Practica 1: Agregación de mAbs Asignatura ABT 19/Marzo/2019

(ver. 0.1) Grado Biotecnología Curso 20018-19

ANÁLISIS DE AGREGADOS: ESTUDIO DEL PERFIL DE

AGREGADOS MEDIANTE SEC DE UN ANTICUERPO
MONOCLONAL TERAPEUTICO COMERCIAL Y DE SU BIOSIMILAR
Realizado por: Barea Pérez, Juan José; Sánchez Gómez, Israel
Fecha de realización: 19/03/2019
Fecha de entrega: 12/04/2019

Introducción
El estudio del perfil de agregados en biomacromoléculas terapéuticas es importante para evitar una
respuesta inmunitaria que neutralice la acción terapéutica o genere efectos adversos al paciente. Al
obtener el perfil del medicamento innovador Remicade® (principio activo Infliximab) y de su biosimilar
Inflectra™ (principio activo CT-P13) podremos asegurarnos de que no se forman agregados y
compararlos como método de control de calidad del biosimilar.

Figura 1. Recipientes y vial de preparación extemporánea de Remicade® (izq.) e Inflectra™ (der.)

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Infliximab es un mAb IgG1 quimérico producido en células de hibridoma murino por tecnología de ADN
recombinante. Se distribuye como liofilizado blanco concentrado para reconstituirlo y administrarlo por
perfusión. Cada vial tiene 100 mg de Infliximab y al reconstituir queda en 10 mg/mL. El monoclonal CT-
P13 de Inflectra™ tiene igual secuencia de aminoácidos, es producido por la misma línea celular y
permite igual forma farmacéutica, composición y ruta de administración que Remicade®, aunque haya
ligeras diferencias en sales utilizadas como excipientes1. Ambos pueden combinarse con metotrexato
para tratar la artritis reumatoide. Son útiles contra la enfermedad de Crohn en adultos y niños, de
moderada a grave; y contra la colitis ulcerosa y psoriasis.

La cromatografía SEC es una de las técnica analíticas principales para analizar el perfil de agregados.
Permite una cuantificación fiable y constituye una metodología robusta, sensible y reproducible con la
que se necesitan volúmenes de muestra muy pequeños. Sin embargo, su bajo rango de tamaño de
partícula no admite agregados superiores (filtración previa) y obliga a analizar la estabilidad observando
el cambio de intensidad en los picos cromatográficos de monómeros y dímeros.

Objetivo (Este es el objetivo, no hay que modificarlo)

Obtener el perfil de agregados de un medicamento biotecnológico innovador comercial cuyo
principio activo es un anticuerpo monoclonal terapéutico en condiciones óptimas de uso (con la máxima
seguridad y eficacia para el paciente). Obtener el perfil de agregados de un biosimilar en las mismas
condiciones. Obtener los perfiles de agregación de ambos biofármacos en estudios de degradación
acelerados por temperatura y elevada fuerza iónica. Estudio comparativo de los resultados evaluando su
similaridad.

Metodología
Para poder obtener los perfiles de agregados se utiliza un sistema de cromatografía de alta eficacia
(HPLC) con una columna de exclusión molecular (SEC) Agilent Bio SEC-5. Esta columna tiene como fase
estacionaria partículas de sílice de 5 𝜇m, que han sido recubiertas con un polímero patentado el cual se
caracteriza por ser neutro e hidrofílico, y que otorga una superficie homogénea para la separación por
peso molecular.

El empaquetado de las partículas se lleva a cabo con una técnica patentada, de manera que dejan el
tamaño de poro deseado en función de las moléculas a separar en el laboratorio. Según el tamaño de
poro existente entre las partículas de sílice funcionalizadas podrán separarse moléculas en un rango de
pesos moleculares concreto:

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Tamaño de poro (Å) Peso molecular (kDa)

100 100-100000
150 500-150000
300 5000-1250000
500 15000-5000000
1000 50000-7500000
2000 >10000000
Tabla 1. Rango de PM a separar por la columna
Agilent Bio SEC-5 en función del tamaño de poro entre
partículas de sílice.

