
A 1000 aumentos, se observa la presencia de secreciones mucinosas que emergen de
las bocas de múltiples criptas y que cubren parte de la superficie. En algunas muestras este
recubrimiento es tan extenso como para oscurecer todos los aspectos de las superficies
epiteliales.
A 8.000 aumentos, se observaban microvellosidades regulares, íntimamente
agrupadas y de tamaño uniforme (Figura 4-3 A). La superficie luminal de cada célula es
convexa, con depresión en los bordes, produciendo
un surco epitelial en la región de unión entre las células. Puede observarse la presencia de
microorganismos sobre la luz intestinal, que ocupan el espacio entre microvellosidades.
IV. 1. 2. Variables histoquímicas con lectinas en microscopía óptica de mucosa normal
Los patrones de reactividad de las lectinas usadas en este estudio muestran claras
diferencias regionales, con presencia o ausencia de enlace y distinta localización en la
longitud de las criptas.
110
En el ciego, la lectina SBA muestra una reactividad a nivel supranuclear, esta

disposición es más evidente a nivel de los 1/3 medio y apical. A nivel basal el marcaje es más
irregular y se dispone también en el interior de los globos de moco y como un refuerzo de los
mismos en su periferia. A nivel del colon ascendente existe reactividad de las vacuolas de
moco en toda la longitud de la cripta, aunque es más intenso a nivel apical, y mostrando
reactividad de la superficie epitelial. En el colon transverso se observa afinidad de esta lectina
por la mucina de las células caliciformes en toda la longitud de la cripta, e igual reactividad
que en el colon descendente.
La SBA mostró una intensa reactividad en la superficie luminal del epitelio de ciego y
colon ascendente, mientras que en el colon transverso y descendente este compartimento
celular se ha marcado más moderadamente.
A nivel de ciego y colon ascendente, las células columnares presentan un patrón de
localización supranuclear, en forma de pequeñas formaciones ovaladas o redondeadas,
principalmente visibles en la porción alta de las criptas y a lo largo del epitelio de superficie
(Tabla 4-1).
CIEGO C. ASC. C. TRANS C. DESC

BASAL SN, C C C C
MEDIO SN C C C
APICAL SN C C C
SUPERFICIE SN SN
C: citoplasma, SN: supranuclear
Tabla 4-1
Patrón de enlace de la lectina Glycine max.
En las glándulas displásicas en relación a placa linfoide se observa una disminución o

ausencia de la reactividad del citoplasma de las células caliciformes.
La lectina GSA-II a nivel de ciego se localiza en el interior del citoplasma de las

células caliciformes en el tercio basal y medio. La GSA-II muestra marcaje intenso
supranuclear a nivel de colon ascendente, de predominio basal. En el colon transverso se sitúa
a nivel del 1/3 basal.
Mientras que en el colon descendente este marcaje es también basal pero se sitúa en el
interior del citoplasma de las células caliciformes (vacuolas de moco) (Tabla 4-2).
CIEGO C. ASC. C. TRANS. C. DESC.

BASAL C SN SN C
MEDIO C SN
APICAL SN
111
SUPERFICIAL SN
C: citoplasma, SN: supranuclear
Tabla 4-2
Patrón de enlace de la lectina Griffonia simplicifolia.
La lectina PNA no se une a la mucina de las células caliciformes en ninguno de los

segmentos examinados, dando un marcaje positivo granular, fino y débil en la región
supranuclear de estas células.
La PNA también tiñe la superficie luminal del ciego y más débilmente la del colon
ascendente, pero no la del colon transverso y descendente (Tabla 4-3).

BASAL SN SN SN SN
MEDIO SN SN SN SN
APICAL SN SN SN SN
SUPERFICIAL SN SN
SN: supranuclear
Tabla 4-3
Patrón de enlace con la lectina Arachis hypogaea.
Las diferencias regionales más notables se han observado con esta lectina. En el ciego
las células caliciformes se marcan a todos los niveles de las criptas, en el colon ascendente
solamente en la base; mientras que en el colon transverso se marcan ocasionalmente, y en el
colon descendente, esta lectina no presenta afinidad por la mucina de las células caliciformes.
A nivel de ciego, la UEA-I, reacciona con la superficie epitelial, y se sitúa a nivel de
las células caliciformes (interior de las vacuolas de moco) y la luz glandular de todos los
niveles de las criptas como ya hemos citado. A nivel de colon ascendente, se sitúa en el
interior de las criptas y luz glandular del 1/3 basal. En el colon transverso tiene un
comportamiento mixto igual que el colon ascendente o de reactividad ausente como en el
colon descendente (Tabla 4-4).

BASAL C, LG C, LG C, LG/ausente
MEDIO C, LG
APICAL C, LG
SUPERFICIAL C
C: citoplasma, LG: luz glandular
112
Tabla 4-4
Patrón de enlace de la lectina Ulex europaeus.
IV. 1. 3. Variables histoquímicas con lectinas en microscopía electrónica de barrido
Con esta técnica los lugares de enlace de la lectina son revelados por partículas de oro
electrón opacas, comprobado mediante microanálisis la presencia de oro.
La lectina SBA muestra afinidad por la mucina de la superficie epitelial del ciego, no
observándose afinidad en el resto de las localizaciones colónicas, excepto a nivel de colon
descendente donde se ha observado marcaje del moco que emerge de la cripta.
1. 3. 2. GSA-II
No se obtuvo marcaje con la lectina GSA-II de la superficie de la mucosa colónica
normal en ninguno de los segmentos del intestino grueso de rata.
No se obtuvo enlace con PNA de la superficie de la mucosa colónica normal en

ninguno de los 4 segmentos.
La UEA-I reacciona intensamente con la mucina de la superficie epitelial de la

mucosa colónica a nivel de ciego, observándose en colon ascendente reactividad en el moco
que emerge de la cripta, y ausencia a nivel de colon transverso y descendente.
IV. 1. 4. Variables histoquímicas con la tinción AB-PAS
La tinción con la secuencia AB-PAS de la mucina de las células caliciformes muestra

gran intensidad y una positividad débil en el borde apical.
Según el aspecto tintorial de las vacuolas de moco de las células caliciformes, se han
observado 3 poblaciones celulares: a) unas, que muestran coloración azul por el AB, b) otras
teñidas de color magenta propia del PAS, y c) otras de coloración morado oscuro debido a la
combinación de las 2 tinciones, AB y PAS.
La tinción AB-PAS mostró también diferencias regionales y distinta distribución a lo
largo de la cripta.
CIEGO C.ASCENDENTE C.TRANSVERSO C.DESCENDENTE

APICAL AB/AB-PAS/PAS AB-PAS AB-PAS AB-PAS
MEDIO AB/AB-PAS/PAS AB-PAS AB-PAS AB-PAS
BASAL AB/AB-PAS/PAS AB AB/AB-PAS AB-PAS/AB
PAS: Color magenta
AB: Color azul
AB-PAS: Color morado oscuro
113
Tabla 4-5
Patrones de tinción AB-PAS en los 4 segmentos colónicos.
En el ciego se obtuvo tinción de los 3 tipos en toda la longitud de las criptas, aunque a
nivel del 1/3 basal de la cripta era más evidente la tinción AB, encontrándose también tinción
AB en la luz glandular en toda la longitud (Figura 4-4A). A nivel de colon ascendente
encontrábamos en toda la longitud los 3 tipos de tinciones: AB/AB-PAS/PAS, predominando
en el tercio basal la tinción azul y en el resto la tinción morada oscura. En el colon transverso
la tinción era cambiante adoptando la forma de colon ascendente o de colon descendente. Y
por último en colon descendente, a nivel basal y 1/3 medio encontramos tinción AB débil y
siendo evidente en toda la longitud la tinción AB-PAS (Tabla 4-5).
La superficie luminal de las células columnares reacciona débilmente con la tinción
AB-PAS, y se muestra bastante homogénea a lo largo de toda la superficie del colon.
IV. 1. 5. Citometría de flujo:
-Análisis del ADN: fase G0G1 del ciclo celular:

El porcentaje medio de células en fase G0G1 para el grupo normal, es de 88,74, con
una DS de 3,48. El valor mínimo es de 83,1 y el máximo de 95,3.
- Análisis del ADN: faseG2M del ciclo celular:
El porcentaje medio de células en fase G2M para el grupo normal, es de 5,03, con una
DS de 1,72. El valor mínimo es de 1,7, y el máximo de 8,3.
- Análisis del ADN: fase S del ciclo celular:
El porcentaje medio de células en fase S para el grupo normal, es de 6,21, con una DS
de 2,46. El valor mínimo es de 1,70, y el máximo de 10,9.
- Indice de proliferación:
El índice de proliferación (IP) es la suma del porcentaje de células en fase S y en fase
G2M. El valor medio es de 11,25 para el grupo normal, con una DS de 3,48, el valor mínimo
es de 4,7 y el máximo de 16,9.
- Aneuploidia; índice de ADN:
Todas la muestras analizadas eran diploides, sólo se identificó un único pico de fase
G0G1 (Figura 4-5)
En la Tabla 4-6 se muestran las medias de las fases del ciclo celular e índice de
proliferación según el sexo y el segmento estudiado.
Variables Categorías GOG1 G2M FASE S IP

Sexo Macho 88,74 5,17 6,55 11,72
Hembra 89,18 4,91 5,91 10,82
Localización Ciego 86,92 5,36 7,72 13,08
C.A. 90,31 4,95 4,73 9,68
C.T. 90,66 4,10 5,24 9,34
C.D. 85,46 6,23 8,30 14,53
Tabla 4-6
114
Valores medios de las fases del ciclo celular e IP según el sexo
y la localización.
IV. 2. Grupo B
En el grupo B, fallecieron espontáneamente 3 animales, y debido a la rápida autolisis

de los roedores se descartaron para el estudio posterior. Dos ratas murieron debido a tumores
oclusivos y la tercera por caquexia extrema asociada a la presencia de tumores múltiples.
De los 39 animales supervivientes del grupo B, 32 presentaron lesiones tumorales a
nivel del colon (82,05%), 4 tumores extracolónicos (10,25%) y sólo 3 mostraron ausencia
tumoral (7,69%) (Figura 4-6). De los 32 animales que presentaron tumor, 22 presentaron
tumores múltiples sincrónicos en intestino grueso (68,75%) y el resto (31,25%) fueron
lesiones tumorales únicas.
IV. 2. 1. Características microscópicas
2. 1. 1. Características de la mucosa normal de rata inyectada con DMH, microscopía óptica
Al microscopio óptico, la mucosa del colon de rata tratada con DMH a dosis de 21
mg/kg/semana durante 20 semanas, muestra hipercromatismo, pseudoestratificación y
alargamiento del núcleo; alto índice mitótico y pérdida de moco muy evidente (Figura 4-7).
También se observan focos de criptas aberrantes, es decir, glándulas aisladas o grupos
de dos glándulas con disminución del moco intracelular, intensa basofilia, pérdida de la
polaridad normal y alineación celular, con ramificación de las criptas.
2. 1. 2. Características de la mucosa normal de rata inyectada con DMH, microscopía

electrónica de scanning
El estudio de la superficie epitelial del colon de rata en este grupo demuestra en todos
los segmentos en general, una pérdida (fenestraciones de la capa de moco, distribución
reticular de la mucina) o ausencia del moco que recubre la mucosa.
El ciego de ratas tratadas a altas dosis de carcinógeno, aunque puede mantener su
morfología (Figura 4-8 A), presenta a menudo una gran desestructuración, con pérdida total
de las células caliciformes, persistiendo las células columnares con ausencia total de
microvellosidades, dándole el aspecto de un panal de miel (Figura 4-8 B). Ocasionalmente
esta alteración ha sido observada en otros segmentos del colon.
Con frecuencia las criptas del ciego pierden su forma redondeada, se distorsionan y
adquieren forma romboidal.
En el colon ascendente los pliegues se hacen irregulares, las células absortivas pierden
sus microvellosidades y protruyen en la luz, formando cordones cerebriformes de epitelio.
Los orificios de las criptas muestran tamaños muy variables e incluso son demasiado anchos
para corresponder a esta estructura. Sus bocas están cerradas por formaciones planas,
probablemente correspondientes a colecciones mucinosas y restos celulares, que se
desprenden con facilidad (Figura 4-9 A).
Tanto el colon transverso como el colon descendente suelen presentar una estructura
más conservada. Se observa la protrusión de las criptas y de los espacios intercriptas, pero las
células absortivas a diferencia del colon ascendente mantienen sus microvellosidades (Figura
4-9 B y Figura 4-10 A).
115
En general, en toda la longitud del colon se observan áreas de mucosa protuberante,
que afectan un número variable de glándulas.
A 8000 aumentos las microvellosidades son cortas y romas, más anchas de diámetro y
se bifurcan (Figura 4-10 B).
2. 1. 3. Descripción de las lesiones neoplásicas con microscopía electrónica de scanning
A poco aumento las muestras tumorales muestran protrusión en la superficie luminal

con desaparición de los pliegues y desarreglo de los mismos o ausencia en las áreas
adyacentes.
A más aumento, se observaron células protruyendo en la luz del colon, acompañadas
de depresiones del epitelio (Figura 4-11 C) Las células absortivas pierden su aspecto
poligonal y las aberturas crípticas están distorsionadas y comprimidas, y disminuídas en
número o ausentes (Figura 4-11 A), confiriéndole una superficie plana en la que no se
reconoce la celularidad normal.
En ocasiones se aprecia sobre la superficie tumoral, grandes acúmulos de material
amorfo, traduciendo un aumento de las secreciones mucinosas (Figura 4-11 B).
A 8.000 aumentos se hacen más obvias las elevaciones y depresiones del epitelio y se
observan células sin microvellosidades o un patrón alterado de las mismas, que se hacen más
irregulares y cortas.
IV. 2. 2. Variables clínicas
2. 2. 1. Sexo
Las 71 lesiones tumorales asentaron en 39 casos (54,93%) sobre ratas macho y 32

sobre hembras (45,17%).
Las 71 lesiones benignas y malignas observadas en este grupo se localizaban en 7

casos en el ciego (9,86%), 27 en el colon ascendente (38,03%), 18 en colon transverso
(25,35%) y 19 en colon descendente (26,76%).
La mayoría de los tumores fueron del tipo tumor exofítico (26 casos 45,61%), se
observaron 13 lesiones polipoideas (22,81%), 8 en forma de pólipo sesil (14,04%) y 10 eran
tumores ulcerados (17,54%) (Figura 4-12)
Las lesiones benignas se clasificaron como tumores polipoideos en 6 casos (50%), en
5 casos como pólipos sesiles (14,67%) y en 1 como tumor exofítico (8,33%). El resto de
lesiones aparecieron en mucosa de aspecto normal o asociadas a placa linfoide,
considerándose en un apartado posterior.
En el grupo B las neoplasias colónicas tienen una media de 0,91 cm, DS de 0,78. El
valor mínimo es de 0,2 y el máximo de 3 cm.
116
IV. 2. 3. Variables anatomopatológicas
En el grupo B se apreciaron 57 lesiones malignas divididas en 31 adenocarcinomas

(Figura 4-13 A), 21 carcinomas mucinosos (Figura 4-13 B) y 5 carcinomas in situ y 14
lesiones benignas distribuidas en 1 displasia leve, 8 moderadas y 4 severas y 1 adenoma
túbulo-velloso.
Los 31 adenocarcinomas se dividieron según su grado de diferenciación en 24

moderadamente diferenciados (77,42%) y 7 poco diferenciados (22,58%).
Se encontraban en estadio A de Dukes 18 adenocarcinomas (34,61%), 15 en estadio B

(28,85%) y 19 en estadio C (36, 54%).
Un total de 56 lesiones (78,87%) se asociaban a la presencia de otras lesiones

colorrectales sincrónicas.
Un total de 41 lesiones tumorales (57,75%) se asociaban a la presencia de tumores

sincrónicos de intestino delgado. Presentaron tumores de intestino delgado 14 ratas.
Se observaron metástasis en 16 ratas (50,00%) de las 32 con tumores. De este modo

37 lesiones (52,11%) estaban asociadas a la presencia de metástasis.
Exclusivamente 6 lesiones benignas y malignas (8,45%) se asociaban a la presencia

de placa linfoide en este grupo.
IV. 2. 4. Variables histoquímicas con lectinas en microscopía óptica
- Marcaje con Glycine max (SBA):

Se estudió la mucosa normal de idéntica localización al tumor en 18 casos mediante la
lectina SBA, de modo que 12 mostraron reactividad para dicha lectina (66,66%), estando
ausente en 6 casos (33,33%).
117
- Marcaje con Griffonia simplicifolia-II (GSA-II):
Se estudiaron un total de 18 muestras normales con la lectina GSA-II. Estando
presente el marcaje en 15 casos (83,33%) y siendo negativo en 3 (16,67%).
- Marcaje con Arachis hypogaea (PNA):
Se estudió la mucosa normal en 14 casos con la lectina PNA. Mostraron enlace de
lectina 3 casos (21,43%) y ausencia de enlace 11 casos (78,57%).
- Marcaje con Ulex europaeus (UEA-I):
El estudio de 24 casos de mucosa normal, mostró reactividad en 10 casos (41,67%) y
ausencia en 14 casos (58,33%).
2. 4. 2. Marcaje de los tumores
- Marcaje con SBA:

Se estudiaron un total de 30 neoplasias colónicas con la lectina SBA. En este grupo,
en 12 casos se observaron enlaces de lectina en todo el tumor (40,00%), en 11 casos se
limitaba a algunas áreas (36,67%) y en 7 casos no se observaron (23,33%).
- Marcaje con GSA-II:
Se estudiaron un total de 29 tumores con la lectina GSA-II, de los que 11 presentaron
marcaje de todo el tumor (37,93%), áreas de marcaje en 12 casos (41,38%) y ausencia de
marcaje en 6 casos (20,69%).
- Marcaje con PNA:
Se estudió el marcaje con la lectina PNA en 18 tumores colorrectales, presentaron
enlaces de lectina en todo el tumor 12 (66,67%), áreas de marcaje 4 casos (22,22%) y
ausencia de enlace 2 tumores (11,11%).
- Marcaje de tumores con UEA-I:
En 31 tumores colorrectales se probó el enlace de lectina UEA-I, resultando en un
enlace completo 14 tumores (45,16%), en áreas en 9 casos (29,03%) y ausencia de enlace en
8 casos (25,81%).
- Marcaje con SBA:

Se estudió la mucosa transicional de 25 tumores mediante la lectina SBA, de modo
que 18 mostraron reactividad para dicha lectina (72,00%), estando ausente en 7 casos
(28,00%).
Se probó el enlace de lectina GSA-II en 25 casos. Estando presente el marcaje en 19
casos (76,00%) y siendo negativo en 6 (24,00%).
- Marcaje con PNA:
Se estudió la mucosa transicional de 18 tumores con la lectina PNA. Mostraron enlace
de lectina 8 casos (46,67%) y ausencia de enlace 10 casos (53,33%).
- Marcaje con UEA-I:
El estudio de la MT de 30 tumores mediante la lectina UEA-I, mostró reactividad en 9
casos (29,63%) y ausencia en 6 casos (70,37%).
118
La mucosa normal de las ratas tratadas con DMH a altas dosis mostró disminución de
la tinción de las mucinas ácidas y neutras, pero en especial de las mucinas PAS +,
presentando algunas glándulas ausencia total de la misma. Estas alteraciones eran más
evidentes en el ciego (Figura 4-4 B).
En este grupo se estudiaron mediante la tinción AB-PAS 17 tumores colorrectales, de

los cuales 5 fueron AB, 4 AB-PAS, 1 PAS/AB, y 6 no se tiñeron.
Se estudió en 20 casos la MT, mostrando alteración de la secuencia AB-PAS 14 casos

(70%) y un aspecto idéntico a la normal alejada del tumor en el resto. Las alteraciones
consistieron en ausencia de AB en 3 casos y de PAS en 11.
IV. 2. 6. Citometría de flujo
2. 6. 1. Citometría de flujo de la mucosa macroscópicamente normal
- Análisis del ADN: fase G0G1 del ciclo celular:

El porcentaje medio de células en fase G0G1 para el grupo DMH-normal es de 86,65
con una DS de 3,21. El valor mínimo es de 79,4 y el máximo de 92,3.
- Análisis del ADN: faseG2M del ciclo celular:
El porcentaje medio de células en fase G2M es de 5,91 con una DS de 1,95. El valor
mínimo es de 2,6 y el máximo de 11,2.
Variable Categorías GOGI G2M FASES IP

Sexo Macho 86,36 6,31 7,31 13,62
Hembra 86,93 5,51 7,54 13,06
C.A 89,10 5,20 5,70 10,90
C.T. 85,75 6,82 7,41 14,23
C.D. 96,98 5,53 7,47 13,01
Tabla 4-7
Valores medios de las fases del ciclo celular e IP según el sexo
y la localización.

El porcentaje medio de células en fase S es de 7,43 con una DS de 2,35. Con valor
mínimo de 3,4 y máximo de 12,9.
El índice de proliferación (IP) es la suma del porcentaje de células en fase S y en fase
119
G2
M. El valor medio es de 11,25 para el grupo DMH normal el valor medio es de 13,34, DS de
3,21. Mínimo de 7,7 y máximo de 20,6 (Figura 4-14 A)
2. 6. 2. Citometría de flujo de los tumores

El porcentaje medio de células en fase G0G1 para el grupo DMH-tumor es de 87,50
con una DS de 3,30, con mínimo de 82,0 y máximo de 93,1.
-Análisis del ADN: fase G2M del ciclo celular:
El porcentaje medio de células en fase G2M para el grupo DMH-tumor es de 4,84 con
una DS de 2,25, con máximo de 10,0 y mínimo de 1,2.
El porcentaje medio de células en fase S para el grupo DMH-tumor es de 7,65 con
una DS de 1,94, con máximo de 11,7 y mínimo de 3,5.
El valor medio del IP del grupo DMH-tumor es 12,49. Muestra una DS de 3,30. El
valor mínimo es de 6,9 y el máximo de 18,0.
- Aneuploidia; índice de ADN:
Ninguno de los casos estudiados presenta alteración en el contenido de ADN (índice
de ADN de 1,00). En el presente estudio todos los tumores de colon de rata son euploides por
citometría de flujo (Figura 4-14 B).
En la Tabla 4-8 se recogen las medias de las variables estudiadas por CMF de los
tumores colorrectales en relación a las variables clínicas y anatomopatológicas.
Variable Categorías GOG1 G2M FASE S IP
Sexo Macho 87,32 4,91 7,75 12,67
Hembra 87,72 4,75 7,52 12,27

C.A. 90,20 3,40 6,39 9,80
C.T. 86,06 5,35 8,58 13,93
C.D. 85,91 6,05 8,02 14,08
Macroscopía T. P. 90,65 3,45 5,90 9,35

T.S. 87,53 5,53 6,93 12,46
T.E. 87,66 4,91 7,42 12,33
T.U. 86,12 4,75 9,11 13,87
Tamaño 0,8 cm 87,91 4,76 7,32 12,08
0,8 cm 87,04 4,93 8,02 12,96
Tipo histológico Adenocarci. 88,24 4,37 7,37 11,75

Mucinoso 86,41 5,52 8,06 13,58
Diferenciación Moderado 88,31 4,34 7,34 11,68
120
Pobre 88,00 4,52 7,47 12,00
Dukes A 89,00 3,92 7,06 10,99

B 87,31 4,92 7,76 12,68
C 86,55 5,50 7,93 13,44
Placa si 87,95 3,78 8,25 12,04

no 87,32 5,25 7,14 12,67
Tumores
sincrónicos si 87,35 4,99 7,65 12,64
no 89,75 2,55 7,70 10,25
Tumores I. Delgado si 87,35 5,08 7,56 12,64

no 87,72 4,49 7,78 12,27
Metástasis si 86,62 5,32 8,05 13,37

no 88,38 4,36 7,25 11,61
Tabla 4-8
Medias de las fases de ciclo celular e IP según las variables
clínicas y anatopatológicas.
IV. 3. Grupo C
En el grupo C se observó la presencia de lesiones benignas sobre mucosa de aspecto

sano a partir de la sexta semana de tratamiento, el primer tumor maligno se detectó en la
semana 16 de inducción. En la Figura 4-15 se muestra el tiempo de inducción de las lesiones
microscópicas en el grupo C. En la semana 22 falleció un animal, revelando la necropsia un
tumor oclusivo en colon descendente. De los 59 animales supervivientes 31 desarrollaron
algún tipo de lesión benigna o maligna; mostrando lesiones sincrónicas múltiples 18 ratas.
IV. 3. 1. Características microscópicas de la mucosa normal de rata inyectada con dmh

en etapas preneoplásicas
A las 2 semanas de iniciado el tratamiento con DMH se observaron glándulas aisladas

o grupos de dos glándulas con disminución de moco intracelular, intensa basofilia, pérdida de
la polaridad normal y alineación celular, con ramificación de las criptas. Estos cambios eran
más evidentes en la zona apical, próxima a la superficie epitelial, y se les denominó lesiones
de predisplasia, o focos de criptas aberrantes. Estas alteraciones se mostraron de forma muy
aislada.
El ciego mostró disminución de la cantidad de moco, con aumento del índice
mitótico; hipercromatismo y aumento del tamaño nuclear, siendo la afectación bastante
general. El colon ascendente mostró disminución de la cantidad de moco, mientras que colon
transverso y colon descendente-recto presentaron una morfología conservada, excepto
aisladísimos focos de predisplasia.
En la 4 ª semana de inyección las lesiones fueron menos evidentes que en las
anteriores, excepto grupos de glándulas que presentaban focos de predisplasia asociados a
121
folículos linfoides (Figura 4-16). El ciego mostró una discreta pérdida de moco.
En la 6ª semana se observaron las primeras displasias leves a nivel del ciego; además
de las lesiones descritas en la 4ª semana.
En las semanas 8 y 10 las lesiones eran similares a las descritas previamente (4ª y 6ª
semanas). La pérdida de moco se hizo más constante en todos los segmentos, estando más
conservada la morfología en el colon descendente-recto.
En las semanas 12 a 20 se observaron displasias moderadas asociadas a placa linfoide.
A partir de la 20ª semana se apreciaron displasias moderadas no asociadas a placa,
además de las descritas previamente y cierta recuperación de las lesiones en algunas
muestras, con aspecto conservado. Es decir, en un mismo animal coexisten displasias y
mucosa normal.
Hasta la 30ª semana no se hizo evidente la hiperplasia de las glándulas con elongación
de las mismas.
3. 2. 1. Sexo
Las lesiones asentaban en 35 casos sobre ratas macho y en 30 sobre hembras. Las
lesiones malignas asentaban sobre ratas macho en 16 casos (61,54%) y en 10 sobre ratas
hembra (48,46%).

casos en el ciego (21,54%), 12 en el colon ascendente y (18,46%), 21 en colon transverso
(32,31%) y 18 en colon descendente (27,69%). Si consideramos exclusivamente las lesiones
malignas; éstas se situaban en 1 caso en el ciego (3,85%), en 5 en el colon ascendente
(19,23%), 9 en colon transverso (34,61%) y 11 en colon descendente (42,31%).
Los tumores malignos se dividieron por su aspecto macroscópico en 7 pólipos

polipoideos(26,92%), 6 pólipos sesiles (23,08%), 11 tumores exofíticos (42,31%) y 2
tumores ulcerados (7,69%). El primer tumor aparecido a las 16 semanas era del tipo pólipo
polipoideo, y todos los tumores ulcerados se observaron en la 30ª semana.
Las lesiones benignas observadas eran en 3 casos pólipos polipoideos (15,79%) y en
16 sesiles (84,21%). El resto de lesiones benignas aparecieron sobre mucosa de aspecto
normal o asociadas a placas linfoides.
El tamaño medio de las lesiones tumorales del grupo C es de 0,62 cm2, DS de 0,43. El
122
En el grupo C se observaron un total de 26 lesiones malignas, consistiendo en 12
adenocarcinomas, 9 carcinomas mucinosos y 5 carcinomas in situ, y 39 lesiones benignas,
divididas en 8 displasias leves, 24 moderadas y 7 severas.
Todos los adenocarcinomas de este grupo fueron moderadamente diferenciados.

(61,90%) y 3 en estadio C (14,29%).

Un total de 19 lesiones tumorales (29,23%) se asociaban a la presencia de tumores

sincrónicos de intestino delgado. Presentaron tumores en esta localización 8 ratas.
Presentaron metástasis 5 ratas (8,47%).