Antes de cargar las muestras correspondientes de Remicade® e Inflectra™ para poder obtener el perfil
de agregados, es necesaria una preparación previa del sistema cromatográfico, la cual consta de tres
fases:

1. Equilibrar la columna mediante el paso de 20 volúmenes de columna de tampón fosfato pH 7

(150 mM fosfato sódico) a un flujo de 0,1 mL/min.

2. Calibrar la columna con las proteínas del kit correspondiente, recogiendo los tiempos de
retención para cada una de ellas y relacionándolos con sus pesos moleculares. Esto permitirá
conocer posteriormente el peso molecular de las moléculas de muestra (el cual se encuentra
dentro del rango de calibrado), a partir del tiempo de retención:

Tiempo de
Proteína Peso molecular (kDa)
retención (min)
Tiroglobulina 670 4,727
γ-globulina 150 7,505
Ovoalbúmina 45 8,430
Mioglobulina 17 10,178
Angiotensina II 1 11,959
Tabla 2. Proteínas del kit de calibración con sus correspondientes pesos moleculares y
tiempos de retención en columna.

3. Filtración y desgasificación del buffer y las muestras para eliminar posibles agregados de orden
superior y asegurar unos resultados correctos. Este proceso lo lleva a cabo el propio equipo
cromatográfico, aunque a veces en esta clase de estudios se evita la filtración para asegurar que
no haya una pérdida significativa de analito en el proceso.

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La columna puede trabajar entre valores de pH de 2 y 8,5; siendo compatible con tampones de baja o
alta fuerza iónica. En este caso se ha utilizado como medio de fase móvil el buffer monofosfato disódico
pH 7 (150 mM fosfato sódico). El rango de temperatura adecuado se encuentra entre 10 y 30 ℃, siendo
en este caso la temperatura ambiente de 23 ℃. La presión máxima del equipo cromatográfico es de 450
bar, mientras que la de la columna queda en 240 bar. Se ha empleado un modo de trabajo isocrático con
un flujo de fase móvil de 0,35 mL/min; y se ha inyectado el mínimo volumen de muestra (1 𝜇L) para
evitar excesivas ppm de impurezas.

Tras el paso de las muestras por la columna se lee la absorbancia a 214 nm gracias al sistema de
detección DAD (“Diode Array Detector”), cuyo esquema se representa en la siguiente figura:

1
2

¿Abs. 214 nm? Ruido de fondo

Figura 2. Esquema de funcionamiento del sistema de detección DAD con los resultados correspondientes en el cromatograma.
Modificada de Crawford Scientific.

Gracias a una rendija móvil (1) puede seleccionarse, en un determinado plano focal, la longitud de onda
transmitida por la muestra, de manera que esta se concentra gracias a una lente focalizadora (2) y excita
el diodo correspondiente a la longitud de onda de 214 nm, que es la que se ha seleccionado para este
estudio. Además, también se mide la intensidad transmitida a 380 nm, una longitud de onda a la cual las
muestras no absorben radiación, pero en la cual se obtiene una señal correspondiente al disolvente de
fase móvil y que por tanto puede restarse a la señal obtenida para corregir el ruido de fondo en el
cromatograma.

Por último, también es necesario describir los estudios de degradación acelerada, llevados a cabo en las
muestras de dos formas:

 Aumento de la fuerza iónica: Mientras que el polvo liofilizado de estos medicamentos se

reconstituye de manera que quede como una solución isotónica (0,9 % NaCl) con respecto al
organismo; en este caso las muestras empleadas se han llevado a un 33 % de fuerza salina con NaCl
1,2 M y se han dejado evolucionar durante un día antes de su análisis en el cromatograma.

 Aumento de la temperatura: Las muestras utilizadas se llevaron a una estufa hasta los 55 ℃ y se
analizaron al día siguiente en el cromatograma.