Se observó que 12 lesiones (18,46%) estaban asociadas a la presencia de metástasis.
En total 26 lesiones benignas y malignas (40,00%) se asociaban a la presencia de

placa linfoide en este grupo.
3. 4. 1. Marcaje de la mucosa macroscópicamente normal en etapas pre y neoplásicas
-Marcaje con SBA:

No se observaron cambios destacables en el patrón de enlace de la lectina SBA. A
nivel del ciego, en las semanas 8 a 18 se observó un discreto aumento del marcaje a nivel de
las vacuolas de moco de la zona basal que posteriormente se hizo negativo.
En el colon ascendente (Figura 4-17 A) y colon transverso no se apreciaron cambios
en el patrón de enlace.
A nivel del colon descendente-recto se observó un aumento de enlace de lectina en el
tercio basal entre las semanas 8 y 14, estando disminuido en las semanas posteriores a todos
los niveles, presentando grupos de glándulas ausencia completa.
Las glándulas predisplásicas mostraron ausencia de enlace con esta lectina. Las
123
glándulas displásicas situadas en la proximidad de una placa linfoide, exhibieron
exclusivamente reactividad supranuclear.
Ligeras alteraciones se apreciaron en algunas muestras de ciego tratadas con DMH.
Ocasionalmente, exhibieron reactividad de las vacuolas de moco a la GSA-II a partir de la
semana 16 y en otras muestras se observó un patrón de enlace disminuido.
El colon ascendente mostró desde etapas tempranas (4ª semana) ausencia de enlace en
los tercios medio y apical, con unión a la mucina de las células caliciformes basales,
generalmente como un fino punteado granular.
No se apreciaron alteraciones del patrón de unión en el colon transverso.
Escasas alteraciones en el patrón de unión se observaron en el colon descendente-
recto de ratas inyectas con DMH. En grupos de 2-3 glándulas se apreció además del marcaje
basal de las vacuolas de moco normal, reactividad a nivel de los tercios medio y apical en el
citoplasma de las células caliciformes a partir de la semana 16 (Figura 4-17 B)
Las glándulas predisplásicas mantienen la positividad pero pierden la distribución
regular. Las glándulas displásicas observadas en relación a placas linfoides mostraron enlace
a nivel supranuclear, perdiéndose la afinidad por las vacuolas de moco. Las glándulas
hiperplásicas, elongadas, mostraron una clara disminución en el enlace de GSA-II.
- Marcaje con PNA:
En la 2ª semana de iniciado el tratamiento el ciego mostró reactividad a nivel del
citoplasma de las células caliciformes (Figura 4-18 A). En el colon ascendente se observó
positividad supranuclear en el tercio basal exclusivamente. El colon transverso no mostró
alteración respecto a las ratas control. En el colon descendente no se objetivó unión a la
lectina.
En las semanas 8, 12, 14 y 18 se mantuvieron los patrones normales de enlace.
En la semana 20 se observó de nuevo positividad en las vacuolas de moco en el ciego y en la
semana 26 en otros segmentos.
Se observa un patrón distinto de enlace de la PNA en las glándulas displásicas
situadas en la proximidad de una placa linfoide en relación a la mucosa normal adyacente, en
algunos casos, con ausencia de reactividad siendo la mucosa normal positiva, y en otros, con
reactividad a nivel supranuclear en ausencia de enlace de la mucosa normal. Los focos de
criptas aberrantes muestran un marcaje más intenso que la respectiva mucosa adyacente
normal.
En la 2ª semana no se observaron cambios en la distribución del enlace de esta lectina
en el ciego, a partir de la 4ª semana la disposición se hizo más irregular, con disminución o
ausencia del marcaje a nivel de las vacuolas de moco en toda la longitud de la cripta, incluso
en las semanas 16 y 18 se pudo observar desaparición del enlace en los tercios medio y
apical. También se hizo evidente la ausencia o disminución de enlace en las células del
epitelio superficial.
A nivel de colon ascendente se observó reactividad de las vacuolas de moco de los
tercio medio y apical, en muestras aisladas a partir de la 4ª semana. En general no se apreció
afinidad de las células superficiales por la lectina.
El comportamiento irregular en los patrones de reactividad de la UEA-I en el colon
transverso hicieron difícil valorar los cambios preneoplásicos. Sin embargo, se observaron
alteraciones similares a las del colon ascendente.
Además de un punteado difuso en toda la longitud de la cripta en algunas muestras a partir de
la 6ª semana, más patente de la 18 a la 30 semanas.
124
En el colon descendente no se obtuvieron cambios del enlace de lectina en las
semanas 2 a 14. A partir de la semana 16 algunos animales mostraron reactividad a nivel de
las vacuolas de moco en toda la longitud de la cripta (Figura 4-18 B).
Las glándulas displásicas en relación a placas linfoides, mostraron enlace disminuido
en todos los segmentos. Mientras que los focos de criptas aberrantes mostraron enlace
aumentado.
- Marcaje con SBA:
Se estudiaron un total de 21 neoplasias colónicas con la lectina SBA en este grupo, en

12 casos se observaron enlaces de lectina en todo el tumor (57,15%), en 7 casos se limitaba a
algunas áreas (33,33%) y en 2 casos no se observaron (9,52%) (Figura 4-19 A).
marcaje en 4 casos (21,05%) (Figura 4-19).
- Marcaje con PNA:
Se estudió el marcaje con la lectina PNA en 21 tumores colorrectales, presentando 4
de ellos enlaces de lectina en todo el tumor (19,05%), áreas de marcaje en 8 casos (38,10%) y
ausencia de enlace en 9 tumores (42,85%) (Figura 4-20 A).
enlace completo en 10 tumores (45,45%), en 9 casos en áreas (40,91%) y ausencia de enlace
en 3 casos (13,64%) (Figura 4-20 B).
- Marcaje con SBA:

Se estudió la MT de 20 tumores mediante la lectina SBA, de modo que 18 mostraron
reactividad para dicha lectina (90,00%), estando ausente en 2 casos (10,00%).
Se observó la MT de las neoplasias colónicas en 17 casos con la lectina GSA-II,
siendo el marcaje positivo en 16 casos (94,12%) y negativo en 1 (5,88%).
- Marcaje con PNA:
Se estudió la MT de 20 tumores con la lectina PNA. Mostraron enlace de lectina 13
casos (65,00%) y ausencia en 7 casos.
Se observó reactividad en la MT en 15 casos (71,43%) y ausencia en 6 (28,57%).
IV. 3. 5. Variables histoquímicas con lectinas en microscopía electrónica
La reactividad de las lectinas en la mucosa macroscópicamente normal de ratas

inyectadas con DMH sigue unos patrones de enlace comunes a todas la lectinas del estudio.
Se ha observado enlace de lectina a nivel de la mucina que tapiza la superficie luminal de la
125
mucosa, así como en las áreas más denudadas a nivel de los acúmulos de moco en forma de
globo o en forma de hilo. También se ha observado unión de las lectinas al moco que emerge
de las criptas. Se han considerado tres categorías en el enlace de lectina: 1) ausente, 2) débil,
y 3) intenso (Figura 4-21 B, Figura 4-22 y Figura 4-23). La observación de algunas muestras
no resultó valorable debido a problemas en el procesado de las mismas, sobre todo por la
existencia de carga electrostática. Los resultados para cada una de las lectinas se expresan en
la tablas siguientes (Tablas 4-9, 4-10, 4-11 y 4-12). La presencia de oro coloidal se confirmó
mediante microanálisis (Figura 4-24)
Semana A D I A D I A D I A D I
2ª 1 3 3 1 1 2 2 1
4ª 2 1 2 3 1 1
6ª 1 1 3 2 1 1
8ª 1 3 1 3 2 1 1 3
10ª 4 1 3 4 2 1 1
12ª 1 3 3 1 4 1 2
14ª
l6ª
18ª 1 2 2 2 1 2 1
20ª 3 1 1 3 2 1 3
22ª 2 1 1 1 1 2
24ª 3 2 1 2 1 2 1
26ª 3 1 1 3 3
28ª 2 1 1 2 1 2 2 1
30ª 1 3 2 2 3 1 1 3
A. ausente
D: débil
I: intenso
Tabla 4-9
Enlace de la lectina Glycine max a la mucosa
macroscópicamente normal del colon de rata tratado con DMH,
según las distintas semanas de tratamiento.
2ª 2 2 3 1 3 1 3
4ª 2 1 2 1 3 2
126
6ª 1 1 1 2 2 1 2
8ª 2 1 2 1 3 1 3
10ª 4 2 2 2 2 1 3
12ª 2 1 3 3 2 1
14ª 2 1 1 1 1 1
16ª 2 2 2 1 1
18ª
20ª 2 1 1 1 2
22ª 2 2
24ª 2 3 3 2
26ª 2 2 1 3 3 1
28ª 1 2 3 2 1 1 2
30ª 3 2 2 3 1 4
A: ausente
D: débil
I: intenso
Tabla 4-10
Enlace de la lectina Griffonia simplicifolia-II a la mucosa
2ª 3 1 4 3 1 4
4ª 3 1 2 1 2 2
6ª 1 1 2 1
8ª 1 1 1
10ª 1 1 1 3 1
l2ª 1 1 1 1 1 2 2
l4ª
16ª
127
18ª 1 1
20ª 3 3 1 2 1 1 2
22ª 1 1 1 1 2
24ª 3 4 4 4
26ª 2 1 2 1 2 1 2
28ª 2 2 1 2 1 2
30ª 3 1 4 1 3 2 2
A: ausente
D: débil
I: intenso
Tabla 4-11
Enlace de la lectina Arachis hypogaea a la mucosa
2ª 2 1 1 2 1 1 2 2 3 1
4ª 2 2 1 2 1 2 2 1 2
6ª 2 2 2 3 1 2 1
8ª 1 1 2 2 2 2 1 3
10ª 1 2 1 1 1
12ª 1 2 2 1 1
14ª
128
16ª 1 1 1 1 1 1
18ª 3 1 1 2 1 4
20ª 2 2 1 1 1 3 1
22ª 1 1 1 1 1
24ª 2 2 1 2
26ª 2 1 2 1 4 2
28ª 3 3 1 1 2 1
30ª 1 3 1 1 2 3 1
A: ausente
D: débil
I: intenso
Tabla 4-12
Enlace de la lectina Ulex europaeus a la mucosa
3. 5. 2. Marcaje de las lesiones tumorales con lectinas en microscopía electrónica
- Marcaje con SBA:

Las neoplasias colónicas observadas por MES mostraron una reactividad para la SBA
del 77,8% (Figura 4-21 A).
Un 28,6% de los tumores colónicos expresaron localizaciones de enlace con GSA-II.
- Marcaje con PNA:
La reactividad de los tumores colorrectales para la PNA fue de 57,2%.
La reactividad de la UEA-I en muestras colorrectales observadas por MES fue del
60%.
3. 6. 1. Tinción de la mucosa macroscópicamente normal en etapas pre y neoplásicas
No se apreciaron cambios en la distribución de las mucinas en ninguno de los

segmentos durante las 6 primeras semanas. En la semana 8 se observó en el ciego
disminución de la tinción de las mucinas ácidas y neutras, pero en especial de las mucinas
PAS+, presentando algunas glándulas ausencia de tinción apical.
Desde la semana 20 era más patente esta alteración, con ausencia total de tinción
PAS+, glándulas sin tinción; y afectación ocasional de otros segmentos del intestino grueso.
Las glándulas displásicas relacionadas con placas linfoides presentaban una alteración
de la tinción normal, con ausencia de algunos de los componentes (AB/PAS, en el 33,33% y
PAS en el 22,22%) o ausencia total de tinción (44,44%).

En este grupo se estudiaron mediante la tinción AB-PAS 12 tumores colorrectales, de
129
los cuales 2 fueron AB, 3 AB-PAS, 1 PAS/AB, y 6 no se tiñeron.
La MT presentaba cambios en la distribución de la tinción en 7 casos (58, 33%) en los

5 casos restantes las características eran idénticas a la mucosa alejada del tumor.
Se observó ausencia de la tinción AB en 1 caso, ausencia de PAS en 3, cambio en la
disposición pero conservando los componentes en otro caso y ausencia total en 2.
Se analizó por citometría de flujo el colon de ratas con mucosa macroscópicamente

normal en las etapas más precoces de la carcinogénesis (entre las 2 y la 8 semanas de
inyección).
El porcentaje medio de células en fase G0G1 del grupo preneoplásico es de 89,96 con
DS de 1,81. El valor mínimo es de 87,5 y el máximo de 93,6.
- Análisis del ADN: fase G2M del ciclo celular:
El porcentaje medio de células en fase G2M es de 3,95 con DS de 0,85. El valor
mínimo es de 1,7 y el máximo de 4,8.
El porcentaje medio de células en fase S es de 6,07 con DS de 1,14 y mínimo de 4,5 y
máximo de 8,0.
El valor medio del IP del grupo preneoplásico es 10,03, DS de 1,81. El valor mínimo
es de 6,4 y el máximo de 12,5 (Figura 4-25).
En la Tabla 4-13 se recogen los valores medios de las fases del ciclo celulae según el
sexo y la localización.
Variable Categorías GOGI G2M FASE S IP
Sexo Macho 90,10 4,27 5,62 9,90
Hembra 89,90 3,80 6,30 10,10
C.A. 91,10 3,60 5,30 8,90
C.T. 89,50 4,17 6,32 10,50
C.D. 90,20 3,67 6,12 9,80
Tabla 4-13
Medias de las fases del ciclo celular e IP según el sexo y la
localización.
IV. 4. Grupo D
En el grupo D, formado por 20 animales, 11 presentaron lesiones tumorales colónicas
(55%), tumor extracolónico en 3 ocasiones (30%) y ausencia de tumor en 6 casos (15%)
(Figura 4-26). De los animales que presentaron tumor, sólo 2 mostraron tumores sincrónicos
en el colon, el resto fueron tumores únicos.
130
IV. 4. 1. Características microscópicas
4. 1. 1. Características de la mucosa normal de rata inyectada con DMH, microscopía óptica
La mucosa normal de las ratas de este grupo mostró una arquitectura más conservada
respecto al grupo tratado con 21 mg/kg/semana; sin embargo, se hicieron patentes
alteraciones como pérdida de moco, hipercromatismo y pseudoestratificación.
4. 1. 2. Características de la mucosa normal de rata inyectada con DMH, microscopía

electrónica de scanning (MES)
El epitelio colónico de ratas tratadas con DMH a dosis de 10 mg/Kg/semana se

mostró mejor conservado que el de las ratas que recibieron altas dosis de carcinógeno.
Exhibió un mayor recubrimiento de material mucinoso. Las criptas presentaron un tamaño
regular y las células absortivas estaban denudadas con menor frecuencia, aunque a grandes
aumentos las microvellosidades mostraron alteración similar a la observada a altas dosis,
siendo más cortas y bifurcadas.
4. 1. 3. Descripción de las lesiones neoplásicas (MES)
Las lesiones neoplásicas presentaban idéntica estructura y morfología a las inducidas

con alta dosis de carcinógeno.
4. 2. 1. Sexo
Se observó la presencia de lesiones malignas colorrectales en 4 ratas macho y en 6

hembras.

casos en el ciego (28,57%), 8 en el colon ascendente y (57,14%), 2 en colon transverso
(14,29%) y en ningún caso se situaron en colon descendente. Si consideramos
exclusivamente las lesiones malignas, éstas se situaban en 2 casos en el ciego (20,00%), en 6
en el colon ascendente (60,00%) y 2 en colon transverso (20,00%).
Las lesiones benignas tuvieron aspecto de pólipo polipoideo en 1 caso (25%) y en los
otros 3 de pólipo sesil (75%). Las lesiones malignas eran en 3 casos tumores sesiles (30%),
en 5 casos un tumor exofítico (50%) y en los dos restantes un tumor ulcerado (20%)
El tamaño medio de las neoplasias del grupo D es de 0,97 cm2. La DS es de 0,59. El
131
En el grupo D se observaron 10 lesiones malignas: 3 adenocarcinomas y 7 carcinomas

mucinosos y 4 lesiones benignas en forma de displasia moderada.
Los 3 adenocarcinomas observados en este grupo se clasificaron según su grado de

diferenciación en 1 moderadamente diferenciado (33,33%) y 2 poco diferenciados (66,66%).

(20,00%) y 3 en estadio C (30,00%).

Un total de 2 lesiones tumorales (14,28%) se acompañaban de tumores sincrónicos de

intestino delgado. Presentaron tumores en esta localización 5 ratas.
Presentaron metástasis 4 ratas (36,36%) de las 11 que presentaron lesiones tumorales.
En conjunto 5 lesiones benignas y malignas (35,71%) se asociaban a la presencia de

placa linfoide en este grupo.
- Marcaje con SBA:

Se observó la mucosa macroscópicamente normal en 8 casos, mostrando todos ellos
(100%) reactividad para la SBA.
Se estudió la mucosa normal alejada del tumor en 3 casos, presentando todos ellos
(100%) enlace con la lectina GSA-II.
132
- Marcaje con PNA:
Se pudo estudiar la mucosa macroscópicamente normal en 3 casos, de forma que se
observó reactividad para esta lectina en 2 muestras (66,67%).
En este grupo se observó la mucosa normal en 5 casos con la lectina UEA-I. Se
apreció enlace en 3 casos (60,00%) y en 2 ausencia (30,00%).
- Marcaje con SBA:

Se estudiaron un total de 9 neoplasias colónicas con la lectina SBA en este grupo. En
5 casos se observaron enlaces de lectina en todo el tumor (55,56%), que en 3 casos se
limitaba a algunas áreas (33,33%) y en 7 casos no fue observado (11,11%).
Se estudió el marcaje con la lectina GSA-II en 7 neoplasias colorrectales, presentaron
enlaces de lectina en todo el tumor 1 (14,19%), áreas de marcaje 4 casos (57,14%) y ausencia
de enlace 2 tumores (28,57%).
- Marcaje con PNA:
En este grupo se estudiaron un total de 4 neoplasias colónicas con la lectina PNA. En
3 casos se observaron enlaces de lectina en todo el tumor (75,00%), en 1 caso se limitaba a
áreas de enlace (25,00%) y no se observó en ningún caso ausencia de reactividad.
Se estudió la mucosa tumoral de 7 lesiones con la lectina UEA-I, mostrando enlace de
lectina en todo el tumor 4 casos (57,14%) y en áreas el resto (42,86%).
- Marcaje con SBA:

Se pudo estudiar la mucosa transicional de 8 tumores mediante la lectina SBA, de
modo que los 8 mostraron reactividad para dicha lectina (100%).
Se estudió la mucosa transicional en 5 casos, presentando enlace de lectina 3
(60,00%), y ausencia 2.
- Marcaje con PNA:
Se pudo estudiar la mucosa transicional de 3 tumores, de forma que sólo mostró
reactividad para esta lectina 1 muestra (33,33%).
En este grupo se observó la mucosa transicional de 5 tumores con la lectina UEA-I.
En 2 casos se observaron enlace (40,00%) y en 3 ausencia.
En general se observó disminución de la intensidad de tinción de la secuencia AB-

PAS, siendo más evidente en el ciego como en las ratas que recibieron altas dosis de
carcinógeno.
Manteniéndose la positividad para la tinción AB (Figura 4-27 A), siendo más evidente
la disminución de las mucinas neutras.
133
En este grupo se estudiaron mediante la tinción AB-PAS, 7 tumores colorrectales, de

los cuales 3 fueron AB-PAS, 3 PAS/AB, y 1 no presentó tinción.
En la MT de los tumores del grupo C se apreció alteración de la tinción en 3 casos

(60%), consistente en todos ellos en disminución de la tinción AB.
IV. 5. Grupo E
Las ratas del grupo E a las que se administró EDTA no presentaron ninguna lesión
tumoral y el aspecto macroscópico fue considerado normal.
IV. 5. 1. Aspecto microscópico
La morfología microscópica (MO y MES) de las ratas tratadas con EDTA no difiere
de la observada en el grupo control sin tratamiento.
IV. 5. 2. Variables histoquímicas con lectinas
La histoquímica de lectinas reveló pequeñas variaciones entre el grupo control no

tratado y el grupo EDTA. Sin embargo no se apreció aparición de enlace en las localizaciones
que habitualmente carecen de él con ninguna de las lectinas.
- Marcaje con SBA:
En general no se observaron cambios en la reactividad de esta lectina en ratas tratadas
con EDTA, aunque la disposición fue algo más heterogénea y se acompañaba de un punteado
difuso inespecífico. En el ciego y en el colon descendente se observó disminución del enlace
de SBA a nivel basal en 3 casos.
No se apreciaron cambios evidentes con respecto al enlace de esta lectina.
- Marcaje con PNA:
El enlace de PNA estaba ausente en las muestras de intestino grueso observadas.
Se observaron alteraciones en el patrón de unión de la lectina UEA-I, consistentes en
alteración a nivel de ciego y colon ascendente, con ausencia o positividad de algunas
vacuolas de moco de forma aislada.
En general se observó en las muestras de colon de ratas inyectadas con EDTA una
disminución de la cantidad de tinción AB-PAS, que traducía una disminución global de
moco. Esta alteración era más evidente en el ciego (Figura 4-27 B).
En el ciego de las ratas inyectadas con EDTA la distribución de la tinción era idéntica
a la de las ratas normales del grupo A, aunque a nivel apical la mayoría de las glándulas
mostraban ausencia de tinción. A nivel de colon ascendente encontrábamos en toda la
134
longitud AB/AB-PAS/PAS en menor cantidad, igual que en las ratas no inyectadas, aunque
en 1 de los animales sólo se obtuvo tinción AB en toda la longitud. En el colon transverso la
tinción era cambiante adoptando la forma de colon ascendente o de colon descendente. Y por
último el colon descendente, en general, conservaba la tinción descrita para la mucosa normal
(a nivel basal y 1/3 medio tinción AB y en el tercio apical AB-PAS).

El porcentaje medio de células en fase G0G1 para el grupo de ratas tratado con EDTA
es de 89,61 con DS de 2,45. El valor mínimo es de 85,5 y el máximo de 94,8.
- Análisis del ADN: fase G2M del ciclo celular:
El porcentaje medio de células en fase G2M para el grupo de ratas tratado con EDTA
presenta un porcentaje medio de 4,72 con DS de 2,00. El valor mínimo es de 2,1 y el máximo
de 8,8.
El porcentaje medio de células en fase S para el grupo de ratas tratado con EDTA
presenta un porcentaje medio de 5,66 con DS de 2,19. El valor mínimo es de 3,1 y el máximo
de 10,8.
El valor medio del IP del grupo EDTA es de 10,38, con un DS de 2,45. Valor mínimo
de 5,2 y máximo de 14,5.
En la Tabla 4-14 se muestran los valores medios de las fases del ciclo celular según el
sexo y la localización.
Variable Categorías GOGI G2M FASE S IP
Sexo Macho 89,22 6,17 4,60 10,77
Hembra 89,73 4,27 5,99 10,26
C.A. 87,60 7,75 4,65 12,40
C.T. 89,41 3,88 6,70 10,58
C.D. 90,75 4,63 4,61 9,25
Tabla 4-14
Medias de las fases del ciclo celular e IP según el sexo y la
localización.
IV. 6. Descripción de las lesiones tumorales
En los tres grupos inyectados con DMH se observaron lesiones tumorales

macroscópicas, que luego se comprobaron por microscopía óptica y otras lesiones que
aparecieron sobre mucosa aparentemente normal. Los datos a los que nos referiremos
posteriormente recogen las lesiones estudiadas anatomopatológicamente, que fueron un total
de 150 lesiones tumorales (benignas y malignas).
135
6. 1. 1. Sexo
De las 73 ratas de los grupos B, C y D que presentaron lesiones tumorales 35 son

machos (47,9%) y 38 hembras (52,1%). Cuando se consideraba exclusivamente las lesiones
malignas 29 eran machos (53,7%) y 25 hembras (46,3%).
6. 1. 2. Localización del tumor
De las 150 lesiones tumorales consideradas en conjunto, 25 se localizaron a nivel de

ciego, 47 en colon ascendente, 41 en colon transverso y 37 en colon descendente. Cuando se
consideraban las lesiones malignas exclusivamente (adenocarcinomas, carcinomas mucinosos
y carcinomas in situ), 8 se localizaban en ciego, 36 en colon ascendente, 26 en colon
transverso y 23 en colon descendente (Figura 4-28).
Los tumores malignos se dividieron por su aspecto macroscópico en 20 tumores

polipoideos (21,51%), 17 tumores sesiles (18,28%), 42 tumores exofíticos (45,16%) y 14
tumores ulcerados (15,05%).
El tamaño medio de las lesiones tumorales malignas, medidas en cm2 es de 0,82 con
una DS de 0,66. El valor mínimo es de 0,2 y el máximo de 3,0.
Como ya hemos citado se observaron un total de 150 lesiones tumorales localizadas

en el colon. De estas 46 fueron adenocarcinomas, 37 carcinomas mucinosos, 10 carcinomas
in situ, 1 adenoma túbulo-velloso, 9 displasias leves, 36 displasias moderadas y 11 displasias
severas (Figura 4-29).
Cuando las lesiones presentaron heterogeneidad morfológica con diversos grados de

diferenciación en el mismo tumor, se estableció el mismo según el patrón predominante.
Los adenocarcinomas se dividieron según su grado de diferenciación en
moderadamente diferenciados (37 casos, 80,43%) y poco diferenciados (9 casos, 19,57%), en
ninguno de los grupos se observaron adenocarcinomas bien diferenciados.
6. 2. 3. Grado de invasión de la pared (Estadio de Dukes)
Se han considerado exclusivamente los adenocarcinomas y carcinomas mucinosos,

excluyendo las lesiones tumorales que en su propia definición excluyen su invasión a capas
profundas del colon.
136
Los tumores fueron Dukes A en 28 casos, Dukes B en 30 casos y Dukes C en 25
casos (Figura 4-30).
En todos los grupos inyectados con DMH y considerando tanto lesiones benignas
como malignas, un total de 42 ratas (23,46%) presentaron tumores sincrónicos colorrectales.
6. 2. 5. Presencia de tumores sincrónicos en intestino delgado
Presentaron tumores sincrónicos en intestino delgado 22 ratas (12,29%) del total de

animales inyectados.
De las 179 ratas supervivientes inyectadas con DMH un total de 20 ratas (11,17%)
presentaron metástasis locales y a distancia. En la mayoría de los casos se situaban en los
ganglios regionales, epiplon, cápsula de Glisson hepática y diafragma, por este orden.
6. 2. 7. Tumores colorrectales que asientan sobre placas linfoides
En este caso se consideró si las lesiones tumorales tanto benignas como malignas
asentaban sobre placas linfoides o no, valorando la posibilidad de que estas fueran
precursoras de las mismas. Un total de 37 lesiones asentaron sobre placas linfoides o estaban
en relación a ellas, en 8 casos eran lesiones malignas y el resto (29), eran lesiones benignas.
6. 3. 1. Marcaje de la mucosa normal
- Marcaje con SBA:

Se estudió la mucosa normal de idéntica localización al tumor en 46 casos mediante la
lectina SBA, de modo que 38 mostraron reactividad para dicha lectina (82,61%), estando
ausente en 8 casos (17,39%) (Figura 4-31).
Se estudiaron un total de 39 muestras normales con la lectina GSA-II. Estando
presente el marcaje en 36 casos (92,31%) y siendo negativo en 3 (7,69%) (Figura 4-32).
- Marcaje con PNA:
Se estudió la mucosa normal en 38 casos con la lectina PNA. Mostraron enlace de
lectina 19 casos (50,00%) y ausencia de enlace otros 19 casos (50,00%) (Figura 4-33).
Se estudió la mucosa de muestras normales mediante la lectina UEA-I en 54 casos, de
modo que 32 mostraron reactividad para dicha lectina (59,26%)
y estando ausente en 22 casos (40, 73%) (Figura 4-34).
Se han obtenido 2 principales patrones de reactividad con las distintas lectinas en los
137
tumores colónicos de rata: a) marcaje de la mucina intraglandular y, b) marcaje de la
superficie luminal del epitelio. Ocasionalmente, también se ha observado reactividad en las
vacuolas de mucina presentes en algunas áreas de los tumores y un fino marcaje granular
intracitoplasmático en la zona supranuclear.
- Marcaje con SBA:
Se estudiaron un total de 60 neoplasias colónicas con la lectina SBA. En 29 casos se
observaron enlaces de lectina en todo el tumor (48,33%), en 21 casos se limitaba a algunas
áreas (35,00%), no observándose en 10 casos (16,67%) (Figura 4-31).
marcaje en 12 casos (21,82%) (Figura 4-32).
- Marcaje con PNA:
Se estudió el marcaje con la lectina PNA en 43 tumores colorrectales, presentando 19
de ellos enlaces de lectina en todo el tumor (44,19%), áreas de marcaje en 13 casos (30,23%)
y ausencia de enlace en 11 tumores (25,58%) (Figura 4-33).
enlace completo 28 tumores (46,67%), en áreas en 21 casos (35,00%) y ausencia de enlace en
11 casos (18,33%) (Figura 4-34).
- Marcaje con SBA:

Se estudió la MT de 43 tumores mediante la lectina SBA, de modo que 36 mostraron
reactividad para dicha lectina (83,72%), estando ausente en 7 casos (16,27% (figura 4-31).
Se estudiaron 47 casos de MT con la lectina GSA-II, estando el marcaje presente en
38 casos (80,85%) y negativo en 9 (19,15%) (figura 4-32)
-Marcaje con PNA:
Se estudió la MT de 34 tumores con la lectina PNA. Mostraron enlace de lectina 19
casos (55,88%) y ausencia de enlace 15 casos (44,12%) (figura 4-33).
Se pudo estudiar la MT de 46 tumores mediante la lectina UEA-I, de modo que 21
mostraron reactividad para dicha lectina (45,65%) y estando ausente en 25 casos (54,35%)
(figura 4-34).
IV. 6. 4. Variables histoquímicas con lectinas en microscopía electrónica
Se estudió la mucosa normal de las ratas exclusivamente en el grupo C, los resultados

se describen previamente en el apartado 3. 5. 1.
6. 4. 2. Marcaje de las lesiones tumorales con lectinas en microscopía electrónica
Exclusivamente se marcaron con lectinas para MES los tumores del grupo C, los
resultados se han recogido previamente en el apartado 3. 5. 2.
138
IV. 6. 5. Tinción de la mucosa tumoral con técnicas histoquímicas convencionales
(tinción de AB-PAS)
Se estudiaron mediante la tinción AB-PAS 43 tumores colorrectales, de los cuales 8

fueron AB, 2 PAS, 11 AB-PAS, 5 PAS/AB, y 17 no se tiñeron.
Se estudiaron por citometría de flujo todos los tumores obtenidos por inyección con
DMH, sólo se consideraron adecuados para el estudio 32 histogramas tumorales, según los
criterios expuestos en material y método (apartado III. 6. 2. 5.).
Se realizaron pruebas estadísticas de independencia de m2 para comprobar que los
tumores aptos para el estudio por citometría de flujo eran representativos. No se observaron
diferencias significativas con respecto a ninguna variable del estudio.
Se decidió no considerar el canal medio de los picos correspondientes a las distintas
fases del ciclo celular de los histogramas por su alto coeficiente de variación entre los grupos
de estudio, no considerándose sin embargo, este error debido a mala técnica, puesto que éste
se mantenía en los diversos animales de un mismo grupo.
Las medias de las fases del ciclo celular e índice de proliferación de los tumores de
intestino grueso han sido expuestas previamente en el apartado 2. 5. 2. de este capítulo.
IV. B. Estudio estadístico
IV. B. 1. Variables tumorales
IV. 1. 1. Comparación de las variables clínicas y el resto de variables
Con la prueba de m2 se ha estudiado la relación de las variables clínicas entre sí: sexo,
localización, aspecto macroscópico y tamaño tumoral, y entre éstas y las variables
anatomopatológicas: tipo histológico, diferenciación, Dukes, asociación a placa, presencia de
tumores sincrónicos de intestino grueso y delgado y metástasis, así como entre las variables
histoquímicas con lectinas. Mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis se han
comparado estos parámetros y las medias de las variables que recogen las fases del ciclo
celular y el índice de proliferación.
1. 1. 1. Sexo
Se ha estudiado la asociación entre el sexo de los animales y el resto de variables de

estudio (Tabla 4-15).
SEXO
Variable Categorías Macho Hembra Significación (p)
Localización Ciego 12 13 0,08419
C. Ascendente 21 26 m2 = 6,64314
C. Transverso 19 22
C. Descendente 26 11
139
Macroscopía T.P. 10 10 0,42495
T.S. 7 10 m2 = 2,79119
T.E. 26 16
T.U. 9 5
Tamaño @ 0.8 49 42 0,79764
> 0.8 19 18 m2 = 0,06575
Tipo histológico Tumor 52 41 0,22035
Lesión benigna 26 31 m2 = 1,50208
Diferenciación Moderado 26 11 0,44531
Pobre 5 4 m2 = 0,71327
Dukes A 16 12 0,51946
B 19 11 m2 = 1,30994
C 12 13
Placa si 16 21 0,21931
no 62 51 m2 = 1,50889
Tumores sincrónicos si 64 49 0,04696
no 14 23 m2 = 3,94665
Tumores I. Delgado si 45 17 0,0002
no 33 55 m2 = 17,93386
Metástasis si 32 22 0,18198
no 46 50 m2 = 1,78137
SBA Todo 15 14 0,318466
Áreas 15 6 m2 = 2,28853
No 5 5
GSA-II Todo 7 9 0,06337
Áreas 20 7 m2 = 5,51761
No 5 7
PNA Todo 10 9 0,55270
Áreas 8 5 m2 = 1,18590
No 8 3
UEA-I Todo 15 13 0,81978
Áreas 12 9 m2 = 0,39744
No 5 6
% células G0G1 m=15,81 m=17,39 0,6348
140
% Células G2M m=17,17 m=15,64 0,6484
% Células S m=16,92 m=15,96 0,7757
I. Proliferación m=17,19 m=16,94 0,6348
Tabla 4-15
Comparación entre el sexo y las otras variables.
1. 1. 1. 1. Comparación entre el sexo y el resto de variables clínicas:

* Comparación entre el sexo y la localización de las lesiones colónicas: Dentro de las
lesiones que asientan en el ciego, un 48% correspondían a machos y un 52% a hembras. De
los que asientan en colon ascendente, 44,68% eran machos y 55,32% hembras. De los de
colon transverso, 46,34% machos y 53,66% hembras y los de colon descendente 70,27%
machos y 27,73% hembras. No hay diferencia significativa (p=0,0841) entre el porcentaje de
machos y hembras y las 4 localizaciones colónicas.
* Comparación entre el sexo y el aspecto macroscópico: El aspecto macroscópico de
las lesiones no guarda relación con el sexo de los animales (p=0,42495).
* Comparación entre el sexo y el tamaño tumoral: El porcentaje de machos con
tumores pequeños (72,06%) y grandes (27,94%) no difiere significativamente (p=0,79764)
del de hembras con pequeños (70%) o grandes tumores (30%).
1. 1. 1. 2. Comparación entre el sexo y las variables anatomopatológicas:

Dentro de las lesiones neoplásicas, un 55,91% se daban en ratas macho y un 44,09%
en hembras, y dentro de las lesiones benignas un 45,61% en ratas macho y un 54,39% en
hembras. La distribución de sexos no es significativamente diferente entre los tipos
histológicos de las lesiones colorrectales (p=0,22035).
Tampoco se encuentra diferencia significativamente estadística (p=0,44531) entre el
porcentaje de machos (70,27%) y hembras (29,73%) con adenocarcinomas moderadamente
diferenciados, y machos (55,56%) y hembras (44,44%) con adenocarcinomas pobremente
diferenciados.
No hay diferencia significativa (p=0,34606) entre el porcentaje de machos y hembras
en estadio de Dukes A (57,14% vs 42,85%), estadio B (63,33% vs 36,67%) y C (43,48% vs
56,52%).
Tampoco se ha encontrado relación entre la asociación o no a placa linfoide y el sexo
de las ratas (p=0,21931).
Se observaron lesiones metastásicas en el 83,87% de los tumores en ratas machos y en
el 73,33% de los tumores en ratas hembras. La distribución de sexos no es significativamente
diferente entre la asociación de las lesiones colorrectales a metástasis (p=0,39836).
Las ratas macho presentan otros tumores sincrónicos colorrectales en mayor
proporción (82,05%) que la ratas hembras (68,05%), mostrando una diferencia significativa
(p=0,04696). El porcentaje de tumores sincrónicos de intestino delgado es superior en las
ratas macho que en las hembras (p=0,00002).
1. 1. 1. 3. Comparación entre el sexo y las variables histoquímicas:

La distribución de sexos no es significativamente diferente para la reactividad a las
distintas lectinas, tal como se muestra en la Tabla 4-10.
1. 1. 1. 4. Comparación entre el sexo y el resultado por citometría de flujo:

141
Los estudios de comparación de medias entre ratas macho y hembra en cuanto al
porcentaje de células en fase G0G1 (p=0,6348), fase G2M (p=0,6484), fase S (p=0,7757) e
índice de proliferación (p=0,6348) no muestran diferencias significativas.
LOCALIZACIÓN
Variable Categorías Ciego CA C:T: C. D. Significación(p)
Macroscopía T. P. 1 12 3 4 0,41797
T.S. 1 6 6 4 m2 = 9,21170
T.E. 4 11 14 13
T.U. 4 4 13 2
Tamaño @ 0.8 13 31 23 24 0,99542
> 0.8 5 12 10 10 m2 = 0,06760
Tipo histológico Tumor 8 36 26 23 0,00314
L. benigna 17 11 15 14 m2 = 13,83519
Adenocarci. 1 18 9 18 0,00191
Mucinoso 7 12 14 4 m2 = 14,89528
Diferenciación Moderado 15 6 16
Pobre 1 3 3 2
Dukes A 1 12 7 8 0,22093
B 2 9 8 11 m2 = 8,24169
C 5 9 8 3
Placa si 7 11 8 11 0,73236
no 18 36 33 26 m2 = 1,28643
Tumores si 21 30 30 32 0,07391
sincrónicos
no 4 17 11 5 m2 = 6,93762
Tumores I. Delgado si 8 17 14 23 0,03054
no 17 30 27 14 m2 = 8,90785
Metástasis * si 6 11 13 10 0,20320
no 2 19 10 12 m2 = 4,60404
SBA Todo 2 10 10 7
Áreas 7 3 6 5
No 6 1 3
GSA-II Todo 1 6 4 5 0,22028
142
Áreas 2 5 10 10 m2 = 8,25222
No 4 3 2 3
PNA Todo 2 6 8 3
Áreas 4 3 6
No 2 3 3 3
UEA-I Todo 4 8 13 3 0,14777
Áreas 3 5 5 8 m2 = 9,49144
No 1 6 2 2
% células G0G 1 m=8,25 m=24,33 m=12,09 m=12,36 0,0033
% células G2M m=23,50 m=10,5 m=18,23 m=21,93 0,0349
% células S m=22,00 m=10,83 m=20,05 m=17,07 0,0667
I. Proliferación m=24,75 m=8,67 m=20,91 m=20,64 0,0033

* exclusivamente para adenocarcinomas y carcinomas mucinosos.
Tabla 4-16
Comparación entre la localización y el resto de variables.
1. 1. 2. 1. Comparación entre la localización y el resto de variables clínicas:

* Comparación entre la localización y la macroscopía tumoral: La localización
tumoral no se relaciona con el aspecto macroscópico tumoral (p=0,41797).
* Comparación entre la localización y el tamaño tumoral: No se ha encontrado
relación entre la localización tumoral y el tamaño de dichos tumores (p=0,99542).
1. 1. 2. 2. Comparación entre la localización y las variables anatomopatológicas:

Las lesiones neoplásicas se localizaron en el ciego en un 8,60%, en el colon
ascendente en 38,71%, en el colon transverso en un 27,96% y en el colon descendente en un
24,73%, mientras que las lesiones benignas se localizaban en el ciego en un 29,82%, en el
colon ascendente en un 19,30%, en el colon transverso en el 26,32% y en el colon
descendente en el 24,56%. Se observó una diferencia significativa entre la localización y los
tipos histológicos benignos y malignos (p=0,00314).
La localización tumoral no se relaciona con la clasificación de Dukes (p=0,22093).
Tampoco se ha encontrado relación entre la asociación o no a placa linfoide y la
localización tumoral (p=0,73236).
observa una relación entre la localización y la aparición de metástasis (p=0,20320).
1. 1. 2. 3. Comparación entre la localización y las variables histoquímicas:

Todos los tumores situados en el ciego presentaron reactividad para la lectina SBA.
En el colon ascendente un 52,63% mostraron reactividad en todo el tumor, 15,79% sólo en
áreas y 31,58% ausencia. En el colon transverso 58,82% en todo el tumor, 35,30% sólo en
áreas y 5,88% ausencia y en el colon descendente 46,67% en todo el tumor, 33,33% sólo en
áreas y 20% ausencia.
No se observaron diferencias significativas entre las localizaciones tumorales y la
reactividad para la lectina GSA-II (p=0,22028) ni para la lectina UEA-I (p=0,14777).
En el ciego mostraron marcaje de PNA 2 tumores (50,00%) y ausencia otros 2, en el
143
colon ascendente 10 tuvieron marcaje (76,92%) y 3 ausencia (23,08%), en el colon transverso
11 presentaron marcaje (78,57%) y 3 ausencia (21,43%), y a nivel del colon descendente 9
mostraron marcaje (75%) y 3 ausencia (25,00%), no mostrando diferencias significativas
(p=0,69977).
1. 1. 2. 4. Comparación entre el resultado por citometría de flujo y la localización del tumor:

Los tumores estudiados se localizaban 2 en ciego (6,25%), 12 en colon ascendente
(37,50%), 11 en colon transverso (34,38%) y 7 en colon descendente (21,87%). Los estudios
de comparación de medias entre las cuatro localizaciones colónicas y el porcentaje de células
en fase G0G1(p=0,0033), porcentaje de fase G2M (p=0,0349) e índice de proliferación
(p=0,0033) muestran diferencias significativas. El porcentaje de células en fase S no muestra
diferencias significativas (p=0,0667).
MACROSCOPIA
Variable Categorías T.P. T.S. T.E. T.U. Significación (p)
Tamaño @ 0.8 16 15 24 4 0,00188
> 0.8 4 2 18 10 m2 = 14,92806
Diferenciación Moderado 7 8 18 4 0,95533
Pobre 1 2 5 1 m2 = 0,32462
Dukes A 4 7 13 4 0,63384
B 5 6 16 3 m2 = 4,31715
C 3 3 12 7
Placa si 2 3 3
no 18 14 39 14
Tumores sincrónicos si 15 11 32 10 0,87012
no 5 6 10 4 m2 = 0,87012
Tumores I. Delgado si 10 8 22 7 0,98617
no 10 9 20 7 m2 = 0,14333
Metástasis si 5 8 21 6 0,91098
no 7 8 20 8 m2 = 0,53570
SBA Todo 6 6 10 3 0,66752
Áreas 2 2 8 5 m2 = 4,06765
No 2 2 2 2
GSA-II Todo 4 2 6 4 0,50663
Áreas 2 5 15 4 m2 = 5,29455
No 2 2 2 1
PNA Todo 4 2 8 3
144
Áreas 1 5 6 1
No 3 5
UEA-I Todo 5 5 10 7
Áreas 4 4 8 3
No 2 2 3
% células G0G 1 m=24,50 m=16,00 m=17,15 m=12,57 0,4255
% células G2M M=10,00 rn=10,5 m=18,17 m=16,83 0,7811
% células S m=8,00 m=13,17 m=15,65 m=22,79 0,1491
I. Proliferación m=8,50 m=17,00 m=15,85 m=20,43 0,4255
Tabla 4-17
Comparación entre el aspecto macroscópico tumoral y el resto
de variables.
1. 1. 3. 1. Comparación entre el aspecto macroscópico y el tamaño tumoral:

Los tumores ulcerados son en su mayoría de gran tamaño, y los tumores sesiles y
pedunculados de pequeño, siendo estas diferencias significativas (p=0,00188).
1. 1. 3. 2. Comparación entre el aspecto macroscópico y las variables anatomo-patológicas:

No se observa relación significativamente estadística entre el aspecto macroscópico y
las variables anatomo-patológicas estudiadas.
1. 1. 3. 3. Comparación entre el aspecto macroscópico y las variables histoquímicas:

La reactividad de las lectinas estudiadas no muestra diferencias según el tipo
macroscópico.
1. 1. 3. 4. Comparación entre el aspecto macroscópico y el resultado por citometría de flujo:

Los valores de las distintas fases del ciclo celular no se asocian al tipo macroscópico
tumoral.
145
TAMAÑO TUMORAL
Variable Categorías @ 0,8 > 0,8 Significación (p)
Tipo histológico Tumor 59 34 0,00185
Lesión benigna 32 3 m2 = 9,69288
Diferenciación Moderado 27 10 0,69754
Pobre 6 3 m2 = 0,14200
Dukes A 20 8 0,00256
B 22 8 m2 = 11,93294
C 8 17
Placa si 25 5 0,09101
no 66 32 m2 = 2,85638
no 22 10 m2 = 0,11405
no 43 23 m2 = 2,34120
no 58 17 m2 = 3,43149
SBA Todo 19 10 0,53750
Áreas 11 10 m2 = 1,24166
No 7 3
GSA-II Todo 9 7 0,90194
Áreas 17 10 m2 = 0,20640
146
No 7 5
PNA Todo 11 8 0,88892
Áreas 7 6 m2 = 0,23550
No 7 4
UEA-I Todo 17 11 0,26363
Áreas 11 10 m2 = 2,66638
No 9 2
% células G0GI m=18,06 m=14,73 0,3169
% Células G2M m=15,41 m=17,73 0,4846
% Células S m=15,56 m=17,57 0,5456
Tabla 4-18
Comparación entre el tamaño tumoral y las otras variables.
1. 1. 4. 1. Comparación entre el tamaño tumoral y las variables anatomopatológicas:

Las lesiones benignas tenían un menor tamaño que las malignas, siendo estas
diferencias significativas (p=0,00185).
El grado de diferenciación tumoral no se asocia significativamente con el tamaño
tumoral (p=0,69754).
El tamaño tumoral se asocia con el estadio de Dukes (p=0,00256); los tumores en
estadio C de Dukes son en un 68% de tamaño superior a 0,8 cm.
La presencia de placa linfoide no se relaciona con un tamaño superior (p=0,09101).
La presencia de otros tumores sincrónicos en colon no se asocia con el tamaño
tumoral (p=0,73558), tampoco la presencia de lesiones metastásicas (p=0,06396).
1. 1. 4. 2. Comparación entre el tamaño tumoral y las variables histoquímicas:

La reactividad de cada una de las lectinas estudiadas no muestra relación con el
tamaño tumoral.
1. 1. 4. 3. Comparación entre el tamaño tumoral y el resultado por citometría de flujo:

Los valores de las distintas fases del ciclo celular no se asocian a pequeños o grandes
tamaños de los tumores.
IV. 1. 2. Comparación de las variables anatomo-patológicas y el resto de variables
1. 2. 1. Comparación de las variables anatomo-patológicas entre sí

Mediante la prueba de m2 se ha estudiado la relación entre sí de las variables: tipo
histológico, grado de diferenciación, estadio de Dukes, presencia de metástasis, presencia de
otros tumores sincrónicos colorrectales, presencia de tumores en intestino delgado y
asociación a placa linfoide.
147
TIPO HISTOLÓGICO
Variable Categorías Adenocarcinoma C. mucinoso Significación (p)
Dukes A 20 8 0,01285
B 18 12 m2 =8,76936
C 8 17
Placa si 4 3 1,00000
no 42 34 m2 = 0,00917
no 13 11 m2 = 0,02152
no 21 21 m2 = 1,01160
no 27 16 m2 = 1,96111
SBA Todo 10 10 0,94601
Áreas 9 8 m2 = 0,11100
No 4 3
GSA-II Todo 5 8 0,38959
Áreas 16 10 m2 = 1,88530
No 3 3
148
PNA Todo 7 8 0,11059
Áreas 11 2 m2 = 4,40389
No 4 2
UEA-I Todo 12 14
Áreas 9 10
No 5
Tinción AB-PAS AB 1 6 0,005378
AB-PAS 4 5 m2 = 7,65177
AB/PAS 2 3
Ausencia 10 3
% células G0G1 m=18,76 m=13,19 0,0989
% Células G2M m=14,95 m=18,77 0,2575
% Células S m=15,47 m=18,00 0,4542
Tabla 4-19
Comparación entre el tipo histológico y el resto de variables.
En estadio Dukes A se observaron 20 adenocarcinomas (71,43%) y 8 carcinomas

mucinosos (28,57%), en estadio B se observaron 18 adenocarcinomas (60%) y 12 mucinosos
(30%) y en estadio C se observaron 8 adenocarcinomas (32%) y 17 mucinosos (68%). La
distribución del estadio tumoral (Dukes) es significativamente diferente dentro de los tipos
histológicos de malignidad de los tumores colorrectales de rata (p=0,01285). Los carcinomas
mucinosos tienden a diagnosticarse en estadio C de Dukes (Tabla 4-19).
Sin embargo, 19 adenocarcinomas (41,30%) presentaron metástasis y 27 no (58,70%),
mientras que 21 carcinomas mucinosos (56,76%) las presentaron y 16 no presentaron
(43,24%). La presencia de metástasis no es significativamente diferente dentro de los tipos
histológicos de malignidad de los tumores colorrectales (p=0,16139).
El tipo histológico no se asocia significativamente a la presencia o no de placas
linfoides (p=1,0000).
DIFERENCIACIÓN
Variable Categorías Moderado Pobre Significación (p)
Dukes A 18 2 0,05060
B 15 3 m2 = 5,96757
C 3 4
Placa si 4
no 33 9
149
no 8 5 m2 = 4,11162
no 14 7 m2 = 4,65433
no 23 4 m2 = 0,93735
SBA si 16 3 1,00000
no 3 1 m2 = 0,19512
GSA-II si 20 1 0,23913
no 2 1 m2 = 2,80519
PNA si 17 1
no 4
UEA-I si 17 4 1,00000
no 4 1 m2 = 0,00236
% células G0G 1 m=10,07 m=9,75 0,9203
% Células G2M m=9,70 m=11,13 0,6526
% Células S m=10,13 m=9,50 0,8414
Tabla 4-20
Comparación entre la diferenciación celular y el resto de
variables.
No existe asociación entre el tipo histológico y la presencia o ausencia de otros

tumores colorrectales (p=0,88336), ni de otros tumores sincrónicos de intestino delgado
(p=0,31452).
Dieciocho tumores colorrectales moderadamente diferenciados se encontraban en
estadio A de Dukes (48,65%), 15 en estadio B (40,54%) y 4 en estadio C (10,81%); mientras
que 2 tumores colorrectales poco diferenciados se encontraban en estadio A de Dukes
(22,22%), 3 en estadio B (33,33%) y 4 en estadio C (44,45%). Si bien se observa una
tendencia de los carcinomas poco diferenciados a presentar estadios de Dukes más
avanzados, no existe diferencia significativa (p=0,05060) (Tabla 4-20).
Ningún adenocarcinoma pobremente diferenciado se asoció a la presencia de placa
linfoide.
DUKES
Variable Categorías Dukes A Dukes B Dukes C Significación (p)
Placa si 3 4
no 25 26 25
Tumores sincrónicos si 17 25 17 0,15179
150
no 11 5 8 m2 = 3,77048
Tumores I. Delgado si 13 16 12 0,85891
no 15 14 13 m2 = 0,30419
SBA Todo 7 8 5 0,83697
Áreas 3 9 5 m2 = 1,44140
No 2 3 2
GSA-II Todo 3 6 4 0,98874
Áreas 9 12 5 m2 = 1,46968
No 1 3 2
PNA Todo 7 4 4 0,26495
Áreas 3 9 1 m2 = 5,22532
No 2 3 1
UEA-1 Todo 6 11 9
Áreas 3 10 6
No 2 3
% células G0G1 m=17,79 m=17,58 m=14,46 0,6339
% células G2M m=15,57 m=15,42 m=18,13 0,7491
% células S m=15,75 m=16,50 m=17,38 0,9076
I. Proliferación m=15,21 m=15,42 m=18,54 0,6339

Tabla 4-21
Comparación entre la clasificación de Dukes y el resto de variables.
No se aprecian diferencias significativas entre el grado de diferenciación celular y la

presencia de otros tumores sincrónicos de intestino grueso (p=0,09217), ni en la presencia de
otros tumores de intestino delgado, aunque los tumores moderadamente diferenciados se
asocian con mayor frecuencia a tumores sincrónicos de intestino delgado.
El grado de diferenciación moderado o pobre no se asocia significativamente con la
presencia o ausencia de metástasis a distancia (p=0,45563).
Ningún tumor en estadio C de Dukes estaba asociado a placa linfoide.
Los distintos estadios de Dukes no se asocian a la presencia o ausencia de otros
tumores colorrectales (p=0,15179), ni a la de tumores sincrónicos de intestino delgado
(p=0,85891).
1. 2. 2. Comparación de las variables anatomopatológicas e histoquímicas

Se ha empleado la prueba de m2 para comparar las variables anatomopatológicas, tipo
histológico, grado de diferenciación y estadio de Dukes, con las variables cuantitativas
resultado del enlace con lectinas en microscopía óptica y tinción con PAS-AB.
1. 2. 2. 1. Comparación entre el tipo histológico y el marcaje con lectinas:

(Tabla 4-19)
151
El 43,47% de los adenocarcinomas muestran enlace de SBA en todo el tumor, el
39,13% sólo en áreas y el 17,39% no muestra enlace, mientras que el 47,62% de los
carcinomas mucinosos muestran marcaje de esta lectina en todo el tumor, el 38,09% sólo en
áreas y el 14,29% no. La proporción de tumores con enlace de SBA no difiere
significativamente según el tipo histológico tumoral (p=0,94601).
El 20,83% de los adenocarcinomas muestran enlace de GSA-II en todo el tumor, el
áreas y el 14,29% no. La proporción de tumores con enlace de GSA-II no difiere
El 31,82% de los adenocarcinomas muestran enlace de PNA en todo el tumor, el
áreas y el 16,67% no. La proporción de tumores con enlace de PNA no difiere
El 31,82% de los adenocarcinomas muestran enlace de UEA-I en todo el tumor, el
50% sólo en áreas y el 18,18% no muestra enlace, mientras que todos los carcinomas
mucinosos muestran marcaje con esta lectina, un 58,33% en todo el tumor y un 41,67% sólo
en áreas.
1. 2. 2. 2. Comparación entre el grado de diferenciación tumoral y el marcaje con lectinas:

(Tabla 4-20)
Nueve adenocarcinomas moderadamente diferenciados (47,37%) mostraron enlace de
SBA en todo el tumor, 7 (36,84%) sólo en áreas y 3 (15,79%) mostraron ausencia, mientras
que los adenocarcinomas poco diferenciados mostraron enlace en 1 caso (25%) en todo el
tumor, 2 en áreas (50%) y 1 (25%) ausencia. No se observaron diferencias significativas
(p=0,70905) entre el grado de diferenciación tumoral y el enlace con SBA.
Veinte adenocarcinomas moderadamente diferenciados (90,90%) presentaron marcaje
con GSA-II y sólo 2 ausencia de marcaje (9,10%), mientras que de los adenocarcinomas
pobremente diferenciados 1 mostró enlace y el otro no (50%), no existiendo diferencias
significativas entre el grado de diferenciación celular y el enlace con GSA-II (p=0,23913).
Sólo pudo estudiarse un tumor poco diferenciado con la lectina PNA, mostrando
marcaje en todas las áreas. Los tumores moderadamente diferenciados mostraron enlacen en
todo el tumor en 6 casos (28,57%), en áreas en 11 (52,38%) y ausencia en 4 casos (19,05%).
Presentaron marcaje con UEA-I en todo el tumor 9 adenocarcinomas moderadamente
diferenciados, 8 sólo en áreas y 4 ausencia, de los adenocarcinomas pobremente
diferenciados 3 mostraron marcaje en todo el tumor, 1 en áreas y 1 ausencia. La proporción
de tumores con enlace de UEA-I no difiere significativamente según la diferenciación
tumoral (p=1,00000).
1. 2. 2. 3. Comparación entre el estadio de Dukes y el marcaje con lectinas:
(Tabla 4-19).
Presentaron enlace con SBA en todo el tumor 7 tumores en Dukes A (58,33%), 3 en

áreas (25%), y 2 ausencia (16,67%); los tumores en estadio B presentaron enlace en todo el
tumor en 8 casos (40%), en 9 en áreas (45%), y ausencia en 3 casos (15%); y en estadio C, 5
mostraron enlace en todo el tumor (41,67%), 5 en áreas (41,67%) y 2 ausencia (16,66%). No
se observaron diferencias significativas entre el enlace con SBA y el estadio de Dukes
(p=0,83697).
Se observó enlace de GSA-II en todo el tumor en 3 tumores en Dukes A (23,08%), 9
152
en áreas (69,23%), y ausencia en 1 caso (7,69%). En los tumores con estadio B de Dukes se
observó marcaje en todo el tumor en 6 casos (28,57%), en áreas en 12 ocasiones (57,14%), y
ausencia en 3 casos (14,29%); en los tumores con estadio C de Dukes se observó enlace en
todo el tumor en 4 casos (36,36%), en áreas en 5 casos (45,46%) y ausencia en 2 casos
(18,18%). La proporción de tumores con enlace de GSA-II no difiere significativamente
según el estadio de Dukes (p=0,98874).
De los tumores en estadio A de Dukes presentaron enlace de PNA en todo el tumor 7
casos (58,33%), en 3 en áreas (25,00%) y ausencia en 2 (16,67%); los tumores Dukes B
presentaron enlace en todo el tumor en 4 casos (25,00%), en áreas en 9 (56,25%), y ausencia
en 3 (18,75%); en estadio Dukes C se observaron 4 tumores con marcaje en todo el tumor
(66,66%), en áreas 1 (16,67%) y ausencia en 1 (16,67%). No existen diferencias
significativas entre el enlace con PNA y el estadio de Dukes (p=0,26495).
Presentaron enlace con UEA-I en todo el tumor 6 neoplasias (54,54%) en Dukes A, 3
en áreas (27,28%) y 2 ausencia (18,18%). Todos los tumores en estadio B de Dukes
presentaron enlace; en todo el tumor 11 casos (52,38%) y en áreas en 10 (47,62%). En
estadio C, 9 mostraron enlace en todo el tumor (50,00%), 6 en áreas (33,33%) y 3 ausencia
(16,67%).
1. 2. 2. 4. Comparación entre el tipo histológico y la tinción AB-PAS:

Los adenocarcinomas presentaron en 1 caso tinción AB (5,88%), en 4 AB-PAS
(23,53%), en 2 AB/PAS (11,77%) y en 10 ausencia (58,82%). Los carcinomas mucinosos
presentaron en 6 casos tinción AB (35,29%), en 5 AB-PAS (29,41%), en 3 AB/PAS
(17,65%) y en 3 ausencia (17,65%). Si bien se observa una mayor tendencia de los tumores
mucinosos a ser positivos para esta tinción, no se observan diferencias significativas
(p=0,05378).
1. 2. 3. Comparación entre las variables anatomopatológicas y el resultado por citometría de

flujo
Mediante la prueba de independencia de Kruskal-Wallis se ha analizado la relación

entre las variables anatomopatológicas tipo histológico, grado de diferenciación y estadio de
Dukes y los resultados obtenidos por citometría de flujo.
1. 2. 3. 1. Comparación entre el tipo histológico y el resultado por citometría de flujo:

El estudio de las medias de las fases del ciclo celular e índice de proliferación no se
asocian al tipo histológico (Tabla 4-19).
1. 2. 3. 2. Comparación entre el grado de diferenciación y el resultado por citometría de

flujo:
El grado de diferenciación celular no muestra relación con el resultado por citometría
de flujo(Tabla 4-20).
1. 2. 3. 2. Comparación entre el estadio de Dukes y el resultado por citometría de flujo:

El estudio de las medias de las fases del ciclo celular e índice de proliferación no se
relaciona con el estadio de Dukes (Tabla 4-21).
IV. 1. 3. Comparación de las variables histoquímicas y el resto de variables
En el estudio estadístico realizado previamente (apartados IV. 1. 1 y 1. 2. 2. de este
153
capítulo) se ha demostrado que no existe relación entre las variables histoquímicas y el resto
de variables del estudio.
IV. 1. 4. Comparación del resultado del análisis por citometría de flujo con el resto de
variables
En el análisis estadístico previo se ha demostrado que existen diferencias

significativas entre las fases del ciclo celular e índice de proliferación según la localización
tumoral.
1. 4. 1. Comparación entre las semanas de tratamiento y el resultado por citometría de flujo
Mediante el estudio del coeficiente de correlación lineal se ha estudiado la asociación

entre los valores de citometría de flujo y las semanas de inducción tumoral.
No se ha mostrado correlación lineal significativa entre las semanas de tratamiento y
ninguna de las variables cuantitativas resultado del estudio por citometría de flujo: porcentaje
de células en fase G0G1 (r=-0,02886, p=0,7204), porcentaje de células en fase G2M (r=-
0,02316, p=0,5891) y porcentaje de células en fase S (r=-0,03332, p=0,9851) e índice de
proliferación (r=-0,02886, p=0,7204).
1. 4. 2. Comparación entre el resultado por citometría de flujo y el resto de variables

anatomo-patológicas
Los estudios de comparación de medias entre los tumores solitarios (6,25%) y los
tumores sincrónicos (93,75%) del porcentaje de células en fase de G0G1 (p=0,2428), fase
G2M (p=0,0616), fase S (p=0,8456) e índice de proliferación (p=0,2428) no muestran
diferencias significativas.
Tampoco se observan diferencias significativas entre la presencia o ausencia de otros
tumores sincrónicos de intestino delgado y el porcentaje de células en fase G0G1 (0,7882),
fase G2M (p=0,5519), fase S (p=0,8030) e índice de proliferación (p=0,7882).
Estudios de comparación de medias entre la presencia (50%) o no de metástasis y el
porcentaje de células en fase G0G1 (p=0,1316), fase G2M (p=0,6108), fase S (p=0,3178), e
índice de proliferación (0,1316) no muestran diferencias significativas.
La presencia o ausencia de placa linfoide asociada no representa diferencias
significativas en los valores, como media, del porcentaje de células en las distintas fases del
ciclo celular ni del índice de proliferación.
IV. 2. Comparación entre los grupos
2. 1. 1. Sexo
La distribución tumoral por sexos no muestra diferencias en los tres grupos de estudio
(p=0,18162).
En el grupo D no se observó ningún tumor a nivel del colon descendente-recto. Para
154
el estudio entre grupos se agruparon las localizaciones en 2 categorías: proximal (ciego y
colon ascendente) y distal (colon transverso y descendente).
Si consideramos los 3 grupos de estudio de inyección de DMH, se observan
diferencias significativas en cuanto a la localización (p=0,00805). Observándose un
predominio de la localización proximal cuando se administran bajas dosis de DMH. No
existen diferencias significativas entre los dos grupos tratados con dosis de 21 mg/kg/semana
de DMH (p=0,35479).
Se observaron diferencias entre los tres grupos inyectados con DMH y el aspecto
macroscópico del tumor. En el grupo B inyectado con altas dosis de carcinógeno durante 20
semanas se observó una mayoría de tumores exofíticos, mientras que en los animales del
grupo C era más frecuente el tipo polipoideo. De forma que existen diferencias significativas
entre los grupos B y C (p=0,00536), y no cuando se comparan los grupos tratados durante
largos periodos de tiempo (p=0,17350) o entre el grupo de ratas que recibieron dosis de 10
mg/kg/semana y el grupo inyectado durante menor tiempo (p=0,33267).
No se apreciaron diferencias significativas entre los 3 grupos con respecto al tamaño

tumoral para las lesiones benignas y malignas (p=0,82634).
IV. 2. 2. Variables anatomo-patológicas:
Clasificando todas las lesiones de los 3 grupos inyectados con DMH en dos
categorías, benignas y malignas, existen diferencias significativas entre ellos (p=0,00001).
Comparando los grupos 2 a 2, observamos que no existen diferencias significativas
(p=0,45869) entre los grupos que recibieron DMH durante largos periodos de tiempo (20
semanas), mientras sí se observan entre el grupo de animales sacrificado en etapas
preneoplásicas y los grupos inyectados durante 20 semanas (p=0,00000 respecto al grupo B y
0,03221 respecto al D).
Sin embargo, no existen diferencias significativas entre los grupos y la presencia de
tumores malignos adenocarcinomas y carcinomas mucinosos (p=0,22189).
Si comparamos los grupos B y D mediante la prueba exacta de Fisher observamos que

no existen diferencias entre los dos grupos inyectados durante 20 semanas (p=0,16444). En el
grupo C no se observaron tumores pobremente diferenciados.
2. 2. 3. Estadio de Dukes
Si bien el grupo C mostró una mayoría de tumores en Dukes B, no existen diferencias

significativas entre los grupos (p=0,05602).
155
En total 56 lesiones del grupo B estaban asociadas a otros tumores colorrectales, 52

del grupo B y 5 del grupo C, mostrando diferencias significativas (p=0,00145).
Las ratas que recibieron DMH a dosis de 10 mg/kg/semana mostraron menos tumores
colorrectales por rata (p=0,00104 respecto al grupo B y p=0,00080 respecto al grupo C). No
apreciándose diferencias significativas entre los dos grupos inyectados con dosis de 21
mg/kg/semana.
Variable Categoría GRUPO B GRUPO C GRUPO D Significación
Sexo Macho 39 35 4 0,18162
Hembra 32 30 10 m2 = 9,64505
Localización Ciego 7 14 4
C. Ascendente 27 12 8
C. Transverso 18 21 2
C. Descendente 19 18
Proximal 34 26 12 0,00805
Distal 37 39 2 m2 = 9,64505
Macroscopía P. pediculado 19 10 1 0,02181
P. sesil 13 22 6 m2 =14,80682
T. exofítico 27 11 5
T. ulcerado 10 2 2
Tamaño * @ 0,8 cm 49 32 10 0,82634
> 0,8 cm 22 11 4 m2 = 0,38150
Tipo histológico Adenocarcinoma 31 12 3
C. mucinoso 21 9 7
C. in situ 5 5
Adenoma 1
D. leve 1 8
D. moderada 8 24 4
D. severa 4 7
Lesión benigna 14 39 4 0,00001
Lesión maligna 57 26 10 m2 = 23,95340
Diferenciación Moderado 24 12 1
Poco 7 2
Dukes A 18 5 5 0,05602
156
B 15 13 2 m2 = 9,21162
C 19 3 3
Placa si 6 26 5 0,00007
no 65 39 9 m2 = 19,19087
Tumores si 56 52 5 0,00145
sincrónicos
no 15 13 9 m2 = 13,06658
Tumores I. Delgado si 41 19 2 0,00033
no 30 46 12 m2 = 16,03764
SBA si 23 19 8 0,38071
no 7 2 1 m2 = 1,93143
GSA-II si 23 15 5 0,89793
no 6 4 2 m2 = 0,21533
PNA si 16 12
no 2 9 4
UEA-I si 23 19 7
no 8 3
* En algunas lesiones no se ha considerado el tamaño tumoral, puesto que asentaban sobre mucosa
aparentemente normal.
Tabla 4-22
Comparación entre los grupos inyectados con DMH (B, C y D)
y el resto de variables.

Si consideramos los 3 grupos de estudio de inyección de DMH se observan
diferencias significativas en cuanto a la presencia de tumores sincrónicos de intestino delgado
(p=0,00033). Se observa que las ratas que recibieron altas dosis de DMH y durante 20
semanas (grupo B) presentan mayor porcentaje de tumores sincrónicos de intestino delgado.
No existiendo diferencia significativas entre los grupos C y D (p=0,25090).
No se observaron diferencias significativas entre los grupos B y D (dosis total y

mitad) en cuanto a la presencia de metástasis (p=0,7455).
2. 2. 7. Presencia de placa linfoide
Considerando lesiones benignas y malignas asociadas a placa linfoide, se observa que

existen diferencias significativas entre los 3 grupos (p=0,00007). El grupo de estudio en
157
etapas preneoplásicas muestra una mayor asociación a placa linfoide.
Si consideramos exclusivamente las lesiones neoplásicas persiste esta tendencia pero
las diferencias no son significativas (p=0,05956).
IV. 2. 3. Variables histoquímicas
Las lectinas SBA y GSA-II no mostraron diferencias entre los grupos. Los 4 tumores
del grupo D incubados con la lectina PNA mostraron enlace con dicha lectina. Si
comparamos los grupos B y C se observan diferencias en la reactividad para dicha lectina
(p=0,02807), puesto que la mayoría de los tumores del grupo B se marcaban.
En el grupo D todos los tumores incubados con la lectina UEA-I presentaron
reactividad para la misma, no observándose diferencias significativas entre los grupos de
dosis alta de DMH.
Fueron aptos para el análisis por citometría de flujo un total de 126 histogramas de los
5 grupos de estudio. En la Tabla 4-23 se muestran los valores del ciclo celular y el índice de
proliferación para cada uno de los grupos de estudio (Figura 4-35).
FASE G0G1 FASE G2M FASE S I. PROLIFERACIÓN

NORMAL 88.74 5.03 6.21 11.25
DMH-NORMAL 86.65 5.91 7.43 13.34
DMH-TUMOR 87.50 4.84 7.65 12.49
EDTA 89.61 4.72 5.66 10.38
PRENEOPLÁSICO 89.96 3.95 6.07 10.03
Total 87.89 5.16 6.93 12.10
Tabla 4-23
Valores medios de las distintas fases del ciclo celular e IP para
los distintos grupos de estudio.
Previamente, se ha descrito la presencia de diferencias significativas en los valores del

índice de proliferación según la localización tumoral (Resultados B 1. 1. 2. 4). El grupo de
ratas que no recibió ningún tratamiento (normal) mostró diferencias significativas entre el
segmento de colon estudiado y la fase S (p=0,0465), pero no en cuanto al índice de
proliferación (p=0,0712) (Tabla 4-24). El grupo control inyectado con EDTA, la mucosa
preneoplásica tanto de etapas previas o coexistiendo con tumores no presentan diferencias
significativas.
Normal DMH-Normal DMH-Tumor EDTA Preneoplásico Significación
GOG1 m=71.34 m=50.11 m=59.64 m=81.65 m=87.00 0.0023
G2M m=63.50 m=77.90 m=55.92 m=53.74 m=42.33 0.0080
S m=52.71 m=71.14 m=75.88 m=41.74 m=49.13 0.0042
IP m=55.66 m=76.85 m=67.39 m=45.38 m=40.04 0.0024
158
Tabla 4-24
Medias y significación de las distintas fases del ciclo celular e
índice de proliferación para los distintos grupos de estudio.
2. 4. 1. Comparación entre los grupos de estudio y el resultado por citometría de flujo
Se han encontrado diferencias significativas entre los distintos grupos de estudio y las
variables cuantitativas resultado del estudio por citometría de flujo. Las medias de los% de
células en fase G0G1, G2M, S y el índice de proliferación y su significación estadística se
muestran en la Tabla 4-24.
Cuando se estudia la variable índice de proliferación (IP) comparando los grupos dos
a dos mediante la prueba U de Mann-Whitney, se observan diferencias significativas entre el
grupo normal y el grupo DMH-normal (p=0,0358), entre los grupos EDTA y DMH-normal
(p=0,0018) y EDTA y DMH-tumor (p=0,0483), preneoplásico y DMH-normal (p=0,0020).
EDTA y DMH-tumor (p=0,0483), preneoplásico y DMH-normal (p=0,0020). y preneoplásico
y DMH-tumor (p=0,0268). La comparación de medias del resto de grupos no demostró
diferencias significativas.
Los estudios del % de células en fase S de los grupos muestra que existen diferencias
significativas entre la ausencia de tratamiento (grupo normal) y DMH-tumor (p=0,0353),
entre EDTA y DMH-normal (p=0,0077), entre EDTA y DMH-tumor (p=0,0022), y entre los
grupo preneoplásico y DMH-tumor (p=0,0078). La comparación de medias no mostró
diferencias significativas en los otros grupos.
159
V. Discusión
V. 1. Aspectos morfológicos
V. 1. 1. Características del cáncer colorrectal inducido con DMH
Los tumores de intestino grueso inducidos por 1,2-dimetilhidracina en roedores son

histopatológicamente análogos al cáncer de colon humano(212),(234).
La morfología general de los tumores inducidos por DMH semeja los descritos
previamente por otros autores(203),(314).
Dosis de 21mg/kg/semana durante 20 semanas proporcionan una tasa tumoral en el
intestino grueso del 82,05%. Se han obtenido unas tasas inferiores a las de otros estudios que
oscilan entre el 90 y el 100%(167) (195) (195). El número medio de tumores invasivos por
animal es de 1,26. Con dosis de 10 mg/kg/semana durante el mismo periodo se obtiene una
tasa del 55%, con una media de tumores invasivos por rata de 0,5, inferior a la publicada en
otras series(206).
Con altas dosis de DMH los tumores observados son generalmente múltiples
(68,75%), mientras que con dosis de 10 mg sólo en un 18, 18%.
Los tumores inducidos con DMH no son clasificados de una manera uniforme en la
literatura, sin embargo, todos coinciden en una división entre adenocarcinomas mucinosos y
no mucinosos.
En conjunto en todos los animales usados en el modelo experimental se han
observado un 60,22% de adenocarcinomas no-mucinosos, considerando además los
carcinomas in situ. Las cifras de tumores mucinosos (39,78%) son superiores a las obtenidas
en otros estudios, en los que suponen un 15% del total de tumores(206). Si consideramos
exclusivamente los tumores invasivos obtenemos un altísimo porcentaje de tumores
mucinosos (44,73%), mientras en la serie de Teague(320) este tipo tumoral constituye menos
de un 5% de todos los tumores invasivos.
Las distintas dosis y tiempos de inducción tumoral no representan una variación
significativa en la presencia de adenocarcinomas mucinosos o no mucinosos.
En este estudio la mayoría de los tumores son invasivos (89,25%), con cifras similares
a las observadas por Teague(320), y en 1 solo caso se describen adenomas, a pesar de que los
animales recibían dosis altas y bajas de carcinógeno, y distintos tiempos de inducción. El
adenoma observado en el estudio se observó en una rata que recibió altas dosis de
carcinógeno durante 20 semanas. Estos resultados difieren de los publicados por otros autores
con alta proporción de adenomas(216), (314) y corroboran otros que afirman que en la rata la
mayoría de adenocarcinomas aparecen de novo sobre mucosa plana(208),(209).
Otra diferencia sustancial respecto a la literatura se refiere a la localización tanto de
las lesiones benignas como malignas. Mientras en el presente estudio se situaban con mayor
frecuencia en colon ascendente tanto en animales tratados con altas como con bajas dosis de
DMH; otros autores describen el predominio distal de las neoplasias(208),(211) ,(216) ,(303)
, otros las observan a nivel de la flexura mayor(314) (intersección entre colon transverso y
descendente en este estudio), mientras otros encontraban una alta proporción de tumores en el
ciego adyacente al íleon en ratones Swiss(216). Estas diferencias no pueden atribuirse a
emplear una distinta clasificación anatómica, puesto que se ha considerado la distancia del
tumor al ano en todos los casos.
Se han observado diferencias entre los tipos histológicos y la localización tumoral: en
el colon descendente existe una mayoría de adenocarcinomas no mucinosos, mientras en el
160
colon transverso y el ciego se objetiva una mayor frecuencia de carcinomas mucinosos. En la
literatura se recoge también una mayoría de adenocarcinomas no mucinosos en el colon
izquierdo(211).
Otros investigadores describen hallazgos histopatológicos distintos entre el colon
proximal y distal, observando que los adenocarcinomas mucinosos son más frecuentes en el
colon ascendente(199), en asociación con colecciones de folículos linfoides(206),(300).
Postulando que el tipo de crecimiento lento del adenocarcinoma bien diferenciado es
probable que se origine en la propia mucosa del colon distal mientras que el tipo de
crecimiento rápido del colon proximal se realice a partir de glándulas atípicas en los folículos
linfoides. Por lo tanto, se sugiere que la histogénesis y los procesos de crecimiento del
carcinoma son distintos en el colon proximal respecto al distal(571). Este aspecto no ha sido
confirmado, puesto que no se han observado diferencias entre la asociación a placa linfoide y
los tipos histológicos malignos, se observaban folículos linfoides en asociación con
adenocarcinomas y con carcinomas mucinosos. Tampoco se han observado diferencias
respecto a la localización tumoral, ya que en los cuatro segmentos colónicos los tumores
podían estar asociados a placas linfoides. El 8,43% de los tumores invasivos se localizaban al
lado de folículos linfoides, muy por debajo del 22% observado por Ross(206).
La presencia de cánceres experimentales en las parcelas linfoides formula la pregunta
de su posible papel en la modulación de la proliferación y la diferenciación de las criptas
intestinales(152).
El tratamiento con bajas dosis de carcinógeno (10 mg/kg/semana) durante 20 semanas
reduce el número de carcinomas de intestino grueso y delgado por rata y el número de
animales con metástasis respecto al grupo de altas dosis de DMH, tal como habían descrito
previamente otros autores(167). Sin embargo, no hay diferencias respecto a los tipos
histológicos y grado de diferenciación. La principal dificultad par el uso de esta dosis y
durante este periodo de tiempo como modelo experimental es la ausencia de lesiones en el
colon descendente, constituyendo la principal diferencia respecto al carcinoma de intestino
grueso humano.
En el grupo de ratas inyectado con dosis de 21 mg/Kg/semana de DMH y sacrificio en
etapas precoces se detectó el primer tumor maligno en la semana 16 de inducción.
Greener(155) encuentra tumores a las 18 semanas en ratas inyectadas con 20 mg/kg del
carcinógeno, desarrollándose en la mayoría de los animales los cánceres definitivos a las 24
semanas de tratamiento. Otros estudios reflejan un periodo de latencia idéntico a dosis de 10-
20 mg/kg/semana(196).
Los tumores mucinosos se encuentran en grados de invasión superior (78,38% en
Dukes B o C) comparado con los adenocarcinomas no mucinosos. La relativamente baja
invasividad de las lesiones no mucinosas queda reflejada en la alta proporción de Dukes A
(53,57%) si asociamos los 10 carcinomas in situ observados en el estudio. Los resultados
obtenidos son similares a los observados por otros investigadores(199),(206).
Las tres pautas de tratamiento no han mostrado diferencias en la clasificación de
Dukes.
El tamaño tumoral está relacionado con la invasividad del tumor.
Algunos trabajos describen que los tumores mucinosos son los únicos que se asocian
con metástasis(300), mientras que en el presente estudio tanto los tumores mucinosos como
los no mucinosos muestran metástasis: Es más, los tumores con heterogeneidad morfológica
presentan metástasis con ambos componentes.
Las metástasis son locales, peritoneales, en los ganglios regionales o a distancia al
igual que lo observado previamente por otros investigadores(155).
161
Existe una ligera menor susceptibilidad de las ratas hembras al carcinógeno. Se han
descrito 41 lesiones malignas en hembras (44,09%) frente a las 52 desarrolladas en machos
(55,91%). Sin embargo, se observan diferencias significativas respecto al tipo histológico y
una mayoría de ratas hembras presentan carcinomas mucinosos.
La presencia de tumores no colorrectales en el presente estudio concuerda con los
previamente publicados de carcinogénesis por DMH(206). Así como la localización más
frecuente a nivel de intestino delgado, en el duodeno y
yeyuno proximal(206).
V. 1. 2. Características de las lesiones benignas inducidas con DMH

La exposición al carcinógeno DMH induce cambios morfológicos precoces en las
glándulas de la mucosa de aspecto macroscópico normal en etapas preneoplásicas.
La presencia de glándulas displásicas asociadas a placa linfoide es un evento precoz,
ya visible en las primeras 4 semanas de inyección con DMH a dosis de 21 mg/kg/semana.
Las primeras lesiones displásicas no asociadas a placas linfoides se apreciaron en la
sexta semana, eran displasias leves y se situaban en el ciego. No pudimos detectar en ningún
caso la aparición de un tumor invasivo originado dentro de un adenoma en la rara, trabajos
similares confirman nuestros resultados(178),(188). Incluso Maskens(193), describió la
aparición de los pólipos benignos en períodos de latencia superiores a los del carcinoma,
también en nuestro caso el hallazgo del único adenoma del estudio se obtuvo de una rata
sacrificada a las 34 semanas, es decir, con un máximo periodo de inducción.
Es importante remarcar la coexistencia de lesiones benignas (displasias, adenoma) y
malignas en el tiempo. Aunque en este grupo se observara con mayor frecuencia la presencia
de lesiones benignas, tipo displasia, no existe una secuencia en la aparición de lesiones a
partir de un cierto periodo de latencia. Estos resultados niegan la secuencia adenoma-
carcinoma en el modelo animal de carcinogénesis inducida con DMH, propia de la neoplasia
colónica humana(572),(68). En que el adenocarcinoma de colon puede entenderse como el
final de un aparente proceso continuo que incluye el adenoma en el punto medio y el colon
normal al principio. De hecho, no es probable que todo carcinoma colorrectal tenga su origen
en un pólipo. La mucosa colónica respondiendo a los factores que promueven el crecimiento
polipoide podrían responder similarmente con el desarrollo de un carcinoma sin que
intervenga el crecimiento polipoideo benigno.
Por otro lado, confirman la relación de las placas linfoides con la degeneración
neoplásica. Se sabe que la renovación epitelial ordenada depende de la membrana basal que
actúa como un recubrimiento de soporte móvil y supone un de freno de la progresión celular
y por consiguiente de las mitosis(573). Las placas linfoides generalmente rompen la
membrana basal aumentando el área proliferativa y la capacidad neoplásica.
V. 1. 3. Focos y lesiones de predisplasia
La transformación de la mucosa del intestino grueso se caracteriza por acumulación

de lesiones cada vez más aberrantes a medida que aumenta la exposición al carcinógeno,
antes del desarrollo de tumores invasivos.
Desde que Spjut y Smith en 1977(574), describieran las lesiones focales
predisplásicas en ratas tratadas con DMH, numerosos estudios se han efectuado al
respecto(572), (575).
Las criptas aberrantes o focos de predisplasia son criptas de tamaño aumentado, línea
epitelial más gruesa y zona pericriptal aumentada, que se sitúan generalmente en la parte
162
superior de la cripta(572). Semejantes anormalidades en las criptas han sido puestas de
manifiesto en la mucosa colónica humana inmediatamente al lado y a distancia de cáncer de
colon al igual que en áreas afectadas por la enfermedad de Crohn(166),(575).
Los focos de predisplasia se consideran la primera etapa en el desarrollo de neoplasias
colónicas y representan focos neoplásicos clonogénicos, a partir de los cuales se desarrolla el
tumor, y sostienen el origen clonal de la neoplasia(572).
El status preneoplásico es un estado comprometido y no es dependiente de la
presencia del carcinógeno. Todo el epitelio de la cripta es preneoplásico, aunque no todas las
células progresan al estado abiertamente transformado(295).
En este estudio las lesiones de predisplasia afectando a glándulas aisladas o grupos de
2 glándulas se observaron a las dos semanas de iniciado el tratamiento con DMH, siendo más
evidente en la porción apical del epitelio. De forma concomitante lesiones más difusas y de
iguales características aparecieron en el ciego, y más ligeramente en colon ascendente,
mientras en colon transverso y descendente la morfología estaba conservada. Cooke y
colaboradores(314) también han demostrado áreas focales de criptas ensanchadas en la
mucosa macroscópicamente normal de ratas tratadas con DMH durante una fase muy precoz
de la carcinogénesis usando microscopía electrónica de scanning y Glickman et al.(576)
describen severas aberraciones nucleares en las criptas del colon de ratón tras una única
exposición al carcinógeno. Otros autores describen su presencia en etapas más tardías, a
partir de la 9ª semana de exposición(320).
Estos hallazgos difieren de los vistos por James et al(235), en otra especie animal, con
predominio de las lesiones en el colon distal. Otros autores describen ausencia de afectación
del ciego durante el periodo de tratamiento(577).
Las lesiones secuenciales observada por Delapierre et al.(578) en ratas Wistar con
alteración de las mucinas en ratas a partir de la 2º semana y modificaciones nucleares de las
células caliciformes en la 2ª semana, y de las absortivas en la 3ª concuerdan con los
resultados obtenidos.
Al igual que los resultados presentados por otros investigadores(211),(575) con el
tiempo de tratamiento aumenta la frecuencia y el tamaño de estas lesiones en cada segmento
intestinal.
La aparente recuperación de las lesiones predisplásicas en la cuarta semana de
inyección podría atribuirse a una recuperación del efecto tóxico local agudo del carcinógeno.
Existe una disminución progresiva en el número de células caliciformes y una
disposición irregular del núcleo, menos evidente en el colon descendente, sugiriendo que éste
no es el segmento "diana" por excelencia de la carcinogénesis inducida por DMH en este
modelo.
En este estudio la hiperplasia de las glándulas mucosas, caracterizada por una
elongación de las mismas, se objetiva en la mucosa macroscópicamente normal de ratas que
han recibido altas dosis de carcinógeno a diferencia de lo observado por otros autores como
un evento precoz de la carcinogénesis.
Los hallazgos del presente estudio experimental sugieren que las áreas de criptas
aberrantes pueden interpretarse como lesiones precursoras en el desarrollo del cáncer de
colon y pueden ser de gran importancia en el diagnóstico de pacientes con riesgo de padecer
esta neoplasia.
V. 1. 4. Microscopía electrónica de scanning
En términos amplios el MES ha sido usado generalmente para examinar la topografía
163
de las superficies naturalmente expuestas de células y tejidos. Aún, en muchos estudios es
esencial explorar tanto los aspectos de superficie, como las relaciones espaciales de las
células localizadas en los tejidos, y visualizar estructuras intracelulares de interés(416).
En contraste con las secciones de microscopía electrónica de transmisión, la MES nos
permite un análisis tridimensional de los eventos que ocurren en la superficie celular.
Diversos estudios muestran las características de la mucosa normal y tratada con
DMH mediante MES, sin embargo, estos estudios no se refieren a todos los segmentos del
intestino grueso y se limitan al colon distal(313),(579).
La observación con MES muestra clara diferencias regionales en el aspecto de la
mucosa normal de la rata a pocos aumentos, aunque la superficie epitelial está cubierta en su
mayoría por una densa capa de moco.
Se observan diferencias en la disposición de los pliegues: el ciego muestra pliegues de
disposición irregular, en el colon ascendente y transverso se disponen oblicuamente y en el
descendente son longitudinales paralelos al eje del intestino.
El aspecto, forma y número de las criptas varía en los cuatro segmentos del intestino
grueso. En el ciego son circulares y abundantes, en el colon transverso tienen aspecto
fusiformes y abultadas, con abundantes grumos de moco sobre ellas. En el colon transverso
se observan escasos orificios criptales. El colon descendente muestra circunvoluciones, con
aspecto cerebroide.
A mayor aumento, se puede apreciar las microvellosidades en los cuatro segmentos,
que no muestran diferencias entre ellos.
Los cambios morfológicos observados durante la carcinogénesis experimental con
DMH indican que hay un patrón definido de anormalidades mucosales progresivas
empezando mucho antes del desarrollo de tumores focales de colon, que estas alteraciones
son dosis dependiente, y que son más evidentes en el colon proximal, corroborando que es
esta región el órgano diana de este modelo experimental.
Las neoplasias del intestino grueso de la rata no muestran diferencias
ultraestructurales según la localización colónica y se asemejan a las descritas por otros
autores(313),(579).
V. 2. Expresión de glicoconjugados
Las mucinas son las fuentes predominantes de glicoproteínas en el epitelio

gastrointestinal, y su estructura difiere según la localización en el tracto gastrointestinal y el
estado de diferenciación(329),(580).
Estudios histoquímicos con tinciones como el ácido periódico de Schiff, azul alzian,
diamina rica en hierro y diamina azul alzian rica en hierro, han demostrado la presencia de
mucosustancias en la mucosa colónica(351).
Se acepta que alteraciones estructurales en el moco secretado están directamente relacionados
con algunas enfermedades gastrointestinales. Este concepto es sostenido por hallazgos
histoquímicos que muestran algunos cambios estructurales en células epiteliales benignas y
malignas. Las alteraciones histoquímicas, caracterizadas por una cantidad mayor de
glucoproteínas sulfatadas y ácido siálico sustituidas o por cambios en la antigenidad de grupo
sanguíneo son de significado diagnóstico en la práctica patohistológica, estos métodos
histoquímicos clásicos no permiten discriminar los diferentes carbohidratos. Para comprender
las actuaciones del moco sin embargo, se necesitan análisis más detallados de sus secuencias
carbohidrato.
Por otra parte, los estudios bioquímicos realizados en el intestino grueso no pueden
164
precisar la distribución de los carbohidratos a nivel celular y subcelular.
V. 2. 1. Microscopía óptica
La aplicación de las distintas lectinas en muestras de intestino grueso permiten

observar diversos patrones de localización de los glicoconjugados del epitelio.
Los resultados obtenidos con lectinas conjugadas con oro coloidal en ratas controles
normal no difieren de los presentados por otros autores usando lectinas conjugadas con otros
marcadores(462) (465),(392).
Cada una de las lectinas usadas en el estudio ha mostrado un patrón de reactividad
propio y característico, mostrando diferencias a lo largo de las criptas, así como a nivel de los
distintos segmentos del colon normal de rata.
Freeman(328) realiza estudios histoquímicos del contenido en azúcares y de la
actividad de diversas glicosidasas y glicosiltransferasas en el colon de rata normal y tratado
con DMH a nivel proximal y distal, encontrando diferencias regionales entre el colon de rata
normal proximal y distal. Diversos estudios histoquímicos han sugerido diferencias
regionales entre el colon de rata normal proximal y distal en relación al contenido mucoso de
carbohidratos y enzimas implicadas en el metabolismo de glicoproteínas. El contenido en
azúcar es mayor distalmente. Existen diferencias regionales para la mayoría de las
glicosiltransferasas y algunas actividades degradativas de la glicosidasa.
Las claras diferencias observadas en los patrones de enlace de lectina en los cuatro
segmentos del intestino grueso de rata, asemejan a las descritas por otros investigadores para
la SBA(394), UEA-I(392),(465) ,(466) y PNA(463). A pesar de esto, se han encontrado
diferencias atribuibles a la especie animal empleada o a la sensibilidad de la técnica, como la
ausencia de diferencias regionales de enlace de la UEA-I observadas por Freeman(392).
Las diferencias más notables se han observado con la UEA-I. Esta lectina marca la
mucina de ciego y colon ascendente, pero no la mucosa del colon descendente, teniendo el
colon transverso un comportamiento mixto entre colon ascendente y descendente.
Las posiciones terminales de las cadenas laterales de oligosacáridos están
generalmente ocupada por ácido siálico-fucosa, estos dos azúcares compiten entre sí para la
ocupación de las posiciones terminales. En estudios químicos de secreciones normales en
humanos se observa un contenido de ácido siálico mayor y menor de fucosa en la mucosa
rectal. Ya que la UEA-I es específica al residuo fucosil terminal la falta de enlace de esta
lectina con el moco rectal puede estar relacionado con el bajo contenido en fucosa del recto.
Otra posible explicación a la ausencia de enlace distal no estaría relacionado con el contenido
de fucosa, sino en la presencia de ácidos siálicos que compiten para la ocupación de las
posiciones terminales de las cadenas laterales de los azúcares. Cabe suponer que idénticos
motivos se dan en el colon descendente de la rata.
Las lectinas SBA, GSA-II y PNA muestran enlace en todos los segmentos colónicos.
La SBA reconoce específicamente residuos no reducidos de N-acetil-D-galactosamina,
situados en la posición terminal de las glicoproteínas.
Las diferencias regionales en la expresión de glicoconjugación pueden correlacionarse
con la distinta actividad de las glicosiltransferasas y glicosidasas en los segmentos proximales
y distales del intestino grueso de la rata.
Las lectinas muestran asimismo diferencias de enlace en los distintos niveles de las
criptas. Las lectinas SBA y GSA-II presentan diferencias a lo largo de las criptas y en su
165
comportamiento de unión a nivel citoplasmático o supranuclear en las distintas localizaciones
colónicas.
En el ciego, la SBA se une a la mucina de las células caliciformes a nivel basal, en los
tercios medios y apical la situación es supranuclear. En el resto del colon se sitúa en
citoplasma de las células caliciformes en toda la longitud de la cripta. Por lo tanto, la N-
acetilgalactosamina es un carbohidrato terminal presente en la mucina del intestino grueso,
aunque no a todos los niveles.
La GSA-II también muestra diferencias locales con mayor afinidad por los segmentos
basales.
La PNA muestra una disposición constante en todos los segmentos del colon, y su
reactividad queda confinada en el área supranuclear de las células caliciformes y columnares.
En el intestino grueso normal de rata las vacuolas de moco de las células caliciformes no se
han marcado con esta lectina. Se ha observado marcaje de la superficie luminal del ciego y
débilmente la del colon proximal, pero no reacciona con la superficie luminal del colon distal.
En el ciego, la UEA-I se une a la mucina de las células caliciformes en toda la
longitud de la cripta, en el colon ascendente de la rata queda confinada a la base de las
criptas. Estos gradientes de reactividad se relacionan con el grado de diferenciación celular.
En general, las lectinas usadas en este estudio muestran un patrón de reactividad
similar al observado en el colon humano(441) (443),(446) ,(351) ,(450).
Las diferencias regionales reflejan modificaciones cualitativas y cuantitativas en la
estructura de los glicoconjugados celulares.
2. 1. 2. Lesiones neoplásicas
Los patrones de reactividad de las lectinas en las lesiones neoplásicas difieren

considerablemente de los de la mucosa normal. Estos cambios observados en los tumores
indican una clara modificación del metabolismo de los glicoconjugados en la transformación
neoplásica.
Los estudios bioquímicos previos describen diferencias considerables en el contenido
de carbohidratos o glicoproteínas mucinosas entre mucosa colónica normal, adyacente no
afectada y tumores colónicos. El tratamiento con el carcinógeno DMH tiene un efecto
diferencial en el tipo de azúcar y enzimas implicadas en el metabolismo glicoproteico, con
reducción en el contenido de azúcar (hexosa total, no dializable y enlazada) y aumento de las
enzimas galactosiltransferasas(328).
El patrón de unión de las lectinas a los carcinomas se han caracterizado por
positividad de la SBA en 83, 33% de los casos, de la GSA-II en 78,18%, PNA en 70, 77% y
UEA-I en 76,67%.
Las diferencias más notables entre los carcinomas y la respectiva mucosa normal se
han observado en todos los segmentos del colon con la lectina PNA y con la UEA-I en el
colon descendente, con aumento de la reactividad para dichas lectinas. Si las alteraciones
observadas son hechos primarios o reflejan cambios secundariamente a la transformación
neoplásica se desconoce.
Por el contrario, la SBA ha mostrado un enlace disminuido en los tumores de colon
ascendente respecto a los controles normales, la reducción del enlace indica que hay menos
residuos GalNAc terminales no reductores en las cadenas de oligosacáridos de la mucina
debido probablemente a una glicosilación incompleta superior de las glicoproteínas en este
segmento con altas tasas de neoplasia.
La GSA-II no mostró diferencias regionales evidentes en su enlace, aunque tanto en
166
colon ascendente como en transverso normal se encuentran a nivel supranuclear, en las
mismas localizaciones tumorales se expresa como una fina tinción de las membranas
celulares apicales y en ocasiones del citoplasma de las células caliciformes, y explicaría un
aumento de la N-acetilglucosamina en la mucina de las células transformadas.
Los resultados con las lectinas PNA y UEA-I en los carcinomas de rata inducidos con
DMH confirman los obtenidos en estudios previos(463),(466) ,(467) y son similares a los
observado en el cáncer humano(454),(351).
Los cambios más aparentes se han detectado con la PNA. Esta lectina muestra
afinidad para los grupos galactosil y reconoce el disacárido D-Gal-A(1-3) D-GalNAc. A
diferencia de la mucosa normal, la reactividad de esta lectina en los carcinomas se localiza en
la superficie luminal del epitelio, en el material intraglandular y en las vacuolas de mucina de
las células tumorales. Las células neoplásicas presentan la capacidad de expresar la estructura
D-Gal-A (1-3) D-GalNAc en compartimentos donde habitualmente no se encuentra. El hecho
que esta estructura ocupe normalmente una posición interna en las cadenas oligosacáridas de
los glicoconjugados sugiere que las células neoplásicas sintetizan glicoconjugados
incompletamente glicosilados, antes de la incorporación del ácido siálico terminal. El enlace
de PNA observado en los tumores puede explicarse también por una disminución de las
glicosiltransferasas a este nivel con aumento de la síntesis del antígeno de grupo sanguíneo
T(318).
La PNA ha mostrado afinidad por los tumores de intestino grueso de rata
independientemente de la localización tumoral, a diferencia de lo observado por Calderó et
al(463), con menor expresión en el colon proximal.
La UEA-I se enlaza con la α-L-Fucosa y muestra gran afinidad por las neoplasias de
intestino grueso, tal como previamente se ha descrito. Aunque las situadas en el colon
ascendente presentan la menor reactividad, con cambios en relación a la mucosa normal, no
se observan diferencias significativas entre la localización tumoral y el enlace con esta
lectina.
Es decir, en el colon proximal, la α-L-Fucosa es accesible a la lectina en condiciones
normales y está disminuido o no es accesible para todas las neoplasias. A diferencia de lo
publicado por otros autores(463) en que la positividad obtenida con la UEA-I no varía con la
transformación neoplásica. La pérdida del efecto gradiente proximal-distal en las muestras
tumorales parece ser debida a una capacidad disminuida de disponibilidad de los residuos
fucosil en el colon ascendente.
La UEA-I es positiva en el colon transverso y descendente, indicando la síntesis de
glicoconjugados con residuos α-L-Fucosa en el terminal no reducido de las cadenas
oligosacáridos, los cuales no estaban presentes en condiciones normales.
Las diferencias regionales en el enlace de las neoplasias con las lectinas PNA y UEA-
I, respecto a la mucosa normal sugieren que los mecanismos que condicionan las diferencias
segmentarias se pierden en la transformación maligna.
La heterogeneidad intratumoral en la reactividad de las lectinas estudiadas, expresada
en los resultados como áreas de marcaje, con alternancia de zonas tumorales reactivas con
otras de intensidad disminuida o ausente, podría reflejar la existencia de diferentes
subpoblaciones celulares en un mismo tumor, con distinta alteración en el metabolismo de los
glicoconjugados o podría traducir simplemente la existencia de tumores con patrón mixto
adenocarcinoma-carcinoma mucinoso o con diferente grado de diferenciación, observado en
otros estudios de carcinogénesis por DMH(320) que tendrían diferente contenido en
carbohidratos.
167
Las lectinas SBA y GSA-II no mostraron diferencias entre los grupos de estudio. En
el grupo D pudieron estudiarse menos casos con las lectinas PNA y UEA-I, mostrando enlace
de lectina todos los tumores de intestino grueso. La lectina PNA mostró diferencias entre los
dos grupos que recibieron altas dosis de carcinógeno, la mayoría de los tumores del grupo de
inyección más prolongada presentaron enlace de esta lectina a diferencia del grupo de
sacrificio más precoz. Este hallazgo podría explicar que periodos prolongados de inducción
tumoral incrementan la capacidad de expresar la estructura D-Gal-A(1-3) D-GalNAc.
La reactividad de las lectinas estudiadas no muestra diferencias según el aspecto
macroscópico y el tamaño tumoral.
Tampoco han mostrado diferencias respecto al tipo histológico, grado de
diferenciación y el estadio de Dukes. En tumores humanos se ha encontrado mayor
reactividad de las lectinas GSA-II y PNA en los tumores invasivos que
en los carcinomas mucosales(443).
2. 1. 3. Mucosa macroscópicamente normal de ratas inyectadas con DMH
En este estudio hemos observado cambios graduales y progresivos de los

glicoconjugados determinados por lectinas de la mucosa del intestino grueso de la rata, según
las semanas de exposición al carcinógeno.
Varios autores han descrito un cambio en la producción de moco del colon de rata
tratado con DMH. Filipe(581) encontró un aumento de los ácidos siálicos en la mucina de
ratas tratadas con este carcinógeno y deplección de las sulfomucinas en las seis primeras
semanas de tratamiento. Varios autores han descrito un cambio en la producción de moco de
colon de rata tratado con DMH. En la serie de Delapierre et al.(578) en ratas Wistar se
observa un paro en la secreción de sulfomucinas en algunas criptas, en la porción superior o
en toda la longitud con una dosis de 30 mg/kg. Otros autores observan glándulas sin cambios
epiteliales asociados que presentan una ausencia completa de mucosustancias(196). Otros
autores describen cambios paralelos cualitativos y cuantitativos en las sialoglicoproteínas en
las distintas regiones del colon durante la carcinogénesis inducida con DMH(582).
Al igual que en la mucosa neoplásica los cambios regionales más importantes se han
observado con las lectinas PNA y UEA-I y asentaban sobre mucosa sin alteraciones
epiteliales evidentes. Estos resultados difieren de los publicados por Balzer et al.(468) en
ratas Wistar en que no observa cambios en el patrón de enlace de UEA-I respecto a las ratas
control ni cambios constantes cáncer-asociados en la mucina con la lectina PNA.
La SBA ha mostrado un patrón irregular de enlace en el ciego y colon descendente, y
en general una disminución de la reactividad a partir de la 16 ª semana, concomitante a la
aparición de lesiones tumorales.
La GSA-II ha mostrado disminución de la reactividad en el colon ascendente.
Coincidiendo con la acción tóxica local del carcinógeno en las dos primeras semanas
de iniciada la inyección con DMH se observó enlace de la PNA a la mucina de las células
caliciformes, que posteriormente desapareció para hacerse constante en la semana 26.
La UEA-I mostró disminución de la reactividad en ciego y colon ascendente y un
aumento de la misma en el colon descendente a partir de la semana 16. Estos resultados son
congruentes con la observación de un menor enlace en los tumores de este segmento.
La aparición de la UEA-I en la mucosa del colon descendente de ratas tratadas con
DMH sugiere la reaparición de los antígenos de grupo sanguíneo H, la alteración de la
estructura terminal de los carbohidratos de este segmento con formación de cadenas de
azúcar adicionales o a la producción de glicoproteínas neoplásicas
168
Estos hallazgos expresarían cambios bioquímicos en la función celular no observados
en los estudios morfológicos convencionales.
Al igual que en el trabajo de Suzuki et al(571) se han observado diferencias en los
patrones de enlace de las lectinas entre los carcinomas y/o las glándulas atípicas asociadas a
folículos linfoides y la mucosa colónica normal de la rata. Así como entre el enlace de las
lectinas en los focos de glándulas predisplásicas y la mucosa normal, tumoral y en las
glándulas atípicas asociadas a folículos linfoides de ratas inyectadas con DMH.
Puesto que tanto criptas predisplásicas aberrantes como las glándulas atípicas
asociadas a folículos linfoides han sido descritas como lesiones precursoras del cáncer de
colon en este modelo experimental, las distintas características en los glicoconjugados de
estas lesiones podría establecer dos orígenes distintos de las neoplasias inducidas por DMH.
Los estudios de Filipe et al(583), Riddell y Levin(102), y Shamsuddin et al(584) han

mostrado que la mucosa adyacente a carcinoma de colon (mucosa transicional) no es normal,
mientras que otros estudios que algunos de los cambios descritos son inespecíficos ya que
aparecen en procesos inflamatorios. Específicamente, Filipe y Branfoot(583), encontraron
aumento de sialomucinas en la mucosa transicional, (en la mucosa normal predominan las
sulfomucinas). Riddell y Levin(102), y Dawson y Filipe(104) describieron alteraciones
ultraestructurales, distorsión y pérdida de la arquitectura normal de la mucosa y células
inmaduras e intermedias en los niveles altos de las criptas. Shamsuddin et al. (584) describen
cambios benignos mucosales no polipoides, incluyendo un aumento en las células
caliciformes y una disminución en las células absortivas, un aumento en la longitud de las
criptas de 0,8 a 2 mm; variaciones en la configuración glandular tales como ramificación,
tortuosidad y criptas distendidas; células basales hiperplásicas y número aumentado de
mitosis(500). Freeman(328) ha descrito diferencias en el metabolismo de las glicoproteínas.
La mucosa transicional podría ser:
a) una respuesta específica de la mucosa colónica a cualquier factor irritante

b) una respuesta mucosal específica a la presencia del carcinoma, un cambio inducido por
una neoplasia adyacente
c) respuesta preneoplásica a un estudio carcinogénico a partir del cual las neoplasias
colónicas podrían desarrollarse
e) este cambio podría reflejar la diseminación intraluminal del tumor colónico(500).
La reactividad de las lectinas en la mucosa adyacente a los tumores muestra

diferencias evidentes en relación a la mucosa normal no tratada. Sin embargo, estas
alteraciones son menos evidentes respecto a la mucosa macroscópicamente normal de ratas
tratadas con DMH y en múltiples ocasiones presentan un enlace similar, aunque no idéntico.
Las diferencias más notables en el enlace a nivel de la mucosa transicional se han
observado en el ciego y colon ascendente con la lectina UEA-I con disminución de enlace
respecto a la mucosa control no tratada y la macroscópicamente normal tratada con DMH.
Mostrando en general esta lectina una reactividad disminuida respecto a la mucosa tumoral
en todos los segmentos. A nivel del ciego es también evidente un mayor enlace de la PNA a
nivel de la mucosa transicional respecto a la tratada del mismo segmento. Por el contrario, en
el ciego la MT enlazada a GSA-II se comporta de forma idéntica a la tratada con el
carcinógeno.
169
Estos hallazgos sugieren que los cambios en los glicoconjugados de la mucosa
transicional de los tumores inducidos por DMH son similares a los de la mucosa
macroscópicamente normal. Es más, en este modelo animal el concepto "mucosa
transicional" dejaría de ser válido, y se referiría a un cambio premaligno difuso de la mucosa.
V. 2. 2. Glicoconjugados de la superficie epitelial
El MES ha tenido una penetración relativamente limitada en el área de la

inmunocitoquímica y la histoquímica con lectinas. La capacidad de emparejar la tecnología
de la inmunocitoquímica al MES ofrece un gran potencial para ampliar el repertorio de
información útil que puede ser obtenida a partir de procedimientos de marcado inmuno y no
inmunocitológicos.
La observación por MES en modo de retrodispersados de las lectinas SBA y UEA-I

conjugadas con oro coloidal ha mostrado una vez más las diferencias regionales existentes en
el intestino grueso normal de la rata.
En ocasiones la mucina de la superficie epitelial no muestra enlace de lectinas y es la
mucosa que emerge de la cripta la que sí lo hace, mostrando la afinidad por las lectinas de la
mucina de las capas más profundas.
Las lectinas GSA-II y PNA han mostrado ausencia de reactividad en toda la mucosa
colónica. La capa mucinosa de la superficie colónica epitelial de ratas Sprague-Dawley no
han expresado las estructura N-acetilglucosamina y D-Gal-A (1-3) D-GalNAc.
2. 2. 2. Mucosa tumoral
El patrón de unión de las lectinas a los carcinomas se han caracterizado por

positividad de la SBA en 77,80% de los casos, de la GSA-II en 28,60%, PNA en 57,20% y
UEA-I en 60%.
Se observa por lo tanto, una disminución en la positividad de los tumores observados
por MES, respecto a los mismos observados por microscopía óptica.
Las lectinas GSA-II y PNA mostraron las mayores diferencias al ser positivos los tumores
respecto a la mucosa normal no tratada que era negativa.
Al igual que en los hallazgos en microscopía óptica, se observó reactividad de los
tumores de colon descendente para la UEA-I, indicando la síntesis de glicoconjugados con
residuos α-L-Fucosa en el terminal no reducido de las cadenas oligosacáridos en la mucina
del epitelio superficial tumoral, los cuales no estaban presentes en condiciones normales.
2. 2. 3. Mucosa macroscópicamente normal de ratas inyectadas con DMH
Los diferentes segmentos colónicos sufrieron un distinto comportamiento a lo largo

de las semanas de inducción del carcinógeno.
Las principales diferencias se observaron en la lectina GSA-II en todos los segmentos
y se apreciaron desde etapas precoces de la carcinogénesis, respecto a la mucosa normal
observada por BES que era negativa para esta lectina.
La SBA mantuvo su patrón de enlace en el ciego, y se observó un aumento de la
reactividad en el resto de los segmentos.
Se observó enlace de la lectina PNA a la mucina de la superficie epitelial,
170
predominando en el ciego y en el colon descendente.
El colon descendente de ratas tratadas con DMH expresa UEA-I desde las primeras
semanas de inducción del carcinógeno.
En general, la detección de glicoconjugados de superficie del colon de rata mediante
MES en modo de BES aporta mayor sensibilidad e información adicional a la observación
con microscoscopía óptica convencional.
V. 3. Citometría de flujo
Durante la pasada década, el análisis del contenido de ADN mediante técnicas de

CMF se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en el constante intento por parte de
los investigadores y de los clínicos de encontrar nuevos factores pronósticos en las distintas
neoplasias y en concreto en el cáncer de colon. Identificar grupos de pacientes con alto riesgo
para desarrollar recidiva local o metástasis a distancia es hoy en día de gran importancia para
indicar tratamientos de radioterapia y quimioterapia adyuvante.
V. 3. 1. Valor del estudio del contenido en adn de las neoplasias colónicas inducidas
experimentalmente con 1,2-dimetilhidracina en la rata
Pocos estudios hablan de la citometría de flujo de los tumores de colon inducidos con
DMH en ratas.
Fischbach et al.(585) estudian 39 carcinomas y 27 adenomas de colon inducidos en
ratas con DMH, encontrando un único caso de carcinoma "casi diploide". El resto de las
lesiones mostraron un patrón diploide de DNA. Estos resultados son similares a los obtenidos
en nuestra serie, en la que todos los tumores son diploides.
Estos hallazgos difieren de los observados en el cáncer de colon humano, con cifras
de aneuploidia según las series que oscila entre un 39 y un 82%(516),(507). A pesar de la
similitud histológica de los tumores inducidos en la rata con DMH y los tumores humanos
existen evidentes diferencias en la morfología biológica.
Las teorías carcinogénicas del cáncer de colon inducido por DMH sostienen un
proceso en dos etapas. Cada inyección de DMH entra en interacciones inespecíficas con el
ADN y es capaz de producir una mutación somática y en una segunda etapa se expresaría el
fenotipo cáncer(193). Si esta teoría es acertada, una posible explicación a la presencia de
tumores diploides en la rata podría atribuirse a los límites de resolución del análisis del
contenido de ADN con las técnicas de citometría de flujo (una variación determinada de 0,05
en el índice de ADN representa 1 cromosoma), y en los tumores que han sufrido una
traslocación u otros cambios genómicos no reflejados en el contenido de ADN o número de
cromosomas(508).
V. 3. 2. Valor del estudio de la proliferación celular por citometría de flujo
Para la valoración de la actividad proliferativa se ha empleado la cuantificación del

porcentaje de células en fase S y el denominado índice de proliferación, resultado de sumar el
porcentaje de células en fase S y en fase G2M.
Ambos parámetros han demostrado ser válidos para la evaluación de la proliferación
en neoplasias humanas y animales(539), pero se ha sugerido que podría ser más fiable el uso
del porcentaje de células en fase S que el índice de proliferación, debido a la mayor
variabilidad y dispersión de los resultados de la fase G2M respecto a la fase S en el estudio de
171
los histogramas del ciclo celular. La variabilidad en la medición de la fase G2M puede
provocar un aumento en la dispersión de los valores del índice de proliferación y la pérdida
de significación de las pruebas estadísticas(586),(587).
En nuestro estudio se han calculado ambos parámetros, con comportamiento similar
en el estudio estadístico, pero no idéntico.
Aunque la actividad proliferativa de un tumor puede ser un determinante pronóstico
más completo que el contenido en ADN(515),(582) , pocos investigadores han utilizado la
medida de la proliferación celular en el cáncer colorrectal humano y de rata(540),(588).
En las neoplasias aneuploides se observa un aumento de la fase S, sin embargo, en
estos casos debe interpretarse con precaución, puesto que podría deberse al remanente de
células diploides de la mucosa en la distribución del DNA(544). En los tumores diploides, al
contrario, se hace imprescindible considerar el porcentaje de células en fase S y el índice de
proliferación celular. En el cáncer colorrectal humano un alto índice de proliferación es un
factor pronóstico independiente desfavorable(543).
En los últimos años diversos estudios han sugerido que en el proceso de
carcinogénesis colorrectal existe una alteración difusa de la mucosa de dicho segmento
digestivo con un patrón proliferativo alterado que precede a la aparición del cáncer. Se han
utilizado diversos métodos para detectar esta anomalía, como son el estudio de la
proliferación de sialomucinas, la actividad de enzima ornitina-decarboxilasa, el índice de
captación de timidina, técnicas de citofotometría y citometría de flujo, entre otros(589).
Es conocido que la DMH y otros carcinógenos colónicos conducen a una
proliferación celular aumentada(317), lo que es crítico para el proceso de
carcinogénesis(166), al existir un mayor contenido de células en el ciclo mitótico que podrían
estar en mayor riesgo de transformación maligna(590).
Básicamente, el colon tiene un nivel relativamente alto de renovación celular. El
efecto de altos niveles de proliferación es producir más células en fase S, que son sensibles a
daño en el ADN, para aumentar el riesgo de transformación neoplásica y acortar el periodo de
latencia del tumor(591).
En los tumores experimentales hay un aumento de la proporción de células en
proliferación (S+G2M) con progresión del centro a la periferia medidos por el índice de
timidina tritiada(508). En nuestro estudio, los tumores de intestino grueso de la rata muestran
un índice de proliferación superior al de las muestras normales control e inyectadas con
EDTA, sin embargo, un índice de proliferación superior ha sido observado en muestras
tratadas no tumorales, una posible explicación sería que la mucosa tumoral pierde en parte su
capacidad de proliferación frente a las células alteradas no tumorales que aumentan su
proliferación y por tanto continúan en riesgo de transformación neoplásica.
Las diferencias observadas en los estudios de fase S entre el índice de marcado de
timidina tritiada y la citometría de flujo pueden deberse a la difusión del radioisótopo por
todo el tumor, y se piensa que algunas células tumorales pueden tener baja o ausente
actividad sintética de DNA, comparada con las células en fase S0 durante la meseta del
crecimiento in vitro(508).
La localización tumoral tiene relación con los resultados citométricos si consideramos
el índice de proliferación, mostrando los tumores de colon ascendente menor tasa de
proliferación y los de ciego la mayor tasa. La fase S no muestra diferencias significativas,
aunque sí es menor también en el mismo segmento. En el colon normal de ratas control no
tratadas, en cambio, es el porcentaje de células en fase S el que muestra diferencias respecto a
los segmentos colónicos, siendo también las muestras de colon ascendente las de menor
proliferación y las de colon descendente las que presentan fases S más altas.
172
Este dato, es inesperado teniendo en cuenta que en el colon ascendente es donde se da
una tasa más alta de tumores colónicos en la rata en este estudio. Glickman et al(592) usando
cepas de ratones con susceptibilidad genética a la DMH diferente, demuestran que la
susceptibilidad a la carcinogénesis por DMH puede ser predicha por las características
proliferativas fisiológicas de la mucosa colónica.
El alto índice de proliferación observado en las muestras de ciego macroscópicamente
normal podría explicarse por la mayor presencia de focos de predisplasia y lesión difusa de la
mucosa con pérdida de células caliciformes observadas en este segmento.
En el cáncer colorrectal humano García et al(540) encuentran diferencias
significativas en el porcentaje de células en fase S entre la localización colónica y rectal,
siendo ésta superior en el recto, estos hallazgos podrían ser compatibles con los observados
en el presente estudio.
Diversos autores(314),(577) ,(593) han descrito diferencias regionales en los
parámetros de proliferación usando otras técnicas. Sin embargo, mientras Sandford(577)
describe un aumento del compartimento de proliferación celular mucho más evidente en el
colon distal, atribuyéndolo a una inadecuada o ausente represión de la síntesis de ADN,
McGarrity(593) describe diferencias regionales en los animales control. De forma que los
parámetros de proliferación cambian en paralelo en todas las regiones durante la
carcinogénesis.
Los resultados obtenidos por citometría de flujo de los distintos segmentos colónicos
no corroboran el cambio en paralelo desde muestras control a muestras tumorales o muestras
colónicas macroscópicamente normales de ratas inyectadas. Es más, tanto el porcentaje de
células en fase S como el índice de proliferación sufren una ligera disminución en el colon
descendente tumoral y algo más evidente en el colon normal de ratas tratadas con DMH. El
mayor aumento de ambos parámetros se da en el colon transverso normal y tumoral. Este
distinto comportamiento de los tumores proximales y distales podría ser debido a un origen
distinto de los mismos o a que los tumores de colon descendente necesitan un periodo de
inducción tumoral superior.
El aspecto macroscópico y el tamaño tumoral no guardan relación con los parámetros
de proliferación.
El porcentaje medio de células en fase S y el índice de proliferación no es
significativamente distintos entre los diferentes grupos de malignidad histológica, ni grado de
diferenciación. Estos estudios corroboran los encontrados por otros autores para el cáncer
colorrectal humano(537),(538) ,(542).
Todos los tumores estudiados por citometría de flujo eran invasivos. No se ha
observado la presencia de parámetros de proliferación aumentados en estadios avanzados de
Dukes y tumores metastásicos. En el cáncer humano altas fases S se corresponden a un mayor
grado invasivo, con tumores en estadios C y D de Dukes(529),(540).
No se ha observado cambios significativos en los parámetros de proliferación según
las semanas de exposición al carcinógeno en los tumores colorrectales.
El aspecto macroscópico y el tamaño tumoral no guardan relación con los parámetros
de proliferación.
Aunque las diferencias en los parámetros de proliferación no son significativas entre
los tumores asociados a placa linfoide y los que no lo están. Los valores medios de fase S son
superiores en las neoplasias asociadas a nódulo linfoide. Se postula que los agregados
linfoides alteran la cinética epitelial celular local y que además están asociados con
fenestraciones en la membrana basal, factores favorecedores de la aparición de neoplasias
colónicas(299).
173
Los valores de fase S de la mucosa normal y tumoral inyectada con DMH durante los
mismos periodos de tiempo son similares, sugiriendo una alteración del patrón de
proliferación celular a todos los niveles, por consiguiente existen alteraciones con potencial
carcinógeno a nivel de toda la mucosa. Hallazgos similares se han encontrado en mucosa
sana de pacientes con cáncer colorrectal(588). Los resultados difieren de los publicados por
Fishbach(585) con un notable aumento del porcentaje de fase S en las muestras tumorales
respecto a la mucosa normal de ratas expuestas a DMH.
Se han observado diferencias entre los parámetros de proliferación y los grupos de
estudio.
Los estudios de la fase S encuentran diferencias entre la mucosa normal (sin
tratamiento o inyectada con EDTA), y la mucosa inyectada con DMH durante 21 semanas,
tanto normal como tumoral. No observándose diferencias con la mucosa normal de ratas
inyectadas hasta la octava semana de inyección. Estos datos irían en contra de otros
publicados usando técnicas distintas en que la DMH induciría proliferación celular en etapas
precoces de la carcinogénesis(204),(594). Mediante la citología de análisis de imagen de
fluorescencia cuantitativa (QFIA), técnica que combina el examen citológico con
cuantificación de contenido en ADN en células exfoliadas, se ha observado un aumento del
contenido en ADN a partir de la segunda semana de inyección del carcinógeno(595). En este
estudio el valor medio del porcentaje de células en fase S es menor al de la mucosa normal y
corroboraría los resultados de Baril et al(596): entre los 28 y 35 días después de la primera
inyección del carcinógeno se produce un aumento en el número de células en fase S y a partir
de los 35 días se produce un paradójico y progresivo descenso en todos los compartimentos
celulares de los valores de fase S. Datos similares han sido publicados por Deschner(211).
Otra posible explicación a las diferencias a estos resultados podría deberse al
momento del sacrificio después de la inyección puesto que se ha descrito mediante el índice
de timidina tritiada que el aumento en la capacidad proliferativa ocurre dentro de un corto
espacio de tiempo tras la exposición a la DMH y sería el resultado de la reparación de la
ruptura de las cadenas de ADN, reemplazo de las células que fueron destruidas por el
carcinógeno o alargamiento de la población de células proliferativas debido al estímulo de la
actividad mitótica en la base de las glándulas. Sandforth et al(577) describen una correlación
entre el aumento en la proliferación celular y la duración de exposición al carcinógeno con
una meseta después de las 24 semanas. Otros autores describen una caída en el índice
mitótico después de 48 horas de exposición al carcinógeno. En el presente estudio los
animales recogidos en etapas precoces de la carcinogénesis eran sacrificados una semana
después de la última inyección(577).
En todos los grupos de estudio las medias del porcentaje de células en fase S son
inferiores a los publicados previamente(588).
Los estudios estadísticos del índice de proliferación proporcionan resultados
inesperados, con diferencias significativas en los valores medios del IP entre la mucosa
normal y tumoral de ratas inyectadas con DMH, y con diferencias entre los dos grupos
control. En estos aspectos parece que los resultados obtenidos con el estudio del porcentaje
de células en fase S son más coherentes, y en las lesiones inducidas con DMH es preferible el
uso de la fase S para la medición de la proliferación celular.
174
VI. Conclusiones
PRIMERA: Los tumores colorrectales inducidos con dosis de 21 mg/kg/semana en
inyección subcutánea durante 20 semanas de 1,2-Dimetilhidracina aparecen de novo
sobre la mucosa plana o a partir de glándulas displásicas relacionadas con placas linfoides.
No se observa la secuencia pólipo-cáncer en este modelo experimental.
SEGUNDA: El número de tumores de intestino grueso y delgado, el número de metástasis y

la distribución de los tumores depende de las dosis de inducción tumoral con
Dimetilhidracina.
TERCERA: En la mucosa normal de rata la afinidad de las lectinas muestra diferencias

regionales entre los cuatro segmentos colónicos, y entre las células de los distintos niveles de
las criptas. Estas diferencias sugieren variaciones en el estado de glicosilación de los
glicoconjugados en relación a la diferenciación celular y al segmento anatómico del intestino
grueso.
CUARTA: Los patrones de reactividad de las lectinas en los carcinomas de intestino grueso
difieren notablemente de la mucosa normal no tratada con carcinógeno. La PNA modifica la
reactividad de los tumores de todos los segmentos anatómicos, mientras que el cambio de
patrón de la UEA-I queda confinado en los tumores de los segmentos distales.
QUINTA: La localización tumoral no representa variaciones sustanciales en el patrón de

reactividad de las lectinas.
SEXTA: Los patrones normales de reactividad de las lectinas sufren cambios progresivos
con la inducción tumoral con DMH. La PNA altera su patrón de unión a lo largo de las
criptas y en todos los segmentos, y la UEA-I se expresa en los segmentos distales. La
observación con MES en forma de retrodispersados confirma un cambio precoz en los
patrones de reactividad de las lectinas.
SÉPTIMA: En líneas generales, los glicoconjugados de la mucosa transicional del intestino

grueso de la rata difieren de la mucosa normal no tratada y neoplásica.
OCTAVA: Los patrones en la distribución de los glicoconjugados de los focos de

predisplasia y de las glándulas atípicas asociadas a placa linfoide son diferentes a los de la
mucosa normal y tumoral, y difieren entre ellos. Es decir, son dos lesiones potencialmente
neoplásicas con diferente estado de glicosilación.
NOVENA: Los glicoconjugados de la mucosa transicional del intestino grueso de la rata

muestra un patrón similar al observado en la mucosa macroscópicamente normal de ratas
inyectadas con DMH, estos cambios expresan un cambio premaligno del epitelio.
DÉCIMA: La expresión de glicoconjugados en tumores de rata es independiente del tipo

histológico, grado de diferenciación y estadio de Dukes.
UNDÉCIMA: Los tumores de intestino grueso inducidos con DMH en ratas son diploides
por citometría de flujo. Son tumores biológicamente diferentes a los humanos.
175
DUODÉCIMA: En muestras de colon normal y tumoral se observan diferencias regionales
en los parámetros de proliferación celular.
DECIMOTERCERA: El porcentaje de células en fase S del colon tumoral y

macroscópicamente normal de ratas tratadas con DMH son similares, sugiriendo que existe
un cambio premaligno difuso del epitelio con características proliferativas semejantes al
maligno.
DECIMOCUARTA: Los parámetros de proliferación celular en los tumores inducidos con