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Resultados y discusión (Incluir los perfiles de agregación que se obtendrán en la realización de la

práctica, así como aquellas valoraciones que se consideren pertinentes del resultado de los análisis de
los dos mAbs considerando también un análisis comparativo del innovador y su biosimilar)

1. Calibración de la columna SEC

Como ya hemos visto la cromatografía SEC nos permite separar los anticuerpos por tamaño. Para
conocer el tamaño de nuestras moléculas lo primero fue realizar un calibrado. Este calibrado se
proporciona por el fabricante de la columna y en este caso se realizó con otras proteínas. El
calibrado utilizado fue el siguiente:

Proteína Pesos moleculares Tiempo de retención

Angiotensina II 1 4.727
Mioglobulina 17 7.505
Ovoalbúmina 45 8.43
γ- globulina 150 10.178
Tiroglobulina 670 11.959

Con estos datos obtuvimos la siguiente representación gráfica a la cual se le a realizado un ajuste
logarítmico ya que es la función que más se 0asemeja al comportamiento de los datos.

La grafica se presenta con el valor de la ecuación obtenida que fue: 𝑦 = −1.088 ln(𝑥) + 12.51
obteniéndose un valor de R2=0.9478.

Calibrado con proteinas

14

12
y = -1.088ln(x) + 12.51
10 R² = 0.9478
8

0
0 100 200 300 400 500 600 700 800

Con esta información se empezó a tratar los resultados del cromatógrafo.

2. Perfiles SEC del mAbs innovador y de su biosimilar

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Se estudiaron los perfiles cromatográficos del medicamento innovador y de su biosimilar en busca

de agregados y ver si el perfil de agregación es similar entre ellos. Los datos recogidos fueron:

Para ver mejor la agregación se realizará una ampliación de los cromatogramas en la zona de
recogida a los 6 min aprox.

IF innovador

IF biosimilar

Vemos un pico más pequeño justo delante del mas grande en ambos casos, estos son los agregados
de la proteína.
Para comprobar que tipos de agregados se tratan vamos a calcular a partir de la ecuación obtenida
en el ajuste lineal y con los tiempos de retención del cromatograma.

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𝑦−12.51
Para ello despejamos la x en nuestra ecuación obteniendo 𝑥 = 𝑒 −1.088
Para el pico principal del IF innovador tenemos que:
𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
6.968−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 163𝑘𝐷𝑎
Si aplicamos la fórmula en el pico de los agregados tenemos:
𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
6.032−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 385.30 𝑘𝐷𝑎
A la vista de estos resultados podemos ver que el IF innovador forma dímeros.

Ahora vamos a analizar el IF bio similar. Para ello realizamos los mismos cálculos que resultan:
Para el pico principal tenemos que:
𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
6.988−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 160𝑘𝐷𝑎

Si aplicamos la fórmula en el pico de los agregados tenemos:

𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
6.150−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 345 𝑘𝐷𝑎

A la vista de estos resultados podemos ver que hay diferencias de 3kD aprox entre los dos
medicamentos. En este caso se han estudiado ambas proteínas en su estado nativo, es decir, el
estado en el cual el medicamento puede ejercer su función.

3. Perfiles SEC en los estudios de degradación acelerada:

Para seguir realizando estudios de estabilidad de los medicamentos se han llevado a cabo estudios
de degradación controlada. En nuestro caso los estados de degradación estudiados son degradación
por temperatura a 55º C temperatura a la que la desnaturalización de estas proteínas es
prácticamente completa. Además, en otro estudio se va a someter a degradación por fuerza iónica
con una disolución 1.2M de NaCl.

a. Degradación por temperatura (55 º C)

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Aquí vamos a mostrar los resultados de la degradación por temperatura. Como en el caso
anterior tenemos los cromatogramas de ambos medicamentos. Las gráficas obtenidas son:

También mostramos la ampliación ya que no se distinguen bien los picos de agregación.

IF innovador

IF biosimilar

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Vamos a realizar los cálculos para obtener el tamaño como en el caso anterior, partimos de la
misma recta de calibrado del caso anterior ya que la columna que se utiliza para el análisis es
la misma y el calibrado es independiente. Ya tenemos despejada las x en la ecuación por lo
que podemos calcular.