DMH en la rata no muestran diferencias respecto al tipo histológico, grado de diferenciación
y Dukes.
Como CONCLUSIÓN FINAL del trabajo de investigación realizado se puede:
1. Confirmar la primera hipótesis, pues se ha comprobado que la mucosa colónica

macroscópicamente normal de rata exhibe cambios secuenciales en la expresión de
glicoconjugados en las etapas preneoplásicas, precursoras de la aparición tumoral.
2. Confirmar también la segunda hipótesis, al haber obtenido un patrón de enlace alterado en
las criptas aberrantes y focos de displasia asociados a placa linfoide.
3. Confirmar parcialmente la tercera hipótesis puesto que si bien el estudio por citometría de
flujo muestra diferencias respecto al segmento estudiado del colon, en cambio no se observan
respecto al resto de variables clínicas y anatomopatológicas.
4. Rechazar la cuarta hipótesis, puesto que no existen cambios evidentes por citometría de
flujo de las muestras macroscópicamente normales en etapas preneoplásicas, respecto al
grupo control.
176
VII. Resumen
El cáncer colorrectal es la tercera causa de mortalidad y morbilidad en los países
occidentales(1),(2). En el pasado la información relacionada con esta alteración se ha
derivado en gran medida de la observación clínica. La dificultad de realizar estudios
prospectivos de los factores etiopatogénicos del cáncer de colon humano, hace necesario la
inducción de neoplasias colónicas experimentales en animales con carcinógenos químicos.
Estos estudios han aportado medios adicionales para investigar algunas de las características
biológicas de estos tumores. La 1, 2-Dimetilhidracina es un carcinógeno efectivo y selectivo
de colon en inyección subcutánea en la rata(193). Los tumores colónicos inducidos con DMH
en roedores muestran remarcable semejanza histopatológica con la neoplasia humana(206).
Diversas evidencias experimentales sugieren que la carcinogénesis incluye una serie
de cambios secuenciales celulares con diferentes propiedades biológicas, bioquímicas y
morfológicas respecto a las células normales.
Estudios bioquímicos(328) e histoquímicos(575),(589) , han demostrado que la
transformación neoplásica de la mucosa colónica tratada con DMH está asociada con
importantes cambios en la composición de los glicoconjugados y actividad de las
glicosiltransferasas. Sin embargo, los métodos histoquímicos clásicos no permiten
discriminar los diferentes carbohidratos que componen los glicoconjugados ni los cambios
asociados a la transformación neoplásica. La aplicación de las lectinas en secciones de
intestino grueso permite observar diversos patrones de localización celular y subcelular de los
glicoconjugados del epitelio colónico(463).
En la pasada década la posibilidad de realizar estudios citométricos en muestras
parafinadas ha facilitado la realización de estudios prospectivos para conocer nuevos factores
predictivos de la evolución de pacientes con cáncer colorrectal.
El conocimiento de la cinética celular de los tumores colónicos y de la mucosa
expuesta a la DMH en roedores mediante citometría de flujo, y de los glicoconjugados
mediante lectinas pueden proporcionar claves en la patogenia del cáncer de colon y ayudar a
una pronta detección de la transformación neoplásica.
MATERIAL Y MÉTODO
Animales y diseño experimental

172 Ratas Sprague-Dawley de 10 semanas de vida alimentadas con dieta standard de
laboratorio y agua ad libitum, se dividieron en varios grupos de estudio:
Grupo A: 10 ratas control sin tratamiento, sacrificadas con dosis letal de hidrato de
cloral entre las 34 y 44 semanas de vida.
Grupo B: 42 ratas recibieron inyecciones s.c. de 1,2-Dimetilhidracina (SIGMA®) a
dosis de 21 mg/kg/semana disuelto en EDTA a pH 6,5 durante 20 semanas, con sacrificio
entre las 24 y 34 semanas de la primera inyección.
Grupo C: 60 animales recibieron iguales dosis de carcinógeno y se sacrificaron cada 2
semanas hasta la 30 de la primera inyección.
Grupo D: 20 ratas fueron inyectadas con DMH a dosis de 10mg/kg/semana durante 20
semanas y sacrificadas entre las 24 y 36 semanas de la primera exposición.
Grupo E: 20 ratas recibieron inyección de EDTA exclusivamente y se sacrificaron en
los mismos periodos que las ratas del grupo B.
Se extrajo el colon y se tomaron muestras de los cuatro segmentos (ciego, colon

177
ascendente, colon transverso y colon descendente) de aspecto macroscópicamente normal y
de todos los tumores. Para su inclusión en parafina la muestras fueron fijadas con formalina
al 4 %, mientras que las muestras destinadas a microscopía electrónica de scanning se fijaron
con una solución de paraformaldehido al 4 % y glutaraldehido al 1 % (0,1 M) en tampón
fosfato monosódico/bisódico 0,2 M a pH 7,4 durante 24 horas.
Investigaciones morfológicas
Las muestras incluidas en parafina y en secciones de 5 Wm fueron teñidas con
hematoxilina-eosina, para la clasificación de los tumores y para observar la presencia de
lesiones sobre mucosa aparentemente normal mediante microscopía óptica convencional.
Para la observación ultraestructural con microscopía electrónica de scanning las
muestras se lavaron con tampón fosfato y se deshidrataron en concentraciones crecientes de
alcohol y se sometieron a punto crítico. Las muestras se recubrieron con una capa fina de oro
y se montaron de forma convencional.
Métodos citoquímicos
Secciones de parafina de muestras normales y tumorales fueron teñidas mediante el
método PAS-AB para diferenciar la presencia de mucinas ácidas y neutras en la mucina de
las células caliciformes(564).
Métodos histoquímicos con lectinas

Para el estudio de los glicoconjugados se han usado las lectinas Glycine max (SBA),
Griffonia sinplicifolia-II (GSA-II), Arachis hypogaea (PNA) y Ulex europaeus-I (UEA-I)
(SIGMA®) conjugadas con oro coloidal de 30 nm según el método de Frens(421), usando
como agente reductor citrato trisódico. Se ha ajustado el pH del oro coloidal al punto
isoeléctrico (pI) de cada una de las lectinas(566) y se ha determinado la cantidad óptima de
lectina necesaria para estabilizar la solución mediante el test de floculación de la sal(567). La
solución se ultracentrifuga a 45.000 r.p.m. durante 45 minutos a 4º C, y se extrae el pellet o
complejo-proteína oro. Posteriormente se realiza un banco de diluciones para obtener la
concentración óptima de lectina, siendo ésta la que conduce a una absorbancia de 0,40-0,42
medida por convenio a una densidad óptica de 520 nm(497). Los complejos lectina-oro en
PBS se suplementan con 1 mM de Cloruro Cálcico y 1 nM de Cloruro Magnésico más 0,5 %
de albúmina bovina, puesto que algunas lectinas necesitan la presencia de estos metales
pesados para mantener un localización de enlace activa; y 0,05 % de TWEEN 20 (SIGMA®),
para inhibir la interacción del enlace de lectina con carbohidratos a través de enlaces
hidrofóbicos. Se practicaron controles de especificidad, con incubaciones control con los
azúcares correspondientes para cada lectina.
Microscopía óptica: Se incuban los portas desparafinados e hidratados con el

complejo lectina-oro durante 45 minutos a temperatura ambiente.
Las muestras de cada uno de los cuatro segmentos normales e inyectadas con DMH,
así como de todos los tumores se han observado con microscopía óptica convencional tras
intensificación con plata (Silver Enhacing kit, BIOCELL®)
Microscopía electrónica de scanning: Las muestras se lavan con tampón fosfato, se

tratan con cloruro amónico 0,15 M durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear
los grupos aldehído, se lavan de nuevo con PBS y se incuban durante 45 minutos a
temperatura con el complejo lectina-oro. Se realizan nuevos lavados con PBS y se procede a
178
la deshidratación y recubrimiento de las muestras con una capa fina de carbón.
Se observaron con microscopía electrónica de scanning (MES) (JSM 840, JEOL® y
S2300, HITACHI®) en modo de imagen de electrones retrodispersados los glicoconjugados
enlazados a lectina de la superficie epitelial de la mucosa colónica de los mismos segmentos,
tanto de la mucosa normal, como tumoral y macroscópicamente normal de ratas inyectadas
con DMH en etapas sucesivas de la carcinogénesis.
Citometría de flujo
Para el procesado de las muestras parafinadas de colon de rata por CMF se usó una
modificación de la técnica de Hedley(481). Se obtuvieron secciones de tejido de 50 m, se
desparafinaron con xilol y rehidrataron con concentraciones decrecientes de etanol. Las
muestras fueron disgregadas mecánicamente con la ayuda de un bisturí y tratadas con pepsina
al 0,5 % en cloruro sódico al 9 % a pH 1,5 durante 45 minutos al baño María. Posteriormente,
se centrifugaron durante 10 minutos a 2.000 r.p.m. a temperatura ambiente y el tejido se
resuspendió en PBS agitando con un vórtex y se filtró con una malla de nylon de 50 Wm de
poro y se resuspende con yoduro de propidio y RNAasa (DNA prep Reagent, COULTER®).
Para el análisis se ha empleado un citómetro de flujo EPICS PROFILE I (COULTER®), para
cada histograma se adquirieron un total de 50.000 eventos. Se identificó la presencia de uno o
más picos de células en fase G0G1. Para la interpretación del ciclo celular se empleó el
programa informático MUTICYCLE®, Phoenix Flow Systems.
Se excluyeron del estudio los histogramas con un coeficiente de variación del pico
G0G1@10, no se obtuvo un pico reconocible de G0G1, existía una pobre discriminación del
ruido de fondo o el número de núcleos adquiridos era inferior a 25.000.
Análisis estadístico
Con todos los parámetros recogidos se construyó una base de datos matricial e
informatizada y se realizó el estudio estadístico de los datos con el programa informático
SPSS para Windows (SPSS Inc, MICROSOFT®). El grado de significación se ha establecido
para una p @ 0,05. Las variables cualitativas se han estudiado mediante una prueba de
independencia de m2 , con corrección de Yates o la prueba exacta de Fischer. Para el estudio
de relación entre variables cualitativas y cuantitativas se ha empleado la prueba de Kruskal-
Wallis y modelos de regresión lineal simple para el estudio entre variables cuantitativas(570).
RESULTADOS
Aspectos morfológicos
Microscopía óptica: Los animales de los grupos control A y E no presentaron lesiones
neoplásicas. En la tabla siguiente se resumen los resultados para cada uno de los grupos
inyectados con DMH.
Dieciséis animales del grupo B (50 %) presentaron metástasis. Un 8,45 % de las
lesiones benignas y malignas se asociaban a placa linfoide.
Variable Categoría GRUPO B GRUPO C GRUPO D
Localización Ciego 7 (9,8 %) 14 (21,5 %) 4 (28,6 %)
C. Ascendente 27 (38,1 %) 12 (18,5 %) 8 (57,1 %)
C. Transverso 18 (25,3 %) 21 (32,3 %) 2 (14,3 %)
179
C. Descendente 19 (26,8 %) 18 (27,7 %)
Proximal 34 (47,9 %) 26 (40,0 %) 12 (85,7 %)
Distal 37 (52,1 %) 39 (60,0 %) 2 (14,3 %)
Macroscopía P. pediculado 19 (27,5 %) 10 (22,2 %) 1 (7,1 %)
P. sesil 13 (18,9 %) 22 (48,9 %) 6 (42,9 %)
T. exofítico 27 (39,1 %) 11 (24,5 %) 5 (35,7 %)
T. ulcerado 10 (14,5 %) 2 (44,4 %) 2 (14,3 %)
Tamaño * @ 0,8 cm 49 (69,0 %) 32 (74,4 %) 10 (71,4 %)
> 0,8 cm 22 (31,0 %) 11 (25,6 %) 4 (28,6 %)
Tipo histológico Adenocarcinoma 31 (43,7 %) 12 (18,5 %) 3 (21,4 %)
C. mucinoso 21 (29,6 %) 9 (13,8 %) 7 (50,0 %)
C. in situ 5 (7.0 %) 5 (7,7 %)
Adenoma l (1,4 %)
D. leve l (1,4 %) 8 (12,3 %)
D. moderada 8 (11,3 %) 24 (36,9 %) 4 (28,6 %)
D. severa 4 (5,6 %) 7 (10,8 %)
Lesión benigna 14 (19,7 %) 39 (60,0 %) 4 (28,6 %)
Lesión maligna 57 (80,3 %) 26 (40,0 %) 10 (71,4 %)
Diferenciación Moderado 24 (77,4 %) 12 (100 %) l (33,3 %)
Poco 7 (22,6 %) 2 (66,67 %)
Dukes A 18 (34,7 %) 5 (23,8 %) 5 (50,0 %)
B 15 (28,8 %) 13 (61,9 %) 2 (20,0 %)
C 19 (36,5 %) 3 (14,3 %) 3 (30,0 %)
Placa si 6 (8,4 %) 26 (40,0 %) 5 (35,7 %)
no 65 (91,6 %) 39 (60,0 %) 9 (64,3 %)
Tumores sincrónicos si 56 (78,8 %) 52 (80,0 %) 5 (35,7 %)
no 15 (21,2 %) 13 (13,0 %) 9 (64,3 %)
Tumores I. Delgado si 41 (57,7 %) 19 (29,2 %) 2 (4,3 %)
no 30 (42,3 %) 46 (70,8 %) 12 (85,7 %)
SBA si 23 (76,7 %) 19 (90,5 %) 8 (88,9 %)
no 7 (23,3 %) 2 (9,5 %) 1 (11,1 %)
GSA-II si 23 (79,3 %) 15 (78,9 %) 5 (71,4 %)
no 6 (20,7 %) 4 (21,1 %) 2 (28,6 %)
PNA si 16 (88,9 %) 12 (57,1 %) 4 (100 %)

180
no 2 (11,1 %) 9 (42,9 %)
UEA-I si 23 (74,2 %) 19 (86,4 %) 7 (100 %)
no 8 (25,8 %) 3(13,6 %)
Tabla 7-1
Variables estudiadas para cada grupo inyectado con DMH.
La mucosa macroscópicamente normal de ratas tratadas con DMH (grupo B)

observada por MO exhibe cambios importantes respecto a la normal, con hipercromatismo,
pseudoestratificación, alto índice mitótico y pérdida de moco muy evidente. También se
observa la presencia de focos de criptas aberrantes.
En el grupo C se observó la presencia de lesiones benignas sobre mucosa de aspecto
sano a partir de la sexta semana de tratamiento, el primer tumor maligno se observó a las 16
semanas.
La mucosa de aspecto normal muestra alteraciones precoces tras la inducción tumoral
con DMH, a las 2 semanas se observaron grupos de criptas aberrantes en la zona apical. El
ciego exhibió disminución de la cantidad de moco, hipercromatismo y aumento del tamaño
nuclear, estando los otros segmentos más conservados y apareciendo lesiones cada vez más
evidentes. En este grupo el 8,47 % de las ratas presentaron metástasis. El 40% de las lesiones
se asociaban a placa linfoide.
En el grupo D el 55 % de los animales presentaron tumoraciones colónicas. Se
observaron tres adenocarcinomas y 7 carcinomas mucinosos. El 14,28 % de las ratas
presentaron metástasis. La mucosa normal de este grupo mostraba una arquitectura más
conservada que la del grupo B.
Microscopía electrónica: El estudio de la superficie epitelial del colon de rata tratado

con dosis de 21 mg/kg/semana de DMH muestra una pérdida (fenestraciones) o ausencia del
moco que recubre la mucosa. Se observa una pérdida de microvellosidades y células
caliciformes, sobre todo en el ciego, y una desestructuración de los pliegues de la mucosa. El
epitelio colónico de ratas tratadas con DMH a dosis de mg/kg/semana se mostró mejor
conservado que el de las ratas que recibieron altas dosis.
Las lesiones tumorales se muestran como grupos de células que protruyen en la luz,
acompañadas de depresiones del epitelio. Las células absortivas pierden su aspecto poligonal
y las aberturas crípticas están distorsionadas y comprimidas, y disminuidas en número o
ausentes.
Histoquímica con la tinción AB-PAS

Evidentes diferencias regionales y distinta distribución a lo largo de la cripta se han
observado con esta tinción en el colon de rata normal.
La mucosa normal de ratas tratadas con DMH a dosis altas mostró disminución de la
tinción de las mucinas ácidas y neutras, siendo estas alteraciones más evidentes en el ciego.
En general se observó una disminución en la intensidad de tinción de la secuencia
AB-PAS en las ratas del grupo D, manteniéndose la positividad para la tinción AB y siendo
más evidente la disminución de las mucinas neutras.
Histoquímica con lectinas

Microscopía óptica: La observación del colon de rata normal incubado con lectinas
181
muestra un patrón característico para cada una de ellas. Las lectinas SBA, GSA-II y PNA
muestran enlace en toda la longitud del epitelio colónico, mientras que el colon descendente
no muestra reactividad para la UEA-I. Se observan diferencias de enlace locales, a lo largo de
la cripta. La GSA-II se encuentra a nivel basal, excepto en colon ascendente en que se
expresa en toda la longitud. La UEA-I se expresa en toda su longitud en el ciego y es basal en
colon ascendente.
La expresión de enlace de los tumores según los grupos se muestra en la Tabla 7-1.
En la mucosa macroscópicamente normal de ratas en etapas preneoplásicas no se
observaron cambios destacables en el patrón de enlace de la lectina SBA y GSA-II, por el
contrario la PNA se expresó a nivel del citoplasma de las células caliciformes en etapas
precoces de la carcinogénesis, así como la lectina UEA-I que mostró reactividad en el colon
descendente a partir de la semana 16.
Microscopía electrónica de scanning: La observación en modo de electrones

retrodispersados de la superficie epitelial del colon normal muestra evidentes diferencias
regionales en la expresión de glicoconjugados. Las lectinas SBA y UEA-I se expresan en
mayor medida a nivel del ciego. No se observa reactividad para las lectinas GSA-II y PNA.
Las muestras de aspecto normal del grupo C exhibieron cambios precoces en la
expresión de lectinas respecto a la mucosa normal. Se hizo presente la reactividad de GSA-II
y PNA, y SBA y UEA-I se expresaron en toda la longitud del colon.
Citometría de flujo
DMH- DMH-
Normal Normal Tumor EDTA Preneoplásico
GOG 1 83,1 86,6 87,5 89,61 89,96

G2M 5,03 5,91 4,84 4,72 3,95
S 6,21 7,43 7,65 5,66 6,07
IP 11,25 11,25 12,49 10,38 10,03
Tabla 7-2
Porcentaje medio de las fases del ciclo celular e IP de los
grupos de estudio.
Estudio comparativo
El tipo histológico muestra diferencias significativas en cuento a la localización
tumoral, siendo más frecuente la presencia de adenocarcinomas en el colon descendente. El
tamaño tumoral guarda relación con el aspecto macroscópico y con el tipo histológico
tumoral. Los carcinomas mucinosos se encuentran con mayor frecuencia en Dukes C. El
enlace de lectinas no muestra relación con ninguna de las variables anatomopatológicas: tipo
histológico, grado de diferenciación o estadio de Dukes.
En el grupo D no se observó ningún tumor a nivel de colon descendente, se observa
un predominio de la localización proximal cuando se administran bajas dosis de carcinógeno.
En el grupo B se observó una mayoría de tumores exofíticos, mientras que en el grupo C eran
de tipo polipoideo, siendo estas diferencias significativas. No existen diferencias
significativas entre los grupos de estudio y la presencia de tumores malignos. El grupo B
muestra una mayoría de lesiones asociadas a otros tumores colorrectales y de intestino
182
delgado sincrónicos. El grupo de estudio en etapas preneoplásicas muestra una mayor
asociación a placa linfoide.
Las lectinas SBA y GSA-II no mostraron diferencias de enlace entre los grupos. Se
observan diferencias de enlace entre los grupos B y C para la PNA. Todos los tumores del
grupo D mostraron enlace para PNA y UEA-I.
Las muestras de colon en todos los grupos muestran diferencias significativas en el
porcentaje de células en fase S según los segmentos estudiados. Existen diferencias entre los
grupos de estudio. No existen diferencias entre la mucosa normal y tumoral de ratas tratadas
con DMH a dosis de 21 mg/kg/semana.
DISCUSIÓN
La morfología general de los tumores inducidos por DMH semeja los descritos
previamente por otros autores(212),(234).
Dosis de 21 mg/kg/semana durante 20 semanas proporcionan una tasa tumoral en el
intestino grueso del 82,05 %. Se han obtenido unas tasas inferiores a las de otros estudios que
oscilan entre el 90 y el 100 %(166),(195). El número medio de tumores invasivos por animal
es de 1,26. Con dosis de 10 mg/kg/semana durante el mismo periodo se obtiene una tasa del
55 %, con una media de tumores invasivos por rata de 0,5, inferior a la publicada en otras
series(206).
En conjunto en todos los animales usados en el modelo experimental se han
observado un 60,22 % de adenocarcinomas no-mucinosos, considerando además los
carcinomas in situ. Las cifras de tumores mucinosos (39,78 %) son superiores a las obtenidas
en otros estudios, en los que suponen un 15 % del total de tumores(206).
En este estudio la mayoría de los tumores son invasivos (89,25 %), con cifras
similares a las observadas por Teague(320), y en 1 solo caso se describen adenomas, a pesar
de que los animales recibían dosis altas y bajas de carcinógeno, y distintos tiempos de
inducción. El adenoma observado en el estudio se observó en una rata que recibió altas dosis
de carcinógeno durante 20 semanas. Estos resultados difieren de los publicados por otros
autores con alta proporción de adenomas(216),(314) y corroboran otros que afirman que en la
rata la mayoría de adenocarcinomas aparecen de novo sobre mucosa plana(208),(209).
Otra diferencia sustancial respecto a la literatura se refiere a la localización tanto de
las lesiones benignas como malignas. Mientras en el presente estudio se situaban con mayor
frecuencia en colon ascendente tanto en animales tratados con altas como con bajas dosis de
DMH; otros autores describen el predominio distal de las neoplasias(208),(211) , (216) ,(303)
, otros las observan a nivel de la flexura mayor(314) (intersección entre colon transverso y
descendente en este estudio), mientras otros encontraban una alta proporción de tumores en el
ciego adyacente al íleon en ratones Swiss(216).
Se han observado diferencias entre los tipos histológicos y la localización tumoral: en
el colon descendente existe una mayoría de adenocarcinomas no mucinosos, mientras en el
colon transverso y el ciego se objetiva una mayor frecuencia de carcinomas mucinosos. En la
literatura se recoge también una mayoría de adenocarcinomas no mucinosos en el colon
izquierdo(211).
Otros investigadores describen hallazgos histopatológicos distintos entre el colon
proximal y distal, observando que los adenocarcinomas mucinosos son más frecuentes en el
colon ascendente(199), en asociación con colecciones de folículos linfoides(206),(300) y se
sugiere que la histogénesis y los procesos de crecimiento del carcinoma son distintos en el
colon proximal respecto al distal(571). Este aspecto no ha sido confirmado, puesto que no se
183
han observado diferencias entre la asociación a placa linfoide y los tipos histológicos
malignos, se observaban folículos linfoides en asociación con adenocarcinomas y con
carcinomas mucinosos. Tampoco se han observado diferencias respecto a la localización
tumoral, ya que en los cuatro segmentos colónicos los tumores podían estar asociados a
placas linfoides.
El tratamiento con bajas dosis de carcinógeno (10 mg/kg/semana) durante 20 semanas
reduce el número de carcinomas de intestino grueso y delgado por rata y el número de
animales con metástasis respecto al grupo de altas dosis de DMH, tal como habían descrito
previamente otros autores(167). Sin embargo, no hay diferencias respecto a los tipos
histológicos y grado de diferenciación. La principal dificultad par el uso de esta dosis y
durante este periodo de tiempo como modelo experimental es la ausencia de lesiones en el
colon descendente, constituyendo la principal diferencia respecto al carcinoma de intestino
grueso humano.
En el grupo de ratas inyectado con dosis de 21 mg/Kg/semana de DMH y sacrificio en
etapas precoces se detectó el primer tumor maligno en la semana 16 de inducción.
Greener(155) encuentra tumores a las 18 semanas en ratas inyectadas con 20 mg/kg del
carcinógeno, desarrollándose en la mayoría de los animales los cánceres definitivos a las 24
semanas de tratamiento. Otros estudios reflejan un periodo de latencia idéntico a dosis de 10-
20 mg/kg/semana(196).
Los tumores mucinosos se encuentran en grados de invasión superior (78,38 % en
Dukes B o C) comparado con los adenocarcinomas no mucinosos. La relativamente baja
invasividad de las lesiones no mucinosas queda reflejada en la alta proporción de Dukes A
(53,57 %) si asociamos los 10 carcinomas in situ observados en el estudio. Los resultados
obtenidos son similares a los observados por otros investigadores(199),(206).
Algunos trabajos describen que los tumores mucinosos son los únicos que se asocian
con metástasis(300), mientras que en el presente estudio tanto los tumores mucinosos como
los no mucinosos muestran metástasis: Es más, los tumores con heterogeneidad morfológica
presentan metástasis con ambos componentes.
La exposición al carcinógeno DMH induce cambios morfológicos precoces en las
glándulas de la mucosa de aspecto macroscópico normal en etapas preneoplásicas. La
presencia de glándulas displásicas asociadas a placa linfoide es un evento precoz, ya visible
en las primeras 4 semanas de inyección con DMH a dosis de 21 mg/kg/semana.
No pudimos detectar en ningún caso la aparición de un tumor invasivo originado
dentro de un adenoma en la rata, trabajos similares confirman nuestros resultados(178),(188).
Incluso Maskens(193), describió la aparición de los pólipos benignos en períodos de latencia
superiores a los del carcinoma, también en nuestro caso el hallazgo del único adenoma del
estudio se obtuvo de una rata sacrificada a las 34 semanas, es decir, con un máximo periodo
de inducción.
Es importante remarcar la coexistencia de lesiones benignas (displasias, adenoma) y
malignas en el tiempo. Aunque en este grupo se observara con mayor frecuencia la presencia
de lesiones benignas, tipo displasia, no existe una secuencia en la aparición de lesiones a
partir de un cierto periodo de latencia. Estos resultados niegan la secuencia adenoma-
carcinoma en el modelo animal de carcinogénesis inducida con DMH, propia de la neoplasia
colónica humana(68),(572). Por otro lado, confirman la relación de las placas linfoides con la
degeneración neoplásica.
La transformación de la mucosa del intestino grueso se caracteriza por acumulación
de lesiones cada vez más aberrantes a medida que aumenta la exposición al carcinógeno.
Desde que Spjut y Smith en 1977(574), describieran las lesiones focales predisplásicas en
184
ratas tratadas con DMH, numerosos estudios se han efectuado al respecto(572),(575). Las
criptas aberrantes o focos de predisplasia son criptas de tamaño aumentado, línea epitelial
más gruesa y zona pericriptal aumentada, que se sitúan generalmente en la parte superior de
la cripta(572). Los focos de predisplasia se consideran la primera etapa en el desarrollo de
neoplasias colónicas y representan focos neoplásicos clonogénicos, a partir de los cuales se
desarrolla el tumor, y sostienen el origen clonal de la neoplasia(572).
En este estudio las lesiones de predisplasia afectando a glándulas aisladas o grupos de
2 glándulas se observaron a las dos semanas de iniciado el tratamiento con DMH, siendo más
evidente en la porción apical del epitelio. De forma concomitante lesiones más difusas y de
iguales características aparecieron en el ciego, y más ligeramente en colon ascendente,
mientras en colon transverso y descendente la morfología estaba conservada. Estos hallazgos
difieren de los vistos por James et al(235), en otra especie animal, con predominio de las
lesiones en el colon distal. Otros autores describen ausencia de afectación del ciego durante el
periodo de tratamiento(577).
Al igual que los resultados presentados por otros investigadores(211), (575) con el
tiempo de tratamiento aumenta la frecuencia y el tamaño de estas lesiones en cada segmento
intestinal.
Existe una disminución progresiva en el número de células caliciformes y una
disposición irregular del núcleo, menos evidente en el colon descendente, sugiriendo que éste
no es el segmento "diana" por excelencia de la carcinogénesis inducida por DMH en este
modelo.
Los hallazgos del presente estudio experimental sugieren que las áreas de criptas
aberrantes pueden interpretarse como lesiones precursoras en el desarrollo del cáncer de
colon y pueden ser de gran importancia en el diagnóstico de pacientes con riesgo de padecer
esta neoplasia.
En términos amplios el MES ha sido usado generalmente para examinar la topografía
de las superficies naturalmente expuestas de células y tejidos. En contraste con las secciones
de microscopía electrónica de transmisión, la MES nos permite un análisis tridimensional de
los eventos que ocurren en la superficie celular. Diversos estudios muestran las características
de la mucosa normal y tratada con DMH mediante MES, sin embargo, estos estudios no se
refieren a todos los segmentos del intestino grueso(313),(579). La observación con MES
muestra clara diferencias regionales en el aspecto de la mucosa normal de la rata a pocos
aumentos, aunque la superficie epitelial está cubierta en su mayoría por una densa capa de
moco. El aspecto, forma y número de las criptas varía en los cuatro segmentos del intestino
grueso.
Los cambios morfológicos observados durante la carcinogénesis experimental con
DMH indican que hay un patrón definido de anormalidades mucosales progresivas
empezando mucho antes del desarrollo de tumores focales de colon, que estas alteraciones
son dosis dependiente, y que son más evidentes en el colon proximal, corroborando que es
esta región el órgano diana de este modelo experimental.
Las neoplasias del intestino grueso de la rata no muestran diferencias
ultraestructurales según la localización colónica y se asemejan a las descritas por otros
autores(313),(579).
La aplicación de las distintas lectinas en muestras de intestino grueso permiten
observar diversos patrones de localización de los glicoconjugados del epitelio. Los resultados
obtenidos con lectinas conjugadas con oro coloidal en ratas controles normal no difieren de
los presentados por otros autores usando lectinas conjugadas con otros
marcadores(392),(462) (465).
185
Cada una de las lectinas usadas en el estudio ha mostrado un patrón de reactividad
propio y característico, mostrando diferencias a lo largo de las criptas, así como a nivel de los
distintos segmentos del colon normal de rata. Las diferencias más notables se han observado
con la UEA-I. Esta lectina marca la mucina de ciego y colon ascendente, pero no la mucosa
del colon descendente, teniendo el colon transverso un comportamiento mixto entre colon
ascendente y descendente. Las lectinas SBA, GSA-II y PNA muestran enlace en todos los
segmentos colónicos. La SBA reconoce específicamente residuos no reducidos de N-acetil-
D-galactosamina, situados en la posición terminal de las glicoproteínas.
Las diferencias regionales en la expresión de glicoconjugación pueden correlacionarse
con la distinta actividad de las glicosiltransferasas y glicosidasas en los segmentos proximales
y distales del intestino grueso de la rata.
Las lectinas muestran asimismo diferencias de enlace en los distintos niveles de las
criptas. Las lectinas SBA y GSA-II presentan diferencias a lo largo de las criptas y en su
comportamiento de unión a nivel citoplasmático o supranuclear en las distintas localizaciones
colónicas. En el ciego, la SBA se une a la mucina de las células caliciformes a nivel basal, en
los tercios medios y apical la situación es supranuclear. En el resto del colon se sitúa en
citoplasma de las células caliciformes en toda la longitud de la cripta. Por lo tanto, la N-
acetilgalactosamina es un carbohidrato terminal presente en la mucina del intestino grueso,
aunque no a todos los niveles. La GSA-II también muestra diferencias locales con mayor
afinidad por los segmentos basales. La PNA muestra una disposición constante en todos los
segmentos del colon, y su reactividad queda confinada en el área supranuclear de las células
caliciformes y columnares. En el ciego, la UEA-I se une a la mucina de las células
caliciformes en toda la longitud de la cripta, en el colon ascendente de la rata queda
confinada a la base de las criptas. Estos gradientes de reactividad se relacionan con el grado
de diferenciación celular.
En general, las lectinas usadas en este estudio muestran un patrón de reactividad
similar al observado en el colon humano(351),(441) (443),(446) ,(450).
Los patrones de reactividad de las lectinas en las lesiones neoplásicas difieren
considerablemente de los de la mucosa normal. Estos cambios observados en los tumores
indican una clara modificación del metabolismo de los glicoconjugados en la transformación
neoplásica. Las diferencias más notables entre los carcinomas y la respectiva mucosa normal
se han observado en todos los segmentos del colon con la lectina PNA y con la UEA-I en el
colon descendente, con aumento de la reactividad para dichas lectinas. Por el contrario, la
SBA ha mostrado un enlace disminuido en los tumores de colon ascendente respecto a los
controles normales, la reducción del enlace indica que hay menos residuos GalNAc
terminales no reductores en las cadenas de oligosacáridos de la mucina debido probablemente
a una glicosilación incompleta superior de las glicoproteínas en este segmento con altas tasas
de neoplasia. La GSA-II no mostró diferencias regionales evidentes en su enlace, aunque
tanto en colon ascendente como en transverso normal se encuentran a nivel supranuclear, en
las mismas localizaciones tumorales se expresa como una fina tinción de las membranas
celulares apicales y en ocasiones del citoplasma de las células caliciformes, y explicaría un
aumento de la N-acetilglucosamina en la mucina de las células transformadas.
Los resultados con las lectinas PNA y UEA-I en los carcinomas de rata inducidos con
DMH confirman los obtenidos en estudios previos(463),(466) ,(467) y son similares a los
observado en el cáncer humano(351),(454).
Los cambios más aparentes se han detectado con la PNA. A diferencia de la mucosa
normal, la reactividad de esta lectina en los carcinomas se localiza en la superficie luminal
del epitelio, en el material intraglandular y en las vacuolas de mucina de las células
186
tumorales. Las células neoplásicas presentan la capacidad de expresar la estructura D-Gal-A
(1-3) D-GalNAc en compartimentos donde habitualmente no se encuentra. La PNA ha
mostrado afinidad por los tumores de intestino grueso de rata independientemente de la
localización tumoral, a diferencia de lo observado por Calderó et al(463), con menor
expresión en el colon proximal.
La UEA-I se enlaza con la α-L-Fucosa y muestra gran afinidad por las neoplasias de
intestino grueso, tal como previamente se ha descrito. Aunque las situadas en el colon
ascendente presentan la menor reactividad, con cambios en relación a la mucosa normal, no
se observan diferencias significativas entre la localización tumoral y el enlace con esta
lectina. Es decir, en el colon proximal, la α -L-Fucosa es accesible a la lectina en condiciones
normales y está disminuido o no es accesible para todas las neoplasias. A diferencia de lo
publicado por otros autores(463) en que la positividad obtenida con la UEA-I no varía con la
transformación neoplásica.
Las lectinas SBA y GSA-II no mostraron diferencias entre los grupos de estudio. En
el grupo D pudieron estudiarse menos casos con las lectinas PNA y UEA-I, mostrando enlace
de lectina todos los tumores de intestino grueso. La lectina PNA mostró diferencias entre los
dos grupos que recibieron altas dosis de carcinógeno, la mayoría de los tumores del grupo de
inyección más prolongada presentaron enlace de esta lectina a diferencia del grupo de
sacrificio más precoz. Este hallazgo podría explicar que periodos prolongados de inducción
tumoral incrementan la capacidad de expresar la estructura D-Gal-β (1-3) D-GalNAc.
En este estudio hemos observado cambios graduales y progresivos de los
glicoconjugados determinados por lectinas de la mucosa del intestino grueso de la rata, según
las semanas de exposición al carcinógeno.
Varios autores han descrito un cambio en la producción de moco del colon de rata
tratado con DMH(578) (581),(58).
Al igual que en la mucosa neoplásica los cambios regionales más importantes se han
observado con las lectinas PNA y UEA-I y asentaban sobre mucosa sin alteraciones
epiteliales evidentes. Estos resultados difieren de los publicados por Balzer et al.(468) en
ratas Wistar en que no observa cambios en el patrón de enlace de UEA-I respecto a las ratas
control ni cambios constantes cáncer-asociados en la mucina con la lectina PNA.
La SBA ha mostrado un patrón irregular de enlace en el ciego y colon descendente, y
en general una disminución de la reactividad a partir de la 16ª semana, concomitante a la
aparición de lesiones tumorales. La GSA-II ha mostrado disminución de la reactividad en el
colon ascendente.
Coincidiendo con la acción tóxica local del carcinógeno en las dos primeras semanas
de iniciada la inyección con DMH se observó enlace de la PNA a la mucina de las células
caliciformes, que posteriormente desapareció para hacerse constante en la semana 26.
La UEA-I mostró disminución de la reactividad en ciego y colon ascendente y un
aumento de la misma en el colon descendente a partir de la semana 16. Estos resultados son
congruentes con la observación de un menor enlace en los tumores de este segmento.
Al igual que en el trabajo de Suzuki et al(571) se han observado diferencias en los
patrones de enlace de las lectinas entre los carcinomas y/o las glándulas atípicas asociadas a
folículos linfoides y la mucosa colónica normal de la rata. Así como entre el enlace de las
lectinas en los focos de glándulas predisplásicas y la mucosa normal, tumoral y en las
glándulas atípicas asociadas a folículos linfoides de ratas inyectadas con DMH.
Puesto que tanto criptas predisplásicas aberrantes como las glándulas atípicas
asociadas a folículos linfoides han sido descritas como lesiones precursoras del cáncer de
colon en este modelo experimental, las distintas características en los glicoconjugados de
187
estas lesiones podría establecer dos orígenes distintos de las neoplasias inducidas por DMH.
La reactividad de las lectinas en la mucosa adyacente a los tumores muestra
diferencias en relación a la mucosa normal no tratada. Sin embargo, estas alteraciones son
menos evidentes respecto a la mucosa macroscópicamente normal de ratas tratadas con
DMH. Las diferencias más notables se han observado en el ciego con la lectina GSA-II
respecto a la mucosa tratada, con un aumento de la reactividad y también en el ciego con la
UEA-I en este caso con disminución de enlace. Estos hallazgos sugieren que los cambios en
los glicoconjugados de la mucosa transicional de los tumores inducidos por DMH son
similares a los de la mucosa macroscópicamente normal, es más, en este modelo animal el
concepto "mucosa transicional" dejaría de ser válido, y se referiría a un cambio premaligno
difuso de la mucosa.
La observación por MES en modo de retrodispersados de las lectinas SBA y UEA-I
conjugadas con oro coloidal ha mostrado una vez más las diferencias regionales existentes en
el intestino grueso normal de la rata. En ocasiones la mucina de la superficie epitelial no
muestra enlace de lectinas y es la mucosa que emerge de la cripta la que sí lo hace, mostrando
la afinidad por las lectinas de la mucina de las capas más profundas.
Se observa una disminución en la positividad de los tumores observados por MES,
respecto a los mismos observados por microscopía óptica.
En general, la detección de glicoconjugados de superficie del colon de rata mediante
BES aporta mayor sensibilidad e información adicional a la observación con microscoscopía
óptica convencional.
Pocos estudios hablan de la citometría de flujo de los tumores de colon inducidos con
DMH en ratas. Fischbach et al.(585) estudian 39 carcinomas y 27 adenomas de colon
inducidos en ratas con DMH, encontrando un único caso de carcinoma "casi diploide". El
resto de las lesiones mostraron un patrón diploide de DNA. Estos resultados son similares a
los obtenidos en nuestra serie, en la que todos los tumores son diploides. Estos hallazgos
difieren de los observados en el cáncer de colon humano, con cifras de aneuploidia según las
series que oscila entre un 39 y un 82 %(516),(507). A pesar de la similitud histológica de los
tumores inducidos en la rata con DMH y los tumores humanos existen evidentes diferencias
en la morfología biológica.
Es conocido que la DMH y otros carcinógenos colónicos conducen a una
proliferación celular aumentada, lo que es crítico para el proceso de carcinogénesis(166), al
existir un mayor contenido de células en el ciclo mitótico que podrían estar en mayor riesgo
de transformación maligna(590).
En nuestro estudio, los tumores de intestino grueso de la rata muestran un índice de
proliferación superior al de las muestras normales control e inyectadas con EDTA, sin
embargo, un índice de proliferación superior ha sido observado en muestras tratadas no
tumorales, una posible explicación sería que la mucosa tumoral pierde en parte su capacidad
de proliferación frente a las células alteradas no tumorales que aumentan su proliferación y
por tanto continúan en riesgo de transformación neoplásica.
La localización tumoral tiene relación con los resultados citométricos si consideramos
el índice de proliferación, mostrando los tumores de colon ascendente menor tasa de
proliferación y los de ciego la mayor tasa. En el colon normal de ratas control no tratadas el
porcentaje de células en fase S muestra diferencias respecto a los segmentos colónicos,
siendo también las muestras de colon ascendente las de menor proliferación y las de colon
descendente las que presentan fases S más altas. Este dato, es inesperado teniendo en cuenta
que en el colon ascendente es donde se da una tasa más alta de tumores colónicos en la rata
en este estudio.
188
Diversos autores(314),(577) ,(593) han descrito diferencias regionales en los
parámetros de proliferación usando otras técnicas. Sin embargo, mientras Sandford(577)
describe un aumento del compartimento de proliferación celular mucho más evidente en el
colon distal, atribuyéndolo a una inadecuada o ausente represión de la síntesis de ADN,
McGarrity(593) describe diferencias regionales en los animales control. De forma que los
parámetros de proliferación cambian en paralelo en todas las regiones durante la
carcinogénesis.
Los resultados obtenidos por citometría de flujo de los distintos segmentos colónicos
no corroboran el cambio en paralelo desde muestras control a muestras tumorales o muestras
colónicas macroscópicamente normales de ratas inyectadas. Es más, tanto el porcentaje de
células en fase S como el índice de proliferación sufren una ligera disminución en el colon
descendente tumoral y algo más evidente en el colon normal de ratas tratadas con DMH. El
mayor aumento de ambos parámetros se da en el colon transverso normal y tumoral. Este
distinto comportamiento de los tumores proximales y distales podría ser debido a un origen
distinto de los mismos o a que los tumores de colon descendente necesitan un periodo de
inducción tumoral superior.
Todos los tumores estudiados por citometría de flujo eran invasivos. No se ha
observado la presencia de parámetros de proliferación aumentados en estadios avanzados de
Dukes y tumores metastásicos. En el cáncer humano altas fases S se corresponden a un mayor
grado invasivo, con tumores en estadios C y D de Dukes(529),(540).
Aunque las diferencias en los parámetros de proliferación no son significativas entre
los tumores asociados a placa linfoide y los que no lo están. Los valores medios de fase S son
superiores en las neoplasias asociadas a nódulo linfoide.
Los valores de fase S de la mucosa normal y tumoral inyectada con DMH durante los
mismos periodos de tiempo son similares, sugiriendo una alteración del patrón de
proliferación celular a todos los niveles, por consiguiente existen alteraciones con potencial
carcinógeno a nivel de toda la mucosa. Hallazgos similares se han encontrado en mucosa
sana de pacientes con cáncer colorrectal(588). Los resultados difieren de los publicados por
Fishbach(585) con un notable aumento del porcentaje de fase S en las muestras tumorales
respecto a la mucosa normal de ratas expuestas a DMH.
Se han observado diferencias entre los parámetros de proliferación y los grupos de
estudio.
Los estudios de la fase S encuentran diferencias entre la mucosa normal (sin
tratamiento o inyectada con EDTA), y la mucosa inyectada con DMH durante 21 semanas,
tanto normal como tumoral. No observándose diferencias con la mucosa normal de ratas
inyectadas hasta la octava semana de inyección. Estos datos irían en contra de otros
publicados usando técnicas distintas en que la DMH induciría proliferación celular en etapas
precoces de la carcinogénesis(204),(594).
189
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232
IX. ANEXO
VARIABLES
número: número de orden de rata
grupo: grupos de estudio

1: grupo A
2: grupo B
3: grupo C
4: grupo D
5: grupo E
tto: tratamiento
No: ratas control no inyectadas
D-N: muestra macroscópicamente normal de ratas inyectas con DMH
D-T: muestra tumoral de ratas inyectadas con DMH
PRE: muestra preneoplásica
EDTA: ratas control inyectadas con EDTA
semana: semanas de tratamiento
sexo: macho
hembra
Local: localización de la muestra

Ciego: ciego
C.A.: colon ascendente
C.T.: colon transverso
C.D.: colon descendente
Macro: aspecto macroscópico tumoral

p. sesil: pólipo sesil
p. pedulado: pólipo pedunculado
t. exofitico: tumor exofítico
t. ulcerado: tumor ulcerado
Histo: tipo histológico

Adenocarcinoma: adenocarcinoma
C. mucinoso: carcinoma mucinoso
C. in situ: carcinoma in situ
D. leve: displasia leve
D. moderada: displasia moderada
D. severa: displasia severa
Dif: diferenciación celular tumoral

mod: moderadamente diferenciado
poco: pobremente diferenciado
233
Dukes: estadio tumoral según la clasificación de Dukes
Dukes A
Dukes B
Dukes C
Tamaño: tamaño
grande @ 0,8
pequeño < 0,8
Placa: presencia de placa linfoide

si: presencia de placa linfoide asociada
no: ausencia de placa linfoide asociada
otrost: presencia de otros tumores sincrónicos colorrectales

si: presencia
no: ausencia
id: presencia de tumores sincrónicos de intestino delgado

si: presencia
no: ausencia
meta: presencia de metástasis

si: presencia
no: ausencia
gmt: marcaje con la lectina Glycine max

de los tumores en M.O.
Todo: marcaje de todo el tumor
Areas: marcaje heterogéneo del tumor
No: ausencia de marcaje
gmmt: marcaje con la lectina Glycine max

de la mucosa transicional en M.O.
Si: marcaje
gmn: marcaje con la lectina Glycine max

de la mucosa normal en M.O.
Si: marcaje
bst: marcaje con la lectina Griffonia simplicifolia-II

bsmt: marcaje con la lectina Griffonia simplicifolia-II
234
Si: marcaje
bsn: marcaje con la lectina Griffonia simplicifolia-II

Si: marcaje
pt: marcaje con la lectina Arachis hypogaea

pmt: marcaje con la lectina Arachis hypogaea

Si: marcaje
pn: marcaje con la lectina Arachis hypogaea

Si: marcaje
ut: marcaje con la lectina Ulex europaeus-I

umt: marcaje con la lectina Ulex europaeus-I

Si: marcaje
un: marcaje con la lectina Ulex europaeus-I

Si: marcaje
megm: marcaje con la lectina Glycine max

de los tumores en MES
Si: marcaje
mebs: marcaje con la lectina Griffonia simplicifolia-II

235
Si: marcaje
mep: marcaje con la lectina Arachis hypogaea

Si: marcaje
meu: marcaje con la lectina Ulex europaeus-I

Si: marcaje
pas: tinción AB-PAS de los tumores colorrectales

P/A: tinción mixta PAS y AB
AB: tinción con azul alzian
A-P: tinción combinada AB-PAS
PAS: tinción con PAS
no: ausencia de tinción
g1: % de células en fase G0G1
g2: % de células en fase G2M
s: % de células en fase S
ip: índice de proliferación celular (fase G2M+fase S)
número grupo tto semana sexo local macro
2 1 NO TTO . macho C.A. .
2 1 NO TTO . macho C.T. .
3 1 NO TTO . macho Ciego .
3 1 NO TTO . macho C.D. .
4 1 NO TTO . hembra Ciego .
4 1 NO TTO . hembra C.T. .
4 1 NO TTO . hembra C.D. .
5 1 NO TTO . macho Ciego .
6 1 NO TTO . hembra C.A. .
236
7 1 NO TTO . hembra C.D. .
8 1 NO TTO . hembra C.T. .
1 2 D-N 21 macho C.T. .
2 2 D-T 18 hembra C.A. t. exofítico
2 2 D-N 18 hembra C.T. .
2 2 D-N 18 hembra C.D. .
5 2 D-T 24 macho ciego t. ulcerado
6 2 D-T 26 macho Ciego t. exofítico
6 2 D-T 26 macho C.A. t. exofítico
6 2 D-N 26 macho C.T. .
6 2 D-N 26 macho C.D. .
6 2 D-T 26 macho C.D. t. ulcerado
7 2 D-N 26 macho Ciego .
7 2 D-T 26 macho C.A. p. sesil
7 2 D-N 26 macho C.D. .
7 2 D-T 26 macho C.D. p. pedunculado
8 2 D-N 27 macho C.T. .
8 2 D-T 27 macho C.T. t. exofítico
9 2 D-T 28 macho C.A t. exofítico
9 2 D-N 28 macho C.T. .
9 2 D-T 28 macho C.D. p. sesil
10 2 D-N 29 macho C.A. .
10 2 D-T 29 macho C.T. p. sesil
10 2 D-N 29 macho C.D. .
10 2 D-N 29 macho C.D. .
10 2 D-T 29 macho C.D. t. exofítico
237
11 2 D-N 29 macho C.T. .

Tabla 9-1
número Grupo tto semana sexo local macro
11 2 D-N 29 macho C.D. .
12 2 D-T 29 macho Ciego t. exofítico
12 2 D-T 29 macho C.A p. sesil
12 2 D-T 29 macho C.T. t. ulcerado
13 2 D-N 30 macho C.T. .
13 2 D-N 30 macho C.D. .
14 2 D-N 30 hembra Ciego .
14 2 D-T 30 hembra Ciego .
14 2 D-T 30 hembra C.A. t. ulcerado
14 2 D-T 30 hembra C.T. t. exofítico
14 2 D-T 30 hembra C.D. p. pedunculado
15 2 D-T 30 hembra C.T. .
16 2 D-T 30 hembra C.D. p. sesil
238
17 2 D-T 31 hembra C.T. p. pedunculado
17 2 D-T 31 hembra C.D. t. exofítico
19 2 D-T 31 hembra C.T. p. sesil
21 2 D-T 23 macho C.A. p. pedunculado
21 2 D-N 23 macho C.T. .
21 2 D-T 23 macho C.T. p. pedunculado
22 2 D-T 22 macho Ciego t. ulcerado
22 2 D-N 22 macho C.D. .
24 2 D-T 24 macho C.A. t. ulcerado
24 2 D-T 24 macho C.T. .

Tabla 9-2
26 2 D-N 25 macho C.T. .
26 2 D-N 25 macho C.D. .
29 2 D-N 29 macho C.A. .
30 2 D-N 30 macho C.D. .
239
32 2 D-N 32 hembra C.A. .
33 2 D-T 33 hembra Ciego p. sesil
34 2 D-T 33 hembra C.A. p. pedunculado
39 2 D-T 34 hembra C.A. p. sesil
43 2 D-T 34 hembra C.A p. pedunculado
50 4 D-T 29 macho C.A. t. ulcerado
56 4 D-T 31 hembra Ciego t. exofítico
62 4 D-T 33 hembra Ciego t. exofítico
3 3 PRENEOP 2 hembra C.A. .
240
3 3 PRENEOP 2 hembra C.T. .
3 3 PRENEOP 2 hembra C.D. .
6 3 PRENEOP 4 macho Ciego .
6 3 PRENEOP 4 macho C.A. .
6 3 PRENEOP 4 macho C.T. .
6 3 PRENEOP 4 macho C.D. .
11 3 PRENEOP 6 hembra Ciego .

Tabla 9-3
13 3 D-T 8 macho C.A. .
22 3 D-T 12 macho C.D. .
36 3 D-T 18 hembra C.D. .
38 3 D-T 20 hembra C.A. .
39 3 D-T 20 macho Ciego p. sesil
39 3 D-T 20 macho C.A. .
39 3 D-T 20 macho C.T. .
241
41 3 D-T 24 macho C.T. P. sesil
41 3 D-T 24 macho C.T. .
48 3 D-T 22 macho C.T. p. pedunculado
49 3 D-T 22 hembra Ciego p. pedunculado
50 3 D-T 24 macho C.T. .
53 3 D-T 26 macho Ciego .
53 3 D-T 26 macho C.A. .
55 3 D-T 26 hembra Ciego p. pedunculado
56 3 D-T 26 hembra C.D. t. exofítico
57 3 D-T 28 macho Ciego p. pedunculado

Tabla 9-4
242
60 3 D-T 30 macho C.D. t. ulcerado
63 3 D-T 32 macho Ciego .
65 5 EDTA 36 macho C.T. .
66 5 EDTA 36 macho C.T. .
66 5 EDTA 36 macho C.D. .
67 5 EDTA 37 macho C.D. .
75 5 EDTA 44 hembra Ciego .
75 5 EDTA 44 hembra C.T. .
75 5 EDTA 44 hembra C.D. .
76 5 EDTA 44 hembra Ciego .
76 5 EDTA 44 hembra C.A. .
78 5 EDTA 45 hembra C.A. .