Para el pico grande que contiene los monómeros de IF innovador tenemos que:

𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
6.986−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 160.3 𝑘𝐷𝑎

Para el pico donde encontramos los agregados tenemos:

𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
𝑥 = 378 𝑘𝐷𝑎

Podemos ver como aun desnaturalizadas en el caso del IF innovador se forman agregados de
dímeros

Ahora vamos a realizar los mismos cálculos para el medicamento biosimilar:

Para el pico grande que contiene los monómeros de IF biosimilar tenemos que:

𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
6.994−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 159.1 𝑘𝐷𝑎

Para el pico donde encontramos los agregados tenemos:

𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
6.057−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 376.55 𝑘𝐷𝑎

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Vemos que en este caso también se forman dímeros y con las diferencias que se observaban
también en el estado nativo

b. Degradación por fuerza iónica del medio (1,2 M NaCl)

Aquí vamos a mostrar los resultados de la degradación por fuerza iónica. Como en el caso
anterior tenemos los cromatogramas de ambos medicamentos. Las gráficas obtenidas son:

También mostramos la ampliación ya que no se distinguen bien los picos de agregación.

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Como en el caso anterior vamos a analizar los tamaños obtenidos con la degradación por
sales.

Para el pico grande que contiene los monómeros de IF innovador tenemos que:

𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
7.009−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 156.9 𝑘𝐷𝑎

En este caso en el medicamento innovador no se forman agregados cuando se desnaturaliza

por fuerza iónica.

Ahora vamos a realizar los mismos cálculos para el medicamento biosimilar:

Para el pico grande que contiene los monómeros de IF biosimilar tenemos que:

𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
7.026−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 154.5𝑘𝐷𝑎

Para el pico donde encontramos los agregados tenemos:

𝑦−12.51
𝑥 = 𝑒 −1.088
6.155−12.51
𝑥= 𝑒 −1.088
𝑥 = 344.1 𝑘𝐷𝑎

Vemos que en este caso también se forman dímeros pero que tanto los monómeros como
los dímeros salen con un tiempo de retención más alto que en los casos anteriores.

Conclusiones
Como conclusión podemos decir que existen diferencias en el peso obtenido para el medicamento
innovador y biosimilar, en este caso podemos asociar algunas de las diferencias en el tamaño a las

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distintas modificaciones postraduccionales, la mayoría de ellas suelen ser glicosilaciones. Podemos

concluir que el medicamento innovador y el biosimilar si que tienen algunas diferencias entre sí, aunque
suponemos que no afectarán a su funcionalidad.

En cuanto a los estudios de degradación podemos decir que en ambos casos el comportamiento a la
degradación por temperatura es similar presentando agregados además y aproximadamente con la
misma diferencia de tamaño por lo tanto concluimos que, aunque la temperatura afecte de manera
importante a la estabilidad del estado nativo no afecta tanto a la formación de agregados, aunque sea
en forma de cadenas polipeptídicas.

Sin embargo, en el caso de la degradación por fuerza iónica si que encontramos una gran diferencia
entre el medicamento innovador y el biosimilar ya que en el caso del primero no se ha encontrado pico
de agregados y en el segundo si que se ha mantenido el perfil de agregados de los demás casos.
Podemos intuir que en el primer caso las cargas de la proteína en sus modificaciones postraduccionales
se han apantallado con las de la sal disociada y no ha permitido la formación de agregados, sin embargo,
en el otro caso no ha ocurrido lo cual nos reafirma más en la hipótesis de que las modificaciones de
ambas proteínas son distintas.

Además, podemos decir que la técnica de la cromatografía-SEC es ideal para realizar estudios de
agregados. Permite una buena definición en cuanto a los picos y se pueden detectar diferencias
significativas entre moléculas parecidas.

Es muy importante realizar estudios de degradación ya que este tipo de medicamentos que deben
distribuirse en el torrente sanguíneo está sometido a fuerzas iónicas y a otros factores que pueden a
afectar a la estabilidad, con este tipo de cromatografía se pueden realizar estudios adecuadamente.

Bibliografía (En caso de ser utilizada, incluirla)

ANEXO (si se considera necesario, pueden incluirse anexos con documentos, etc.)

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