Tabla 9-5
número histo dif Dukes tamaño placa
2 . . . . .
2 . . . . .
3 . . . . .
3 . . . . .
3 . . . . .
3 . . . . .
243
4 . . . . .
4 . . . . .
4 . . . . .
5 . . . . .
5 . . . . .
5 . . . . .
6 . . . . .
7 . . . . .
7 . . . . .
7 . . . . .
8 . . . . .
8 . . . . .
8 . . . . .
1 . . . . .
2 C. mucinoso . Dukes A grande no
2 D. moderada . . pequeño no
2 . . . . .
2 . . . . .
5 C. mucinoso . Dulces A grande no
6 C. mucinoso . Dukes B pequeño no
6 Adenocarcinoma moderado Dukes B pequeño no
6 . . . . .
6 . . . . .
6 C. mucinoso . Dukes C pequeño no
7 . . . . .
7 Adenocarcinoma moderado Dukes A pequeño no
7 . . . . .
7 D. moderada . . pequeño si
8 Adenocarcinoma moderado Dulces A pequeño no
8 . . . . .
9 . . . . .
9 . . . . .
9 Adenocarcinoma moderado Dukes C pequeño no
244
10 . . . . .
10 . . . . .
10 Adenocarcinoma moderado Dukes C grande no
10 . . . . .
10 . . . . .
11 Adenocarcinoma poco Dukes C pequeño no
11 Adenocarcinoma moderado Dulces B pequeño no
11 . . . . .
Tabla 9-6
11 . . . . .
11 C. in situ . . pequeño no
12 C. mucinoso . Dulces C pequeño no
12 C. mucinoso . Dukes C grande no
13 . . . . .
13 . . . . .
14 . . . . .
14 D. leve . . pequeño no
14 . . . . .
14 D. severa . . pequeño no
245
15 . . . . .
15 . . . . .
15 . . . . .
15 . . . . .
16 Adenocarcinoma poco Dukes B pequeño no
17 . . . . .
17 . . . . .
17 Adenocarcinoma moderado Dukes A grande no
17 D. moderada . . grande si
18 Adenocarcinoma moderado Dukes A pequeño si
19 C. mucinoso . Dulces C grande no
18 . . . . .
18 . . . . .
19 . . . . .
21 . . . . .
22 Adenocarcinoma moderado Dukes B pequeño si
22 . . . . .
24 Adenocarcinoma moderado Dukes B grande no
24 . . . . .
26 . . . . .
Tabla 9-7
26 . . . . .
26 . . . . .
246
27 Adenocarcinoma poco Dukes B grande no
28 . . . . .
29 . . . . .
30 . . . . .
30 Adenocarcinoma poco Dukes C grande no
32 . . . . .
32 . . . . .
32 Adenocarcinoma poco Dukes C grande no
32 . . . . .
32 . . . . .
33 . . . . .
33 Adenocarcinoma poco Dukes C pequeño no
33 . . . . .
36 Adenocarcinoma poco Dukes B pequeño no
36 . . . . .
40 Adenoma . . grande no
46 Adenocarcinoma poco Dukes A pequeño no
52 Adenocarcinoma poco Dukes A pequeño no
247
57 C. mucinoso . Dukes A pequeño si
3 . . . . .
3 . . . . .
3 . . . . .
6 . . . . .
6 . . . . .
6 . . . . .
6 . . . . .
11 . . . . .
11 D. leve . . . no
Tabla 9-8
11 . . . . .
11 . . . . .
12 D. leve . . . no
12 D. leve . . . si
13 D. leve . . . si
15 . . . . .
15 . . . . .
22 D. moderada . . . si
27 C. mucinoso . Dukes A pequeño no
33 C. mucinoso . Dukes A pequeño no
34 C. mucinoso . Dukes B grande no
248
37 D. leve . . . no
38 D. moderada . . . no
38 D. leve . . . no
41 D. leve . . pequeño no
48 D. leve . . . no
48 D. severa . . . no
49 D. severa . . pequeño si
50 C. in situ . . grande si
50 Adenocarcinoma moderado Dukes B grande si
51 D. severa . . grande si
249
55 C. mucinoso . Dukes B pequeño si
57 C. mucinoso . . pequeño no
Tabla 9-9
58 C. mucinoso . Dukes B grande no
59 Adenocarcinoma moderado Dukes A pequeño si
62 C. mucinoso . Dukes B grande si
65 . . . . .
66 . . . . .
66 . . . . .
67 . . . . .
75 . . . . .
75 . . . . .
75 . . . . .
76 . . . . .
76 . . . . .
76 . . . . .
76 . . . . .
77 . . . . .
77 . . . . .
78 . . . . .
78 . . . . .
250
79 . . . . .
79 . . . . .
Tabla 9-10
número otrostt ID metas gmt gmmt gmn
2 . . . . . .
2 . . . . . .
3 . . . . . .
3 . . . . . .
3 . . . . . .
3 . . . . . .
4 . . . . . .
4 . . . . . .
4 . . . . . .
5 . . . . . .
5 . . . . . .
5 . . . . . .
6 . . . . . .
7 . . . . . .
7 . . . . . .
7 . . . . . .
8 . . . . . .
8 . . . . . .
8 . . . . . .
1 . . . . . .
2 si no no . . .
2 si no no . . .
2 si no no . . .
2 si no no . . .
5 si no no áreas si .
6 si si si áreas . .
6 si si si áreas si si
6 si si si . . .
6 si si si . . .
6 si si si todo si .
7 no no no . . .
251
7 no no no áreas no .
7 no no no . . .
7 no no no no no Si
8 si si no . . .
8 si si no . . .
8 si si no áreas si si
9 si si si . . .
9 si si si . . .
9 si si si . . .
9 si si si . . .
9 si si si . . .
10 si si si . . .
10 . . . . . .
10 si si si todo . .
10 si si si . . .
10 si si si . . .
10 si si si todo si si
10 si si si . . .
11 si si no . . no
11 si si no . . .
11 si si no . . .
Tabla 9-11
número otrostt ID metas Gmt gmmt gmn
11 si si no . . .
11 si si no . . .
11 si si no . . .
12 si si si . . .
12 si si si . . .
12 si si si no no si
12 si si si . . .
12 si si si . . .
13 si si si . . .
13 si si si . . .
13 si si si . . .
13 si si si . . .
252
13 si si si . . no
13 si si si . . .
14 si si no . . .
14 si si no . . .
14 si si no . . .
14 si si no . . .
14 si si no todo si no
14 si si no . . .
14 si si no . . .
14 si si no . . .
15 no no si . . .
15 no no si . . .
15 no no si . . .
15 no no si todo si .
15 no no si . . .
15 no no si . . .
16 si no si no no .
16 si no si no no si
17 si no si . . .
17 si si no todo si si
17 si si no . . .
17 si si no todo si no
17 si si no . . .
18 no no no . . .
19 si no si . . .
18 si no si . . .
18 si no si . . .
18 si no si . . .
19 si no si . . .
19 si si no . . .
21 si si no . . .
21 si si no . . .
21 si si no . . .
22 si si si áreas si .
22 si si si no no no
253
22 si si si . . .
22 si si si áreas . .
24 si no no todo si .
24 si no no . . .
24 si no no áreas si si
26 si . no . . .
Tabla 9-12
26 si . no . . .
26 si . no . . .
27 no no si áreas . .
27 no no si áreas . .
28 . . . . . .
29 no no no . . .
29 no no no . . .
30 si no si todo no no
30 si no si . . .
30 si no si . . .
32 no no si . . .
32 no no si . . .
32 no no si . . .
32 no no si . . .
32 no no no . . .
33 no si si . . .
33 no si si . . .
33 no si si . . .
34 no si no . . .
36 si no no no si .
36 si no no áreas si .
36 si no no . . .
37 no no no todo si si
38 no no no . . .
39 no si no todo si si
40 si no no todo si si
40 si no no no si si
254
41 si no si . . .
41 si no si . . .
43 no no si . . .
46 no no no . . .
50 no si no todo . .
56 si no si . . .
56 si no si . . .
56 si no si . . .
57 no no no no si si
61 no si si . . .
62 no no si áreas si si
63 no no no áreas si si
3 . . . . . .
3 . . . . . .
3 . . . . . .
6 . . . . . .
6 . . . . . .
6 . . . . . .
6 . . . . . .
11 no no no . . .
11 no no no . . .
Tabla 9-13
11 no no no . . .
11 . . . . . .
12 si no no . . .
12 si no no . . .
13 no no no . . .
15 no no no . . .
15 no no no . . .
255
22 si no no . . .
22 si no no . . .
27 no no no . . .
29 no no no . . .
31 no no no . . .
34 no no no áreas si .
36 no no no . . .
37 si no no . . .
37 si no no . . .
38 si no no . . .
38 si no no . . .
38 si no no . . .
39 si no no . . .
39 si no no . . .
39 si no no . . .
40 si no no . . .
40 si no no . . .
41 si si no todo si si
41 si si no . . .
41 si si no . . .
48 si no no . . .
48 si no no . . .
48 si si no . . si
48 si si no áreas si .
48 si si no . . .
48 si si no todo si .
49 si si si . . .
49 si si si . . si
49 si si si . . .
50 si si si . . .
50 si si si . . .
256
52 no no si . . .
53 si no no . . .
53 si no no . . .
54 no no no . . .
55 si no no . . .
56 no no no áreas si si
57 si si no todo no no
Tabla 9-14
57 si si no no si .
57 si si no . . .
59 no no no . . .
60 si no no no si si
60 si no no áreas . .
60 si no no . . si
62 si no no . . si
62 si no no . . .
62 si no no . . .
63 si no si . . .
63 si no si todo si si
64 si no no . . .
64 si no no todo no no
65 . . . . . .
66 . . . . . .
66 . . . . . .
67 . . . . . .
75 . . . . . .
75 . . . . . .
75 . . . . . .
257
76 . . . . . .
76 . . . . . .
76 . . . . . .
76 . . . . . .
77 . . . . . .
77 . . . . . .
78 . . . . . .
78 . . . . . .
79 . . . . . .
79 . . . . . .
Tabla 9-15
número bst bsmt bsn pt pmt pmn ut umt un meg meb
2 . . . . . . . . . . .
2 . . . . . . . . . . .
3 . . . . . . . . . . .
3 . . . . . . . . . . .
3 . . . . . . . . . . .
3 . . . . . . . . . . .
4 . . . . . . . . . . .
4 . . . . . . . . . . .
4 . . . . . . . . . . .
5 . . . . . . . . . . .
5 . . . . . . . . . . .
5 . . . . . . . . . . .
6 . . . . . . . . . . .
7 . . . . . . . . . . .
7 . . . . . . . . . . .
7 . . . . . . . . . . .
8 . . . . . . . . . . .
8 . . . . . . . . . . .
8 . . . . . . . . . . .
1 . . . . . . . . . . .
2 . . . . . . . . . . .
2 . . . . . . . . . . .
2 . . . . . . . . . . .
258
2 . . . . . . . . . . .
5 . . . . . . . . . . .
6 áreas si . todo . . áreas no no . .
6 áreas no si áreas no no todo no no . .
6 . . . . . . . . . . .
6 . . . . . . . . . . .
6 todo si . . . . todo no no . .
7 . . . . . . . . . . .
7 . . . . . . . . . . .
7 . . . . . . . . . . .
7 . . . . . . . . . . .
8 . . . . . . . . . . .
8 . . . . . . . . . . .
8 áreas no no . . no todo no no . .
9 . . . . . . . . . . .
9 . . . . . . . . . . .
9 . . . . . . . . . . .
9 . . si no no no no no no . .
9 . . . . . . . . . . .
10 . . . . . . . . . . .
10 . . . . . . . . . . .
10 áreas . . áreas si . todo no no . .
10 . . . . . . . . . . .
10 . . . . . . . . . . .
10 áreas si si todo si si no no no . .
10 . . . . . . . . . . .
11 . . si . . . no no si . .
11 . . . . . . . . . . .
11 . . . . . . . . . . .
Tabla 9-16
11 . . . . . . . . . . .
11 . . . . . . . . . . .
11 . . . . . . . . . . .
12 . . . . . . . . . . .
259
12 . . . . . . . . . . .
12 no no si . . . áreas no si . .
12 todo . . . . . . . . . .
12 . . . . . . . . . . .
13 . . . . . . . . . . .
13 áreas si . . . . . . . . .
13 . . . . . . . . . . .
13 . . . . . . . . . . .
13 . . no . . . . . no . .
13 . . . . . . . . . . .
14 . . . . . . . . . . .
14 . . . . . . . . . . .
14 . . . . . . . . . . .
14 todo si . . . . todo si si . .
14 todo si . . . . . . . . .
14 todo si si todo si si todo si no . .
14 . . . . . . . . . . .
14 . . . . . . . . . . .
15 . . . . . . . . . . .
15 . . . . . . . . . . .
15 . . . . . . . . . . .
15 todo si . todo si si todo si . . .
15 . . . . . . . . . . .
15 . . . . . . . . . . .
16 . . . . . . . . . . .
16 no no no . . . áreas no si . .
17 . . . . . . . . . . .
17 todo si si todo si no . . no . .
17 . . . . . . . . . . .
17 todo no . todo si no áreas no si . .
17 . . . . . . . . . . .
18 . . si . . . . . si . .
19 . . . . . . . . . . .
18 . . . . . . . . . . .
18 no si si . . . todo si . . .
260
18 . . . . . . . . . . .
19 . . . . . . . . . . .
19 . . . . . . . . . . .
21 . . . . . . . . . . .
21 . . . . . . . . . . .
21 . . . todo . . . . . . .
22 áreas si . . . . todo no no . .
22 todo si si áreas no no áreas no . . .
22 . . . . . . . . . . .
22 áreas . . . . . áreas . . . .
24 todo si . todo no . todo no no . .
24 . . . . . . . . . . .
24 áreas no . áreas no no . . . . .
26 . . . . . . . . . . .
Tabla 9-17
26 . . . . . . . . . . .
26 . . . . . . . . . . .
27 áreas . . todo . . todo . . . .
27 . . . . . . . . . . .
28 . . . . . . . . . . .
29 . . . . . . . . . . .
29 . . . . . . . . . . .
30 áreas si si . . . áreas no no . .
30 . . . . . . . . . . .
30 . . . . . . . . . . .
32 . . . . . . . . . . .
32 . . . . . . . . . . .
32 . . . . . . . . . . .
32 . . . . . . . . . . .
32 . . . . . . . . . . .
33 . . . . . . . . . . .
33 . . . . . . todo . . . .
33 . . . . . . . . . . .
34 . . . . . . áreas no no . .
261
36 áreas si . . . . áreas si si . .
36 . . . . . . todo si . . .
36 . . . . . . . . . . .
37 . . . . . . . . . . .
38 . . . . . . . . . . .
39 todo si si todo no no no si si . .
40 no si si . . . no no si . .
40 no si si todo si no no no si . .
41 no si si no no no no no . . .
41 . . . todo no no todo si . . .
43 . . . . . . no . . . .
46 áreas . . todo . . todo . . . .
50 . . . . . . . . . . .
52 . . . . . . . . . . .
53 áreas no . áreas no no todo si no . .
56 . . . . . . áreas no si . .
56 no no si . . . áreas si si . .
56 áreas . . . . . áreas no si . .
57 áreas si si todo no si todo no no . .
58 . . . . . . . . . . .
58 no si si . . . . . . . .
60 . . . . . . . . . . .
61 todo si . todo si si todo . . . .
62 . . . . . . . . . . .
63 . . . . . . . . . . .
3 . . . . . . . . . . .
3 . . . . . . . . . . .
3 . . . . . . . . . . .
6 . . . . . . . . . . .
6 . . . . . . . . . . .
6 . . . . . . . . . . .
6 . . . . . . . . . . .
11 . . . . . . . . . . .
11 . . . . . . . . . . .
Tabla 9-18
262
11 . . . . . . . . . . .
11 . . . . . . . . . . .
12 . . . . . . . . . . .
12 . . . . . . . . . . .
13 . . . . . . . . . . .
15 . . . . . . . . . . .
15 . . . . . . . . . . .
22 . . . . . . . . . . .
22 . . . . . . . . . . .
27 . . . . . . . . . . .
29 . . . . . . . . . . .
31 . . . . . . . . . . .
33 áreas si si no no no áreas si si . .
34 áreas si . no si . todo si si . .
36 . . . . . . . . . . .
37 áreas si si áreas no si todo si si todo .
37 . . . . . . . . . . .
38 . . . . . . . . . . .
38 . . . . . . . . . . .
38 . . . . . . . . . . .
39 . . . . . . . . . . .
39 no si si . . . . . . . .
39 . . . . . . . . . . .
39 . . . . . . . . . . .
40 . . . . . . . . . . .
40 . . . . . . áreas si si . .
40 . . . . . . . . . . .
41 . . . . . . no no si todo .
41 . . . . . . . . . . .
41 . . . . . . no si si . .
48 . . . . . . . . . . .
48 . . . . . . . . . . .
48 no si si no no no todo si no . .
48 áreas si . no no no todo si . . .
263
48 áreas . . áreas no . áreas no . todo no
48 áreas si . áreas si . áreas si no . .
49 . . . . . . . . . todo .
49 . . . no no no no si si . .
49 . . si . . si . . no . no
49 . . . . . . . . . . .
50 . . . . . . . . . no .
50 . . . . . . . . . . .
50 todo si si no no no áreas no no . .
51 no si si no si no áreas si si . .
51 todo si si no si si todo si si . .
52 . . . . . . . . . . .
53 . . . . . . . . . . .
53 . . . . . . . . . . .
54 . . . . . . todo no si . áreas
55 . . . . . . . . . . .
55 . . . . . si todo no si . .
56 áreas si si áreas si si . . . . no
57 todo si si todo si si todo si si . áreas

Tabla 9-19
57 no si si todo si si . . . todo .
57 áreas no . áreas si . . . . . .
58 áreas si si áreas si si todo si si áreas .
59 . . . . . . . . . . .
60 . . si todo . . . . si . no
60 áreas . . . . si áreas . . no .
60 . . si . . si . . si . no
62 . . si no si si . . si . .
62 . . si áreas si si todo si si . .
62 todo si si áreas si no áreas no no . .
62 . . . . . . . . . . .
63 . . . . . . . . . . .
63 . . . todo si . áreas si si areas .
64 . . . . . si . . si . .
264
64 áreas si si . . si . . si . .
65 . . . . . . . . . . .
66 . . . . . . . . . . .
66 . . . . . . . . . . .
67 . . . . . . . . . . .
75 . . . . . . . . . . .
75 . . . . . . . . . . .
75 . . . . . . . . . . .
76 . . . . . . . . . . .
76 . . . . . . . . . . .
76 . . . . . . . . . . .
76 . . . . . . . . . . .
77 . . . . . . . . . . .
77 . . . . . . . . . . .
78 . . . . . . . . . . .
78 . . . . . . . . . . .
79 . . . . . . . . . . .
79 . . . . . . . . . . .
Tabla 9-20
número mep meu pas g1 g2
2 . . . 88.40 5.80
2 . . . 92.00 4.70
3 . . . 89.50 3.40
3 . . . 84.20 6.00
3 . . . 88.80 5.70
3 . . . 83.10 8.30
4 . . . 83.90 5.20
4 . . . 92.80 1.70
4 . . . 87.70 4.30
5 . . . 86.50 5.60
5 . . . 92.40 4.10
5 . . . 89.50 3.00
6 . . . 95.30 3.00
7 . . . 85.10 7.90
7 . . . 93.80 3.50
265
7 . . . 85.60 6.10
8 . . . 89.60 4.70
8 . . . 87.80 7.30
8 . . . 90.20 5.40
1 . . . 79.40 11.20
2 . . . 90.00 4.10
2 . . . . .
2 . . . . .
2 . . . 88.10 6.20
5 . . . 87.40 4.80
6 . . . 82.20 8.00
6 . . . 93.10 3.40
6 . . . 87.40 6.20
6 . . . 88.70 6.70
6 . . . 83.10 8.50
7 . . . 85.30 6.20
7 . . . . .
7 . . . 82.90 4.20
7 . . . . .
8 . . . 89.80 3.80
8 . . . 86.30 5.00
8 . . . 82.20 8.60
9 . . . 86.00 8.10
9 . . . . .
9 . . . 88.00 5.50
9 . . . 82.00 7.50
9 . . P/A 83.00 9.40
10 . . . 83.80 5.40
10 . . . 81.60 8.10
10 . . . 87.00 4.50
10 . . . 85.00 8.60
10 . . . 85.30 5.00
10 . . . 87.10 4.00
10 . . . . .
11 . . . 90.50 3.00
266
11 . . . . .
11 . . . 85.20 5.50
Tabla 9-21
11 . . . 81.60 8.10
11 . . . . .
11 . . . . .
12 . . . . .
12 . . . 92.60 2.70
12 . . . 85.70 6.10
12 . . . . .
12 . . . . .
13 . . . 85.10 6.40
13 . . . 89.50 3.50
13 . . . . .
13 . . . 91.80 3.90
13 . . . 90.30 5.10
13 . . . . .
14 . . . 84.20 7.20
14 . . . . .
14 . . AB . .
14 . . AB 87.80 3.70
14 . . . . .
14 . . . 89.60 2.70
14 . . . 84.30 7.10
14 . . . . .
15 . . . 85.90 5.80
15 . . . 79.90 9.10
15 . . . 88.20 7.50
15 . . AB 83.80 10.00
15 . . . . .
15 . . . 82.90 7.70
16 . . A-P 87.50 6.10
16 . . no . .
17 . . . 90.50 5.00
267
17 . . . . .
17 . . . 89.40 4.50
17 . . no . .
17 . . . . .
18 . . . 89.00 2.10
19 . . . 88.50 3.40
18 . . . 93.10 8.70
18 . . . 90.10 2.60
18 . . . 88.10 3.40
19 . . P/A . .
19 . . . 85.20 5.10
21 . . . 92.50 2.50
21 . . . 83.70 9.10
21 . . . . .
22 . . . . .
22 . . AB . .
22 . . . 89.50 4.10
22 . . . . .
24 . . . 86.20 5.80
24 . . . 92.30 2.60
24 . . no . .
26 . . . 88.10 5.70
Tabla 9-22
26 . . . 92.00 4.60
26 . . . 83.20 8.70
27 . . P/A 82.50 5.80
27 . . P/A 85.50 3.20
28 . . . 91.80 3.50
29 . . . 88.40 7.40
29 . . . . .
30 . . no . .
30 . . . 89.40 3.20
30 . . . . .
32 . . . 84.20 5.50
268
32 . . . 87.50 3.30
32 . . . 90.20 4.90
32 . . . 85.10 4.70
32 . . . 90.80 3.00
33 . . . 85.60 3.40
33 . . . . .
33 . . . 90.00 4.90
34 . . AB . .
36 . . . 90.90 1.20
36 . . . 88.80 4.40
36 . . . 90.20 5.80
37 . . . . .
38 . . . . .
39 . . no . .
40 . . PAS . .
40 . . . . .
41 . . no . .
41 . . no . .
43 . . . . .
46 . . . . .
50 . . A-P . .
52 . . . . .
53 . . A-P . .
56 . . A-P . .
56 . . P/A . .
56 . . . . .
57 . . . . .
58 . . . . .
58 . . . . .
60 . . . . .
61 . . P/A . .
62 . . no . .
63 . . P/A . .
3 . . . 91.20 3.20
3 . . . 89.30 4.00
269
3 . . . 93.60 1.70
6 . . . 89.00 4.70
6 . . . 91.00 4.00
6 . . . 89.20 4.70
6 . . . 91.20 3.70
11 . . . 89.60 4.20
11 . . . . .
Tabla 9-23
11 . . . 91.80 3.70
11 . . . 87.50 4.80
12 . . . . .
12 . . . . .
13 . . . . .
15 . . . 87.70 4.30
15 . . . 88.50 4.50
22 . . . . .
22 . . . . .
27 . . . . .
29 . . . . .
31 . . . . .
33 . . no . .
34 . . P/A . .
36 . . . . .
37 . . no . .
37 . . . . .
38 . . . . .
38 . . . . .
38 . . . . .
39 . . . . .
39 . todo . . .
39 . áreas . . .
39 . . . . .
40 . . . . .
40 . . P/A . .
270
40 . . . . .
41 . . AB . .
41 . . . . .
41 . . . . .
48 . . . . .
48 . . . . .
48 todo . no . .
48 . no no 87.90 3.30
48 . . A-P . .
48 . . no . .
49 . . no . .
49 . . no . .
49 . . . . .
49 . . . . .
50 . . . . .
50 . . . . .
50 áreas . P/A . .
51 . no . . .
51 . no . . .
52 . . . . .
53 . . . . .
53 . . . . .
54 . . . . .
55 . . . . .
55 todo . . . .
56 todo . . . .
57 . . . . .
Tabla 9-24
57 todo . . . .
57 . áreas . . .
58 . . AB . .
59 . . . . .
60 . . . . .
60 . áreas P/A . .
271
60 . . no . .
62 . . . . .
62 . no no . .
62 . . AB . .
62 . . . . .
63 . . . . .
63 . áreas . . .
64 todo . . . .
64 todo todo PAS . .
65 . . . 90.30 3.60
66 . . . 90.40 5.20
66 . . . 87.40 8.80
67 . . . 88.80 7.10
75 . . . 91.10 5.30
75 . . . 92.30 3.00
75 . . . 94.80 2.10
76 . . . 86.70 4.50
76 . . . 86.80 8.30
76 . . . 85.50 3.70
76 . . . 93.20 3.40
77 . . . 89.30 4.80
77 . . . 89.30 3.60
78 . . . 88.40 7.20
78 . . . 90.20 3.90
79 . . . 87.90 3.00
79 . . . 91.00 2.80
Tabla 9-25
número s ip
2 5.80 11.60
2 4.70 8.00
3 3.40 10.50
3 6.00 15.80
3 5.50 11.20
3 8.60 16.90
4 10.90 16.10
272
4 5.50 7.20
4 8.00 12.30
5 7.90 13.50
5 3.50 7.60
5 7.50 10.50
6 1.70 4.70
7 7.00 14.90
7 2.70 6.20
7 8.30 14.40
8 5.70 10.40
8 4.90 12.20
8 4.40 9.80
1 9.40 20.60
2 5.90 10.00
2 . .
2 . .
2 5.70 11.90
5 7.80 12.60
6 9.80 17.80
6 3.50 6.90
6 6.30 12.50
6 4.60 11.30
6 8.40 16.90
7 8.50 14.70
7 . .
7 12.90 17.10
7 . .
8 6.40 10.20
8 8.70 13.70
8 9.20 17.80
9 5.90 14.00
9 . .
9 6.50 12.00
9 10.50 18.00
9 7.60 17.00
273
10 10.80 16.20
10 10.30 18.40
10 8.50 13.00
10 6.40 15.00
10 9.70 14.70
10 8.90 12.90
10 . .
11 6.50 9.50
11 . .
11 9.30 14.80
Tabla 9-26
número s ip
11 10.30 18.40
11 . .
11 . .
12 . .
12 4.70 7.40
12 8.20 14.30
12 . .
12 . .
13 8.50 14.90
13 7.00 10.50
13 . .
13 4.30 8.20
13 4.60 9.70
13 . .
14 8.60 15.80
14 . .
14 . .
14 8.50 12.20
14 . .
14 7.70 10.40
14 8.60 15.70
14 . .
15 8.30 14.10
274
15 11.00 20.10
15 4.30 11.80
15 6.20 16.20
15 . .
15 9.40 17.10
16 6.40 12.50
16 . .
17 4.50 9.50
17 . .
17 6.10 10.60
17 . .
17 . .
18 8.90 11.00
19 8.10 11.50
18 8.70 16.90
18 7.30 9.90
18 8.50 11.90
19 . .
19 9.70 14.80
21 5.00 7.50
21 7.20 16.30
21 . .
22 . .
22 . .
22 6.40 10.50
22 . .
24 8.00 13.80
24 5.10 7.70
24 . .
26 6.20 11.90
Tabla 9-27
número s ip
26 3.40 8.00
26 8.10 16.80
27 11.70 17.50
275
27 11.30 14.50
28 4.70 8.20
29 4.20 11.60
29 . .
30 . .
30 7.40 10.60
30 . .
32 10.30 15.80
32 9.20 12.50
32 4.90 9.80
32 10.20 14.90
32 6.20 9.20
33 11.00 14.40
33 . .
33 5.10 10.00
34 . .
36 7.90 9.10
36 6.80 11.20
36 4.00 9.80
37 . .
38 . .
39 . .
40 . .
40 . .
41 . .
41 . .
43 . .
46 . .
50 . .
52 . .
53 . .
56 . .
56 . .
56 . .
57 . .
276
58 . .
58 . .
60 . .
61 . .
62 . .
63 . .
3 5.60 8.80
3 6.70 10.70
3 4.70 6.40
6 6.30 11.00
6 5.00 9.00
6 6.10 10.80
6 5.10 8.80
11 6.20 10.40
11 . .
Tabla 9-28
número s ip
11 4.50 8.20
11 7.70 12.50
12 . .
12 . .
13 . .
15 8.00 12.30
15 7.00 11.50
22 . .
22 . .
27 . .
29 . .
31 . .
33 . .
34 . .
36 . .
37 . .
37 . .
38 . .
277
38 . .
38 . .
39 . .
39 . .
39 . .
39 . .
40 . .
40 . .
40 . .
41 . .
41 . .
41 . .
48 . .
48 . .
48 . .
48 8.80 12.10
48 . .
48 . .
49 . .
49 . .
49 . .
49 . .
50 . .
50 . .
50 . .
51 . .
51 . .
52 . .
53 . .
53 . .
54 . .
55 . .
55 . .
56 . .
57 . .
278
Tabla 9-29
número s ip
57 . .
57 . .
58 . .
59 . .
60 . .
60 . .
60 . .
62 . .
62 . .
62 . .
62 . .
63 . .
63 . .
64 . .
64 . .
65 6.10 9.70
66 4.40 9.60
66 3.80 12.60
67 4.10 11.20
75 3.60 8.90
75 4.70 7.70
75 3.10 5.20
76 8.80 13.30
76 4.90 13.20
76 10.80 14.50
76 3.40 6.80
77 5.90 10.70
77 7.10 10.70
78 4.40 11.60
78 5.90 9.80
79 9.10 12.10
79 6.20 9.00
Tabla 9-30
279

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Estudio de los cambios en la mucosa colónica de rata y

cinética celular durante la carcinogénesis experimental

AB: tinción de azul alcian

El cáncer colorrectal es, según estimaciones recientes, la tercera neoplasia en orden de

La comparación internacional de las tasas de incidencia muestra variaciones

1. 1. 2. Relación entre el colon y el recto

1. 1. 3. diferencias de riesgo entre las poblaciones urbanas y rurales

1. 1. 4. Distribución por edad y sexo

En el cáncer colorrectal la incidencia aumenta exponencialmente con la edad. En las

I. 1. 2. Factores de riesgo del cáncer colorrectal

h. Grado de actividad física

Se conocen además cuatro tipos de alteraciones genéticas relacionadas con el cáncer

1. 2. 6. Antecedentes patológicos y grupos de riesgo

b. Enfermedad inflamatoria intestinal

c. Patología biliar previa

El cáncer colorrectal habitualmente es silente durante un largo periodo de tiempo que

1. 3. 2. Diagnóstico en el paciente asintomático

1. 3. 3. Diagnóstico en el paciente sintomático

Desde el punto de vista macroscópico, los carcinomas colorrectales adoptan

1. 4. 2. 3. Carcinoma de células pequeñas

La mucosa transicional o mucosa adyacente al tumor colónico se ha observado que

Los tumores colorrectales presentan cuatro vías clásicas de crecimiento: la extensión

I. 1. 8. Factores pronósticos del cáncer colorrectal

El estudio de los factores pronósticos mejora nuestro conocimiento de la historia

1. 8. 1. Factores pronósticos clínicos

e. Intervalo entre el primer síntoma y el diagnóstico

f. Localización del tumor

g. Variables clínicas preoperatorias

h. Tamaño del tumor

1. 8. 2. Factores pronósticos anatomopatológicos

a. Nivel de penetración del tumor en la pared del intestino

b. Número de ganglios positivos

c. Invasión de órganos vecinos

1. 8. 3. Otras variables pronosticas

a. Contenido de ADN y ploidia del tumor

I. 2. Carcinogénesis colónica experimental

I. 2. 2. Principales carcinógenos conocidos

1,2-Dibezantreno Rata or Intestino Lorenz y Stewart, 1941

20-Metilcolantreno Rata or Intestino Stewars, 1953

Aceite lubricante Rata or Intestino Lushsbaugh y Hackett, 1948

20-Metilcolantreno Rata ir I. G. Rack, Kaufman, Simeone, 1955

Alcohol Rata ir I. G. Krebs, 1928

20-Metilcolantreno Rata sc I. G. Millers, Pybus, 1955

N-N-Dimetil-aminodifenil Rata Intestino Miller, Miller, Sandin y Brown, 1947

3,2-Dimetil-4-aninodifenil Rata sc, or I. D. e I. G. Walpole y Williams, 1958

Cicasina Rata or I. G. Laqueur, 1963

Rata, ratón, or, sc, ip,

Azoximetano Rata, ratón or, sc, ir I. D. el. I. G. Druckrey, 1970

or, sc, ip,

3-Metil-2-aminonaftaleno Rata or, sc I. D. e I. G.

3-Metilcolantreno Hamster or I.G.

Hidracinas 1, 1 - Dimetilhidracina (1,1-DMH)

1,2 - Dimetilhidracina dihidrocloruro (1,2-DMH)

Acido fórmico 2-4-(5-nitro-2-furil)-2-tiazolilhidracida

l-Metil-2-butilhidracina dihidrocloruro (MBH)

Compuestos azoxi Azoximetano (AM)

Metilazoximetanol glucósido, cicasina (MAMG)

Compuestos N-Nitroso N-Metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG)

N-Nitrosobis (2-hidroxipropil) amina (BHP)

N-Nitrosobis (2-oxopropil) amina (BOP)

Dextrano sulfato y polisacáridos Asbestos

Aminas ariles y heterocíclicas 3,2'-Dimetil-4-aminobifenil (DMAB)

Hidrocarburos aromáticos policíclicos 3-Metilcolantreno